Name: Wysokoprzepustowe miareczkowanie rekombinowanych wirusów eksprymujących lucyferazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę miareczkowania wirusów eksprymujących lucyferazę w liniach komórkowych Vero. Technika umożliwia szybkie przetwarzanie próbek z jednoczesną oceną cytotoksyczności komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vanessa Garcia jest finansowana przez stypendium Queen Elizabeth II Ontario Graduate Scholarship w dziedzinie nauki i technologii, a Cory Batenchuk przez stypendium Rady Nauk Przyrodniczych i Inżynierii.

1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Pobrać próbki zawierające wirusa wykazującego ekspresję lucyferazy (tutaj VSV∆51-Fluc jako przykład) do miareczkowania i przenieść na płytki 96-dołkowe. Alternatywnie należy przeprowadzać infekcje na 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych i bezpośrednio stosować supernatanty.</li>
	<li>Pozostaw dwie kolumny nieobrobione w celu uwzględnienia krzywych standardowych. W przypadku doświadczeń przeprowadzanych bezpośrednio na płytkach 96-dołkowych, miano należy określić na koniec doświadczenia (40 godzin po zakażeniu) lub przechowywać w temperaturze -80 °C, a miano w późniejszym terminie.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek permisywnych do miareczkowania wirusa
<ol>
	<li>Na 24 godziny przed mianowaniem należy przygotować zawiesinę komórek Vero o stężeniu 2,5 x 105 komórek/ml w zmodyfikowanym pożywce orła (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 30 mM HEPES i 1% penicyliny/streptomycyny. UWAGA: Chociaż ten protokół wykorzystuje komórki Vero, można użyć dowolnej odpowiedniej linii komórkowej permisywnej do infekcji VSV.</li>
	<li>Wysiewaj 2,5 x 104 komórek (100 μl) w 96-dołkowych białych płytkach z płaskim dnem za pomocą dozownika do mikropłytek.
	<ol>
		<li>Przygotować 12 ml zawiesiny komórkowej na płytkę plus 5 ml do gruntowania.</li>
		<li>Kasetę z dozownikiem na mikropłytki należy oczyścić, przepłukując rurkę 50 ml sterylnej wody.</li>
		<li>Napełnić przewody dozownika mikropłytek zawiesiną komórkową i przepuścić przez nie 5 ml zawiesiny komórek.</li>
		<li>Wybierz program, który dozuje 100 μl do każdego dołka z 96-dołkowej płytki o białych ściankach. Dozować i powtórzyć w razie potrzeby dla dodatkowych płytek. Wysiewaj również kilka dołków w 96-dołkowej, przezroczystej płytce o płaskim dnie, jeśli do weryfikacji zdrowia i gęstości komórek używane są płytki o białych ściankach z nieprzezroczystym dnem.</li>
		<li>Po zakończeniu spłucz komórki z powrotem do oryginalnego pojemnika. Wyczyść kasetę, przepuszczając przez rurkę 50 ml 70% etanolu, a następnie 50 ml ciepłej, sterylnej wody.</li>
		<li>Upewnij się, że kaseta i rurki są odpowiednio czyszczone między użyciami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Przygotowanie Wzorcowej Krzywej Wirusa
<ol>
	<li>Przygotować wzorcową krzywą VSV∆51-Fluc w DMEM bez surowicy, tak aby końcowe stężenie jednostek tworzących płytkę miażdżycową (pfu) na ml po przeniesieniu na komórki Vero było następujące: 108 pfu/ml, 107 pfu/ml, 106 pfu/ml, 105 pfu/ml, 104 pfu/ml, 103 pfu/ml, 102 pfu/ml i 101 pfu/ml. Przygotuj 50 μl każdego stężenia na płytkę komórek Vero plus dodatkowe 10%. 
	UWAGA: Miano zapasu wirusa lucyferazy będzie musiało zostać ocenione w klasyczny sposób10 w celu wygenerowania krzywej standardowej, która pozwoli na bezwzględną kwantyfikację. W przeciwnym razie względną kwantyfikację można osiągnąć bez dokładnych informacji o mianie poprzez arbitralne ustawienie miana wirusa na podstawie etapów rozcieńczania. Na przykład pierwsze rozcieńczenie krzywej wzorcowej można ustawić na 108 jednostek wirusowych, a następne rozcieńczenie 1/10 na 10,7 i tak dalej. W tym kontekście należy wyrazić wartości jako zmianę krotności w porównaniu z wcześniej określoną próbką, ponieważ bezwzględna kwantyfikacja nie będzie dokładna.</li>
</ol>
4. Przeniesienie supernatantów próbki do komórek permisywnych
<ol>
	<li>Sprawdź komórki Vero posiane na przezroczystej 96-dołkowej płytce pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić, że monowarstwy zlewają się w co najmniej 95%.</li>
	<li>Przenieść 25 μl supernatantu próbki na komórki Vero wysiane na płytkach o białych ściankach. Nie należy przenosić supernatantów do 2 kolumn przeznaczonych dla krzywych standardowych. UWAGA: Można to zrobić jednocześnie dla wszystkich studzienek na jednej płycie za pomocą 96-kanałowego regulatora cieczy.</li>
	<li>Używając 8- lub 12-kanałowego pipetora wielokanałowego, dodać 25 μl każdego rozcieńczenia krzywej wzorcowej przygotowanej w kroku 3 do komórek Vero w 2 wyznaczonych kolumnach.</li>
	<li>Odwirować płytki przez 5 minut przy 430 x g przy wilgotności względnej.</li>
	<li>Inkubować przez 5 godzin w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
</ol>
5. Ocena żywotności komórek
<ol>
	<li>UWAGA: Rozpoczynając od supernatantów uzyskanych z eksperymentów infekcyjnych przeprowadzonych na przezroczystych 96-dołkowych płytkach, żywotność próbki można ocenić przed kwantyfikacją za pomocą barwnika wskaźnika żywotności komórek, takiego jak rezazuryna.</li>
	<li>Dodać rezazydynę w ilości równej 10% objętości w każdym dołku z 96-dołkowej płytki próbek zawierających wirusa i komórki. Uwzględnij kontrolki tylko komórki, a także kontrolkę tylko multimediów, aby określić wartości odpowiednio 100% i 0% żywotności.</li>
	<li>Po 2-4 godzinach (czas inkubacji będzie się różnił w zależności od typu ogniwa i stężenia dostępnego w handlu lub odtworzonego proszku barwnika), odczytaj i zapisz sygnał za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych (wzbudzenie 530-560, emisja 590). Zgłoś żywotność komórki dla próbki zgodnie ze wzorem Względna aktywność metaboliczna = ((Sygnał próbki testowej - ujemny sygnał kontrolny) / (Sygnał kontrolny tylko komórka - ujemny sygnał kontrolny)) x 100%</li>
</ol>
6. Przygotowanie substratu lucyferyny
<ol>
	<li>30 minut przed końcem 5-godzinnej inkubacji przygotować lucyferynę do otrzymania roztworu o stężeniu 2 mg/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS). Przygotuj 2,5 ml na talerz plus dodatkowe 2 ml. Chronić roztwór przed światłem. UWAGA: Lucyferyna może być również przygotowana wcześniej w ciągu dnia i przechowywana w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
7. Odczyt bioluminescencji
<ol>
	<li>Po 5-godzinnym okresie inkubacji dodaj 25 μl lucyferyny do każdej studzienki komórek Vero na białych płytkach stałych. Dodaj lucyferynę ręcznie lub za pomocą automatycznego dozownika zintegrowanego z luminometrem. UWAGA: Użycie przyrządu z odczytami tylko pojedynczego i punktu końcowego może wymagać dodania buforu do lizy zgodnego z lucyferazy przed dodaniem substratu lucyferyny w celu poprawy konsystencji.</li>
	<li>Odczytaj tabliczki z następującymi parametrami:
	<ol>
		<li>Wstrząsaj przez 5 sekund.</li>
		<li>Poczekaj 30 sekund.</li>
		<li>Odczyt luminescencji przy odpowiedniej stałej czułości / wartości ekspozycji. Jeśli opcja jest dostępna w urządzeniu, użyj odczytów wielopunktowych (np. matrycy 3 x 3), aby poprawić dokładność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rejestruj i zapisuj ilościowo określoną intensywność bioluminescencyjną.</li>
	<li>Jeśli do dodania lucyferyny użyto automatycznego dozownika, oczyść lucyferynę i zalej linie ciepłą, sterylną wodą.</li>
</ol>
8. Analiza danych
<ol>
	<li>Aby uzyskać dokładne wyniki, rozwiąż regresję nieliniową, aby wygenerować równanie Hilla na podstawie krzywych standardowych. Zastosuj to równanie do próbek, z których ma się miano, aby obliczyć jednostki ekspresji wirusa. Niektóre wirusy lub sytuacje mogą tworzyć krzywą standardową z liniową zależnością; W takim przypadku rozwiąż równanie liniowe.</li>
</ol>

<ol><li>Grigorov, B., Rabilloud, J., Lawrence, P., Gerlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+titration+of+measles+and+other+viruses%3A+optimization+with+determination+of+replication+cycle+length%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid titration of measles and other viruses: optimization with determination of replication cycle length.</a> PLoS One. 6 (e24135), (2011).</li>
<li>Lizee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li>
<li>McSharry, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uses+of+flow+cytometry+in+virology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Uses of flow cytometry in virology.</a> Clin Microbiol Rev. 7, 576-604 (1994).</li>
<li>Watcharatanyatip, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispecies+detection+of+antibodies+to+influenza+A+viruses+by+a+double-antigen+sandwich+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Multispecies detection of antibodies to influenza A viruses by a double-antigen sandwich ELISA.</a> J Virol Methods. 163, 238-243 (2010).</li>
<li>Dawson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Direct+Quantification+of+Viruses+in+Solution+Using+the+ViroCyt+Virus+Counter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">Rapid, Direct Quantification of Viruses in Solution Using the ViroCyt Virus Counter.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 23 (S10), (2012).</li>
<li>Snyder, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+and+RT-PCR%3A+true+or+false%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV and RT-PCR: true or false.</a> Mol Ther. 1, 389-390 (2000).</li>
<li>Diallo, J. S., Roy, D., Abdelbary, H., De Silva, N., Bell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+infection+of+live+tissue+with+oncolytic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo infection of live tissue with oncolytic viruses.</a> J Vis Exp. 52, (2011).</li>
<li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells.</a> Appl Microbiol. 16, 588-594 (1968).</li>
<li>Green, M., Loewenstein, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adenoviruses%3A+propagation%2C+purification%2C+quantification%2C+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Human adenoviruses: propagation, purification, quantification, and storage.</a> Curr Protoc Microbiol. 14 (14C 11), (2006).</li>
<li>Diallo, J. S., Vaha-Koskela, M., Le Boeuf, F., Bell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation%2C+purification%2C+and+in+vivo+testing+of+oncolytic+vesicular+stomatitis+virus+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Propagation, purification, and in vivo testing of oncolytic vesicular stomatitis virus strains.</a> Methods Mol Biol. 797, 127-140 (2012).</li>
<li>Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Ebola+virus+expressing+luciferase+allows+for+rapid+and+quantitative+testing+of+antivirals%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals.</a> Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).</li>
<li>Diallo, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+pharmacoviral+approach+identifies+novel+oncolytic+virus+sensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers.</a> Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane tutaj podejście oparte na lucyferazie zapewnia szereg zalet w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, w tym łatwość, szybkość, minimalne zapotrzebowanie na sprzęt i stosunkowo niski koszt. Kluczowym czynnikiem przyczyniającym się do tego jest unikanie etapu seryjnego rozcieńczania. Niemniej jednak, oparte na seryjnym rozcieńczaniu pochodne tego protokołu są z pewnością wykonalne i zostały ostatnio wykorzystane do oceny miana Eboli wykazującego ekspresję lucyferazy w wysokoprzepustowym badaniu przesiewowymprzeciwwirusowym 11. Chociaż takie adaptacje są z natury bardziej czasochłonne i droższe, w razie potrzeby mogą zapewnić większy zakres dynamiki do kwantyfikacji wirusa. Oprócz tego, że szczególnie dobrze nadaje się do oceny miana wirusa w kontekście wysokoprzepustowych badań przesiewowych, nasza jednoetapowa metoda kwantyfikacji wirusa oparta na lucyferazy generuje dokładne szacunki zakaźnych wirionów w przypadku replikacji wirusów. Co więcej, odczyty luminescencji wraz z danymi cytotoksyczności z tego samego eksperymentu dają pełniejszy obraz wpływu warunków eksperymentalnych na komórki docelowe, co jest szczególnie przydatne w kontekście wirusów onkolitycznych i badań przesiewowych leków.
W przedstawionym przykładzie wykorzystano replikujący się ujemny wirus jednoniciowego RNA; Jednak protokół ten można dostosować do wielu wirusów replikujących się i niereplikujących z kilkoma niewielkimi zmianami protokołu. Obejmuje to wirusy DNA, takie jak krowianka, HSV i AAV (patrz ryc. 5). Próbki zakażone wirusami wewnątrzkomórkowymi, takimi jak na przykład wirus krowianki, wymagają etapu uwalniania wirusa przed oceną ilościową (np. co najmniej jednego cyklu zamrażania i rozmrażania). Stosując tę technikę do innych wirusów, konieczne jest zoptymalizowanie czasu inkubacji od przeniesienia supernatantu wirusowego lub lizatu do odczytu płytek przez luminometr. Parametr ten będzie zależał głównie od cyklu replikacji wirusa w permisywnej linii komórkowej i siły promotora napędzającego ekspresję lucyferazy. Najlepiej jest to zrobić, używając pełnej krzywej standardowej w kroku optymalizacji. Aby to zrobić, należy zainfekować odpowiednią permisywną linię komórkową różnymi powtórzeniami przygotowanej krzywej wzorcowej i odczytać każdą replikę w różnych punktach czasowych po transferze. Idealnie byłoby, gdyby wybrano punkt czasowy inkubacji, który prowadzi do liniowej zależności między LOG(RLU) a LOG(mianem) obejmującej oczekiwany zakres miana próbki. W przypadku VSV∆51-Fluc jest to zwykle od 104 pfu/ml -107 pfu/ml przez 5 godzin inkubacji. Jeśli oczekuje się, że od próbek będą niższe lub wyższe miana, można po prostu odpowiednio wydłużyć lub skrócić czas inkubacji. Alternatywnie, próbki można rozcieńczać, aby mieściły się w zakresie, tak jak ma to miejsce zazwyczaj w przypadku testu ELISA.
Jak wspomniano powyżej, metoda ta doskonale nadaje się do wykonywania wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przy użyciu bibliotek leków, ponieważ większość kroków można zautomatyzować. Komórki można efektywnie posiać za pomocą automatycznego dozownika mikropłytek, bibliotekę leków można dodać za pomocą 96-kanałowego urządzenia do obsługi cieczy, wirusa można dodać za pomocą dozownika mikropłytek, a płytki odczytać za pomocą automatycznego luminometru. Teoretycznie można to również dostosować do formatów 384-dołkowych lub mniejszych; jednak ograniczeniem w tym celu jest liczba komórek, które można platerować, biorąc pod uwagę, że mniejsza liczba komórek prowadzi do węższego zakresu liniowości relacji LOG(RLU) do LOG(Titer). Wreszcie, ocena żywotności komórek przy użyciu resazuryny lub innych barwników metabolicznych może być łatwo włączona do przepływu pracy, co pozwala na dyskryminację związków cytotoksycznych w badaniach przesiewowych przeciwwirusowych lub identyfikację związków, które prowadzą do synergicznego zabijania w połączeniu z wirusami12. Niemniej jednak ograniczenia tej metody obejmują wymóg transgenu eksprymującego wirusa lucyferazy, co nie zawsze jest możliwe, oraz dostępność wystarczająco liberalnej linii komórkowej. Jest jednak prawdopodobne, że możliwe jest dostosowanie metody do stosowania z innymi genami reporterowymi (np. GFP), pod warunkiem że metoda oznaczania ilościowego reportera ma odpowiednią liniowość i stosunek sygnału do szumu. Ogólnie rzecz biorąc, opisana metoda o wysokiej przepustowości może być modyfikowana tak, aby pasowała do wielu różnych wirusów i była dostosowana do różnych zastosowań.

Klasyczne testy płytek wirusowych nadal stanowią podstawę badań nad wirusami, mimo że mogą być bardzo czasochłonne i stanowić znaczące wąskie gardło w uzyskiwaniu wyników eksperymentów. Pojawiły się szybsze metody pośredniej kwantyfikacji wirusa, w tym ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR), ELISA i cytometria przepływowa1-4. Najnowsze innowacje, takie jak licznik wirusów Virocyt, mogą bezpośrednio zliczać wirusy przy użyciu zaawansowanej technologii sortowania przepływowego oraz dzięki połączeniu barwników białkowych i DNA/RNA5. Chociaż wszystkie te metody niewątpliwie przyspieszyły tempo badań nad wirusami, każda z nich ma swoje zalety i wady. Na przykład qPCR może pozwolić na ilościowe określenie określonej sekwencji genomu wirusa, ale nie może skutecznie odróżnić zakaźnych od wadliwych wirionów6. Testy ELISA mogą być bardzo specyficzne, jednak wymagają odpowiedniego przeciwciała przeciwko pożądanemu docelowemu białku wirusowemu i mogą być bardzo kosztowne. Chociaż technologia cytometrii przepływowej oferuje wiele zalet i uległa znacznej poprawie, przepustowość i dostęp do wysoce specjalistycznego sprzętu pozostają przeszkodą. Co ważne, wszystkie te techniki nie nadają się idealnie do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, dla których kluczowe znaczenie ma łatwość i czas wymagany na etapie kwantyfikacji wirusa.
Tutaj opisujemy wysokoprzepustową i łatwo zautomatyzowaną technikę mianowania wirusów, które wyrażają transgen lucyferazy świetlików (Fluc). Metoda ta generuje przybliżone miana wirusów w próbce testowej na podstawie sygnału luminescencji odczytanego poprzez równoległe użycie krzywej standardowej znanych ilości wirusa. Próbki zawierające nieznane ilości wirusa wykazującego ekspresję lucyferazy są przenoszone do permisywnej "plakowanej" linii komórkowej równolegle ze standardową krzywą rozcieńczenia wirusa, a luminescencja związana z wirusem jest odczytywana po kilku godzinach inkubacji. Pozwala to na szybkie, ilościowe, często tego samego dnia generowanie wyników, w przeciwieństwie do klasycznych protokołów oznaczania płytek, które zwykle wymagają kilku dni inkubacji w celu ręcznego policzenia widocznych blaszek7-9. 
Protokół przedstawia etapy naszej metody miareczkowania przy użyciu onkolitycznego wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej kodującego transgen Fluc (VSV∆51-Fluc) jako przykładu i dostarcza przegląd liczby 1. Przygotowanie próbki 2. Posiewanie dopuszczającej się linii komórkowej do miareczkowania wirusa przy użyciu automatycznego dozownika 3. Przygotowanie krzywej wzorcowej wirusa 4. Przeniesienie supernatantów próbki do permisywnej linii komórkowej za pomocą 96-dołkowego pipetora ręcznego 5. Ocena cytotoksyczności próbki przy użyciu odczynnika żywotności komórek 6. Przygotowanie substratu lucyferyny 7. Odczyt bioluminescencji i 8. Analiza danych.

<table><tbody><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium firmy Dulbeccos (DMEM)</td><td>Corning</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>NorthBio Inc.</td><td>NBSF-701</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td>Przygotuj 1 mM roztwór o pH 7,3</td></tr><tr><td>alamarNiebieski&nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>BUF012B</td><td></td></tr><tr><td>Sól potasowa D-Lucyferyny</td><td>Biotium</td><td>10101-2</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe, stałe, białe, płaskie płytki polistyrenowe z płaskiego dna poddane działaniu TC Płytki</td> 384-dołkowe <td>Corning</td><td>3917</td><td>mogą być również używane do większej przepustowości</td></tr><tr><td>Synergy Mx</td><td>BioTek</td><td>SMTBL</td><td>Monochromator czytnik mikropłytek</td></tr><tr><td>Liquidator96</td><td>Mettler Toledo</td><td>LIQ-96-200</td><td>Ręczny system pipetowania 96 końcówek</td></tr><tr><td>Liquidator96 LTS Końcówki sterylizowane z filtrami</td><td>Mettler Toledo</td><td>LQR-200F</td><td>Odpowiednie są wszelkie sterylne końcówki z filtrem kompatybilne z wybranymi pipetami</td></tr><tr><td>Microflo</td><td>BioTek</td><td>111-206-21</td><td>Służy do płytki komórek w płytce 96-dołkowej</td></tr><tr><td>Fluoroskan Ascent FL</td><td>Thermo Scientific</td><td>5210450</td><td>Fluorometr do mikropłytek</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe miareczkowanie rekombinowanych wirusów eksprymujących lucyferazy

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standardowe testy płytek w celu określenia zakaźnych mian wirusów mogą być czasochłonne, nie są podatne na dużą ilość próbek i nie mogą być wykonane z wirusami, które nie tworzą blaszek. Jako alternatywę dla testów płytki nazębnej opracowaliśmy wysokoprzepustową metodę miareczkowania, która pozwala na jednoczesne miareczkowanie dużej ilości próbek w ciągu jednego dnia. Podejście to obejmuje zakażenie próbek wirusem znakowanym lucyferazy świetlika, przeniesienie zakażonych próbek do odpowiedniej permisywnej linii komórkowej, następnie dodanie lucyferyny, odczytanie płytek w celu uzyskania odczytów luminescencji, a na końcu konwersję z luminescencji na miana wirusa. Ocena cytotoksyczności przy użyciu barwnika żywotności metabolicznej może być łatwo włączona do przepływu pracy równolegle i dostarczyć cennych informacji w kontekście badania przesiewowego leków. Technika ta zapewnia niezawodną, wysokoprzepustową metodę określania miana wirusa jako alternatywę dla standardowego testu płytki miażdżycowej.

Podsumowanie schematu postępowania opisującego metodę wysokoprzepustową przedstawiono na Rysunku 1. Rysunek 2 pokazuje wyniki typowej krzywej wzorcowej dla VSV∆51-Fluc. Analiza regresji nieliniowej czteroparametrowej pozwoliła na wygenerowanie wykresu Hilla, z którego można interpolować nieznaną liczbę jednostek tworzących pędy (pfu) (szacunkowy miano wirusa). Szacunkowe miana te nazywa się jednostkami ekspresji wirusowej (VEU). Rysunek 3A przedstawia VEU oraz miana uzyskane poprzez przeprowadzenie standardowego testu pęplykowego na tych samych próbkach10. Próbki pochodziły z eksperymentu, w którym zastosowano różne substancje chemiczne w celu zwiększenia replikacji i rozprzestrzeniania się VSV∆51-Fluc w komórkach 786-0. Wartości VEU interpolowane z krzywej wzorcowej muszą zostać pomnożone przez współczynnik oparty na rozcieńczeniu nadnadfiltrów z próbek przenoszonych na komórki Vero (w tym przypadku współczynnik rozcieńczenia wynosi 5). Korelację liniową między mianami a VEU przedstawiono na Rysunku 3B z R2 wynoszącym 0,8083 i współczynnikiem korelacji Pearsona r wynoszącym 0,899 (p &lt;0,0001). Na Rysunku 4 przedstawiono typowe dane dotyczące cytotoksyczności komórkowej uzyskane z testu metabolicznego dla komórek 786-0 traktowanych substancjami chemicznymi przed zakażeniem VSV∆51-Fluc. Na koniec, Rysunek 5 pokazuje typowe krzywe wzorcowe uzyskane dla różnych wirusów (wirusa opryszczki pospolitej (HSV), wirusa vaccinia oraz wirusa adeno-zależnego (AAV), wszystkie wykazujące ekspresję lucyferazy świetlikowej) oraz opisuje wymagane czasy inkubacji i cykle zamrażania i rozmrażania.
<img alt="Schemat procesu testu z komórkami Vero z ustawieniem czytnika płytek do luminescencji i fluorescencji w celu analizy." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat wysokoprzepustowego miareczkowania wirusa i testu cytotoksyczności z użyciem VSV∆51-Fluc. (A) Wysiew 2.5 x 104 komórek Vero na dołek (100 μl) i inkubacja w 37 °C. (B) Po 24 h przeniesienie 25 μl krzywej standardowej na komórki Vero (2 kolumny na płytkę). (C) Przeniesienie 25 μl próbek do miareczkowania na pozostałe komórki Vero. Wirowanie płytek i inkubacja w 37 °C. (D) Do płytki zawierającej oryginalne próbki dodanie odczynnika rezauryny w ilości równej 10% objętości w dołku. Inkubacja płytek w 37 °C. (E) Po 3 h odczyt i zapis fluorescencji oraz ocena cytotoksyczności. (F) Po 5 h dodanie 25 μl roztworu lucyferyny o stężeniu 2 mg/ml do każdego dołka z komórkami Vero. Odczyt luminescencji i obliczenie jednostek ekspresji wirusowej.
<img alt="Krzywa dawkowa ekspresji wirusowej; wykres przedstawiający Log(średniej wartości RLU) w funkcji jednostek wirusowych, dane eksperymentalne." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przewidywana krzywa wzorcowa dla VSV∆51-Fluc. Ekspresję lucyferazy zmierzono 5 h po przeniesieniu supernatantu w pięciu różnych punktach w obrębie dołka przy użyciu luminometru, a bioluminescencję wyrażono w średnich względnych jednostkach światła (RLU). Średnią wartość RLU naniesiono w funkcji znanej wartości wejściowej pfu/ml w celu rozwiązania regresji nieliniowej i wyznaczenia równania Hilla. Przedstawiono średnią z dwóch powtórzonych krzywych oraz słupki błędu standardowego (r2= 0,9993).
<img alt="Analiza miana wirusa, wykres słupkowy (test plackowy, lucyferaza) i wykres punktowy (korelacja, R²=0,8083)." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Porównanie mian uzyskanych w standardowym teście plackowym z mianami uzyskanymi metodą wysokoprzepustową. (A) Miana wirusa w pfu/ml uzyskane w standardowym teście plackowym na komórkach Vero zestawiono z obliczonymi mianami wirusa (VEU/ml) z tych samych próbek, dla których miano wyznaczono za pomocą wysokoprzepustowego testu lucyferazowego. (B) Liniowa zależność między VEU/ml a mianem uzyskanym w standardowym teście plackowym. Przedstawiono krzywą regresji liniowej oraz współczynnik determinacji (R2).
<img alt="Wykres słupkowy procentowej względnej aktywności metabolicznej komórek w 21 próbkach, analiza metaboliczna." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Żywotność próbek. Żywotność próbek przed przeniesieniem nadsączu na komórki Vero określono poprzez ocenę aktywności metabolicznej komórek z wykorzystaniem dostępnego komercyjnie roztworu rezazuryny. Surowe wartości fluorescencji znormalizowano względem wartości dla studni niepoddanych działaniu leku i niezakażonych.
<img alt="Analiza ekspresji wirusowej, wykresy liniowe RLU w funkcji Units/mL, wykazujące zależność dawka-odpowiedź." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Oczekiwane krzywe wzorcowe dla wirusów HSV, Vaccinia i AAV. Ekspresję lucyferazy mierzono w pięciu różnych punktach w obrębie studzienki za pomocą lumnometru, a bioluminescencję wyrażono w średnich względnych jednostkach światła (RLU). (A) Krzywa wzorcowa HSV została naniesiona na komórki Vero wysiane 24 hr wcześniej w gęstości 2,5 x 104 komórek na studzienkę (100 μl), a pomiar lucyferazy wykonano 17 hr po przeniesieniu supernatantu (R2= 0,9489, n=1). Równanie Hilla wygenerowano poprzez rozwiązanie regresji nieliniowej. (B) Krzywa wzorcowa Vaccinia została naniesiona na komórki Vero wysiane 24 hr wcześniej w gęstości 2,5 x 104 komórek na studzienkę (100 μl) i inkubowane przez 2,5 hr w temperaturze 37 °C, po czym wykonano pomiary lucyferazy (R2= 0,9892). Równanie liniowe wygenerowano poprzez rozwiązanie regresji liniowej. (C) Krzywa wzorcowa AAV została naniesiona na ludzkie komórki raka płuc (A549) wysiane 24 hr wcześniej w gęstości 2,5 x 104 komórek na studzienkę (100 μl), a pomiar lucyferazy wykonano 24 hr po infekcji. Równanie Hilla wygenerowano poprzez rozwiązanie regresji nieliniowej. Przedstawiono średnią z pięciu powtórzeń krzywych wraz z słupkami błędów standardowych (R2= 0,9926).

Ten artykuł przedstawia wysokoprzepustową metodę miareczkowania różnych wirusów RNA i DNA opartą na ekspresji lucyferazy przy użyciu automatycznych i ręcznych płynów.

Wysokoprzepustowe miareczkowanie rekombinowanych wirusów eksprymujących lucyferazy

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest oszacowanie miana wirusa znakowanego lucyferazą przy użyciu wysokoprzepustowej metody ilościowej. Jest to osiągane poprzez przeniesienie nadanu próbek poddawanych mianowaniu, a także krzywej wzorcowej wirusa, na podatnią linię komórkową w celu umożliwienia ekspresji lucyferazy. W drugim kroku do oryginalnych próbek można dodać rezazurynę, która zostanie wykorzystana do oceny żywotności komórek.Następnie, po odpowiednim czasie inkubacji, do komórek dodaje się lucyferynę w celu ilościowego oznaczenia bioluminescencji. Wyniki wskazują ilość wirusa w próbce na podstawie ekspresji lucyferazy.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak miareczkowanie płytek, jest możliwość szybkiego i jednoczesnego przetworzenia dużej liczby próbek. Metodę tę można również rozszerzyć na wirusy wykazujące ekspresję lucyferazy, które nie tworzą płytek, ponieważ nie zależy ona od powstawania płytek. Do schematu postępowania można łatwo włączyć odczyt cytotoksyczności komórkowej, co może być przydatne w kontekście przesiewania leków. Procedurę zaprezentują Vanessa, Ramya i Colin, troje doktorantów z mojego laboratorium.W pierwszej kolejności należy przeprowadzić infekcje wirusem VSV-Delta 51 wykazującym ekspresję lucyferazy świetlikowej w 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej. Nadnadstąpienia z tych płytek zostaną poddane miareczkowaniu po odpowiednim czasie inkubacji. Na 24 godziny przed miareczkowaniem należy przygotować zawiesinę komórek Vero o stężeniu 2,5 × 10⁵ komórek/ml w pożywce DMEM zawierającej 10% FBS, 30 mM HEPES oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Następnie, przy użyciu dozownika do mikropłytek, należy wysiać 2,5 × 10⁴ komórek do białych, 96-dołkowych płytek z pełnym, płaskim dnem. Aby przygotować zawiesinę komórkową, należy oczyścić kasetę dozownika do mikropłytek poprzez przepłukanie przewodów 50 ml sterylnej wody.Następnie wypełnij linie dozownika mikropłytek zawiesiną komórek, pozwalając na przepływ 5 mL zawiesiny. Wybierz program, który dozuje 100 µL do każdego dołka białej płytki 96-dołkowej. Rozpocznij dozowanie i powtórz czynność w razie potrzeby dla kolejnych płytek. Wysiej również kilka dołków w przezroczystej płytce 96-dołkowej z białym dnem w celu weryfikacji stanu zdrowia i gęstości komórek.Po zakończeniu przepłucz komórki z powrotem do oryginalnego pojemnika. Oczyść kasetę, przepuszczając przez cewki 50 milliliters 70% etanolu, a następnie 50 milliliters ciepłej sterylnej wody. Następnie inkubuj komórki przez 24 hours w temperaturze 37 degrees Celsius w wilgotnym inkubatorze z 5% carbon dioxide.Przygotować krzywą wzorcową VSV-Delta-51 w bezsurowicznym medium DMEM w taki sposób, aby końcowe stężenie jednostek tworzących plaki na mililitr po przeniesieniu na komórki Vero było następujące. Przygotować 50 µL każdego stężenia na płytkę z komórkami Vero, plus dodatkowe 10%. Krzywą wzorcową można przenieść do 96-dołkowej płytki głębokiej. Następnie sprawdzić pod mikroskopem świetlnym komórki Vero wysiane na płytce 96-dołkowej z przezroczystym dnem, aby potwierdzić, że monowarstwy osiągnęły co najmniej 95% konfluencji. Przenieść 25 µL supernatantu z próbki na komórki Vero wysiane na płytkach z białymi ściankami, używając 12-kanałowej pipety wielokanałowej, aplikując 25 µL każdego rozcieńczenia krzywej wzorcowej do komórek Vero w dwóch wyznaczonych kolumnach. Wirować płytki przez pięć minut przy 430 g w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować płytki przez pięć godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% carbon dioxide.W tym momencie do każdej studni płytki 96-dołkowej zawierającej próbki z wirusem i komórkami należy dodać rezazurynę w ilości odpowiadającej 10% objętości w studni. Po dwóch do czterech godzinach należy odczytać i zapisać sygnał za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek, stosując zakres od 530 do 560 dla wzbudzenia oraz 590 dla emisji. Żywotność komórek dla danej próbki należy obliczyć zgodnie z poniższym wzorem.Na 30 minut przed zakończeniem pięciogodzinnej inkubacji przygotować lucyferynę, aby uzyskać roztwór o stężeniu 2 mg/mL w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Chronić roztwór przed światłem. Po zakończeniu pięciogodzinnego okresu inkubacji dodać 25 µL lucyferyny do każdej studni z komórkami Vero w białych płytkach z dnem pełnym, używając automatycznego dozownika zintegrowanego z luminometrem. Odczytać płytki przy użyciu następujących parametrów.Wstrząsaj przez pięć sekund, a następnie odczekaj 30 sekund. Odczytaj luminescencję przy odpowiedniej stałej czułości lub wartości ekspozycji, a następnie zarejestruj i zapisz zmierzoną intensywność bioluminescencji. Jeśli do dodania lucyferyny użyto automatycznego dozownika, przepłucz go i przygotuj linie za pomocą sterylnej wody. Aby uzyskać dokładne wyniki, przeprowadź nieliniową regresję w celu wyznaczenia równania Hilla na podstawie krzywych wzorcowych.Zastosuj to równanie do próbek poddanych miareczkowaniu, aby obliczyć jednostki ekspresji wirusa. Tutaj przedstawiono wyniki typowej krzywej wzorcowej dla VSV-Delta 51. Nieliniowa analiza regresji czteroparametrowej pozwoliła na wygenerowanie wykresu Hilla, z którego można interpolować nieznane wejściowe jednostki tworzące plaques. Miana wirusa uzyskane za pomocą standardowego testu plackowego na komórkach Vero porównano z mianami wirusa obliczonymi z tych samych próbek miareczkowanych przy użyciu wysokoprzepustowego testu lucyferazowego. Próbki pochodziły z eksperymentu, w którym zastosowano różne związki chemiczne w celu zwiększenia replikacji i rozprzestrzeniania się VSV-Delta-51 w komórkach 786-0. Tutaj przedstawiono liniową korelację między mianami a jednostkami ekspresji wirusa z współczynnikiem R kwadrat wynoszącym 0,8083 i współczynnikiem korelacji Pearsona R równym 0,899. Tutaj pokazano typowe dane dotyczące cytotoksyczności komórkowej uzyskane z testu metabolicznego dla komórek 786-0 traktowanych chemikaliami przed zakażeniem VSV-Delta-51. Tutaj wyświetlono typowe krzywe wzorcowe uzyskane dla wirusa opryszczki zwykłej, wirusa szczepionkowego oraz wirusa towarzyszącego adenowirusom, z których każdy wykazuje ekspresję lucyferazy świetlikowej.Po opanowaniu ta technika może być wykorzystana do przeprowadzania wysokoprzepustowych przesiewów bibliotek związków w połączeniu z badanym wirusem w celu uzyskania danych dotyczących mian i cytotoksyczności. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o prawidłowym rozcieńczeniu krzywej wzorcowej, ponieważ jest to kluczowe dla interpolacji jednostek ekspresji wirusa.Należy pamiętać, że praca z żywymi wirusami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca w komorze bezpieczeństwa biologicznego oraz stosowanie odpowiednich środków ochrony indywidualnej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat szacowania mian wirusa przy użyciu wysokoprzepustowej metody ilościowej opartej na ekspresji transgenu lucyferazy, pomiarze bioluminescencji oraz interpolacji nieznanych jednostek ekspresji wirusowej na podstawie krzywej wzorcowej. Jednocześnie można określić cytotoksyczność próbki za pomocą odpowiedniego testu żywotności.

high-throughput-titration-of-luciferase-expressing-recombinant-viruses

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wysokowydajna tytulacja rekombinowanych wirusów ekspresujących lucyferazę

W celu wytworzenia lentiwirusów wektory DNA są transfekowane do ludzkich komórek 293. Po zbiorze i skoncentrowaniu naddatku miano wirusa jest określane na podstawie ekspresji fluorescencji przy użyciu cytometru przepływowego.

Produkcja lentiwirusa

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates a luciferase-based pseudovirus titration assay to determine the optimal target cell density for maximum infection. By comparing luminescence across cell densities, the method ensures high assay sensitivity and reproducibility for downstream applications.

Determining Optimal Target Cell Density Using a Luciferase-Based Pseudovirus Infection Assay

Film demonstruje test lucyferazy używany do ilościowego oznaczania białek znakowanych lucyferazy. W teście wykorzystuje zmodyfikowany enzym lucyferazy składający się z dużego fragmentu, który wiąże się z małym fragmentem, który jest sprzężony z interesującym białkiem. Związane podjednostki tworzą aktywny enzym, który w obecności substratu uwalnia sygnał luminescencyjny. Sygnał ten jest następnie oznaczany ilościowo za pomocą luminometru.

Test lucyferazy: wysokoprzepustowy test do pomiaru sygnałów luminescencyjnych przy użyciu zaprojektowanych bioreporterów opartych na systemie nanolucyferazy

Ten film demonstruje technikę in vitro do wykrywania zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) za pomocą rekombinowanego systemu reporterowego HBV. Po zakażeniu komórek gospodarza rekombinowany genom wirusa wykazuje ekspresję enzymu reporterowego lucyferazy, który wytwarza bioluminescencję po utlenieniu substratu - pomagając wykryć infekcję wirusową.

System reporterowy rekombinowanego wirusa in vitro do wykrywania infekcji wirusowych

Ten film demonstruje metodę śledzenia infekcji wirusowych w modelach mysich przy użyciu rekombinowanego wirusa grypy A z ekspresją białka rekombinowanego i fluorescencji, wyrażającego bi-reporter. Metoda ta umożliwia prowadzenie badań zarówno in vivo, jak i ex vivo, umożliwiając naukowcom uzyskanie wglądu w dynamikę wirusa i efekty interwencji.

Wirus wirusa grypy reporterowej lucyferazy-fluorescencji do śledzenia infekcji wirusowych

Ten film demonstruje test do badania regulacji translacji w komórkach zakażonych wirusem poxvirus. Niezakażone i zakażone wirusem komórki były współtransfekowane mRNA kodującymi lucyferazy świetlika (Fluc) i lucyferazy Renilla (Rluc), przy czym mRNA Fluc zawierało sekwencję liderową 5' poli(A). Po dodaniu substratów bioluminescencyjnych na lizowanych komórkach, zmierz sygnał z obu lucyferazy, aby zidentyfikować przewagę translacyjną mRNA Fluc w komórkach zakażonych wirusem, przyznaną przez...

Test reporterowy lucyferazy do badania regulacji translacji w komórkach zakażonych ospą

Prezentujemy szybką i tanią metodę przesiewową do identyfikacji regulatorów transkrypcji za pomocą wysokoprzepustowych transfekcji robotycznych i domowego testu lucyferazy o podwójnym świeceniu.  Protokół ten szybko generuje bezpośrednie dane funkcjonalne dla tysięcy genów i można go łatwo modyfikować w celu ukierunkowania na dowolny gen będący przedmiotem zainteresowania.

Wysokoprzepustowe funkcjonalne badania przesiewowe przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku

Tutaj prezentujemy protokół generowania pseudotypowanych cząstek w ustawieniu BSL-2 zawierających białko kolca wysoce patogennych wirusów bliskowschodniego zespołu oddechowego i koronawirusów zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej. Te pseudotypowane cząstki zawierają gen reporterowy lucyferazy, który umożliwia ilościowe określenie wnikania wirusa do docelowych komórek gospodarza.

Produkcja pseudotypowanych cząstek do badania wysoce zjadliwych koronawirusów w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2

Prezentujemy protokół do badania regulacji translacji mRNA w komórkach zakażonych wirusem poxvirus za pomocą testu reporterowego in vitro transkrybowanego RNA lucyferazy. Test może być stosowany do badania regulacji translacji przez cis elementy mRNA, w tym region 5'-nieulegający translacji (UTR) i 3'-UTR. Za pomocą tej metody można również badać różne tryby inicjacji tłumaczenia.

Test reporterowy lucyferazy oparty na RNA w transkrypcji in vitro w celu zbadania regulacji translacji w komórkach zakażonych pokswirusem

Wirusy grypy A (IAV) są zakaźnymi patogenami układu oddechowego, które powodują coroczne epidemie i sporadyczne pandemie. W tym miejscu opisujemy protokół śledzenia infekcji wirusowych in vivo przy użyciu nowej rekombinowanej lucyferazy i bi-reporterowego IAV z ekspresją fluorescencji (BIRFLU). Takie podejście zapewnia naukowcom doskonałe narzędzie do badania IAV in vivo.

Lucyferazy-fluorescencyjny wirus reporterowy grypy do obrazowania na żywo i ilościowego oznaczania infekcji wirusowej

Aby zidentyfikować nowe regulatory czynników transkrypcyjnych, opracowaliśmy podejście do badania przesiewowego bibliotek RNAi lentiwirusowych lub retrowirusowych za pomocą testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazie. Takie podejście oferuje szybki i stosunkowo niedrogi sposób na przebadanie przesiewowe setek kandydatów w jednym eksperymencie.

Identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie

Poznaj wysokoprzepustową metodę miareczkowania wirusów eksprymujących lucyferazę w liniach komórkowych Vero. Technika umożliwia szybkie przetwarzanie próbek z jednoczesną oceną cytotoksyczności komórek.

Wysokoprzepustowe miareczkowanie rekombinowanych wirusów eksprymujących lucyferazy

Przeglądaj więcej filmów