Endoskopia mysia do multimodalnego obrazowania in vivo kancerogenezy i oceny gojenia się ran jelitowych i stanów zapalnych
26 sierpnia 2014
Techniki obrazowania małych zwierząt pozwalają na seryjne badania diagnostyczne i interwencje terapeutyczne in vivo. W ostatnim czasie zakres zastosowań znacznie się poszerzył i obecnie obejmuje ocenę rozwoju guza jelita grubego, gojenie się ran oraz monitorowanie stanu zapalnego. Protokół ten ilustruje te różnorodne potencjalne zastosowania endoskopii mysiej skóry.
W tym filmie zostaną zaprezentowane różne zastosowania endoskopii neuronów w pierwszym zastosowaniu. Jak używać endoskopu do oceny nasilenia choroby w mysim modelu zapalenia jelita grubego, zostanie pokazane w drugiej aplikacji. Zastosowanie endoskopii do monitorowania gojenia się ran błony śluzowej in vivo zostanie zademonstrowane w ostatniej aplikacji.
Zastosowanie endoskopii fluorescencyjnej do wykrywania nowotworów jelita oraz technika wstrzykiwania środków dośluzówkowych zostanie ostatecznie przedstawiona w procesie gojenia się ran jelitowych, stanów zapalnych i raka. Agenezję można ocenić na podstawie wyników analizy endoskopowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza histologiczna eksperymentalnego zapalenia jelita grubego, jest to, że dzięki niej można wykonywać indywidualne badania kontrolne i powtarzalnie oceniać zmiany w błonie śluzowej.
Dlatego metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie eksperymentalnego zapalenia jelit, takie jak to, co jest czasowym ustaleniem zapalenia jelita grubego. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię raka jelita grubego ze względu na możliwość funkcjonalnego scharakteryzowania zmian nowotworowych. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w rozwój raka jelita grubego, może być również stosowana w innych systemach, takich jak nieswoiste zapalenie jelit lub zakaźne zapalenie jelita grubego.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności z wyzwaniem związanym z obsługą fluorescencji endoskopu na małą skalę. Endoskopia rozszerza potencjał endoskopii szerokokątnej na obrazowanie molekularne poprzez specyficzne celowanie w struktury komórkowe za pomocą fluorescencyjnie znakowanych śladów podczas badań endoskopowych. Aby wywołać raka jelita grubego u zwierząt doświadczalnych, najpierw użyj jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 30 do wstrzyknięcia międzyotrzewnowego 10 miligramów na kilogram świeżo przygotowanych mutagennych jako tlenometan do każdej myszy.
Rzuć wyzwanie eksperymentalnej grupie myszy z powtarzającymi się cyklami 3% masy na objętość, siarczan dekstranu, sodu lub DSS od dnia zerowego do 7, 21 do 28 i 42 do 49, aby wywołać zapalnie napędzanego raka jelita grubego. Agenezja polegająca na zaopatrywaniu myszy w wodę z autoklawu pomiędzy wyzwaniami w dniu kolonoskopii. Po potwierdzeniu sedacji przez uszczypnięcie palca u nogi, użyj kaniuli zapinanej na guziki, aby wkroplić dwa mililitry płynnej lewatywy do okrężnicy zwierzęcia doświadczalnego.
Jeśli podejrzewa się znaczne obciążenie kałem, to czekając, aż mysz się wypróżni, podłącz endoskopową stację roboczą weterynaryjną dla małych zwierząt do jednostki kamery w celu endoskopii światłem białym. Skonfiguruj ustawienia źródła światła, aby wzbudzić ślady, które mają zostać wstrzyknięte, a następnie zintegruj odpowiedni filtr pasmowo-przepustowy między teleskopem a kamerą. Teraz umieść mysz na stole do badań i bardzo ostrożnie włóż endoskop.
Aby uniknąć perforacji, otwórz oba zawory osłony. Jeden zawór powinien być podłączony do pompy powietrza. Drugi powinien być uszczelniony palcem wskazującym, aby kontrolować powietrze.
Następnie powoli i ostrożnie napompuj okrężnicę, przesuwając endoskop tylko do prawego zginacza okrężnicy, aby uniknąć perforacji około 4,5 centymetra od odbytu. Teraz powoli odciągnij endoskop i zbadaj błonę śluzową pod kątem zmian zapalnych lub złośliwych oraz oceń cały obwód jelita. Następnie, aby pobrać próbkę z biopsji, ostrożnie przełóż kleszcze do biopsji przez kanał roboczy, aż końcówka kleszczyków będzie widoczna na monitorze.
Ostrożnie otwieraj i zamykaj kleszcze, aby uniknąć perforacji i przenieś je w miejsce patologii. W przypadku stosowania środków farmakologicznych na błonę śluzową międzyra, należy wstępnie napełnić elastyczną rurkę iniekcyjną całkowicie interesującym nas środkiem, a następnie przepchnąć rurkę przez kanał roboczy, aż kaniula będzie widoczna na monitorze. Następnie przymocuj cienką strzykawkę i włóż igłę do błony podśluzowej Pod kątem 15 do 30 stopni skierowanym do skosu w kierunku błony śluzowej, delikatnie podaj do 50 mikrolitrów środka terapeutycznego.
Po udanym wstrzyknięciu błona śluzowa będzie wykazywać charakterystyczny lifting w celu wykonania endoskopii fluorescencyjnej, podania interesującego czynnika dożylnie przed badaniem. Sprawdź optymalny punkt czasowy między wstrzyknięciem znakowanego fluorescencyjnie znacznika a procedurą obrazowania, która jest zależna od farmakologii znacznika. Następnie, aby wyświetlić wstrzyknięty czynnik za pomocą endoskopii fluorescencyjnej, skonfiguruj ustawienia systemu filtrów pasmowoprzepustowych zgodnie z długościami fal wzbudzenia i emisji wstrzykiwanego znacznika.
Na koniec zobrazuj tkankę po nałożeniu znacznika, aby uzyskać odczyt stosunku celu do tła po indukcji zapalenia jelita grubego. Myszy. Wykazują utratę masy ciała począwszy od trzeciego dnia, z maksymalną utratą masy ciała o 19% występującą w siódmym dniu zgodnie z utratą masy ciała. Wskaźnik endoskopowy neuronów nasilenia zapalenia jelita grubego wzrasta w siódmym dniu po tym, jak DSS zaczyna wskazywać na masywne uszkodzenie zapalne błony śluzowej okrężnicy, które ulega poprawie do 13 dnia.
Również w siódmym dniu, po rozpoczęciu DSS, uszkodzenie histologiczne jest znacznie wyższe u myszy leczonych DSS w porównaniu z grupą kontrolną, co znajduje odzwierciedlenie w denudacji nabłonka, owrzodzeniach błony śluzowej i zwiększonym nacieku neutrofili, z których wszystkie ulegają znacznej poprawie do 13 dnia. Na tych reprezentatywnych obrazach z rutynowej endoskopii, rany błony śluzowej zostały wywołane mechanicznie za pomocą miniaturowych kleszczy biopsyjnych z raną o średnicy jednego milimetra. Gojenie było następnie monitorowane za pomocą codziennego badania endoskopowego i określane ilościowo poprzez pomiar resztkowej powierzchni rany za pomocą oprogramowania do edycji obrazu.
Zamknięcie pojedynczego obszaru rany w czasie zostało następnie wyrażone za pomocą ilorazu rzeczywistej powierzchni rany na początkową powierzchnię rany. Na przykład trzy dni po powstawaniu rany 41% powierzchni rany zostało zagojone, podczas gdy po siedmiu dniach rana była całkowicie zagojona. Jak zwykle, pod koniec eksperymentu, rany można wyciąć w celu oceny histologicznej, X vivo, jak na tych reprezentatywnych obrazach łożysk ran barwionych hematyną i ESN w dniu zero i piątym, około 80 dni po indukcji guza przez tlenek metanu i trzy cykle mnogich guzów jelita grubego DSS, a także można zaobserwować makroskopowe objawy przewlekłego stanu zapalnego, takie jak ziarnista błona śluzowa
.Endoskopowa endoskopia fluorescencyjna jelita nerwowego bez zastosowania znacznika, skutkuje brakiem detekcji jakiegokolwiek specyficznego sygnału, a także nie obserwuje się interakcji z tkanką okrężnicy ani autofluorescencji kałowej. W przeciwieństwie do tego, bezpośrednio po dożylnym podaniu Fitz Dextran, fluorochrom można zaobserwować na błonie śluzowej okrężnicy i może być wykorzystany do oceny zwiększonego unaczynienia w obszarach przewlekłego stanu zapalnego lub złośliwej błony śluzowej. W związku z tym kwantyfikacja intensywności fluorescencji może być wykorzystana do pomiaru znacznie zwiększonego wychwytu fluorochromu w tkance złośliwej w porównaniu z niedotkniętą błoną śluzową okrężnicy.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu do 10 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby ostrożnie przesuwać sztywny endoskop przez okrężnicę morską. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić gojenie się ran nabłonkowych, zapalenie jelit i agenezję raka podczas wykonywania kolonoskopii morskiej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono protokół endoskopii u myszy, podkreślając jego zastosowanie w ocenie rozwoju guzów jelita grubego, gojenia ran oraz monitorowania stanu zapalnego in vivo. Metoda ta umożliwia przeprowadzanie seryjnych badań i interwencji terapeutycznych, dostarczając wiedzy na temat eksperymentalnych stanów zapalnych jelit oraz raka jelita grubego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia
- Medycyna eksperymentalna
Wstęp
- Zakres technik obrazowania małych zwierząt uległ rozszerzeniu.
- Endoskopia umożliwia monitorowanie postępu choroby w czasie rzeczywistym.
- Endoskopia fluorescencyjna usprawnia wykrywanie guzów jelit.
- Metoda ta może dostarczyć istotnych informacji na temat nieswoistych zapaleń jelit oraz raka jelita grubego.
Cel badania
- Aby zademonstrować zastosowanie endoskopii u myszy w ocenie stopnia ciężkości zapalenia jelita grubego.
- Aby monitorować gojenie ran błony śluzowej in vivo.
- Aby ocenić rozwój raka jelita grubego za pomocą technik endoskopowych.
Zastosowane Metody
- Doustne lub domięśniowe wstrzyknięcia agentów mutagennych do indukowania raka jelita grubego.
- Zastosowanie dekstranu siarczanu sodu (DSS) w celu indukowania stanu zapalnego.
- Endoskopia fluorescencyjna do obrazowania i oceny zmian błony śluzowej.
- Pobieranie próbek do biopsji oraz wstrzykiwanie środków farmakologicznych podczas endoskopii.
Główne wyniki
- Odnotowano znaczną utratę masy ciała u myszy po zastosowaniu DSS.
- Zwiększony wskaźnik ciężkości zapalenia jelita grubego korelujący z uszkodzeniami zapalnymi.
- Pomyślne monitorowanie gojenia ran błony śluzowej w czasie.
- Poprawa uszkodzeń histologicznych do 13. dnia po leczeniu.
Wnioski
- Endoskopia mysia jest cennym narzędziem w badaniu chorób jelit.
- Technika ta umożliwia wielokrotną ocenę zmian w błonie śluzowej.
- Pozwala ona na uzyskanie informacji na temat czasowego przebiegu rozwoju zapalenia jelita grubego oraz nowotworów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Endoskopia mysia umożliwia powtarzalną ocenę błony śluzowej przewodu pokarmowego in vivo, co ogranicza konieczność stosowania histologii terminalnej i wspiera podłużne modelowanie chorób. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w badaniach przedklinicznych nad stanami zapalnymi jelit, gojeniem ran i kancerogenezą, pozwalając na śledzenie odpowiedzi terapeutycznej w obrębie tego samego osobnika. Metoda ta wspiera wczesną walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w projektach z zakresu onkologii i gastroenterologii poprzez zastosowanie nieterminalnych, mierzalnych punktów końcowych obrazowania.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia bezpośrednią wizualizację zmian nowotworowych i zapalnych w celu weryfikacji hipotez terapeutycznych w modelach żywych.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez korelację znalezisk endoskopowych z obrazowaniem molekularnym przy użyciu specyficznych znaczników.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio dzięki powtarzalnemu monitorowaniu zmian śluzówki i progresji choroby.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez ustalenie bazowej integralności błony śluzowej i zakresu dynamicznego.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność testów dzięki mierzalnemu zamykaniu się obszaru rany oraz pomiarom intensywności fluorescencji.
- Skalowalność: Umożliwia rzetelną ocenę związków poprzez powtarzane badania endoskopowe i lokalne podawanie czynników.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje istotność chorobową poprzez modelowanie patofizjologii jelit człowieka u żywych myszy z wykorzystaniem obrazowania podłużnego.
- Wartość operacyjna: Wspiera dopasowanie biomarkerów translacyjnych poprzez ilościowe określanie przepuszczalności naczyniowej i wychwytu znacznika za pomocą endoskopii fluorescencyjnej.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza informacji dla przedklinicznych decyzji go/no-go poprzez śledzenie kinetyki gojenia i rozwoju zmian nowotworowych w czasie.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje biologię odkrywczą, badania przesiewowe, analitykę i badania translacyjne, umożliwiając nieterminalne, powtarzalne obrazowanie odpowiedzi błon śluzowych na perturbacje genetyczne, chemiczne lub terapeutyczne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnalizacyjnych poprzez wizualizację spatiotemporalnej dynamiki stanu zapalnego i inicjacji nowotworu.
- Przesiewy: Zapewnia gotowość do analizy dzięki zestandaryzowanym protokołom zadawania ran śluzówkowej oraz ilościowego określania procesu gojenia.
- Analityka: Dostarcza ilościowych odczytów, w tym ilorazu powierzchni rany, stosunków intensywności fluorescencji oraz punktowych ocen stopnia zaawansowania zmian w badaniu endoskopowym dla analizy porównawczej stanów.
- Badania translacyjne: Łączy z ciągłością przedkliniczną poprzez monitorowanie podłużne, które odzwierciedla kliniczne harmonogramy obrazowania kontrolnego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma obrazowania wielokrotnego zastosowania, możliwa do wykorzystania w modelach stanu zapalnego, onkologii oraz chorób zakaźnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki bezpośredniej, powtarzalnej wizualizacji in vivo.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i skalowalność dzięki zdefiniowanym procesom endoskopowym i mierzalnym punktom końcowym opartym na obrazowaniu.
- Wartość strategiczna: Zwiększa efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka biologicznego i zmniejszając odsetek niepowodzeń w późnych fazach badań wynikających z niezweryfikowanych celów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki danym podłużnym, które informują decyzje o dalszym rozwoju w obszarze IBD oraz onkologii.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obsłudze mikroendoskopu, nawigacji po błonie śluzowej oraz unikaniu perforacji w przewodzie pokarmowym małych zwierząt.
- Zależność od infrastruktury stacji roboczej do endoskopii, w tym od źródła światła, filtrów pasmowych oraz systemów kamer dla trybów światła białego i fluorescencji.
- Konieczność międzyzespołowej standaryzacji indukowania ran, czasu podawania znacznika oraz protokołów analizy obrazu.
- Kwestie dostosowania do różnych systemów modelowych, w tym korekty w zależności od długości jelita grubego, kruchości błony śluzowej i fenotypów specyficznych dla danej choroby.
- Ograniczenia praktyczne obejmują trudności techniczne w manipulowaniu endoskopem oraz zależność od optymalnej farmakokinetyki znacznika w celu uzyskania dokładnych stosunków sygnału celu do tła.
