Name: Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Poznaj ekspresję białek rekombinowanych w komórkach HEK 293F dla badań biologii strukturalnej. Ta metoda umożliwia uzyskanie wysokich plonów kompleksów białkowych trudnych do wyrażenia w bakteriach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Dr. Xiaowen Yang (usługa klonowania PROTEX) za przygotowanie konstrukcji wyrażeń używanych w tej pracy oraz University of Leicester Core Biotechnology Services. Prace te były wspierane przez stypendium BBSRC, program Wellcome Trust oraz granty dla starszych badaczy WT085408 & WT100237 oraz granty BBSRC RM31G0224.

UWAGA: Protokół jest odpowiedni dla każdej skali ekspresji, dlatego objętości i ilości odczynników powinny być skalowane proporcjonalnie. Dla tego protokołu należy użyć odpowiedniego wektora ekspresji ssaków. Tutaj użyliśmy zmodyfikowanego wektora ekspresji pcDNA 3.1, który wygodnie umożliwia włączenie lub wykluczenie znacznika powinowactwa w zależności od wyboru enzymów restrykcyjnych użytych w klonowaniu (ryc. 1). Poniższy protokół opisuje transfekcję na dużą skalę.
1. Hodowla na dużą skalę/transfekcja w 1 litrowych butelkach rolkowych
Hoduj i utrzymuj HEK293F komórki przystosowane do zawiesiny zgodnie ze standardowymi protokołami. Zazwyczaj kultury starterowe o pojemności od 30 do 100 ml są hodowane w stożkowych kolbach do hodowli komórkowych o pojemności 250 ml.
<ol>
	<li>Komórki nasienne w proporcji 0,5 x 106 komórek/ml do końcowej objętości 300 ml w każdej butelce rolkowej o pojemności 1 l. 
	UWAGA: Butelki rolkowe mieszczą od minimum 150 ml do maksimum 300 ml kultury zawiesiny. W przypadku transfekcji na większą skalę użyj wielu butelek.</li>
	<li>Inkubować przez 24 godziny w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną w temperaturze 37 °C, 120 obr./min i 5% CO2 do momentu, aż komórki osiągną gęstość 1,0 x 106 komórek/ml (komórki powinny dzielić się mniej więcej co 24 godziny).</li>
	<li>Odpipetować łącznie 300 μg wysterylizowanego przez filtr DNA (patrz metoda uzupełniająca) do 30 ml PBS i energicznie wirować przez 3 sek. 
	UWAGA: Użyj łącznie 1 μg DNA na milion transfekowanych komórek. Jeśli dwa lub więcej plazmidów ma być jednocześnie transfekowanych, zmniejsz ilość każdego z nich, tak aby stosunek DNA do komórek pozostał stały. </li>
	<li>Dodać 1,2 ml 0,5 mg/ml wysterylizowanego przez filtr PEI do roztworu PBS/DNA i energicznie wirować przez 3 sekundy.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Dodaj mieszaninę DNA/PEI do komórek – które powinny mieć gęstość 1 x 106 komórek/ml (krok 1.3).</li>
	<li>Po kotransfekcji inkubować komórki w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną przez kolejne 48 godzin w temperaturze 37 °C, 120 obr./min i 5% CO2 .</li>
	<li>Białka wewnątrzkomórkowe należy zbierać przez odwirowywanie komórek przy 3 000 x g przez 5 minut i przechowywać osad w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Alternatywnie należy użyć standardowego inkubatora z wytrząsaniem (bez emisjiCO2), jeśli atmosfera powyżej kultury zostanie zastąpiona 5% CO2 i pokrywka butelki jest szczelnie zamknięta. Atmosfera będzie musiała być wymieniana przy każdym przejściu (zwykle co 2 dni).</li>
</ol>
2. Oczyszczanie kompleksu białkowego z ekstraktu z całych komórek
Ten protokół jest zoptymalizowany do oczyszczania kompleksów jądrowych za pomocą białek oznaczonych flagą.
<ol>
	<li>Rozmrozić osad komórkowy w ~ 40 ml wstępnie schłodzonego buforu do lizy (100 mM octanu potasu, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glicerolu, 0,3% Triton X-100, inhibitory proteazy) na L hodowli.</li>
	<li>Ponownie zawiesić granulkę, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół (aby uniknąć pienienia, nie wirować).</li>
	<li>Dokładnie ponownie zawiesić komórki za pomocą homogenizatora szklanego. Sonikuj przez 3 cykle (15 sekund włączenia, 15 sekund wyłączenia). Wirować przy 30 000 x g przez 25 minut w temperaturze 4ºC i zachować supernatant.</li>
	<li>Zrównoważyć 1,25 ml żywicy agarozowej upakowanej przeciw flagom na litr kultury, przemłukując trzykrotnie buforem równoważącym żywicę (100 mM octanu potasu, 50 mM Tris pH 7,5).</li>
	<li>Inkubować ekstrakt z całych komórek z etapu 2.3 z żywicą powinowactwa w jednej lub kilku probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml i delikatnie obracać próbkę przez 30-120 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować przy 3 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant.</li>
	<li>Przemyć żywicę 45 ml wstępnie schłodzonego buforu 1 (100 mM octanu potasu, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glicerolu, 0,3% Triton X-100). Odwirować przy 3 000 x g przez 1 minutę i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Powtórz krok 2.7 używając buforu o wysokiej zawartości soli (300 mM octanu potasu, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glicerolu), a następnie buforu o niskiej zawartości soli (50 mM octanu potasu, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glicerolu) i buforu rozszczepiającego TEV (50 mM octanu potasu, 50 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM TCEP). 
	UWAGA: Upewnij się, że każde pranie jest krótkie, tj. wystarczające do całkowitego ponownego zawieszenia żywicy i nie dłużej.</li>
	<li>Zebrać 10 μl próbki żywicy i rozcieńczyć w 1 objętości 2x buforu ładującego białko do analizy (kontrola białka związanego). Nie należy stosować środków redukujących, aby uniknąć uwolnienia przeciwciała z żywicy.</li>
	<li>Ponownie zawiesić żywicę w 8-10 ml wstępnie schłodzonego buforu rozszczepiającego TEV i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodać ~40 μg proteazy TEV (z zapasu w dawce 1 mg/ml) na litr oryginalnej kultury i dobrze wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Zastąp atmosferę rurki gazem 100% N2, aby zapobiec utlenianiu białek.</li>
	<li>Delikatnie obrócić O/N w temperaturze 4ºC.</li>
	<li>Wirować przy 3 000 x g przez 10 minut. Przenieść supernatant do ultrafiltra odśrodkowego z odpowiednią granicą masy cząsteczkowej i zagęścić do 500 μl.</li>
	<li>Zebrać 10 μl próbki skoncentrowanego białka i rozcieńczyć w 1 objętości 2x buforu ładującego białko do analizy. (kontrola eluatu TEV).</li>
	<li>Zebrać 10 μl próbki żywicy i rozcieńczyć w 1 objętości 2x buforu ładującego białko do analizy. Nie należy stosować środków redukujących, aby uniknąć uwalniania dużych ilości przeciwciał z żywicy. (kontrola żywicy po TEV).</li>
	<li>Zrównoważyć kolumnę chromatograficzną wykluczającą wielkość z żelowym buforem filtracyjnym (50 mM octan potasu, 50 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM TCEP).</li>
	<li>Przefiltruj białko przez filtr 0,22 μm</li>
	<li>Załaduj próbkę do kolumny i zbierz frakcje.</li>
	<li>Pobrać próbki z kroków 2.9, 2.15 i 2.16 oraz frakcje filtracji żelu z kroku 2.19 na SDS-PAGE i barwieniu Coomassie w celu analizy. 
	UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie SDS-PAGE próbek z kroków 2.9, 2.15 i 2.16 przed filtracją żelową w celu potwierdzenia ekspresji białka docelowego.</li>
</ol>

<ol><li>Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Current opinion in biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).</li>
<li>Aricescu, A. R., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+recombinant+glycoproteins+in+mammalian+cells%3A+towards+an+integrative+approach+to+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology.</a> Current opinion in structural biology. 23 (3), 345-356 (2013).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Boussif, O., Zanta, M. A., Behr, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+galenics+improve+in+vitro+gene+transfer+with+cationic+molecules+up+to+1000-fold%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Optimized galenics improve in vitro gene transfer with cationic molecules up to 1000-fold.</a> Gene therapy. 3 (12), 1074-1080 (1996).</li>
<li>Godbey, W. T., Wu, K. K., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+%28ethylenimine%29+and+its+role+in+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Poly (ethylenimine) and its role in gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 60 ((2-3)), 149-160 (1999).</li>
<li>Beljelarskaya, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+expression+systems+for+production+of+recombinant+proteins+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus expression systems for production of recombinant proteins in insect and mammalian cells.</a> Molecular Biology. 45 (1), 123-138 (2011).</li>
<li>Cregg, J. M., Vedvick, T. S., Raschke, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+expression+of+foreign+genes+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris.</a> Nature Biotechnology. 11 (8), 905-910 (1993).</li>
<li>Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+HDAC3+bound+to+co-repressor+and+inositol+tetraphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate.</a> Nature. 481 (7381), 335-340 (2013).</li>
<li>Millard, C. J., Watson, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I+HDACs+Share+a+Common+Mechanism+of+Regulation+by+Inositol+Phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Class I HDACs Share a Common Mechanism of Regulation by Inositol Phosphates.</a> Molecular Cell. 51 (1), 57-67 (2013).</li>
<li>Tom, R., Bisson, L., Durocher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+HEK293-EBNA1+Cells+in+Suspension+with+Linear+PEI+for+Production+of+Recombinant+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Transfection of HEK293-EBNA1 Cells in Suspension with Linear PEI for Production of Recombinant Proteins.</a> CSH protocols. , pdb.prot4977(2008).</li>
<li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), (2002).</li>
<li>Baldi, L., Muller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Gene+Expression+in+Suspension+HEK%E2%80%90293+Cells%3A+Application+to+Large%E2%80%90Scale+Protein+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Transient Gene Expression in Suspension HEK‐293 Cells: Application to Large‐Scale Protein Production.</a> Biotechnology Progress. 21 (1), 148-153 (2005).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opracowaliśmy prostą i opłacalną metodę (PEI kosztuje znacznie mniej niż dostępne na rynku odczynniki do transfekcji lipofilowej) do ekspresji i oczyszczania dużych ilości rekombinowanych białek i kompleksów wielopodjednostkowych z komórek ssaków. Optymalna wydajność transfekcji i ekspresji może zostać osiągnięta, jeśli wysoce czyste plazmidowe DNA (260/280 między 1,8 a 2,0) jest używane w połączeniu z PEI, jak opisano w sekcji protokołu. Komórki muszą być hodowane w pożywkach wolnych od surowicy i antybiotyków, dlatego bezwzględnie wymagana jest sterylna technika pasażowania i transfekcji komórek, aby uniknąć kosztownych i czasochłonnych infekcji. Żywotność komórek powinna wynosić 90% lub więcej, a kultury nie powinny być hodowane do gęstości większej niż 2,5 x 106 komórek/ml bezpośrednio przed transfekcją, ponieważ zmniejszy to wydajność białka. Aby transfekcja zakończyła się sukcesem, hodowle powinny zawierać tylko pojedyncze lub dzielące się komórki. Gromady mogą być rozbijane przez energiczne wirowanie w ciągu 20 do 30 sekund (ryc. 5). Stosunek każdego plazmidu użytego w kotransfekcji może być zmieniany przez użytkownika w zależności od stechiometrii badanego kompleksu. Wydajność odciągania można zoptymalizować dla białka będącego przedmiotem zainteresowania, dzięki czemu można ustalić odpowiedni czas odciągania. Oczyszczanie powinno być przeprowadzane w niskiej temperaturze próbki białka przez cały czas, aby zmniejszyć ryzyko niepożądanej degradacji proteolitycznej. Wybór znaczników i oczyszczających ma kluczowe znaczenie, ponieważ mogą one zakłócać działanie elementów strukturalnych lub miejsc aktywnych niektórych białek, często powodując zmniejszoną rozpuszczalność i/lub utratę aktywności enzymatycznej. Transfekcje na małą skalę są szczególnie przydatne do testowania różnych konstruktów do oczyszczania dużych kompleksów białkowych.
Obecnie dostępnych jest wiele różnych alternatywnych metodologii ekspresji rekombinowanych białek eukariotycznych (Tabela 2). Na przykład ekspresja bakulowirusa w komórkach owadów jest szeroko stosowana ze względu na jego wysoką skuteczność transdukcji i brak cytotoksyczności w porównaniu z innymi gatunkami wirusów6. Jednak proces wytwarzania wirusa jest czasochłonny, a jego niestabilność nie pozwala na przechowywanie wirusa przez długi czas. Z drugiej strony, systemy ekspresji drożdży oferują możliwość hodowania komórek do bardzo dużych gęstości w kulturach fermentorowych, co skutkuje wysoką wydajnością białka7. Wciąż jednak brakuje im pełnej gamy modyfikacji potranslacyjnych wymaganych do prawidłowego fałdowania białek eukariotycznych i interakcji ze swoimi partnerami białkowymi. Na przykład HDAC3 ulega ekspresji, ale nie fałduje się w E. coli. Jednak po ekspresji w komórkach 293F byliśmy w stanie oczyścić aktywny enzym w kompleksie z jego korepresorem (SMRT) i cząsteczką tetrafosforanu inozytolu (IP4)8, którego nie ma w komórkach prokariotycznych. Metoda ta pozwoliła nam również oczyścić i rozwiązać strukturę krystaliczną HDAC1 oddziałującą z MTA1 w kompleksie NuRD, który jest podobnie aktywowany przez IP49. Idealnie byłoby, gdybyśmy zawsze chcieli mieć ekspresję białek eukariotycznych w ich naturalnym, fizjologicznym środowisku. Opisano systemy ekspresji ssaków wykorzystujące komórki HEK 293-EBNA1 w bioreaktorach10-12 , które dają bardzo wysokie poziomy białka, ale ich użycie może być skomplikowane.
Nasza metoda jest prostą i dostępną alternatywą dla ekspresji w systemach bakterii, drożdży i bioreaktorów. Metoda odciągania jest szybka i nie wymaga użycia drogiego sprzętu, szczególnie jeśli atmosfera w butelce rolkowej lub kolbie zostanie zastąpiona 5% CO2 i stosowane są standardowe inkubatory z wytrząsaniem. Wykorzystaliśmy te protokoły do jednoczesnej transfekcji wielu plazmidów i oczyszczania kompleksów z maksymalnie pięcioma białkami z wydajnością >1 mg / L hodowli. Co ciekawe, system pomaga w identyfikacji stabilnych, dobrze zachowujących się kompleksów. Na przykład ekspresja binarnego kompleksu HDAC1 i Sin3A dała ograniczoną wydajność białka, ale dodanie SDS3 spowodowało 5-krotnie większe ilości, a zatem prowadzi biologa strukturalnego w wyborze odpowiednich konstruktów i stabilnych kompleksów do krystalizacji.

Szybki postęp molekularnej biologii komórki i ciągłe zapotrzebowanie na ulepszone leki w medycynie stworzyły potrzebę dla biologów strukturalnych, aby przyglądać się coraz bardziej złożonym strukturom białkowym. Mogą one często wymagać szczególnych modyfikacji potranslacyjnych, molekularnych białek opiekuńczych i kofaktorów, aby wspierać ich skomplikowane fałdowanie i aktywność enzymatyczną. Podczas gdy zdecydowana większość struktur obecnych w Banku Danych o Białkach została uzyskana przy użyciu bakteryjnych systemów ekspresji, prokariota nie są w stanie przeprowadzić dużej liczby tych modyfikacji i brakuje im wielu niezbędnych kofaktorów eukariotycznych. Może to stanowić problem w badaniach dużych kompleksów wielopodjednostkowych, które są aktywowane przez małe cząsteczki sygnałowe, a także w przypadku białek jądrowych, powierzchniowych i wydzielanych komórek, które wymagają skomplikowanych mechanizmów fałdowania. Wiele szczepów E. coli zostało zaprojektowanych w celu przezwyciężenia niektórych z tych ograniczeń1. Jednak w ostatnich latach zastosowanie systemów ekspresji ssaków rośnie, ponieważ niezawodnie wytwarzają one białka eukariotyczne, których ekspresja w innym przypadku byłaby problematyczna w innych układach2. Obecnie możliwe jest uzyskanie stabilnych i przejściowych linii ekspresyjnych komórek ssaków za pomocą różnych technik, które obejmują transdukcję wirusa po transfekcję za pośrednictwem substancji chemicznych, fizyczny transfer genów, taki jak elektroporacja i bezpośrednia iniekcja3. Chociaż wszystkie te metody mają swój własny zestaw zalet i wad, tylko kilka z nich nadaje się do badań strukturalnych, które są albo zbyt drogie, albo czasochłonne.
Tutaj opisujemy bardzo prostą, szybką, niedrogą, a jednocześnie wysoce efektywną metodę ekspresji kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej w zawieszonych komórkach ssaków. Podejście to wykorzystuje przejściową kotransfekcję linii komórkowej ludzkiego embrionalnego nerki (HEK) (np. komórek Freestyle HEK 293F). Komórki te pochodzą z linii komórkowej HEK 293, są przystosowane do wzrostu w kulturach zawiesinowych, osiągając wysokie gęstości przy użyciu pożywek bez surowicy (takich jak FreeStyle 293 Expression Medium). Komórki są następnie przejściowo transfekowane przy użyciu rozgałęzionej wersji polietylenininy (PEI), niedrogiego odczynnika polimerowego, który, jak doniesiono, działa dla szerokiego zakresu komórek ssaków4 poprzez tworzenie kompleksów DNA/PEI, które dostają się do komórki gospodarza przez endocytozę5. Metoda ta nadaje się zarówno do eksperymentów na małą skalę (30 ml), jak i na dużą skalę (do 300 ml) i może wytwarzać wysokie poziomy oczyszczonych kompleksów białkowych. Jest to szczególnie przydatne do badania białek, które wymagają złożonych mechanizmów fałdowania, kofaktorów lub szczególnych modyfikacji potranslacyjnych, których nie mogą przeprowadzić komórki bakterii, drożdży i owadów.
W tym protokole prezentujemy ekspresję i oczyszczanie centralnego rusztowania trójbiałkowego z kompleksu represji transkrypcyjnej Sin3A. Składa się on z deacetylazy histonowej 1 (HDAC1), tłumika wadliwego wyciszenia 3 (SDS3) i niezależnego od przełącznika 3 (Sin3A). Oczyszczony kompleks służy do wysokoprzepustowych prób krystalizacji.

<table><tbody><tr><td>Ogniwa FreeStyle HEK 293F&nbsp;</td><td>LifeTechnologies</td><td>R790-07</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>LifeTechnologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>SIGMA</td><td>A220</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Kolba Erlenmeyera z wentylowaną nakrętką</td><td>Corning</td><td>431144</td><td></td></tr><tr><td>Butelki rolkowe z wentylowanymi</td><td>nakrętkami Corning</td><td>01836-02</td><td></td></tr><tr><td>Polietyleninina, 25 kDa, rozgałęziona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>Zrobić zapasy 0,5 mg/ml w H2O, dostosować pH do 7,0 za pomocą rozcieńczonego HCl i przechowywać w temperaturze -20 - 4&ordm; C</td></tr><tr>Wektor <td></td><td></td><td></td><td>ekspresji ssaków</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mikro; m Filtry odśrodkowe</td><td>Amicon</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Ultra filtry odśrodkowe (10 kDa odcięcie)</td><td>Amicon</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Superdex&nbsp; 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Nauki Przyrodnicze</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr></tbody></table>

ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych hek 293f: nowatorskie i dostępne podejście

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

Ekspresja i oczyszczanie dużych ilości rekombinowanych kompleksów białkowych jest podstawowym wymogiem dla badań biologii strukturalnej. Przez ponad dwie dekady prokariotyczne systemy ekspresji, takie jak E. coli, zdominowały literaturę naukową w stosunku do kosztownych i mniej wydajnych eukariotycznych linii komórkowych. Pomimo wyraźnej przewagi pod względem wydajności i kosztów ekspresji białek rekombinowanych w bakteriach, brak specyficznych kofaktorów, białek opiekuńczych i modyfikacji potranslacyjnych może powodować utratę funkcji, nieprawidłowe fałdowanie i może zakłócać interakcje białko-białko niektórych eukariotycznych kompleksów wielocząsteczkowych, receptorów powierzchniowych i wydzielanych białek. Zastosowanie systemów ekspresji komórek ssaków może rozwiązać te problemy, ponieważ zapewniają one eukariotyczne środowisko ekspresji. Jednak niska wydajność białka i wysokie koszty takich metod do niedawna ograniczały ich zastosowanie w biologii strukturalnej. Tutaj opisujemy prostą i dostępną metodę ekspresji i oczyszczania miligramowych ilości białka poprzez wykonywanie przejściowych transfekcji hodowanych w zawiesinie komórek HEK (Human Embryonic Kidney) 293F.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metodę przejściowej kotransfekcji i oczyszczania kompleksu trójskładnikowego HDAC1, SDS3 i Sin3A w skali 2 L (8 kultur po 250 ml). HDAC1 oraz SDS3 oddziałują z Sin3A za pośrednictwem domeny interakcji z HDAC (HID) białka Sin3A. Typowe oczyszczanie pozwala na uzyskanie do 1 mg kompleksu z jednego litra hodowli.
<img alt="Schemat kolistego wektora ekspresyjnego DNA, pcDNA 3.1, przedstawiający miejsca genowe i markery oporności na antybiotyki." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat zmodyfikowanego wektora ekspresyjnego pcDNA 3.1. Plazmid poddano trawieniu enzymami EcoRV i EcoRI, aby wprowadzić znacznik powinowactwa i miejsce cięcia TEV na terminusie aminowym Sin3A. W celu klonowania wersji HDAC1 i SDS3 bez znacznika, wektor poddano trawieniu enzymami KpnI i EcoRI.
<img alt="Schemat żelu SDS-PAGE z oczyszczania białka przedstawiający prążki HDAC1, SDS3, Sin3A-HID; eluat TEV." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. SDS-PAGE przedstawiająca pierwszy etap oczyszczania. Ścieżka „bound protein” pokazuje kompleks związany z żywicą powinowactwa. Po trawieniu proteazą TEV znacznik obecny na Sin3A-HID zostaje odcięty, a kompleks zostaje eluowany z żywicy, co pokazano na drugiej i trzeciej ścieżce żelu.
<img alt="Wykres chromatografii wykluczania wielkości; absorbancja przy 280 nm w funkcji objętości elucji; oczyszczanie białek." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Chromatogram kompleksu białkowego oczyszczonego za pomocą chromatografii wykluczania wielkości. Należy zauważyć, że czysty kompleks eluował w objętości martwej, ponieważ w roztworze tworzy on dimer.
<img alt="Schemat elektroforezy żelowej SDS-PAGE pokazujący rozdzielenie białek i identyfikację HDAC1, SDS3, Sin3A-HID." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. SDS-PAGE przedstawiający frakcje filtracji żelowej pokazane na Rysunku 3.
<img alt="Obraz mikroskopowy komórek, analiza statyczna do liczenia komórek, badania biologiczne, badanie gęstości komórek." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Komórki HEK 293F barwione błękitem trypanu o gęstości 2.3x106 komórek/ml przygotowane do transfekcji. Komórki powinny występować wyłącznie jako pojedyncze lub dzielące się, natomiast duże skupiska można rozbić poprzez energiczne mieszanie w vorteksie przez około 25 s.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Problem</td>
			<td>Możliwe przyczyny</td>
			<td>Działanie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Niska wydajność białka.</td>
			<td>Niska liczba przetransfekowanych komórek.</td>
			<td>Upewnij się, że gęstość komórek wynosi w przybliżeniu 1,0 x 106 przed dodaniem mieszaniny reakcyjnej do transfekcji do hodowli.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komórki mogły zostać poddane zbyt wielu pasażom.</td>
			<td>Należy użyć świeżych komórek ze stoków po około 90 pasażach.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas DNA może być zdegradowany lub zawierać dużą ilość zanieczyszczeń.</td>
			<td>Należy upewnić się, że stosowany plazmidowy DNA posiada stosunek 260/280 w zakresie od 1,8 do 2,0. W celu oceny jakości DNA zaleca się przeprowadzenie elektroforezy w żelu agarozowym.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ekspresowane białko (białka) nie jest wystarczająco stabilne lub rozpuszczalne.</td>
			<td>Przetestuj różne konstrukty w małej skali przed zwiększeniem skali transfekcji. Upewnij się, że znaczniki nie wpływają na strukturę białek będących przedmiotem badania.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komórki wydają się zmętniałe i mają nietypowy kolor i/lub zapach.</td>
			<td>Komórki są zakażane bakteriami lub drożdżami.</td>
			<td>Należy przez cały czas stosować właściwe techniki sterylności. W przypadku infekcji fumigacja komór z laminarnym przepływem powietrza oraz dezynfekcja pomieszczenia do hodowli komórkowej promieniowaniem UV pomagają w opanowaniu problemu.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Komórki wykazują niską żywotność.</td>
			<td>Niewłaściwe pH pożywki.</td>
			<td>Należy upewnić się, że hodowle są prowadzone w atmosferze zawierającej 5-8% CO2.2 przez cały czas.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komórki hodowano do uzyskania zagęszczenia przekraczającego 3,0x106  komórek/ml.</td>
			<td>Komórki nie powinny być hodowane do gęstości przekraczającej 2,5 x 106 komórek/ml bezpośrednio przed transfekcją i nigdy powyżej 3,0 x 106 komórek/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Oczyszczanie powinowactwem nie powiodło się</td>
			<td>Białko (białka) nie ulega ekspresji.</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warunki oczyszczania mogą być niewłaściwe.</td>
			<td>Dostosuj warunki buforu (np. wysoka zawartość soli, niska zawartość soli, pH.)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Rozwiązywanie problemów.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>System</td>
			<td>Zalety</td>
			<td>Wady</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>
			<ul>
				<li>Szybki system ekspresyjny</li>
				<li>Wysokie wydajności białka</li>
				<li>Niedrogi</li>
				<li>Odpowiednie do niskokosztowej produkcji białek znakowanych izotopowo</li>
			</ul>
			</td>
			<td>
			<ul>
				<li>Brak istotnych białek opiekuńczych (chaperonów), które mogą być wymagane do fałdowania białek</li>
				<li>Brak wielu modyfikacji potranslacyjnych</li>
				<li>Może brakować kofaktorów, które są istotne dla funkcji białka i/lub montażu kompleksu.</li>
			</ul>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P. pastoris</td>
			<td>
			<ul>
				<li>Może przeprowadzić większość modyfikacji potranslacyjnych</li>
				<li>Niedrogi</li>
			</ul>
			</td>
			<td>
			<ul>
				<li>Brak niektórych modyfikacji potranslacyjnych</li>
				<li>Mogą brakować kofaktorów istotnych dla funkcji białka i/lub montażu kompleksu.</li>
			</ul>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ekspresja bakulowirusowa w komórkach owadziej</td>
			<td>
			<ul>
				<li>Może przeprowadzać wszystkie modyfikacje potranslacyjne</li>
				<li>Bakulowirus jest mniej cytotoksyczny niż inne szczepy wirusów</li>
			</ul>
			</td>
			<td>
			<ul>
				<li>Przygotowanie wirusa do transdukcji jest czasochłonne.</li>
				<li>Wirus jest niestabilny i nie może być przechowywany przez dłuższy czas.</li>
				<li>Komórki owadzie mogą nie posiadać kofaktorów istotnych dla funkcji białek i/lub składania kompleksów.</li>
			</ul>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioreaktory z systemami ssaczymi</td>
			<td>
			<ul>
				<li>Może przeprowadzać wszystkie modyfikacje potranslacyjne</li>
				<li>Może dostarczyć wszystkich kofaktorów niezbędnych do funkcji białek i składania kompleksów</li>
				<li>Możliwość hodowli komórek przy bardzo wysokiej gęstości</li>
				<li>Może wyekspresować wszystkie białka ssaków wymagające złożonych mechanizmów fałdowania</li>
				<li>Bardzo wysokie wydajności białka</li>
			</ul>
			</td>
			<td>
			<ul>
				<li>Obsługa bioreaktora wymaga wyspecjalizowanego personelu.</li>
				<li>Wymagane jest kosztowne wyposażenie.</li>
				<li>Optymalizacja warunków ekspresji może być czasochłonna.</li>
			</ul>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>komórki zawiesinowe HEK 293F</td>
			<td>
			<ul>
				<li>Może przeprowadzać wszystkie modyfikacje potranslacyjne</li>
				<li>Może zapewnić wszystkie kofaktory niezbędne do funkcjonowania białek i montażu kompleksów</li>
				<li>Może ekspresować wszystkie białka ssaków wymagające złożonego mechanizmu fałdowania</li>
				<li>Szybki i intuicyjny protokół transfekcji</li>
				<li>Stosunkowo tanie w porównaniu z bioreaktorami i/lub innymi dostępnymi komercyjnie odczynnikami do transfekcji.</li>
			</ul>
			</td>
			<td>
			<ul>
				<li>Pomimo przystępnej ceny, nie jest to rozwiązanie tak tanie jak ekspresja w bakteriach</li>
			</ul>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Zalety i wady głównych systemów ekspresyjnych.

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

Ogólnym celem poniższego filmu jest zademonstrowanie prostej i niedrogiej techniki wytwarzania dobrego plonu białka lub kompleksów białkowych przy użyciu systemu ekspresji ssaków. Osiąga się to poprzez hodowlę komórek F HEC 2 93 w zawiesinie w wilgotnym inkubatorze z wytrząsaniem w atmosferze utrzymywanej na poziomie 5% dwutlenku węgla. W drugim etapie komórki są przejściowo transfekowane jednym lub więcej plazmidami o wysokiej liczbie kopii.Używając środka do transfekcji polietylenu EIN lub PEI, komórki pozostawiono do wzrostu przez 48 godzin przed pobraniem. Następnie przeprowadza się oczyszczanie białka za pomocą żywicy powinowactwa, a następnie filtrację żelową w celu oczyszczenia interesującego kompleksu białkowego w celu przeprowadzenia badań strukturalnych i funkcjonalnych. Ostatecznie, ten niedrogi i prosty system ekspresji ssaków umożliwia ekspresję i oczyszczanie białek i kompleksów białkowych, które są trudne do ekspresji w komórkach bakteryjnych.Główną zaletą tego podejścia jest jego wygoda i wszechstronność w zakresie ekspresji kompleksów białkowych. Jest to prawie tak proste, jak wytwarzanie białek w bakteriach, zwłaszcza, że można mieszać i dopasowywać wektory ekspresji białek. Metoda może być początkowo stosowana na małą skalę do testowania ekspresji kompresów białkowych, ale jest łatwo skalowalna, aby uzyskać dobrą wydajność kompresów białkowych W przypadku badań strukturalnych i funkcjonalnych kluczem do sukcesu jest utrzymanie komórek w zdrowym stanie, wolnym od infekcji bakteryjnych lub drożdżakowych.Ponieważ antybiotyki w pożywce znacznie zmniejszają wydajność białka. Na początek wyjmij z ciekłego azotu fiolkę kriograficzną zawierającą jeden mililitr komórek HEC 2 9 3 F o gęstości 20 milionów komórek na mililitr i szybko rozmroź w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozbić wszelkie grudki, pipetując kilka razy w górę i w dół, a następnie odpipetować całą zawartość do stożkowej kolby do hodowli komórkowych o pojemności 250 mililitrów, zawierającej 34 mililitry pożywki wstępnej.Po 48 godzinach umieść kulturę w nawilżonym inkubatorze z wytrząsaniem orbitalnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 120 obr./min i 5% dwutlenku węgla. Sprawdź żywotność komórek za pomocą błękitu trianowego. Barwienie normalnej żywotności komórek na tym etapie wynosi około 70%gdy komórki osiągną liczbę około 1 miliona komórek na mililitr.Wmasuj je do końcowej liczby 0,35 miliona komórek na mililitr do stożkowej kolby do hodowli komórek o pojemności 250 mililitrów zawierającej 60 mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki, kontynuuj masaż komórek co 48 godzin lub gdy osiągną około 2 milionów komórek na mililitr. Pokazano tutaj próbkę komórek F Trian blue stain, HEC 2, 9, 3 w ilości 2,3 miliona komórek na mililitr z zapasu gotowego do wysiewu do transfekcji, komórki powinny być obecne tylko jako komórki pojedyncze lub dzielące się. Jeśli komórki są przerośnięte, utworzą duże grudki i będą miały bardzo niską żywotność, jak pokazano na tym rysunku.Jeśli komórki tworzą skupiska, mogą one zostać rozbite przez energiczne wirowanie przez 25 sekund. Aby rozpocząć hodowle na dużą skalę, należy zasiać komórki w ilości pół miliona komórek na mililitr do końcowej objętości 300 mililitrów w każdej litrowej butelce rolkowej. Inkubować przez 24 godziny w wilgotnej wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 135 obr./min i 5% dwutlenku węgla, aż komórki osiągną gęstość 1 miliona komórek na mililitr.Następnie odpipetuj łącznie 300 mikrogramów wysterylizowanego DNA z filtrem do 30 mililitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS i energicznie wiruj przez trzy sekundy. Następnie dodaj 1,2 mililitra po 0,5 miligrama na mililitr. Przefiltruj wysterylizowany PEI do roztworu PB SDNA i energicznie wiruj przez dodatkowe trzy sekundy.Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 minut przed dodaniem mieszaniny do komórek po łóżeczku. Transfekcja inkubuje komórki w nawilżonym inkubatorze z wytrząsaniem orbitalnym przez kolejne 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 135 obr./min i 5% dwutlenku węgla po 48 godzinach. Zbieraj białka wewnątrzkomórkowe, odwirowując komórki w temperaturze 3000 razy G przez pięć minut.Jeśli osad komórkowy nie jest przeznaczony do natychmiastowego użycia, można go przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem oczyszczania kompleksów białkowych z jądra, w którym jedno z białek ma znacznik flagowy. Aby rozpocząć rezus oczyszczania, zawiesić paletę komórek w około 40 mililitrach wstępnie schłodzonej lizy, bufor na litr kultury, stosując kombinację kilkakrotnie pipetowania w górę iw dół, a także sonikację szklanego homogenizatora przez trzy cykle po 15 sekund przy 15 sekundach przerwy.Następnie odwiruj 108 000 razy G przez 25 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zachowaj natant leżący na wznak. Następnie zrównoważyć 1,2 mililitra żywicy aros upakowanej Anti-Flag na litr kultury, przemywając trzykrotnie buforem równowagi żywicy, inkubować supinat, który reprezentuje ekstrakt z całej komórki z żywicą powinowactwa w jednej lub więcej 50-mililitrowych probówkach wirówkowych, delikatnie obracając przez 30 do 120 minut w czterech stopniach Celsjusza po wirowaniu inkubacyjnym w temperaturze 3000 razy G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supinatu przenieś żywicę do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i przemyj łącznie 45 mililitrami wstępnie schłodzonego buforu, przed nim odwiruj, a następnie odrzuć supinat powtórne mycie i odwirowanie przy użyciu buforu o wysokiej zawartości soli, a następnie buforu o niskiej zawartości soli i buforu rozszczepiającego TEV.Upewnij się, że każde pranie jest wystarczające do całkowitego ponownego zawieszenia żywicy, ale nie dłużej. Następnie zbierz 10 mikrolitrów próbkę żywicy i rozcieńcz w jednej objętości dwukrotnie razy białko buforu ładującego do analizy w celu przedstawienia próbki białka związanego. Nie używaj środków redukujących, ponieważ uwolnią one przeciwciało z żywicy.Następnie ponownie zawiesić żywicę w 10 mililitrach wstępnie schłodzonego buforu rozszczepiającego TEV w około 40 mikrogramach proteazy TEV na litr oryginalnej kultury i wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę. Poziomy proteazy TEV można zoptymalizować w zależności od ilości białka ekspresyjnego. Zastąp atmosferę rurki 100% azotem, aby zapobiec utlenianiu białek, a następnie delikatnie obracaj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego dnia.Odwirować próbkę o temperaturze 3000 razy G przez 10 minut, a następnie przenieść supinat do ultrafiltra odśrodkowego z odpowiednim odcięciem masy cząsteczkowej i zagęścić do 500 mikrolitrów. Zebrać 10 mikrolitrów próbki skoncentrowanego białka i rozcieńczyć w jednej objętości bufor dwukrotnie obciążający białko do analizy. Próbka ta reprezentuje próbkę eluacyjną TEV.Następnie zebrać 10 mikrolitrów próbki żywicy i rozcieńczyć do jednej objętości buforu dwukrotnie obciążającego białko. Ta próbka reprezentuje próbkę żywicy po TEV. Następnym krokiem jest przepuszczenie białka przez kolumnę wykluczającą wielkość i należy zastosować odpowiednią matrycę filtracji żelu w zależności od wielkości kompleksu będącego przedmiotem zainteresowania.W tym przypadku użyliśmy kolumny chromatograficznej S 200 o wymiarach 10 na 300 milimetrów, która zrównuje kolumnę chromatografii wykluczającej rozmiar z żelowym buforem filtracyjnym. Przefiltrować białko przez filtr 0,22 mikrona i załadować próbkę do kolumny. Przystąp do zbierania ułamków, gdy schodzą z kolumny.W ostatnim kroku należy wykonać elektroferezę w żelu poliakrylamidowym SDS lub stronę SDS na pobranych próbkach, a także frakcjach filtracji żelu, histonach DS SLA jeden lub HD jeden supresor wadliwego wyciszenia trzy lub SDS trzy i syn trzy, domena interakcji HDAC lub syn trzy, HID tworzą stabilny kompleks obrotowy. Oczyszczanie powinowactwa kompleksu Turny'ego można zaobserwować za pomocą strony SDS. Pokazany tutaj jest oczyszczony kompleks wytwarzany przez łóżeczko, przenikający dwa litry komórek.Pas związanego białka pokazuje kompleks związany z żywicą powinowactwa. Po trawieniu TEV znacznik obecny na grzechu trzy A HID jest odcinany i nawiązuje się do kompleksu. Przedstawiona tutaj żywica jest chromatogramem kompleksu białkowego oczyszczonego przy użyciu kolumny chromatograficznej wykluczającej o wymiarach 10 na 300 milimetrów S 200.Zauważ, że czysty kompleks wymyka się blisko objętości pustki, ponieważ tworzy dimer w roztworze. Wreszcie, analiza strony SDS ujawnia oczyszczone białko w żelowych frakcjach filtracyjnych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować, utrzymywać i hodować zawiesinę kotranu HEC dwie i trzy komórki aplikacji, a także jak powinowactwo, oczyszczać i koncentrować białko.Złożone zdrowe komórki będą miały zasadnicze znaczenie dla powodzenia eksperymentów, dlatego upewnij się, że są hodowane i regularnie utrzymują się w swoich warunkach i pasażach. Nie zniechęcaj się hodowlą tkankową. Biolodzy strukturalni mogą łatwo wyrażać i oczyszczać duże ilości białek i kompleksów białkowych z komórek ssaków.

recombinant-protein-expression-for-structural-biology-hek-293f

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Transdukcja białek umożliwia bezpośrednie dostarczanie biologicznie czynnych białek do komórek. W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod, takich jak transfekcja DNA czy transdukcja wirusowa, ten nieinwazyjny paradygmat pozwala na wysoce efektywną manipulację komórkową w sposób miareczkowalny, unikając toksyczności komórkowej oraz ryzyka transformacji onkogennej wynikającej z trwałej modyfikacji genetycznej.

Inżynieria białek przenikających przez błony komórkowe

Niezawodna metoda wysokowydajnej ekspresji in vitro i następującego po niej zapisu elektrofizjologicznego rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowlach ludzkich komórek embrionalnej nerki (HEK-293T).

Zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach HEK-293T

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Kindliny mają fundamentalne znaczenie dla adhezji komórek poprzez integryny, ale badania nad nimi były utrudnione z powodu trudności napotkanych podczas ich rekombinacyjnej ekspresji u gospodarzy bakteryjnych. Opisujemy tutaj metody ich efektywnej produkcji w komórkach owadów zakażonych bakulowirusem.

Wydajna produkcja i oczyszczanie rekombinowanego mysiego Kindlin-3 z komórek owadów do badań biofizycznych

Rozwój biotynylowalnych białek fuzyjnych ma wiele potencjalnych zastosowań w różnych dziedzinach badań. Inżynieria białek rekombinowanych to prosta procedura, która jest opłacalna, zapewniając wysoką wydajność niestandardowych białek.

Ekspresja, izolacja i oczyszczanie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych białek biotynylowanych do regeneracji tkanki nerwowej

To jest szybki, efektywny kosztowo protokół produkcji wydzielanych, glikozylowanych białek ssaków i późniejszego jednoetapowego oczyszczania z wystarczającą wydajnością jednorodnego białka do krystalografii rentgenowskiej i innych badań biofizycznych.

Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Nielityczne systemy ekspresji komórek owadów są niedostatecznie wykorzystywane do produkcji, transportu/lokalizacji komórkowej i analizy funkcjonalnej białek rekombinowanych. W tym miejscu opisujemy metody generowania wektorów ekspresyjnych i późniejszej przejściowej ekspresji białek w dostępnych na rynku liniach komórkowych lepidoptera. Przedstawiono również kolokalizację akwaporyn Bemisia tabaci z subkomórkowymi białkami markerowymi fluorescencyjnymi.

Przejściowa ekspresja i lokalizacja komórkowa rekombinowanych białek w hodowanych komórkach owadów

Prezentujemy podejścia do biofizycznej i strukturalnej charakterystyki glikoprotein z fałdowaniem immunoglobulin za pomocą interferometrii biowarstwowej, izotermicznej kalorymetrii miareczkowej i krystalografii rentgenowskiej.

Charakterystyka glikoprotein z fałdem immunoglobulinowym za pomocą krystalografii rentgenowskiej i technik biofizycznych

Badania strukturalne i biochemiczne ludzkich transporterów błonowych wymagają miligramowych ilości stabilnego, nienaruszonego i jednorodnego białka. W tym miejscu opisujemy skalowalne metody badań przesiewowych, ekspresji i oczyszczania ludzkich transporterów nośników substancji rozpuszczonych przy użyciu genów zoptymalizowanych pod kątem kodonów.

Wysokoprzepustowa ekspresja i oczyszczanie ludzkich nośników substancji rozpuszczonych do badań strukturalnych i biochemicznych

Protokół ten opisuje produkcję rekombinowanej ludzkiej rybonukleazy SLFN14 oraz jej stechiometryczną analizę za pomocą fotometrii masowej.<br...

Szybka produkcja rekombinowanego rybonukleazy SLFN14 u człowieka oraz analiza stechiometryczna za pomocą fotometrii masowej

Poznaj ekspresję białek rekombinowanych w komórkach HEK 293F dla badań biologii strukturalnej. Ta metoda umożliwia uzyskanie wysokich plonów kompleksów białkowych trudnych do wyrażenia w bakteriach.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

Przeglądaj więcej filmów