Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

Ogólnym celem poniższego filmu jest zademonstrowanie prostej i niedrogiej techniki wytwarzania dobrego plonu białka lub kompleksów białkowych przy użyciu systemu ekspresji ssaków. Osiąga się to poprzez hodowlę komórek F HEC 2 93 w zawiesinie w wilgotnym inkubatorze z wytrząsaniem w atmosferze utrzymywanej na poziomie 5% dwutlenku węgla. W drugim etapie komórki są przejściowo transfekowane jednym lub więcej plazmidami o wysokiej liczbie kopii.

Używając środka do transfekcji polietylenu EIN lub PEI, komórki pozostawiono do wzrostu przez 48 godzin przed pobraniem. Następnie przeprowadza się oczyszczanie białka za pomocą żywicy powinowactwa, a następnie filtrację żelową w celu oczyszczenia interesującego kompleksu białkowego w celu przeprowadzenia badań strukturalnych i funkcjonalnych. Ostatecznie, ten niedrogi i prosty system ekspresji ssaków umożliwia ekspresję i oczyszczanie białek i kompleksów białkowych, które są trudne do ekspresji w komórkach bakteryjnych.

Główną zaletą tego podejścia jest jego wygoda i wszechstronność w zakresie ekspresji kompleksów białkowych. Jest to prawie tak proste, jak wytwarzanie białek w bakteriach, zwłaszcza, że można mieszać i dopasowywać wektory ekspresji białek. Metoda może być początkowo stosowana na małą skalę do testowania ekspresji kompresów białkowych, ale jest łatwo skalowalna, aby uzyskać dobrą wydajność kompresów białkowych W przypadku badań strukturalnych i funkcjonalnych kluczem do sukcesu jest utrzymanie komórek w zdrowym stanie, wolnym od infekcji bakteryjnych lub drożdżakowych.

Ponieważ antybiotyki w pożywce znacznie zmniejszają wydajność białka. Na początek wyjmij z ciekłego azotu fiolkę kriograficzną zawierającą jeden mililitr komórek HEC 2 9 3 F o gęstości 20 milionów komórek na mililitr i szybko rozmroź w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozbić wszelkie grudki, pipetując kilka razy w górę i w dół, a następnie odpipetować całą zawartość do stożkowej kolby do hodowli komórkowych o pojemności 250 mililitrów, zawierającej 34 mililitry pożywki wstępnej.

Po 48 godzinach umieść kulturę w nawilżonym inkubatorze z wytrząsaniem orbitalnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 120 obr./min i 5% dwutlenku węgla. Sprawdź żywotność komórek za pomocą błękitu trianowego. Barwienie normalnej żywotności komórek na tym etapie wynosi około 70%gdy komórki osiągną liczbę około 1 miliona komórek na mililitr.

Wmasuj je do końcowej liczby 0,35 miliona komórek na mililitr do stożkowej kolby do hodowli komórek o pojemności 250 mililitrów zawierającej 60 mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki, kontynuuj masaż komórek co 48 godzin lub gdy osiągną około 2 milionów komórek na mililitr. Pokazano tutaj próbkę komórek F Trian blue stain, HEC 2, 9, 3 w ilości 2,3 miliona komórek na mililitr z zapasu gotowego do wysiewu do transfekcji, komórki powinny być obecne tylko jako komórki pojedyncze lub dzielące się. Jeśli komórki są przerośnięte, utworzą duże grudki i będą miały bardzo niską żywotność, jak pokazano na tym rysunku.

Jeśli komórki tworzą skupiska, mogą one zostać rozbite przez energiczne wirowanie przez 25 sekund. Aby rozpocząć hodowle na dużą skalę, należy zasiać komórki w ilości pół miliona komórek na mililitr do końcowej objętości 300 mililitrów w każdej litrowej butelce rolkowej. Inkubować przez 24 godziny w wilgotnej wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 135 obr./min i 5% dwutlenku węgla, aż komórki osiągną gęstość 1 miliona komórek na mililitr.

Następnie odpipetuj łącznie 300 mikrogramów wysterylizowanego DNA z filtrem do 30 mililitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS i energicznie wiruj przez trzy sekundy. Następnie dodaj 1,2 mililitra po 0,5 miligrama na mililitr. Przefiltruj wysterylizowany PEI do roztworu PB SDNA i energicznie wiruj przez dodatkowe trzy sekundy.

Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 minut przed dodaniem mieszaniny do komórek po łóżeczku. Transfekcja inkubuje komórki w nawilżonym inkubatorze z wytrząsaniem orbitalnym przez kolejne 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 135 obr./min i 5% dwutlenku węgla po 48 godzinach. Zbieraj białka wewnątrzkomórkowe, odwirowując komórki w temperaturze 3000 razy G przez pięć minut.

Jeśli osad komórkowy nie jest przeznaczony do natychmiastowego użycia, można go przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem oczyszczania kompleksów białkowych z jądra, w którym jedno z białek ma znacznik flagowy. Aby rozpocząć rezus oczyszczania, zawiesić paletę komórek w około 40 mililitrach wstępnie schłodzonej lizy, bufor na litr kultury, stosując kombinację kilkakrotnie pipetowania w górę iw dół, a także sonikację szklanego homogenizatora przez trzy cykle po 15 sekund przy 15 sekundach przerwy.

Następnie odwiruj 108 000 razy G przez 25 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zachowaj natant leżący na wznak. Następnie zrównoważyć 1,2 mililitra żywicy aros upakowanej Anti-Flag na litr kultury, przemywając trzykrotnie buforem równowagi żywicy, inkubować supinat, który reprezentuje ekstrakt z całej komórki z żywicą powinowactwa w jednej lub więcej 50-mililitrowych probówkach wirówkowych, delikatnie obracając przez 30 do 120 minut w czterech stopniach Celsjusza po wirowaniu inkubacyjnym w temperaturze 3000 razy G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supinatu przenieś żywicę do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i przemyj łącznie 45 mililitrami wstępnie schłodzonego buforu, przed nim odwiruj, a następnie odrzuć supinat powtórne mycie i odwirowanie przy użyciu buforu o wysokiej zawartości soli, a następnie buforu o niskiej zawartości soli i buforu rozszczepiającego TEV.

Upewnij się, że każde pranie jest wystarczające do całkowitego ponownego zawieszenia żywicy, ale nie dłużej. Następnie zbierz 10 mikrolitrów próbkę żywicy i rozcieńcz w jednej objętości dwukrotnie razy białko buforu ładującego do analizy w celu przedstawienia próbki białka związanego. Nie używaj środków redukujących, ponieważ uwolnią one przeciwciało z żywicy.

Następnie ponownie zawiesić żywicę w 10 mililitrach wstępnie schłodzonego buforu rozszczepiającego TEV w około 40 mikrogramach proteazy TEV na litr oryginalnej kultury i wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę. Poziomy proteazy TEV można zoptymalizować w zależności od ilości białka ekspresyjnego. Zastąp atmosferę rurki 100% azotem, aby zapobiec utlenianiu białek, a następnie delikatnie obracaj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego dnia.

Odwirować próbkę o temperaturze 3000 razy G przez 10 minut, a następnie przenieść supinat do ultrafiltra odśrodkowego z odpowiednim odcięciem masy cząsteczkowej i zagęścić do 500 mikrolitrów. Zebrać 10 mikrolitrów próbki skoncentrowanego białka i rozcieńczyć w jednej objętości bufor dwukrotnie obciążający białko do analizy. Próbka ta reprezentuje próbkę eluacyjną TEV.

Następnie zebrać 10 mikrolitrów próbki żywicy i rozcieńczyć do jednej objętości buforu dwukrotnie obciążającego białko. Ta próbka reprezentuje próbkę żywicy po TEV. Następnym krokiem jest przepuszczenie białka przez kolumnę wykluczającą wielkość i należy zastosować odpowiednią matrycę filtracji żelu w zależności od wielkości kompleksu będącego przedmiotem zainteresowania.

W tym przypadku użyliśmy kolumny chromatograficznej S 200 o wymiarach 10 na 300 milimetrów, która zrównuje kolumnę chromatografii wykluczającej rozmiar z żelowym buforem filtracyjnym. Przefiltrować białko przez filtr 0,22 mikrona i załadować próbkę do kolumny. Przystąp do zbierania ułamków, gdy schodzą z kolumny.

W ostatnim kroku należy wykonać elektroferezę w żelu poliakrylamidowym SDS lub stronę SDS na pobranych próbkach, a także frakcjach filtracji żelu, histonach DS SLA jeden lub HD jeden supresor wadliwego wyciszenia trzy lub SDS trzy i syn trzy, domena interakcji HDAC lub syn trzy, HID tworzą stabilny kompleks obrotowy. Oczyszczanie powinowactwa kompleksu Turny'ego można zaobserwować za pomocą strony SDS. Pokazany tutaj jest oczyszczony kompleks wytwarzany przez łóżeczko, przenikający dwa litry komórek.

Pas związanego białka pokazuje kompleks związany z żywicą powinowactwa. Po trawieniu TEV znacznik obecny na grzechu trzy A HID jest odcinany i nawiązuje się do kompleksu. Przedstawiona tutaj żywica jest chromatogramem kompleksu białkowego oczyszczonego przy użyciu kolumny chromatograficznej wykluczającej o wymiarach 10 na 300 milimetrów S 200.

Zauważ, że czysty kompleks wymyka się blisko objętości pustki, ponieważ tworzy dimer w roztworze. Wreszcie, analiza strony SDS ujawnia oczyszczone białko w żelowych frakcjach filtracyjnych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować, utrzymywać i hodować zawiesinę kotranu HEC dwie i trzy komórki aplikacji, a także jak powinowactwo, oczyszczać i koncentrować białko.

Złożone zdrowe komórki będą miały zasadnicze znaczenie dla powodzenia eksperymentów, dlatego upewnij się, że są hodowane i regularnie utrzymują się w swoich warunkach i pasażach. Nie zniechęcaj się hodowlą tkankową. Biolodzy strukturalni mogą łatwo wyrażać i oczyszczać duże ilości białek i kompleksów białkowych z komórek ssaków.