Ilościowe i jakościowe badanie oddziaływań cząstka-cząstka za pomocą nanoskopii sondy koloidalnej

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie informacji ilościowych na temat oddziaływań w nanoskali obecnych między cząstkami w układzie koloidalnym opartym na cieczy. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw funkcjonalnej sondy koloidalnej poprzez przymocowanie pojedynczej cząstki do wspornika mikroskopu sił atomowych tipis. Drugim krokiem jest zamontowanie sondy na mikroskopie sił atomowych i przygotowanie ciekłej komórki z koloidalnym substratem cząsteczkowym.

Następnie stała sprężystości i czułość sondy koloidalnej są kalibrowane termicznie za pomocą oprogramowania mikroskopu. Ostatnim krokiem jest użycie sondy koloidalnej i zmierzenie interakcji z substratem cząstek części koloidalnej w cieczy w celu kalibracji. Bezpośredni pomiar czułości sondy za pomocą substratu MICA w cieczy jest również wykonywany ostatecznie za pomocą sondy koloidalnej.

Mikroskopia może być wykorzystana do pomiaru sił międzycząsteczkowych, które mogą być odpowiedzialne za kinetykę krzepnięcia i niestabilność fizyczną badanego ciekłego układu koloidalnego. Metoda ta może pomóc w określeniu i zmierzeniu kluczowych parametrów odpowiedzialnych za stabilność fizyczną i kinetykę krzepnięcia różnych płynnych układów koloidalnych, takich jak te obecne w inhalatorach ciśnieniowych, farmaceutykach, preparatach dożylnych, systemach biologicznych i kilku innych systemach Poprzez bardzo precyzyjne pomiary sił przyciągania, kohezji i dekohezji dwóch materiałów stałych. Metoda ta może zapewnić bardzo głęboki wgląd w chemiczne i fizyczne oddziaływania tych dwóch ciał stałych poza skalą.

Wiedza ta może być wykorzystana do przewidywania stabilności preparatów farmaceutycznych, ale może być również stosowana do bardzo różnych systemów biologicznych do badania powinowactwa cząstek lub różnych ciał stałych do komórek lub bakterii. Zacznij od przygotowania sondy koloidalnej za pomocą końcówki mikroskopii sił atomowych, mniej wspornika, przymocuj wspornik do uchwytu kątowego 45 stopni, jak pokazano tutaj. Uchwyt podpiera wspornik pod kątem 45 stopni nad poziomem.

Następnym krokiem jest umieszczenie żywicy epoksydowej na szkiełku mikroskopowym, aby to zrobić. Po przygotowaniu żywicy epoksydowej za pomocą czystej szpatułki rozsmaruj cienką warstwę na szkiełku. Za pomocą tymczasowego kleju przymocuj przeciwną stronę szkiełka do niestandardowego uchwytu przeznaczonego do wsuwania na obudowę soczewki mikroskopu.

Wróć do mikroskopu z zespołem szkiełka i uchwytu, a po zakończeniu wsuń uchwyt na obudowę obiektywu. Zjeżdżalnia z żywicą epoksydową powinna znajdować się powyżej wspornika na platformie próbki. Gdy wszystko jest na swoim miejscu, obserwuj wspornik przez mikroskop i zbliż się do platformy i wspornika do szkiełka epoksydowego.

Gdy wspornik zdobędzie niewielką ilość żywicy epoksydowej, wycofaj wspornik z założoną żywicą epoksydową. Użyj tej samej techniki, aby przymocować cząsteczkę lipidową o wielkości od dwóch do pięciu mikronów na wierzchołku wspornika. Teraz przygotuj podłoże do mikroskopii sił atomowych.

Użyj okrągłego szkiełka nakrywkowego o średnicy 35 milimetrów i termoplastycznego kleju montażowego. Podgrzej szkiełko nakrywkowe na płycie grzejnej wyposażonej w sondę temperatury. Gdy płyta grzejna osiągnie około 120 stopni Celsjusza, nałóż klej termoplastyczny, wyłącz płytę grzejną i poczekaj, aż szkiełko nakrywkowe ostygnie do 40 stopni Celsjusza.

W tym momencie odkurz szkiełko nakrywkowe niewielką ilością cząstek koloidalnych. Gdy szkiełko nakrywkowe ostygnie do temperatury pokojowej, przenieś je do uchwytu i umyj je pipetując. Niewielka ilość ciekłego podłoża tutaj, dwa H trzy H na fluor PENTAN lub HPFP.

Zrób to kilka razy, aby usunąć nieprzyczepione cząstki. Następnym krokiem jest zamontowanie podłoża do użycia w mikroskopie sił atomowych lub FM w tym celu, użyj dolnej połowy płynnej komórki, zamontuj szkiełko nakrywkowe z cząstkami koloidalnymi w dolnej połowie ogniwa. Upewnij się, że O-ring jest prawidłowo osadzony, aby zapobiec wyciekom.

Pod mikroskopem sił atomowych należy podjąć środki ostrożności przed wyciekami. Zabezpiecz stolik mikroskopu przezroczystym arkuszem hydrofobowym. Następnie umieść płynną komórkę na scenie.

Po przymocowaniu sondy koloidalnej do głowicy skanującej, zmontuj ją na A FM. Uruchom A FM i oprogramowanie instrumentu, a następnie użyj pokręteł regulacyjnych głowicy skanującej, aby ustawić ostrość końcówki wspornika i wyrównać laser. Aby wyrównać laser, monitoruj intensywność lasera i maksymalizuj jego wartość. Pozwól systemowi zrównoważyć się w powietrzu, a następnie użyj pokrętła regulacji ugięcia, aby sprowadzić ugięcie do zera lub lekko ujemnej wartości.

Następnie z okna panelu głównego oprogramowania przejdź do panelu termicznego. Aby znaleźć czułość sondy koloidalnej, wybierz opcję Oblicz odwrotną czułość dźwigni optycznej, a następnie przechwyć dane termiczne. Gdy widoczny jest wyraźny szczyt, przestań przechwytywać dane.

Kliknij, aby powiększyć główny szczyt, a następnie wybierz opcję Zainicjuj dopasowanie. Po danych termicznych dopasowania zostanie obliczona wartość czułości. Postępuj zgodnie z podobną procedurą, aby określić stałą sprężystości sondy koloidalnej.

Po znalezieniu czułości i stałej sprężystości nadszedł czas, aby dodać pożywkę do płynnej komórki. Użyj strzykawki zawierającej co najmniej dwa mililitry HPFP, aby powoli dodać dwa mililitry, upewniając się, że wokół wspornika nie ma pęcherzyków. Po dodaniu medium należy ponownie ustawić laser, aby uwzględnić zmianę współczynnika załamania światła.

Pozwól, aby wartość ugięcia zrównoważyła się w HPFP przez pięć do 10 minut. Następnie ustaw go z powrotem na zero. Gdy wszystko będzie gotowe do skanowania na panelu głównym, ustaw początkowy rozmiar skanowania na 20 mikronów.

Szybkość skanowania do jednego herca, kąt skanowania do 90 stopni i ustawienie wartości na 0,2 V. Podejdź do próbki i zeskanuj. Gdy zostanie znaleziona cząstka będąca przedmiotem zainteresowania, natychmiast ją przybliż, aby zapobiec przedłużającym się interakcjom sondy z podłożem, skanuj, aby uzyskać obraz wystarczający do zlokalizowania cząstki na podłożu lub poznania wysokości jej głównych cech.

Następnie przełącz się na panel siły w oprogramowaniu, przesuń czerwony pasek pozycji do najwyższej pozycji. Ustaw odległość siły na pięć mikronów. Szybkość skanowania do 0,1 Hz i kanał wyzwalania do braku.

Wykonaj pojedynczy pomiar siły i upewnij się, że sonda nie styka się z podłożem z uzyskanego wykresu. Kliknij prawym przyciskiem myszy na okno wykresu i wybierz oblicz wirtualną linię ugięcia. Spowoduje to automatyczne obliczenie i aktualizację ugięcia pionowego.

Teraz zmień kanał spustu na ugięcie i ustaw punkt wyzwalania na 20 nanometrów. Ustaw odległość siły na jeden mikron. Dostosuj prędkość skanowania do 200 nanometrów na sekundę odpowiednią do sił związanych z tą cząstką.

Następnie po zakończeniu pomiaru przeprowadź pierwszy z dwóch lub trzech pojedynczych pomiarów siły. Przejdź do panelu siły i kliknij recenzję. Aby otworzyć główny panel sił, podświetl ostatni pomiar siły i sprawdź, czy zaznaczona jest opcja tylko pod nagłówkiem osi.

Zmień również pole wejściowe osi x na odległość separacji. Następnie kliknij utwórz wykres. Przejdź do zakładki parametrów na panelu siły głównej i dostosuj wartość odwróconej czułości dźwigni optycznej, aż obszar styku wykresu będzie całkowicie pionowy.

Zwróć uwagę na wartość zwracaną do panelu masterforce. Otwórz zakładkę siły i zakładkę podrzędną kalibracji. Następnie wprowadź odwrotną wartość odwrotnej czułości dźwigni optycznej w polu dla odchylenia odwrotnej czułości dźwigni optycznej.

Powtórz pomiar siły i regulację czułości dwa lub trzy razy, aby upewnić się, że wartość nie zmienia się znacząco przy ustawionych parametrach, sprawdź poziom ciekłego medium i stabilność ugięcia. Kontynuuj pomiary krzywych sił lub map sił. Po zakończeniu pomiarów określ rzeczywistą czułość sondy.

Usuń płynną komórkę z substratem i zastąp ją płynną komórką. W przypadku MICA lub innej twardej powierzchni zanurz MICA w tym samym płynnym podłożu. Kontynuuj, przeprowadzając pomiar siły za pomocą sondy koloidalnej, wykorzystując stosunkowo duże ugięcie, tak aby krzywa siły miała długi obszar kontaktu.

Oprogramowanie określa czułość na podstawie nachylenia obszaru styku. Skorzystaj z obliczonej przez oprogramowanie czułości podczas analizy krzywych uzyskanych za pomocą sondy. Ten topograficzny obraz substratu cząstkowego uzyskano za pomocą sondy koloidalnej w dwóch H three H na fluoro pentan.

Obraz jest mniej wyraźny niż te uzyskane za pomocą zaostrzonej stożkowej końcówki. Celem jest jednak znalezienie cząstki substratu do oceny oddziaływań międzycząsteczkowych. Skany mogą dodatkowo skupić się na powierzchni pojedynczej cząstki, mapując siłę za pomocą cząstek na bazie lipidów w dwóch godzinach, trzech godzinach na fluor.

Pentan może dostarczyć zarówno mapy topograficzne wysokości próbki, jak i mapę adhezji przedstawiającą maksymalną siłę bieguna dla każdej pojedynczej krzywej siły. Oba typy wykresów danych surowych można wyświetlać w reprezentacjach trójwymiarowych. Nałożenie ich na siebie tworzy trójwymiarową ilustrację rozkładu sił adhezji w funkcji topografii.

Pomiary siły przebywania pozwalają na badanie wpływu mechaniki kontaktu i długości kontaktu na siły adhezyjne. Użyto stałych cząsteczek lipidowych, a pomiary wskazują, że siły adhezyjne rosną w funkcji czasu. Korzystając z wgłębienia, siły adhezyjne utrzymują się na stałym poziomie za pomocą ugięcia podczas próby tej procedury.

Ważne jest, aby zrównoważyć ciekłe media przed rozpoczęciem pomiaru, aby zapewnić uzyskanie najdokładniejszych wyników.