Name: Immunodetekcja białek błony zewnętrznej za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych mitochondriów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Poznaj metodę immunodetekcji białek błony zewnętrznej mitochondriów izolowanych z rdzenia kręgowego szczura przy użyciu cytometrii przepływowej. Ta technika umożliwia jednoczesną analizę funkcji mitochondrialnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Laurie Destroismaisons i Sarah Peyrard za znakomite wsparcie techniczne oraz Dr.Alexandre Prat za dostęp do cytometru przepływowego. Chcielibyśmy również podziękować dr Timothy'emu Millerowi za jego wkład w usuwanie mieliny z preparatów. Prace te były wspierane przez Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem (CIHR) Partnerstwo Badań Nerwowo-Mięśniowych, Kanadyjską Fundację Innowacji, Kanadyjskie Towarzystwo ALS, Fundację Fricka na rzecz Badań nad ALS, Fundację CHUM oraz Fonds de la Recherche en Santé du Québec (C.V.V.). Zarówno C.V.V., jak i N.A. są stypendystami Fonds de la Recherche en Santé du Québec i CIHR New Investigators. S.P. jest wspierany przez stypendium Tima Noëla z ALS Society of Canada.

Zwierzęta wykorzystane w niniejszym badaniu były traktowane w ścisłej zgodności z protokołem (N08001CVsr) zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet Ochrony Zwierząt Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal (CRCHUM), który stosuje standardy krajowe określone przez Kanadyjską Radę ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC).
Przygotuj wszystkie odczynniki wymagane do przeprowadzenia tego protokołu (Tabela 1). Wszystkie pozostałe szczegóły dotyczące sprzętu, materiałów i dostawców znajdują się w Liście Materiałów.
<img alt="Składy buforów do eksperymentów; tabela ze szczegółami i uwagami dotyczącymi HB, HB+KCL oraz buforu M." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51887/51887table1.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Składy buforów.
1. Pobieranie rdzenia kręgowego szczura
<ol>
	<li>Głęboko znieczul szczura (rasy Sprague Dawley) przy użyciu 4% izofluranu. Potwierdź znieczulenie, sprawdzając brak odruchu po uciśnięciu przedniej łapy. Uśmierć szczura poprzez gilotynowanie. Ta metoda eutanazji jest preferowana nad innymi, które mogłyby zdeformować rdzeń kręgowy.</li>
	<li>Nacinij skórę na grzbiecie, aby odsłonić kręgosłup. Przetnij kręgosłup nożyczkami do kości tuż powyżej kości miednicy. Zlokalizuj otwór w kanale kręgowym.</li>
	<li>Wprowadź do kanału kręgowego strzykawkę o pojemności 10 ml z dołączonym końcem pipety 200 µl (przymocowanym poprzez lekkie stopienie nad płomieniem), wypełnioną solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS).</li>
	<li>Wypłucz rdzeń kręgowy, wywierając umiarkowany nacisk na tłok strzykawki.</li>
	<li>Jeśli na rdzeniu kręgowym znajduje się krew, przepłucz go PBS przed przejściem do następnego kroku. 
	UWAGA: Metoda ta została zwalidowana również dla mózgu i wątroby. W przypadku pobierania tych tkanek, pobierz połowę mózgu z uśmierconego szczura oraz fragment wątroby o masie równej masie rdzenia kręgowego. Wszystkie pozostałe kroki pozostają bez zmian.</li>
</ol>
2. Izolacja mitochondriów z rdzenia kręgowego (na podstawie Vande Velde et al. 4)
<ol>
	<li>Pobrać cały, nienaruszony rdzeń kręgowy i umieścić go w szklanym homogenizatorze o pojemności 5 ml z 5 objętościami (~3,25 ml) buforu do homogenizacji (HB). Aby zapewnić optymalną odzyskiwalność wyizolowanych mitochondriów, wszystkie etapy należy przeprowadzać w lodzie lub w pomieszczeniu chłodniczym. Homogenizować tkankę ręcznie, aż do całkowitego rozdrobnienia dużych fragmentów, wykonując około ośmiu pociągnięć. Homogenizat przenieść do dwóch probówek do mikrocentryfugi (2 ml) lub trzech (1,7 ml). Wirować z prędkością 1 300 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C w mikrocentryfudze laboratoryjnej.</li>
	<li> zebrać nadsącz i przenieść go do probówki do ultrawirowania o pojemności 5 ml. Do probówki z osadem dodać 750 µl (~0,5 objętości) HB i delikatnie resuspendować osad. Kroki wirowania i resuspensji powtórzyć jeszcze dwukrotnie. Wszystkie nadsącze (S1a i S1b) połączyć w tej samej probówce do ultrawirowania o pojemności 5 ml. Ten etap służy do usunięcia drobnych zanieczyszczeń.</li>
	<li>Połączone S1 wirować w ultrawirowarce wyposażonej w rotor z koszyczkami odchylanymi przy 17 000 × g przez 15 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Nadsącz (S2) zachować do dalszej obróbki, jeśli frakcja cytozolowa jest przedmiotem zainteresowania (np. do analizy Western blot). Osad (P2), będący surową frakcją mitochondrialną, resuspendować w 4 ml HB+50 mM KCl. Wirować przy 17 000 × g przez 15 min w temperaturze 4 °C w rotorze z koszyczkami odchylanymi. Odrzucić nadsącz i delikatnie resuspendować osad (P3) w 800 µl HB. 
	UWAGA: Mitochondria są płukane buforem HB+50 mM KCl w celu usunięcia niespecyficznych zanieczyszczeń związanych z mitochondriami.</li>
	<li>Do nowej probówki do ultrawirowania o pojemności 5 ml dodać dokładnie 800 µl resuspendowanego osadu (P3).</li>
	<li>Do probówki dodać 200 µl Iodixonolu (medium do gradientu gęstości), tworząc tym samym stężenie końcowe 12% Iodixonolu. Zawartość probówki wymieszać delikatnie, ale dokładnie za pomocą pipety P1000. W celu ułatwienia dokładnego wymieszania może być korzystniejsze dodanie najpierw Iodixonolu, a następnie resuspendowanego osadu (P3). Wirować w ultrawirowarce wyposażonej w rotor z koszyczkami odchylanymi przy 17 000 × g przez 15 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>UWAGA: Wątroba nie zawiera mieliny, dlatego ten etap nie jest konieczny, jeśli przetwarzana jest tylko wątroba. Jeśli jednak wątroba jest przetwarzana równolegle z mitochondriami OUN, zaleca się traktowanie wszystkich tkanek w ten sam sposób.</li>
	<li>Odssać warstwę mieliny z górnej części probówki, a następnie ostrożnie usunąć i odrzucić nadsącz. Osad może być luźny. Resuspendować osad w 4 ml HB. Ponownie wirować przy 17 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Odrzucić nadsącz i resuspendować osad w 4 ml HB. Powtórzyć wirowanie i usunąć nadsącz.</li>
	<li>Końcowy osad (P7) resuspendować w 100-200 µl HB i przenieść do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml. Próbka ta zawiera wyizolowane mitochondria.</li>
	<li>Przejść do kwantyfikacji białka. Próbki oraz krzywą wzorcową rozcieńczyć w 2% dodecylosiarczanie sodu (SDS), aby zapewnić odpowiednią solubilizację mitochondriów podczas kwantyfikacji białka.</li>
</ol>
3. Immunoznakowanie wyizolowanych mitochondriów do cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Dla każdej mieszaniny barwiącej poddawanej badaniu, nanieś pipetą 25 µg izolowanych mitochondriów do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml. W każdym eksperymencie należy uwzględnić próbkę niezbarwioną; a w przypadku każdego przeciwciała należy upewnić się, że dołączono próbkę dla odpowiedniej kontroli izotypowej.</li>
	<li>Wiruj przy 17 000 x g przez 2 min w temperaturze 4 °C w mikrocentryfugę laboratoryjną.</li>
	<li>Usunąć supernatant i zawiesić wyizolowane mitochondria w 50 µl bufor mitochondrialny (bufor M) uzupełniony o 10% BSA wolnej od kwasów tłuszczowych przez 15 min w 4 °C (etap blokowania). 
	UWAGA: Podczas znakowania inkubacje należy prowadzić w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodaj przeciwciało pierwszorzędowe (królicze anty-Mfn2, 20 µg na ml) do probówki i inkubować przez 30 min w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Optymalne stężenie każdego przeciwciała należy określić empirycznie poprzez miareczkowanie. Ze względu na zmienność stężenia i/lub czystości, różne partie tego samego przeciwciała od tego samego producenta mogą prowadzić do różnych wyników; w związku z tym miareczkowanie jest konieczne dla każdej nowej partii przeciwciał.</li>
	<li>Wypłukanie nieprzypisanego przeciwciała pierwszorzędowego: Wirować przy 17 000 x g przez 2 min w 4 °CUsuń nadosad i delikatnie resuspender osad w 200 µl Bufor M. Wirować przy 17 000 x g przez 2 min w temp. 4 °CUsuń nadsącz i resuspenduj osad w 50 µl Bufor M.</li>
	<li>Dodaj przeciwciało wtórne (anty-królicze IgG z osła z fikoerytryną (PE), 0.5 µg na ml) do probówki i inkubować próbki przez 30 min w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Wypłukanie nieprzypisanego przeciwciała wtórnego: Wirowanie przy 17 000 x g przez 2 min w temperaturze 4 °COdciąć supernatant i resuspendować osad w 200 µl Bufor M. Wirować przy 17 000 x g przez 2 min w temp. 4 °COdessać supernatant i resuspender osad w 500 µl Bufor M.</li>
	<li>Aby upewnić się, że analizowane zdarzenia są rzeczywiście mitochondriami, należy zabarwić wyizolowane mitochondria specyficznym fluorescencyjnym barwnikiem mitochondrialnym przez 15 min w temperaturze pokojowej, w ciemności. Jeśli planowane jest barwienie innych parametrów funkcjonalnych (potencjału błony mitochondrialnej lub produkcji anionów ponadtlenkowych), należy przejść do kroku 4. W przeciwnym razie należy przejść do kroku 5 w celu akwizycji danych. 
	UWAGA: Należy upewnić się, że widmo emisji przeciwciała wtórnego jest zgodne z widmem barwników funkcjonalnych. Na przykład, w przypadku weryfikacji czystości mitochondriów za pomocą komercyjnego barwnika o właściwościach spektralnych podobnych do FITC oraz pomiaru potencjału błony za pomocą estru metylowego tetrametylorodaminy (TMRM), odpowiednim przeciwciałem wtórnym byłaby allofikocyjanina (APC: Ex 650 nm/Em 660 nm). Należy dodać kontrole kompensacji, t.j. próbkę immunoznakowaną lub barwioną pojedynczym fluoroforem, jeśli dotyczy.</li>
	<li>Przenieś próbkę do probówki odpowiedniej do załadunku do cytometru przepływowego. (Aby ułatwić pracę z małą objętością próbki, probówkę do mikropłytek umieszcza się wewnątrz probówki do cytometrii przepływowej o pojemności 3 ml). Próbki należy przechowywać w lodzie i niezwłocznie przekazać do cytometru przepływowego w celu akwizycji danych.</li>
</ol>
4. Pomiar potencjału błony mitochondrialnej i produkcji anionorodnika supertlenkowego w mitochondriach za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>W kroku 3.8 zweryfikuj, czy izolowane mitochondria posiadają nienaruszony potencjał błonowy, barwiąc je 100 nM TMRM (Ex 548 nm/Em 574 nm)5 przez 15 min w temperaturze pokojowej (RT), w ciemności. Do porównywania potencjału błonowego między próbkami i populacjami bardziej odpowiednie może być zastosowanie niższych, niegaszących stężeń TMRM (od 1 do 30 nM)6.
	<ol>
		<li>Jako kontrolę barwienia TMRM, zabarw izolowane mitochondria 100 nM TMRM w obecności 100 µM cyjanorku karbonylowego m-chlorofenylhydrazyny (CCCP), będącego odsprzęgaczem mitochondrialnym, który powoduje depolaryzację mitochondriów. Stężenie CCCP wymagane do depolaryzacji mitochondriów może być niższe, jeśli zastosowano mniejsze stężenia barwnika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W kroku 3.8 zweryfikuj, czy izolowane mitochondria wytwarzają mitochondrialny anion ponadtlenkowy, barwiąc je odpowiednim wskaźnikiem nadtlenku mitochondrialnego7 przez 15 min w temperaturze pokojowej (RT), w ciemności.
	<ol>
		<li>Jako kontrolę produkcji mitochondrialnego anionu ponadtlenkowego, zabarw izolowane mitochondria barwnikiem w obecności 10 µM antymycyny A, inhibitora kompleksu III łańcucha oddechowego, który zwiększy produkcję mitochondrialnego anionu ponadtlenkowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Akwizycja i analiza immunoznakowanych izolowanych mitochondriów metodą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Konfiguracja instrumentu: Przełącz napięcia z trybu liniowego na logarytmiczny, aby ułatwić analizę izolowanych mitochondriów, i ustaw wartości napięć (FSC: 450; SSC: 250). Upewnij się, że zdarzenia są zbierane w trybach FSC-A (pole), FSC-W (szerokość) oraz FSC-H (wysokość), aby umożliwić wykluczenie dubletów (t.j. dwóch zdarzeń przechodzących przez detektor w tym samym czasie) podczas analizy po zakończeniu akwizycji danych. Ustaw liczbę zdarzeń do zebrania na 100 000. Pozyskaj kontrole kompensacji, jeśli są wymagane.</li>
	<li>Akwizycja danych: Przed akwizycją danych unikaj mieszania próbek w vorteksie. Zamiast tego wymieszaj je, delikatnie opukując probówkę. Początkowo, podczas bramowania, zbieraj zdarzenia przy niskim ciśnieniu. Wyznacz bramkę dla całej populacji. Odpowiednio dostosuj napięcia histogramów; zazwyczaj szczyt próbki niebarwionej powinien odpowiadać drugiej dekadzie (102). Po ustaleniu bramek i rozpoczęciu przetwarzania próbek można przełączyć ciśnienie na wysokie.</li>
	<li>Analiza: Zwizualizuj dublety, wykreślając FSC-W względem FSC. Zidentyfikuj singlety i dublety. Wyznacz bramkę dla singletów. Wybierz populację mitochondriów, bramując zdarzenia, które zostały zabarwione dodatnio barwnikiem selektywnym dla mitochondriów.</li>
	<li>Określ poziom tła na podstawie kontroli izotypowej. Korzystając z próbki kontroli izotypowej, określ procent populacji mitochondriów wykazujący dodatnie barwienie dla przeciwciała Mfn2.</li>
</ol>

<ol><li>Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics in neurodegeneration.</a> Trends Cell Biol. 23, 64-71 (2013).</li>
<li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).</li>
<li>Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+intracellular+organelle+function+using+fluorescent+probes%3A+from+animalcules+to+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots.</a> Circ Res. 95, 239-252 (2004).</li>
<li>Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).</li>
<li>Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+five+dimensions%3A+time-dependent+membrane+potentials+in+individual+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria.</a> Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).</li>
<li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient%3A+a+practical+usage+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50, 98-115 (2011).</li>
<li>Xu, X., Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+determination+of+superoxide+release+at+both+sides+of+the+mitochondrial+inner+membrane+by+capillary+electrophoretic+analysis+of+the+oxidation+products+of+triphenylphosphonium+hydroethidine%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine.</a> Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).</li>
<li>Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+function+and+regulation+of+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">New insights into the function and regulation of mitochondrial fission.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).</li>
<li>de Brito, O. M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456, 605-610 (2008).</li>
<li>Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+mitochondrial+heterogeneity+tell+us+about+mitochondrial+dynamics+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy.</a> Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).</li>
<li>Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H. Jr, Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+damage+revealed+by+immunoselection+for+ALS-linked+misfolded+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1.</a> Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).</li>
<li>Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dynamin-related+protein+1%2C+a+mediator+of+mitochondrial+fission%2C+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis.</a> Dev Cell. 1, 515-525 (2001).</li>
<li>West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li>
<li>Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalhães, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+pH+monitored+by+a+new+engineered+green+fluorescent+protein+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant.</a> J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).</li>
<li>Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).</li>
<li>Tantama, M., Martinez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+energy+status+in+live+cells+with+a+fluorescent+biosensor+of+the+intracellular+ATP-to-ADP+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio.</a> Nat Commun. 4, 2550(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Coraz bardziej oczywiste jest, że mitochondria odgrywają kluczową rolę zarówno w normalnej fizjologii, jak i chorobie. Podczas gdy immunoblotting może określić, które białka znajdują się w mitochondriach lub na powierzchni mitochondriów w określonym stanie, ta metoda informuje o średniej dla całej populacji. Metoda ta nie może dostarczyć informacji o względnej liczebności subpopulacji lub podzbiorów mitochondriów. Chociaż wcześniej zakładano, że wszystkie mitochondria są tworzone jednakowo, w tej dziedzinie coraz częście...

Mitochondria to wysoce dynamiczne organelle, które przechodzą wiele rund rozszczepienia i fuzji, są transportowane do miejsc o wysokim zapotrzebowaniu na energię i szybko reagują na bodźce fizjologiczne1. Ponieważ coraz częściej uznaje się, że mitochondria w różnych tkankach, a nawet w różnych przedziałach komórkowych, mają różne profile funkcjonalne, potrzebne są nowe metody identyfikacji tych odrębnych podzbiorów mitochondrialnych.
Mikroskopia dostarcza środków, dzięki którym można wizualizować poszczególne mitochondria i można określić obecność białka w mitochondriach lub w mitochondriach za pomocą immunofluorescencji2. Jednak analiza ilościowa tą metodą jest pracochłonna i jest bardziej odpowiednia do eksperymentów z wykorzystaniem unieśmiertelnionych lub pierwotnych linii komórkowych. Badanie poszczególnych mitochondriów pochodzących z tkanek jest znacznie trudniejsze, a większość metod nie pozwala na łatwą identyfikację podzbiorów mitochondriów równolegle z oceną funkcji mitochondriów3.
Aby rozwiązać tę przeszkodę, opracowano nową metodę immunoznakowania mitochondriów wyizolowanych z tkanek gryzoni, a następnie analizowanych za pomocą cytometrii przepływowej. Pozwala to na szybkie wykrywanie i kwantyfikację białek zlokalizowanych na zewnętrznej błonie mitochondrialnej, co w porównaniu z analizą mikroskopową jest znacznie mniej pracochłonne i pozwala na analizę tysięcy mitochondriów w jednej próbce. Test ten można zastosować do monitorowania losu i względnej ilości białek błony zewnętrznej mitochondriów, które uważa się za konstytutywnie obecne w mitochondriach, rekrutacji białek do powierzchni mitochondriów lub wykrywania białek błędnie zlokalizowanych w mitochondriach w warunkach patologicznych. Co więcej, włączenie konwencjonalnych fluorescencyjnych barwników wskaźnikowych pozwala na jednoczesną ocenę niektórych aspektów funkcji mitochondriów w różnych subpopulacjach mitochondrialnych.

<table><tbody><tr><td>Szczury</td><td>Charles River</td><td>Szczep kod 400</td><td>Dorosłe (od 9 tygodni do 18 tygodni) samce lub samice szczurów mogą być używane do protokołu izolacji. Zwykle stosuje się wagę szczurów w zależności od płci i wieku (samce od 300 do 500 g i samice od 200 do 350 g).</td></tr><tr><td>Homogenizator odcinowy</td><td>Kontes Glass Co.&nbsp;</td><td>885450-0022</td><td>Mikrowirówka Duall 22</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Sorvall Legend Micro 17 R</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Probówki do ultrawirówek</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td>Przezroczyste, cienkościenne&nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Ultrawirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td></td> Wirnik i wiadra <td>Sorvall WX UltraSeries</td></tr><tr><td>AH-650&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-prep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114542</td><td>Jodixanol, średni gradient gęstości</td></tr><tr><td>Bez kwasów tłuszczowych Surowica bydlęca Albumina</td><td>Sigma</td><td>A8806</td><td>Musi być wolna od kwasów tłuszczowych dla mitochondriów</td></tr><tr><td>Bursztynian sodu dwuzasadowy sześciowodny&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9637</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-Mitofusin2</td><td>Sigma</td><td>M6319</td><td></td></tr><tr><td>Królicze IgG</td><td>Jackson Badania immunologiczne&nbsp;</td><td>011-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Anty-królicza IgG PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4739-81</td><td></td></tr><tr><td>Mikrorurka do mianowania</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9391</td><td>Do pobierania próbek metodą cytometrii przepływowej&nbsp;</td></tr><tr><td>MitoTrackerGreen (MTG)</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td>100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm</td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T668</td><td>100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm</td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Red</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td>5 &micro; M: Ex 540 nm/Em 600 nm</td></tr><tr><td>Antymycyna A</td><td>Sigma</td><td>A8874</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy LSR II</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD BD FACSDiva Oprogramowanie</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>TreeStar Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Oprogramowanie służące do analizy</td></tr><tr><td>zestawu do oznaczania białek BCA&nbsp; &nbsp;</td><td>Test Pierce/Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Bradford nie jest zalecany, ponieważ nie jest kompatybilny z wysokimi stężeniami SDS</td></tr></tbody></table>

immunodetekcja białek błony zewnętrznej za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych mitochondriów

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Metody wykrywania i monitorowania składników białkowych zewnętrznej błony mitochondrialnej w tkankach zwierzęcych są niezbędne do badania fizjologii i patofizjologii mitochondriów. Protokół ten opisuje technikę, w której mitochondria wyizolowane z tkanki gryzoni są znakowane immunologicznie i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Mitochondria są izolowane z rdzenia kręgowego gryzoni i poddawane szybkiemu etapowi wzbogacania w celu usunięcia mieliny, głównego zanieczyszczenia frakcji mitochondrialnych przygotowanych z tkanki nerwowej. Wyizolowane mitochondria są następnie znakowane wybranym przeciwciałem i fluorescencyjnie sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym. Analiza za pomocą cytometrii przepływowej weryfikuje względną czystość preparatów mitochondrialnych poprzez barwienie barwnikiem specyficznym dla mitochondriów, a następnie wykrywanie i kwantyfikację białka znakowanego immunologicznie. Technika ta jest szybka, policzalna i wysokoprzepustowa, co pozwala na analizę setek tysięcy mitochondriów na próbkę. Ma zastosowanie do oceny nowych białek na powierzchni mitochondriów w normalnych warunkach fizjologicznych, a także białek, które mogą zostać nieprawidłowo zlokalizowane w tej organelli podczas patologii. Co ważne, metoda ta może być połączona z fluorescencyjnymi barwnikami wskaźnikowymi w celu informowania o pewnych aktywnościach subpopulacji mitochondrialnych i jest wykonalna dla mitochondriów z ośrodkowego układu nerwowego (mózg i rdzeń kręgowy), a także wątroby.

Mitochondria wyizolowane z rdzeni kręgowych szczura mogą zostać immunoznakowane przeciwciałem skierowanym przeciwko Mitofuzynie 2 (Mfn2), białku zaangażowanym w fuzję zewnętrznej błony mitochondriów8. Po izolacji i znakowaniu swoistym przeciwciałem przeciwko Mfn2 oraz koniugowanym z fluoresceincją przeciwciałem wtórnym, mitochondria są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 1). Po akwizycji danych próbki są analizowane przy użyciu oprogramowania do analizy cytometrii przepływow...

Opisana tutaj jest metoda wykrywania i ilościowego oznaczania białek zewnętrznej błony mitochondrialnej poprzez immunoznakowanie mitochondriów wyizolowanych z tkanek gryzoni i analizę za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta może być rozszerzona o ocenę funkcjonalnych aspektów subpopulacji mitochondrialnych.

Immunodetekcja białek błony zewnętrznej za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych mitochondriów

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Nadrzędnym celem tej procedury jest immunoznakowanie interesujących białek na błonie mitochondrialnej ER wybranym przeciwciałem i jednoczesna analiza funkcji mitochondriów. Osiąga się to poprzez najpierw pobranie od szczura tkanki będącej przedmiotem zainteresowania, takiej jak mózg, rdzeń kręgowy lub wątroba. Drugim krokiem jest odizolowanie mitochondriów od tkanki, w tym przypadku rdzenia kręgowego.Rdzeń kręgowy jest homogenizowany za pomocą tańca. Homogenizator i inne organelle oraz resztki dnia komórkowego są usuwane przez szereg etapów wirowania, aż do uzyskania surowego podniebienia mitochondrialnego mielina, główne zanieczyszczenie ośrodkowej tkanki nerwowej, jest usuwana przez zmieszanie mitochondriów z roztworem 12% opti przygotowanie i ponowne odcentrowanie. Następnie izolowane mitochondria są znakowane wybranym przeciwciałem pierwszorzędowym, a następnie przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluorem.Ostatnim krokiem jest dodanie barwników fluorescencyjnych w celu potwierdzenia tożsamości mitochondriów, a raczej parametrów funkcjonalnych. Ostatecznie cytometria przepływowa służy do pokazania względnej obfitości mitochondrialnych błon altowych w normalnej fizjologii lub

immunodetection-outer-membrane-proteins-flow-cytometry-isolated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film pokazuje znakowanie komórek neuronalnych przeciwciałami dla mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego, białka związanego z mitochondrialnym DNA i mitochondrialnego białka błony zewnętrznej, a następnie cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia ich poziomów.

Pomiar wielu parametrów mitochondrialnych w neuronach za pomocą cytometrii przepływowej

Porównanie potencjału błony mitochondrialnej między próbkami dostarcza cennych informacji o stanie komórek. Opisano szczegółowe etapy izolacji mitochondriów i oceny odpowiedzi na inhibitory i rozprzęgacze za pomocą fluorescencji. Metoda i użyteczność tego protokołu są zilustrowane przez zastosowanie hodowli komórkowej i zwierzęcego modelu stresu komórkowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Tutaj prezentujemy protokół, który wykorzystuje barwnik JC-1 do oceny potencjału błony mitochondrialnej komórek po wystawieniu na hipoksję/reoksygenację z lub bez środka ochronnego.

Test oparty na cytometrii przepływowej do pomiaru potencjału błony mitochondrialnej w miocytach serca po niedotlenieniu/reoksygenacji

Mitofagia, selektywna degradacja mitochondriów, jest związana z homeostazą mitochondriów i jest rozregulowana w różnych chorobach ludzkich. Jednak wygodne metody eksperymentalne do pomiaru aktywności mitofagii są bardzo ograniczone. Tutaj zapewniamy czuły test do pomiaru aktywności mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej.

Czuły pomiar mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zależnego od pH reportera fluorescencyjnego mt-Keima

Ten artykuł ilustruje potężną metodę ilościowego oznaczania mitochondriów lub lizosomów w żywych komórkach. Połączenie barwników specyficznych dla lizosomów lub mitochondriów z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym umożliwia ilościowe określenie tych organelli w mieszanych populacjach komórek, takich jak komórki pierwotne pobrane z próbek tkanek, przy użyciu wielobarwnej cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja mitochondriów i lizosomów w limfocytach T oparta na wielobarwnej cytometrii przepływowej

Ten artykuł opisuje protokół cytometrii przepływowej oparty na FRET, który pozwala określić ilościowo samoorganizację białek zarówno w komórkach S. cerevisiae, jak i HEK293T.

Wykrywanie i charakterystyka samoorganizacji białek in vivo za pomocą cytometrii przepływowej

Ksenobiotyczne pompy wypływowe są bardzo aktywne w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) i powodują ekstruzję TMRM, barwnika fluorescencyjnego o potencjale błony mitochondrialnej. W tym miejscu przedstawiamy protokół do dokładnego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej w HSPC za pomocą TMRM w obecności Werapamilu, inhibitora pompy wypływowej.

Poprawa dokładności cytometrycznej oceny potencjału błony mitochondrialnej w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych poprzez hamowanie pomp wypływowych

Prezentujemy dwuetapowy protokół wysokiej jakości izolacji mitochondriów, który jest zgodny z odkrywaniem białek i kwantyfikacją w skali proteomu. Nasz protokół nie wymaga inżynierii genetycznej, a zatem nadaje się do badania mitochondriów z dowolnych pierwotnych komórek i tkanek.

Dwuetapowa izolacja mitochondriów bez znaczników w celu lepszego odkrywania białek i kwantyfikacji

Mitochondrialne miejsca kontaktu to kompleksy białkowe, które oddziałują z wewnętrznymi i zewnętrznymi białkami błony mitochondrialnej. Miejsca te są niezbędne do komunikacji między błonami mitochondrialnymi, a tym samym między cytozolem a macierzą mitochondrialną. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji kandydatów kwalifikujących się do tej konkretnej klasy białek.

Ulepszona metoda izolowania mitochondrialnych miejsc kontaktowych

W niniejszym opracowaniu opisano procedurę stosowaną w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Białek Błonowych Caffreya w celu ręcznego przygotowania prób krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych.

Krystalizacja białek błonowych do wyznaczania struktury z wykorzystaniem mezofaz lipidowych

Poznaj metodę immunodetekcji białek błony zewnętrznej mitochondriów izolowanych z rdzenia kręgowego szczura przy użyciu cytometrii przepływowej. Ta technika umożliwia jednoczesną analizę funkcji mitochondrialnych.

Immunodetekcja białek błony zewnętrznej za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych mitochondriów

Przeglądaj więcej filmów