Immunodetekcja białek błony zewnętrznej za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych mitochondriów

Nadrzędnym celem tej procedury jest immunoznakowanie interesujących białek na błonie mitochondrialnej ER wybranym przeciwciałem i jednoczesna analiza funkcji mitochondriów. Osiąga się to poprzez najpierw pobranie od szczura tkanki będącej przedmiotem zainteresowania, takiej jak mózg, rdzeń kręgowy lub wątroba. Drugim krokiem jest odizolowanie mitochondriów od tkanki, w tym przypadku rdzenia kręgowego.

Rdzeń kręgowy jest homogenizowany za pomocą tańca. Homogenizator i inne organelle oraz resztki dnia komórkowego są usuwane przez szereg etapów wirowania, aż do uzyskania surowego podniebienia mitochondrialnego mielina, główne zanieczyszczenie ośrodkowej tkanki nerwowej, jest usuwana przez zmieszanie mitochondriów z roztworem 12% opti przygotowanie i ponowne odcentrowanie. Następnie izolowane mitochondria są znakowane wybranym przeciwciałem pierwszorzędowym, a następnie przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluorem.

Ostatnim krokiem jest dodanie barwników fluorescencyjnych w celu potwierdzenia tożsamości mitochondriów, a raczej parametrów funkcjonalnych. Ostatecznie cytometria przepływowa służy do pokazania względnej obfitości mitochondrialnych błon altowych w normalnej fizjologii lub chorobie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia, jest to, że pozwala ona na wysoką przepustowość i szybką ocenę ilościową tysięcy pojedynczych mitochondriów.

Zwierzęta wykorzystane w tym badaniu były traktowane ściśle według protokołu zatwierdzonego przez Instytucjonalny Komitet Ochrony Zwierząt C-R-C-H-U-M, który jest zgodny z krajowymi standardami określonymi przez Kanadyjską Radę ds. Opieki nad Zwierzętami Air. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść cały nienaruszony rdzeń kręgowy, który został pobrany od szczura, w pięciomililitrowym szklanym homogenizatorze zawierającym pięć objętości buforu homogenizacyjnego. Umieść szklany homogenizator na lodzie i homogenizuj tkankę ręcznie, aż nie pozostaną większe kawałki tkanki, co zajmie około ośmiu pociągnięć.

Przenieść homogenat do dwóch lub trzech mikroprobówek wirówkowych i odwirować w temperaturze 1 300 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnie pipetować supernatant S do pięciomililitrowej probówki ultrawirówkowej. Dodać 750 mikrolitrów buforu homogenizacyjnego do granulki i delikatnie ponownie zawiesić osad. Następnie odwirować zawiesinę i ponownie zawiesić osad.

Jeszcze dwa razy, aby usunąć drobne zanieczyszczenia, wciągnij wszystkie supernatanty do tej samej pięciomililitrowej probówki ultrawirówki, a następnie umieść probówki w wirniku ultrawirówki. Wyposażony w wahadłowe wiadra, odwiruj probówki pod ciśnieniem 17 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zakończeniu wirowania zachowaj supernatant do dalszego przetwarzania, jeśli frakcja cytozolowa jest przedmiotem zainteresowania.

Następnie zawiesić osad, który jest surową frakcją mitochondrialną w czterech mililitrach buforu homogenizacyjnego zawierającego 50-milimolową wirówkę chlorku potasu. Zawieszony osad o temperaturze 17 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w kołyszącym się wirniku kubełkowym, następnie wyrzuć supinat i delikatnie ponownie zawieś osad w 800 mikrolitrach buforu homogenizacyjnego w nowej pięciomililitrowej probówce ultrawirówkowej przy dokładnie 800 mikrolitrach zawieszonego osadu. Następnie odpipetować 200 mikrolitrów jod dal do 800 mikrolitrów zawieszonego osadu, aby uzyskać końcowe stężenie 12% jod Dal.

Zawartość probówki delikatnie, ale dokładnie wymieszać pipetą P 1000, a następnie odwirować w temperaturze 17 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w kołyszącym się wirniku kubełkowym, zassać warstwę mieliny na górze probówki i ostrożnie wyrzucić supinat, ponieważ paleta może być luźna. Resus zawiesić osad w czterech mililitrach buforu homogenizacyjnego. Następnie odwiruj swój zysk przy 17 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w kołyszącym się wirniku kubełkowym.

Odrzuć supinat i resus. Zawiesić osad w czterech mililitrach buforu homogenizacyjnego. Następnie powtórzyć wirowanie ponownie i usunąć środek leżący na plecach reus.

Zegnij końcowe osady w 100 do 200 mikrolitrach buforu homogenizacyjnego i przenieś do mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,7 mililitra. Określ ilość białka w każdej próbce za pomocą standardowego testu ilościowego białka, takiego jak test kwasu bionicznego lub BCA. Przygotowując próbki do oceny ilościowej, należy rozcieńczyć próbki i krzywą wzorcową w 2% siarczanie sodu, aby zapewnić odpowiednią rozpuszczalność mitochondriów.

Dla każdej badanej mieszaniny barwiącej należy pobrać pipetę z 25 mikrogramów wyizolowanych mitochondriów do probówki micro centri o pojemności 1,7 mililitra. Upewnij się, że w każdym eksperymencie dołączono niebarwioną próbkę, a także odpowiednią kontrolę izotypu dla każdego testowanego przeciwciała, odwiruj każdą próbkę w temperaturze 17 000 razy G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza w mikrowirówce stołowej. Następnie usuń supinat i ponownie zawieś izolowane mitochondria w 50 mikrolitrach buforu mitochondriów.

Uzupełniony 10% BSA wolnym od kwasów tłuszczowych inkubować roztwór przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie dodać 20 mikrogramów przeciwciała pierwszorzędowego na mililitr roztworu. Inkubować izolowane mitochondria z pierwotnym przeciwciałem przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby wypłukać niezwiązane przeciwciało, odwirować każdą próbkę i wyrzucić natant leżący na wznak. Następnie delikatnie ponownie zawieś osad w 200 mikrolitrach buforu mitochondriów, a następnie powtórz etap wirowania, wyrzuć natant leżący na wznak i ponownie zawieś osad w 50 mikrolitrach buforu mitochondriów.

Dodać 0,5 mikrograma przeciwciała drugorzędowego na mililitr próbki. Następnie inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc je przed światłem. Po zakończeniu inkubacji odwirować każdą próbkę i odrzucić supinat, który zawiera niezwiązane przeciwciało drugorzędowe. Reese.

Zawiesić osad w 200 mikrolitrach buforu mitochondriów i odwirować próbkę. Znów. Następnie usuń supinat i Reese. Zawieś osad w 500 mikrolitrach buforu mitochondriów, aby upewnić się, że obserwowane zdarzenia są w rzeczywistości mitochondriami.

Wybarwić próbkę barwnikiem fluorescencyjnym specyficznym dla mitochondriów, takim jak MIT tracker green z in Vitrogen przez 15 minut w ciemności. Jeśli dalsze barwienie nie jest konieczne do zbadania innych parametrów funkcjonalnych, należy przenieść oznakowaną próbkę do probówki nadającej się do załadowania do cytometru przepływowego. Przechowywać próbki na lodzie i przejść do cytometru przepływowego w celu pobrania w celu sprawdzenia, czy wyizolowane mitochondria mają nienaruszony potencjał transbłonowy, zabarwić mitochondria 100-nanomolowym estrem metylowym pałeczki tetraetylowej przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności jako kontrola barwienia dominą pałeczki tetraetylu.

Ester metylowy zabarwia izolowane mitochondria 100-nanomolowym estrem metylowym dominy pręta tetraetylowego w obecności 100 mikromolowego cyjanku karbonylu m chlorofenolu HydroOne. Ta substancja chemiczna jest rozprzęgnięciem mitochondriów i depolaryzuje mitochondria w celu sprawdzenia, czy izolowane mitochondria wytwarzają ponadtlenkowy barwnik mitochondrialny odpowiednim wskaźnikiem ponadtlenkowym, takim jak mitozy skarpetki czerwone z in Vitrogen przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności jako kontrola produkcji mitochondriów ponadtlenkowych. Pozostań w izolowanych mitochondriach z barwnikiem w obecności 10 mikromolowej antymycyny.

Antymycyna A jest inhibitorem kompleksu trzeciego łańcucha oddechowego i zwiększa produkcję ponadtlenku mitochondriów przed rozpoczęciem akwizycji. Skonfiguruj instrument zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie wymieszaj próbki, delikatnie stukając w probówkę, ale nie wiruj.

Rozpocznij zbieranie początkowych zdarzeń przy niskim ciśnieniu podczas bramkowania. Upewnij się, że bramka jest na całkowitej populacji. Następnie odpowiednio dostosuj napięcia histogramów.

Szczyt niebarwionej próbki zwykle odpowiada drugiej dekadzie. Następnie, po ustawieniu bramek i przetwarzaniu próbek, przełącz ciśnienie na cytometrię o wysokim przepływie. Analiza preparatów rdzenia kręgowego wykazała, że 94% zdarzeń było pozytywnych dla barwnika specyficznego dla mitochondriów.

W tym eksperymencie 30% pozytywnych zdarzeń mitochondriów zostało oznaczonych przeciwciałem specyficznym dla fuzji MIT 2, które jest białkiem zaangażowanym w fuzję zewnętrznej błony mitochondriów. Analiza mitochondrialnego potencjału transbłonowego przy użyciu estru metylowego tetraetylu żwactwa wykazała, że 95% wyizolowanych mitochondriów ma nienaruszony potencjał transbłonowy. Wykazano, że to barwienie jest specyficzne, ponieważ zaobserwowano znaczny spadek barwienia, gdy wykonano je w obecności mitochondriów uncofunkcjonalnych mitochondriów, które okazały się wytwarzać podstawową ilość tlenku SUP, mierzoną za pomocą barwnika przepuszczalnego dla błony.

To staje się fluorescencyjną reakcją P z tlenkiem SUP. Leczenie mitochondriów antymycyną a powoduje około 10% wzrost produkcji ponadtlenków po opanowaniu. Tę technikę można wykonać w ciągu sześciu do siedmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.