Wysokoprzepustowe miareczkowanie rekombinowanych wirusów eksprymujących lucyferazy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest oszacowanie miana wirusa znakowanego lucyferazy przy użyciu metody kwantyfikacji o wysokiej przepustowości. Osiąga się to poprzez przeniesienie supernatantu próbek, które mają być mianowane, a także krzywej wzorcowej wirusa na permisywną linię komórkową, aby umożliwić ekspresję lucyferazy. W drugim etapie RESA zurin może zostać dodany do oryginalnych próbek, które zostaną wykorzystane do oceny żywotności komórek.

Następnie, po odpowiednim czasie inkubacji, lucyferian dodaje się do komórek w celu ilościowego określenia za pomocą luminescencji. Wyniki pokazują ilość wirusa w próbce na podstawie ekspresji lucyferazy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tittering płytki nazębnej, jest to, że duża liczba próbek może być przetwarzana szybko i jednocześnie.

Metodę tę można również rozszerzyć na wirusy wykazujące ekspresję lucyferazy, które nie zalegają z jego eksprymacją. Ponieważ nie jest zależny od tworzenia się płytki nazębnej, odczyt cytotoksyczności komórek można łatwo włączyć do przepływu pracy i może być przydatny w kontekście badania przesiewowego leku. Procedurę zademonstrują Vanessa, Ramia i Colin, trzej doktoranci z mojego laboratorium, którzy najpierw przeprowadzają infekcje przy użyciu VSP Delta 51 eksprymującego lucyferazy świetlika w 96 roku.

Otóż supernatanty z tych płytek do kultur tkankowych będą miały miano po odpowiednim czasie inkubacji na 24 godziny przed mianowaniem. Przygotować zawiesinę komórek Vero w stężeniu 2,5 razy 10 do piątej komórki na mililitr w DMEM zawierającej 10% FBS 30 milimolowych hałd i 1% penicyliny streptomycyny C, 2,5 razy 10 do czwartej komórki w 96. Dobrze białe, solidne płytki z płaskim dnem za pomocą dozownika mikropłytek do przygotowania zawiesiny komórek, wyczyść kasetę dozownika mikropłytek, przepłukując rurkę 50 mililitrami sterylnej wody.

Następnie napełnij linie dozownika mikropłytek zawiesiną komórek, umożliwiając przepływ pięciu mililitrów zawiesiny komórek. Wybierz program, który dozuje 100 mikrolitrów do każdej studzienki z 96-dołkową płytką o białych ściankach i powtórz w razie potrzeby dla dodatkowych płytek. Wysiej również kilka dołków w 96-dołkowej, przezroczystej, białej płycie dolnej w celu weryfikacji zdrowia i gęstości komórek.

Po zakończeniu przepłucz komórki z powrotem do oryginalnego pojemnika. Wyczyść kasetę, przepuszczając przez rurkę 50 mililitrów 70% etanolu, a następnie 50 mililitrów ciepłej, sterylnej wody. Następnie inkubuj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.

Przygotować wzorcową krzywą VSV Delta 51 w DMEM wolnym od surowicy, tak aby końcowe stężenie jednostek platformowych na mililitr po przeniesieniu na komórki Vero było następujące. Przygotuj 50 mikrolitrów każdego stężenia na płytkę komórek Vero plus dodatkowe 10%Standardową krzywą można przenieść na płytkę o głębokości 96 sztuk. Następnie sprawdź komórki Vero posiane na przezroczystej dolnej płytce 96-dołkowej pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić, że monowarstwy są co najmniej w 95% zlewające się transtransferem.

25 mikrolitrów supernatantu próbki na komórki Vero osadzone na płytkach o białych ściankach przy użyciu 12-kanałowego pipetera wielokanałowego przy 25 mikrolitrach każdego rozcieńczenia krzywej wzorcowej do komórek Vero w dwóch wyznaczonych kolumnach. Odwirowywać płytki przez pięć minut w temperaturze 430 g w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj płytki przez pięć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.

W tym momencie dodać zurynę w ilości równej 10% objętości w każdym dołku z 96-dołkowej płytki próbek zawierających wirusa i komórki. Po dwóch do czterech godzinach odczytaj i zapisz sygnał za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych, używając 530 do 560 do wzbudzenia i 590 do raportu emisji. Żywotność komórek próbki według następującego wzoru.

Na 30 minut przed końcem pięciogodzinnej inkubacji przygotować Lucyfera do uzyskania roztworu o stężeniu dwa miligramy na mililitr w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem. Chronić roztwór przed światłem po pięciogodzinnym okresie inkubacji w 25 mikrolitrach Lucyfera do każdej studzienki komórek Vero na białych stałych płytkach z automatycznym dozownikiem zintegrowanym z luminometrem. Przeczytaj tabliczki z poniższymi parametrami.

Wstrząsaj przez pięć sekund i odczekaj 30 sekund. Odczytaj luminescencję przy odpowiedniej wartości ekspozycji ukośnika o stałej czułości, a następnie zarejestruj i zapisz ilościowo określoną intensywność bioluminescencyjną. Jeśli do dodania lucyferiana użyto automatycznego dozownika, przysiądź lucyfera i zalej linie sterylną wodą lub dokładnymi wynikami, rozwiąż regresję nieliniową, aby wygenerować równanie wzgórza z krzywych standardowych.

Zastosuj to równanie do próbek, z których ma się miano, aby obliczyć jednostki ekspresji wirusa. Wyniki typowej krzywej standardowej VSV Delta 51 są pokazane tutaj, lub analiza regresji nieliniowej parametrów wygenerowała wykres gradu, z którego można interpolować nieznane wejściowe jednostki formujące. Miana wirusa uzyskane za pomocą standardowego testu płytki nazębnej na komórkach Vero porównano z obliczonymi mianami wirusa z tych samych próbek.

lucyferazy o wysokiej przepustowości pochodziły z eksperymentu, w którym użyto różnych substancji chemicznych w celu zwiększenia replikacji i rozprzestrzeniania się komórek VSV Delta 51 i 7 8 6 0. Liniowa korelacja między mianami a jednostkami ekspresji wirusa o R do kwadratu 0,8083 i wyniku R Pearsona wynoszącym 0,899 jest przedstawiona tutaj. Typowe dane dotyczące cytotoksyczności komórek uzyskane z testu metabolicznego przedstawiono tutaj dla 7, 8 6 0 komórek poddanych działaniu substancji chemicznych przed zakażeniem.

W przypadku VSV Delta 51, typowych krzywych standardowych uzyskanych z wirusem opryszczki pospolitej, wirusem krowianki i wirusem związanym z adenowirusem, wszystkie wyrażające lucyferazy świetlika są tutaj wyświetlane. Po opanowaniu, technika ta może być wykorzystana do przeprowadzania wysokoprzepustowych badań przesiewowych bibliotek związków w połączeniu z wirusem będącym przedmiotem zainteresowania w celu wygenerowania miana i danych cytotoksyczności. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o odpowiednim rozcieńczeniu krzywej wzorcowej, ponieważ ma to kluczowe znaczenie dla interpolacji jednostek ekspresji wirusa.

Nie zapominaj, że praca z żywymi wirusami może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak praca w komorze bezpieczeństwa biologicznego i noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oszacować miana wirusa przy użyciu metody kwantyfikacji o wysokiej przepustowości opartej na ekspresji transgenu lucyferazy pomiar bioluminescencji w interpolacji nieznanych jednostek ekspresji wirusa. Na podstawie próbki z krzywej wzorcowej cytotoksyczność można jednocześnie określić za pomocą odpowiedniego testu żywotności.