Name: Endoskopia mysia do multimodalnego obrazowania in vivo kancerogenezy i oceny gojenia się ran jelitowych i stanów zapalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Poznaj endoskopię mysią do multimodalnego obrazowania kancerogenezy i oceny gojenia ran jelitowych. Ta metoda umożliwia szeregowe badania oraz interwencje terapeutyczne u myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Sonji Dufentester i Elke Weber za fachową pomoc techniczną. Dziękujemy Faekah Gohar za korektę manuskryptu i Stefanowi Brücknerowi za wsparcie w zakresie informatyki medycznej. Prace te zostały wsparte interdyscyplinarnym grantem Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A94). D. Bettenworth był stypendystą naukowym na Wydziale Lekarskim Westfälische Wilhelms-Universität Münster. M. Brückner był wspierany przez rotacyjną pozycję "Gerok" Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1009B8). Dziękujemy Heike Blum za ilustrację kreskówki z myszką.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) zgodnie z niemiecką ustawą o ochronie zwierząt.
1. Materiały i konfiguracja eksperymentalna
<ol>
	<li>Opieka nad zwierzętami
	<ol>
		<li>Używaj samic lub samców myszy dowolnego szczepu o wadze od 20 do 25 g i trzymaj je w pomieszczeniach zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami.</li>
		<li>Nakarm myszy specjalną karmą dla gryzoni i zastosuj karmę bez lucerny co najmniej trzy dni przed badaniami fluorescencyjnymi, aby zminimalizować autofluorescencję endoluminalną.</li>
		<li>Dostarczyć autoklawowaną wodę pitną ad libitum.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukcja ostrego zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS
	<ol>
		<li>Przygotować 3% (w/v) roztwór siarczanu dekstranu sodu (DSS, masa cząsteczkowa: 36 000–50 000 Da), rozpuszczając 3 g DSS w 100 ml autoklawowanej wody. Oferuj ten roztwór jako wyłączną wodę pitną dla myszy ad libitum i oblicz 5 ml roztworu DSS na mysz dziennie. Karm myszy kontrolne wodą w autoklawie bez DSS ad libitum9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukcja raka jelita grubego
	<ol>
		<li>Rozpuścić mutagenny azoksymetan (AOM) (UWAGA! Może powodować raka i uszkodzenia genetyczne!) w sterylnym izotonicznym roztworze soli fizjologicznej do uzyskania końcowego stężenia 1 mg/ml. Jednorazową dawkę 10 mg AOM na kg masy ciała należy stosować dootrzewnowo za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml (30 G)10.</li>
		<li>Myszy prowokacyjne (z wyłączeniem myszy kontrolnych) z powtarzającymi się cyklami 3% (w/v) DSS od dnia 0 do 7, dnia 14 do 21, dnia 28 do 35 i dnia 42 do 49 w celu wywołania zapalnej rakotwórczości jelita grubego. Karm myszy autoklawowaną wodą tylko pomiędzy tymi wyzwaniami (patrz rysunek 4A, aby uzyskać szczegółowy harmonogram). Karm myszy kontrolne autoklawowaną wodą przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie endoskopii fluorescencyjnej (FE)
	<ol>
		<li>Użyj Fluoresceina-Izotiocyjanat (FITC) - dekstran (masa cząsteczkowa 70 000 Da; FITC: Glukoza = 1:250) do wykrywania gruczolaka okrężnicy poprzez wizualne wzmocnienie wzorca naczyniowego związanego z dysplazją.</li>
		<li>Podać 60 mg dekstranu sprzężonego z FITC rozcieńczonego w 100 μl PBS dożylnie na 5 minut przed fluorescencyjnym badaniem endoskopowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>znieczulenie
	<ol>
		<li>Zapewnić ciągły dopływ izofluranu do znieczulenia (1,5 lO2/min; 1,5–2% obj. izofluranu [2-chloro-2-(difluorometoksy)-1,1,1-trifluoro-etan]). Używaj specjalnego weterynaryjnego sprzętu anestezjologicznego z maską na twarz, aby ściśle kontrolować znieczulenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie lewatywy
	<ol>
		<li>Wkroplić 2 ml płynnej lewatywy (zawartość: wodorofosforan disodowy 1,5% (w/v) i diwodorofosforan sodu 11% (w/v)) do jelita grubego, jeśli podejrzewa się znaczne obciążenie kałem, które może zasłaniać widok.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wyposażenie techniczne
<ol>
	<li>Używaj endoskopowej weterynaryjnej stacji roboczej, która została opracowana i zatwierdzona do stosowania endoskopii małych zwierząt. Podłącz stację roboczą do kamery, ksenonowego źródła światła, pompy powietrza i do konwencjonalnego monitora PC w celu endoskopii światła białego. Następnie połącz kamerę z miniaturowym sztywnym teleskopem (średnica zewnętrzna 1,9 mm, długość 10 cm; Rysunek 5).</li>
	<li>Użyj osłonki endoskopu z kanałem roboczym (ryc. 5D) do aplikacji kleszczyków biopsyjnych lub rurki iniekcyjnej. Osłonkę bez kanału roboczego należy stosować do kolonoskopii diagnostycznej.</li>
	<li>Skonfiguruj ustawienia źródła światła dla endoskopii fluorescencyjnej, aby wzbudzić używane znaczniki (np. 490 nm dla dekstranu sprzężonego z FITC). Dodatkowo należy zintegrować odpowiedni filtr pasmowoprzepustowy między teleskopem a kamerą (np. 525 nm dla dekstranu sprzężonego z FITC).</li>
	<li>Wprowadzić elastyczne kleszczyki do biopsji (3 Charr., 28 cm) przez kanał roboczy endoskopu, aby uzyskać biopsje.</li>
	<li>Wprowadzić elastyczną rurkę iniekcyjną (0,96 mm) przez kanał roboczy do miejscowego, dośluzówkowego lub endoluminalnego podawania środków diagnostycznych lub terapeutycznych.</li>
	<li>Używać podgrzewanego stołu do badań o temperaturze 42 °C. Zapobiega to hipotermii myszy podczas badania.</li>
</ol>
3. Znieczulenie zwierząt
<ol>
	<li>Umieść mysz w małym, ale szczelnym pudełku i podaj izofluran (100% (v/v), 5 vol%, 3 l/min). Poczekaj, aż mysz straci przytomność.</li>
	<li>Przenieś mysz na stół do badań w celu endoskopii. Kontynuować inhalację izofluranu przez maskę na twarz w dawce 100% v/v, 1,5 obj., 1,5 l/min. Zawsze nakładaj maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Oceń skuteczność znieczulenia, sprawdzając odruchy. Sprawdź "odruch odwrócenia się": po odpowiednim znieczuleniu mysz leżąca na grzbiecie nie powinna się odwracać. Sprawdź "odruch palców u stóp": gdy znieczulenie jest odpowiednie, delikatne szczypanie między palcami zwierzęcia nie powinno prowadzić do wycofania nogi (etap tolerancji chirurgicznej).</li>
</ol>
4. Kolonoskopia
<ol>
	<li>Połóż znieczuloną mysz na brzuchu / na plecach na stole do badań.</li>
	<li>Podać 2 ml lewatywy przez zapinaną kaniulę do okrężnicy, jeśli podejrzewa się znaczne obciążenie kałem, które może zasłaniać widok. Poczekaj, aż myszy wypróżnią się po podaniu lewatywy. Włóż endoskop bardzo ostrożnie, aby uniknąć perforacji.</li>
	<li>Otwórz oba zawory osłony, z których jeden jest podłączony do pompy powietrza. Uszczelnij drugi zawór palcem wskazującym, aby dozować powietrze. Napompuj okrężnicę powietrzem, powoli i ostrożnie, szczególnie w przypadku biopsji lub wstrzyknięcia.</li>
	<li>Endoskop należy przesunąć tylko do prawego zgięcia okrężnicy, aby uniknąć perforacji (4–5 cm od odbytu).</li>
	<li>Kolonoskopia diagnostyczna
	<ol>
		<li>Zbadaj błonę śluzową pod kątem zmian zapalnych lub złośliwych, jednocześnie odciągając endoskop. Odciągnij się powoli, aby ocenić cały obwód jelita. Oceń patologie śródświetlne przy użyciu odpowiednich, ustalonych systemów punktacji, zgodnie z wymaganiami.</li>
		<li>Aby zagwarantować identyczną pozycję endoskopową do uzyskania obrazu podczas powtarzających się wizualizacji obszarów rany, należy zwrócić uwagę na odległość między mysim odbytem a zmianą błony śluzowej. Ponadto należy użyć końcówki kleszczyków biopsyjnych jako elementu dystansowego, aby uzyskać identyczną odległość między endoskopem a obszarem rany podczas pozyskiwania obrazu. Rozmiar rany jest związany z rozmiarem osłonki endoskopu, która składa się z 3 mm. 
		UWAGA: Umieść endoskop w identycznej pozycji poprzez porównanie optyczne z dokumentacją zdjęciową poprzednich badań. Zmierz zmiany pod tym samym kątem i w tej samej odległości przy każdym kontrolnym badaniu endoskopowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura biopsji
	<ol>
		<li>Wykonaj biopsje z pomocą dwóch badaczy. Ostrożnie wprowadzić kleszcze do biopsji przez kanał roboczy, aż końcówka kleszczy będzie widoczna na monitorze dla drugiego badacza. Ostrożnie otwieraj i zamykaj kleszcze, aby uniknąć perforacji.</li>
		<li>Przenieś kleszcze na miejsce patologii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura iniekcji
	<ol>
		<li>Wykonaj procedurę iniekcji z pomocą dwóch badaczy. Wstępnie napełnij elastyczną rurkę iniekcyjną (0,96 mm) całkowicie podawanym środkiem. Przepchnij rurkę przez kanał roboczy, aż kaniula (30 G) będzie widoczna na monitorze dla drugiego badacza. Przygotować cienką strzykawkę i delikatnie podać żądaną ilość środka diagnostycznego lub terapeutycznego. Objętość iniekcji powinna wynosić maksymalnie 50 μl.</li>
		<li>Włóż igłę do submocosy pod kątem 15–30 stopni. Skieruj skos w kierunku błony śluzowej. Błona śluzowa wykazuje charakterystyczny objaw liftingu po udanym wstrzyknięciu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Endoskopia fluorescencyjna (FE)
	<ol>
		<li>Przed fluorescencyjnym badaniem endoskopowym podać 60 mg dekstranu sprzężonego z FITC rozcieńczonego w 100 μl PBS.</li>
		<li>Sprawdź optymalny punkt czasowy między wstrzyknięciem znacznika znakowanego fluorescencyjnie a procedurą obrazowania, która jest zależna od farmakologii znacznika. Skonfiguruj ustawienia systemu filtrów pasmowo-przepustowych zgodnie z długością fali wzbudzenia i emisji zastosowanego znacznika. Wykonaj endoskopię fluorescencyjną w celu uzyskania niespecyficznych znaczników objętości krwi (np. FITC) natychmiast po dożylnym wstrzyknięciu barwnika fluorescencyjnego, aby ocenić wzór naczyniowy powierzchni błony śluzowej.</li>
		<li>Rozważ obrazowanie kilka godzin po zastosowaniu znacznika w przypadku ukierunkowanych znaczników lub "inteligentnych sond", aby zapewnić lepszy stosunek celu do tła.</li>
		<li>Wykonaj dokumentację fotograficzną i filmową wyników.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Po kolonoskopii
<ol>
	<li>Oddziel mysz w pustej klatce i połóż ją na ręczniku papierowym, aby chronić mysz przed zasysaniem ściółki. Ogrzej mysz lampą czerwonego światła, aby zapobiec hipotermii. Obserwuj mysz i nie pozostawiaj jej bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej świadomości, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Gdy będziesz całkowicie świadomy, umieść mysz z powrotem w odpowiedniej klatce.</li>
	<li>Pod koniec eksperymentu umieść mysz w małym, ale szczelnym pudełku i podaj CO2 (100% (v/v), 100 vol%, 3 l/min). Poczekaj, aż mysz straci całkowitą przytomność i przestanie oddychać. Wyślij mysz przez złamanie szyi. Wykonaj laparotomię brzuszną i eksplantację jelita grubego. Otwórz okrężnicę wzdłużnie i umyj ją w celu dalszej oceny histologicznej lub molekularnej.</li>
</ol>

<ol><li>Bettenworth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+18F-FDG+PET%2FCT+imaging+to+monitor+lesion+activity+in+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+nuclear+medicine+%3A+official+publication%2C+Society+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation.</a> Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 54, 748-755 (2013).</li>
<li>Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+animal+imaging.+current+technology+and+perspectives+for+oncological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging.</a> European journal of cancer. 38, 2173-2188 (2002).</li>
<li>Huang, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonoscopy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+endoscopy%22%5BJournal%5D)">Colonoscopy in mice.</a> Surgical endoscopy. 16, 22-24 (2002).</li>
<li>Becker, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+colitis+and+colon+cancer+development+in+mice+using+high+resolution+chromoendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of colitis and colon cancer development in mice using high resolution chromoendoscopy.</a> Gut. 54, 950-954 (2005).</li>
<li>Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+colonoscopy+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">High resolution colonoscopy in live mice.</a> Nature protocols. 1, 2900-2904 (2006).</li>
<li>Neurath, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+tumor+development+and+wound+healing+using+endoscopic+techniques+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice.</a> Gastroenterology. 139, 1837-1843 (2010).</li>
<li>Pickert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+links+IL-22+signaling+in+intestinal+epithelial+cells+to+mucosal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">STAT3 links IL-22 signaling in intestinal epithelial cells to mucosal wound healing.</a> The Journal of experimental medicine. 206, 1465-1472 (2009).</li>
<li>Shapira, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+murine+laparoscopy+for+continuous+in-vivo+assessment+of+the+liver+in+multiple+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+one%22%5BJournal%5D)">Utilization of murine laparoscopy for continuous in-vivo assessment of the liver in multiple disease models.</a> Plos one. 4, e4776(2009).</li>
<li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature protocols. 2, 541-546 (2007).</li>
<li>Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+mouse+model+of+colon+carcinogenesis+for+the+analysis+of+sporadic+and+inflammation-driven+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression.</a> Nature protocols. 2, 1998-2004 (2007).</li>
<li>Dieleman, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+experimental+colitis+induced+by+dextran+sulphate+sodium+%28DSS%29+is+characterized+by+Th1+and+Th2+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+experimental+immunology%22%5BJournal%5D)">Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines.</a> Clinical and experimental immunology. 114, 385-391 (1998).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colitis-accelerated+colorectal+cancer+and+metabolic+dysregulation+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Colitis-accelerated colorectal cancer and metabolic dysregulation in a mouse model.</a> Carcinogenesis. 34, 1861-1869 (2013).</li>
<li>Foersch, S., Neufert, C., Neurath, M. F., Waldner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endomicroscopic+Imaging+of+COX-2+Activity+in+Murine+Sporadic+and+Colitis-Associated+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+and+therapeutic+endoscopy%22%5BJournal%5D)">Endomicroscopic Imaging of COX-2 Activity in Murine Sporadic and Colitis-Associated Colorectal Cancer.</a> Diagnostic and therapeutic endoscopy. 2013, 250641(2013).</li>
<li>Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical-based+molecular+imaging%3A+contrast+agents+and+potential+medical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22European+radiology%22%5BJournal%5D)">Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications.</a> European radiology. 13, 231-243 (2003).</li>
<li>Keller, R., Winde, G., Terpe, H. J., Foerster, E. C., Domschke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+endoscopy+using+a+fluorescein-labeled+monoclonal+antibody+against+carcinoembryonic+antigen+in+patients+with+colorectal+carcinoma+and+adenoma%5BTitle%5D)+AND+%22Endoscopy%22%5BJournal%5D)">Fluorescence endoscopy using a fluorescein-labeled monoclonal antibody against carcinoembryonic antigen in patients with colorectal carcinoma and adenoma.</a> Endoscopy. 34, 801-807 (2002).</li>
<li>Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+mucosal+regeneration%3A+role+of+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+bioscience+%3A+a+journal+and+virtual+library%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors.</a> Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 4, 303-309 (1999).</li>
<li>Mertz, H. R., Walsh, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptic+ulcer+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Medical+clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Peptic ulcer pathophysiology.</a> The Medical clinics of North America. 75, 799-814 (1991).</li>
<li>Pantelis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+sealing+with+a+fixed+combination+of+collagen+matrix-bound+coagulation+factors+on+the+healing+of+colonic+anastomoses+in+experimental+high-risk+mice+models%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbeck%27s+archives+of+surgery+%2F+Deutsche+Gesellschaft+fur+Chirurgie%22%5BJournal%5D)">The effect of sealing with a fixed combination of collagen matrix-bound coagulation factors on the healing of colonic anastomoses in experimental high-risk mice models.</a> Langenbeck's archives of surgery / Deutsche Gesellschaft fur Chirurgie. 395, 1039-1048 (2010).</li>
<li>Burk, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+factor+from+a+transformed+cell+line+that+affects+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A factor from a transformed cell line that affects cell migration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70, 369-372 (1973).</li>
<li>Msaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+RelA+%28p65%29+threonine+505+phosphorylation+in+the+regulation+of+cell+growth%2C+survival%2C+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">The role of RelA (p65) threonine 505 phosphorylation in the regulation of cell growth, survival, and migration.</a> Molecular biology of the cell. 22, 3032-3040 (2011).</li>
<li>Zigmond, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+murine+colonoscopy+for+orthotopic+implantation+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Utilization of murine colonoscopy for orthotopic implantation of colorectal cancer.</a> PloS one. 6, e28858(2011).</li>
<li>Foersch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+VEGF+in+gastrointestinal+cancer+in+vivo+using+confocal+laser+endomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of VEGF in gastrointestinal cancer in vivo using confocal laser endomicroscopy.</a> Gut. 59, 1046-1055 (2010).</li>
<li>Mitsunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+endoscopic+detection+of+murine+colitis-associated+colon+cancer+by+topically+applied+enzymatically+rapid-activatable+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Fluorescence endoscopic detection of murine colitis-associated colon cancer by topically applied enzymatically rapid-activatable probe.</a> Gut. 62, 1179-1186 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Gojenie się ran nabłonkowych jest procesem ciągłym. Następuje ciągłe fizjologiczne złuszczanie komórek powierzchniowych w obrębie błony śluzowej przewodu pokarmowego, co wymaga częstej regeneracji komórek nabłonka 16. W związku z tym upośledzone gojenie się ran ma ogromny wpływ na wiele chorób, w tym wrzody przewodu pokarmowego i 17 nieszczelność zespolenia 18. Ocena tła molekularnego, jak również potencjalnych kandydatów na leki stymulujące gojenie nabłonka, może być przeprowadzona tylko...

Modele zwierzęce znacznie wzbogaciły nasze zrozumienie licznych patologii jelitowych. Mysz laboratoryjna (Mus musculus) stała się głównym modelem zwierzęcym w badaniach biomedycznych ze względu na obfitość informacji genetycznych i genomicznych i jest łatwo dostępna w szczepach transgenicznych i nokautowych. Oprócz lepszego zrozumienia patogenezy chorób, modele zwierzęce są również wykorzystywane do testowania kandydatów na leki, a także do przedklinicznych interwencji diagnostycznych lub terapeutycznych. Jednak pomimo różnorodności modeli mysich naśladujących chorobę ludzką, wiele opcji diagnostycznych i interwencyjnych, które są rutynowo stosowane w opiece nad pacjentem, nie jest dostępnych dla myszy. W związku z tym strategie nadzoru mające na celu monitorowanie przebiegu choroby mysiej lub skutków interwencji terapeutycznych są często ograniczone do pośrednich obserwacji lub analiz pośmiertnych. Chociaż istnieją nieinwazyjne procedury monitorowania żywotności myszy, takie jak wskaźniki aktywności choroby, kwantyfikacja utraty lub przyrostu masy ciała, analizy krwi, moczu i kału, są to tylko wskaźniki pośrednie i są obciążone zmiennością międzyosobniczą. Ponadto analizy pośmiertne zapobiegają obserwacjom podłużnym w powtarzających się punktach czasowych. Zaawansowane techniki obrazowania do monitorowania aktywności choroby u myszy zostały wprowadzone dopiero niedawno 1,2. Chociaż te techniki obrazowania pozwalają na powtarzalne analizy, zapewniają jedynie opisowy i często nieprecyzyjny obraz jelit, nie umożliwiają bezpośredniej wizualizacji błony śluzowej ani nie umożliwiają interwencji diagnostycznych lub terapeutycznych, takich jak pobieranie biopsji lub miejscowe i dośluzówkowe stosowanie kandydatów na leki.
Ostatnio opracowano systemy endoskopowe o wysokiej rozdzielczości do stosowania u żywych myszy 3,4. Po raz pierwszy te techniki endoskopowe umożliwiają bezpośrednią wizualizację patologii choroby jelita grubego, takich jak gojenie się ran lub zapalenie jelit, zapewniając obiektywny stan w czasie rzeczywistym, umożliwiając badania podłużne na tym samym zwierzęciu w powtarzających się punktach czasowych. Oprócz umożliwienia wielokrotnych biopsji u pojedynczej myszy, systemy endoskopowe mogą być również stosowane do terapeutycznego wpływania na odrębny guz lub zlokalizowany stan zapalny poprzez umożliwienie bezpośredniego zastosowania substancji w obszarze zainteresowania. Ponadto, ponieważ substancje terapeutyczne i kontrolne mogą być dostarczane bezpośrednio do obszaru zainteresowania, można to zrobić za pomocą tej samej myszy, z wyłączeniem zmienności międzyosobniczej. Systemy te zostały obecnie wykorzystane do oceny stanu zapalnego jelita grubego, gojenia się ran, laparoskopowych biopsji wątroby i ortotopowej indukcji guzów wątroby 8 i rozwoju guza przy użyciu różnych systemów punktacji, takich jak mysi endoskopowy wskaźnik nasilenia zapalenia jelita grubego (MEICS) 5-7. MEICS składa się z pięciu parametrów do oceny stanu zapalnego: pogrubienie ściany jelita grubego, zmiany wzoru naczyniowego, obecność fibryny, ziarnistość powierzchni błony śluzowej i konsystencja stolca.
W tym protokole opisujemy zastosowanie sztywnej endoskopii w mysich modelach gojenia się ran jelitowych, stanów zapalnych i raka jelita grubego. Po pierwsze, pokazujemy endoskopową ocenę gojenia się ran i zapalenia okrężnicy, a także podłużną ocenę aktywności zapalenia jelita grubego i badanie rakogenezy w jelicie grubym. Poza opisowym zastosowaniem endoskopii mysiej podajemy szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z oprzyrządowania endoskopowego do uzyskiwania biopsji oraz miejscowego i dośluzówkowego stosowania różnych składników będących przedmiotem zainteresowania (np. kandydatów na leki lub komórek nowotworowych). Na koniec demonstrujemy zastosowanie mysiej endoskopii fluorescencyjnej, która wykorzystuje wyrafinowane techniki obrazowania molekularnego, w leczeniu guzów jelita grubego.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynniki</td></tr><tr><td>Dieta bez lucerny</td><td>Harlan Laboritories, Madison, USA</td><td>2014</td><td></td></tr><tr><td>Azoksymetan (AOM)</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Niemcy</td><td>A5486</td><td></td></tr><tr><td>Maść do oczu Bepanthen</td><td>Bayer, Leverkusen, Niemcy</td><td>80469764</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan dekstranu sodu (DSS)</td><td>TdB Konsulatancje, Uppsala, Szwecja</td><td>DB001</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Niemcy</td><td>E 4382</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Niemcy</td><td>E 9884</td><td></td></tr><tr><td>Probówka Falcon 50 ml</td><td>BD Biosciences, Erembodegem, Belgia</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Florene 100 V/V</td><td>Abbott, Wiesbaden, Niemcy</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>Haematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Niemcy</td><td>HHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>Izopentan (2-metylobutan)</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Niemcy</td><td>M32631-1L</td><td></td></tr><tr><td>Błękit metylenowy</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>1159430025</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Tissue Tek compound&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sakura, Zoeterwonde, Holandia</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Omnican F - canula</td><td>Braun, Melsungen, Niemcy</td><td>9161502</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, PBS</td><td>Lonza, Verviers, Belgia</td><td>4629</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu 0,9%</td><td>Braun, Melsungen, Niemcy</td><td>5/12211095/0411</td><td></td></tr><tr><td>Dieta standardowa</td><td>Altromin, Lage, Niemcy</td><td>1320</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, Leiden, Holandia</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Vitro &ndash; Clud&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>R. Langenbrinck, Teningen, Niemcy</td><td>04-0002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Sprzęt</td></tr><tr><td>AIDA Control</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Niemcy</td><td>20 096020</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy</td><td>Semrock, Rochester, Stany Zjednoczone</td><td>HC 716/40</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy</td><td>Semrock, Rochester, Stany Zjednoczone</td><td>HC 809/81</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do biopsji, 3 Fr., 28 cm</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Niemcy</td><td>61071ZJ</td><td></td></tr><tr><td>Dell Monitor</td><td>Dell, Frankfurt nad Menem, Niemcy</td><td>U2412Mb</td><td></td></tr><tr><td>Osłona egzaminacyjna, 9 Fr.Karl</td> <td>Storz - Endoskope, Tuttlingen, Niemcy</td><td>61029D</td><td></td></tr><tr><td>Osłona egzaminacyjna, 9 Fr.Karl</td> <td>Storz - Endoskope, Tuttlingen, Niemcy</td> światłowodowy <td>61029C</td><td></td></tr><tr><td>, 3.5 mm</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Niemcy</td><td>69495NL</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Blue System filtracyjny</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Niemcy</td><td>20100032</td><td></td></tr><tr><td>Filtr barierowy fluoresceinowy</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Niemcy</td><td>20100033</td><td></td></tr><tr><td>Przełącznik nożny</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Niemcy</td><td>20010430</td><td></td></tr><tr><td>Teleskop HOPKINS, 1,9 mm, długość 10 cm</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Niemcy</td><td>1830231</td><td></td></tr><tr><td>SCB D-light P&nbsp;</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Niemcy</td><td>20 133720</td><td></td></tr><tr><td>SCB tricam SL II</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Niemcy</td><td>20 2230 20</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw przewodów VETPUMP II</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Niemcy</td><td>69811</td><td></td></tr><tr><td>Tricam PDD PAL</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Niemcy</td><td>20221037</td><td></td></tr><tr><td>UniVet Porta</td><td>Groppler Medizintechnik, Deggendorf, Niemcy</td><td>BKGM 0451</td><td></td></tr><tr><td>Vetpump 2</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Niemcy</td><td>69321620</td><td></td></tr></tbody></table>

endoskopia mysia do multimodalnego obrazowania in vivo kancerogenezy i oceny gojenia się ran jelitowych i stanów zapalnych

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Modele mysie są powszechnie używane do badania patogenezy chorób człowieka oraz do oceny procedur diagnostycznych, jak również interwencji terapeutycznych przedklinicznie. Jednak prawidłowa ocena zmian patologicznych często wymaga analizy histologicznej, a gdy jest wykonywana ex vivo, wymaga śmierci zwierzęcia. Dlatego w konwencjonalnych warunkach eksperymentalnych rzadko możliwe są wewnątrzindywidualne badania kontrolne. W ten sposób rozwój endoskopii mysiej u żywych myszy umożliwia badaczom po raz pierwszy zarówno bezpośrednią wizualizację błony śluzowej przewodu pokarmowego, jak i powtórzenie procedury w celu monitorowania zmian. Istnieje wiele zastosowań endoskopii mysiej in vivo, w tym badanie stanów zapalnych jelit lub gojenia się ran, wielokrotne wykonywanie biopsji błony śluzowej oraz miejscowe podawanie środków diagnostycznych lub terapeutycznych za pomocą miniaturowych cewników iniekcyjnych. Ostatnio obrazowanie molekularne rozszerzyło możliwości obrazowania diagnostycznego, umożliwiając specyficzne wykrywanie różnych cząsteczek docelowych za pomocą specjalnych fotosond. Podsumowując, endoskopia mysia stała się nowatorską, najnowocześniejszą technologią diagnostycznego eksperymentalnego obrazowania in vivo i może znacząco wpłynąć na badania przedkliniczne w różnych dziedzinach.

In vivo monitorowanie gojenia ran jelitowych 
Podczas rutynowej endoskopii rany błony śluzowej indukowano mechanicznie za pomocą miniaturowych kleszczyków biopsyjnych o średnicy 3 French (równowartość 1 mm; Rycina 1A). Następnie gojenie ran monitorowano poprzez codzienne badania endoskopowe, a następnie ilościowo określano poprzez pomiar pozostałej powierzchni rany z wykorzystaniem oprogramowania do edycji obrazów, np. ImageJ (Rycina 1B</stro...

Techniki obrazowania małych zwierząt pozwalają na seryjne badania diagnostyczne i interwencje terapeutyczne in vivo. W ostatnim czasie zakres zastosowań znacznie się poszerzył i obecnie obejmuje ocenę rozwoju guza jelita grubego, gojenie się ran oraz monitorowanie stanu zapalnego. Protokół ten ilustruje te różnorodne potencjalne zastosowania endoskopii mysiej skóry.

Endoskopia mysia do multimodalnego obrazowania in vivo kancerogenezy i oceny gojenia się ran jelitowych i stanów zapalnych

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

W tym filmie zostaną zaprezentowane różne zastosowania endoskopii neuronów w pierwszym zastosowaniu. Jak używać endoskopu do oceny nasilenia choroby w mysim modelu zapalenia jelita grubego, zostanie pokazane w drugiej aplikacji. Zastosowanie endoskopii do monitorowania gojenia się ran błony śluzowej in vivo zostanie zademonstrowane w ostatniej aplikacji.Zastosowanie endoskopii fluorescencyjnej do wykrywania nowotworów jelita oraz technika wstrzykiwania środków dośluzówkowych zostanie ostatecznie przedstawiona w procesie gojenia się ran jelitowych, stanów zapalnych i raka. Agenezję można ocenić na podstawie wyników analizy endoskopowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza histologiczna eksperymentalnego zapalenia jelita grubego, jest to, że dzięki niej można wykonywać indywidualne badania kontrolne i powtarzalnie oceniać zmiany w błonie śluzowej.Dlatego metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie eksperymentalnego zapalenia jelit, takie jak to, co jest czasowym ustaleniem zapalenia jelita grubego. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię raka jelita grubego ze względu na możliwość funkcjonalnego scharakt

murine-endoscopy-for-vivo-multimodal-imaging-carcinogenesis

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Pooperacyjny niedrożność jelit (POI) jest powikłaniem operacji w obrębie jamy brzusznej, prowadzącym do zwiększonej zachorowalności i przedłużonego pobytu w szpitalu. Ze względu na brak strategii profilaktycznych lub terapeutycznych konieczne są intensywne badania. W związku z tym opracowaliśmy zstandaryzowany i wykonalny model mysi, aby zbadać patofizjologię POI oraz przestudiować potencjalne opcje terapeutyczne.

Funkcjonalna ocena motywności jelit i stanu zapalnego ściany jelita u gryzoni: analizy w zestandaryzowanym modelu manipulacji jelitowej

W ciągu ostatnich kilku lat, endoskopy nowej generacji stały się ważnymi diagnostycznymi pomocami badawczymi do oceny mysiego zapalenia jelita grubego i guzów jelita grubego. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół endoskopowej oceny stanu zapalnego i guzów jelita grubego u myszy, a także nowatorski system punktacji, który wykorzystuje identyfikatory dziesiętne do dokumentowania endoskopowego nasilenia zapalenia jelita grubego i guzów jelita grubego.

Elastyczna kolonoskopia u myszy w celu oceny ciężkości zapalenia jelita grubego i guzów jelita grubego przy użyciu zwalidowanego systemu punktacji endoskopowej

Używając transgenicznych myszy reporterowych i wstrzykiwanych znaczników fluorescencyjnych, długoterminowa mikroskopia konfokalna z wirującym dyskiem umożliwia bezpośrednią wizualizację zachowania komórek szpikowych w gruczolaku jelitowym w modelu raka jelita grubego ApcMin/+.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki komórek szpikowych w guzach jelita ApcMin/+ za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem

Opisujemy metody długotrwałego monitorowania skuteczności terapii w leczeniu patologii jelita grubego u myszy za pomocą sztywnego endoskopu. Protokół ten może być z łatwością wykorzystany do scharakteryzowania odpowiedzi terapeutycznej pojedynczego guza u żywych myszy, a także do monitorowania potencjalnego nawrotu choroby.

Nieinwazyjna ocena skuteczności nowych terapii patologii jelitowych za pomocą seryjnego obrazowania endoskopowego żywych myszy

Opisano montaż i użycie multimodalnego mikroendoskopu, który może rejestrować dane obrazu tkanek powierzchownych z parametrami fizjologicznymi tkanek, w tym stężeniem hemoglobiny, stężeniem melaniny i nasyceniem tlenem. Technika ta może być przydatna do oceny struktury tkanki i perfuzji oraz może być zoptymalizowana pod kątem indywidualnych potrzeb badacza.

Multimodalna platforma obrazowania i spektroskopii mikroendoskopii z wiązkami włókien do nieinwazyjnej analizy tkanek in vivo

Sondy specyficzne dla celu stanowią innowacyjne narzędzie do analizy mechanizmów molekularnych, takich jak ekspresja białek w różnych typach chorób (np. zapaleniu, infekcji i nowotworzenia). W tym badaniu opisano ilościową trójwymiarową ocenę tomograficzną infiltracji makrofagów jelitowych w mysim modelu zapalenia jelita grubego przy użyciu tomografii fluorescencyjnej specyficznej dla F4 / 80.

Tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami

Tutaj prezentujemy protokół do ustalenia ważnych punktów końcowych i markerów proliferacyjnych uszkodzenia jelita cienkiego i hiperproliferacji kompensacyjnej przy użyciu modelu zapalenia błony śluzowej wywołanego chemioterapią. Demonstrujemy wykrywanie proliferujących komórek za pomocą markera specyficznego dla cyklu komórkowego i przy użyciu masy jelita cienkiego, głębokości krypty i wysokości kosmków jako punktów końcowych.

Ważne punkty końcowe i markery proliferacyjne do oceny uszkodzenia jelita cienkiego i adaptacji przy użyciu mysiego modelu zapalenia błony śluzowej wywołanego chemioterapią

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Tutaj podajemy szczegółowy opis procedury wywoływania biopsji szczypanych pod kontrolą kolonoskopii u myszy i śledzenia zamykania ran w czasie rzeczywistym. Dodatkowo przedstawiono metody przygotowania tkanek do analiz histologicznych, immunohistochemicznych i molekularnych łożyska rany.

Wykonywanie biopsji szczyptowych pod kontrolą kolonoskopową u myszy i ocena późniejszych zmian w tkankach

Tutaj prezentujemy metodę uzyskiwania obrazów jelita po zranieniu wywołanym laserem. Poprzez wystawienie jelita myszy na działanie lasera wielofotonowego, utrata jednej lub wielu krypt jest indukowana lokalnie. Poprzez wielokrotne obrazowanie uszkodzonego obszaru przez miesiące, uchwycona jest dynamika regeneracji jelit w czasie rzeczywistym.

Ablacja laserowa i mikroskopia przyżyteczna w celu zbadania przebudowy jelit

Poznaj endoskopię mysią do multimodalnego obrazowania kancerogenezy i oceny gojenia ran jelitowych. Ta metoda umożliwia szeregowe badania oraz interwencje terapeutyczne u myszy.

Endoskopia mysia do multimodalnego obrazowania in vivo kancerogenezy i oceny gojenia się ran jelitowych i stanów zapalnych

Przeglądaj więcej filmów