Name: Niedokrwienne uszkodzenie tkanki w grzbietowej komorze fałdu skórnego myszy: model płata skóry do badania ostrego uporczywego niedokrwienia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj model niedokrwiennego płata skóry w grzbietowej komorze skórnej myszy. Ta metoda umożliwia wizualizację mikrokrążenia przez 10 dni przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Katharinie Haberland za edycję obrazu. Finansowanie: Główny autor otrzymał grant KKF od Technische Universität München na założenie nowego laboratorium badawczego.

UWAGA: Przed wdrożeniem przedstawionego modelu, należy zapoznać się z odpowiednimi przepisami dotyczącymi ochrony zwierząt i uzyskać zgodę od lokalnych władz. W niniejszej pracy wszystkie doświadczenia zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami przewodnimi dla badań na zwierzętach oraz niemieckimi przepisami dotyczącymi ochrony zwierząt. Eksperymenty zostały zatwierdzone przez lokalny komitet opieki nad zwierzętami.
1. Przygotowanie zwierzęcia i chirurgiczne uniesienie płata
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Trzymaj zwierzęta w pojedynczych klatkach w temperaturze pokojowej 22–24 °C i wilgotności względnej 60–65% w 12-godzinnym cyklu dnia i nocy. Pozwól myszom na swobodny dostęp do wody pitnej i standardowej karmy laboratoryjnej. Zawsze utrzymuj sterylne warunki podczas operacji przeżycia.</li>
	<li>Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,1 ml roztworu soli fizjologicznej na 10 g masy ciała, zawierającego 90 mg/kg m.c. chlorowodorku ketaminy i 25 mg/kg m.c. chlorowodorku dihydroksylidynotiazyny. Znieczulenie jest niezbędne do przygotowania zwierząt, zabiegu chirurgicznego i późniejszej mikroskopii. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, sprawdzając reakcję na bolesny bodziec. W czasie znieczulenia nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Po wprowadzeniu odpowiedniego znieczulenia należy osuszyć plecy golarką elektryczną. Następnie nałóż krem do depilacji na ogolony obszar, aby usunąć pozostałe włosy.</li>
	<li>W czasie przebywania kremu do depilacji ~7–10 min przygotuj narzędzia, w tym kleszczyki do skóry i mikrokleszczyki, nożyczki i mikronożyczki, materiał do szycia i marker. Zdezynfekować i przygotować komorę tytanową, przykręcając dwie z nakrętką u podstawy komory oraz mocując piankę samoprzylepną (rys. 1 A-C) wokół okienka odpowiednika komory, aby zagwarantować szczelność układu komory.</li>
	<li>Usuń cały krem do depilacji z tyłu, zmywając go letnią wodą. Następnie osusz i zdezynfekuj skórę roztworem zawierającym alkohol.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej i nakreśl linię środkową pleców. Chwyć skórę centralnie i unieś ją do góry, aby utworzyć fałd (ryc. 2A). Poprzez trans-oświetlenie przy użyciu dowolnego rodzaju źródła światła, zdecyduj, gdzie tymczasowo umieścić tytanową ramę (rys. 2B). Upewnij się, że dystalne gałęzie bocznej tętnicy piersiowej (LTA) czaszkowo i głębokiej tętnicy biodrowej obwodowej (DCIA) doogonowo przechodzą przez środek okna komory (ryc. 2B-D). Po ustawieniu komory należy przebić obie warstwy skóry na samym dole fałdy w celu późniejszego zamocowania tytanowej ramy. Teraz zdejmij tytanową ramę, umieść mysz w pozycji leżącej i w razie potrzeby ponownie nakreśl linię środkową pleców.</li>
	<li>Obrysuj płat prostopadle do grzbietu, zaczynając od linii środkowej, ze stosunkiem szerokości do długości 15 x 11 mm, aby uzyskać klapę o boku i losowo perfundowanej. Następnie obrysuj dodatkowy obszar skóry o grubości 2 mm rozciągający się na stronę przeciwległą (rys. 2C, D). Obszar ten jest pobierany za pomocą kleszczy, a następnie przyszywany do tytanowej ramy bez ingerencji w widoczny obszar klapy.</li>
	<li>Po ostatecznym znakowaniu naciąć klapkę. W tym celu należy przeciąć zarówno LTA, jak i DCIA i podnieść klapkę (rys. 2E). Nie ma potrzeby koagulacji ani podwiązania przeciętych naczyń.</li>
	<li>Wprowadzić komory przez wcześniej wykonane perforacje skóry (ryc. 2F) i przymocować fałd skórny zarówno do przodu, jak i do tyłu w obrębie ramy komory podwyższonej klapy do tylnej części ramy za pomocą otworów ramy komory i szwów przerywanych 5-0 (ryc. 2G).</li>
	<li>Zszyć pionowe kończyny płata z powrotem do otaczającej skóry za pomocą szwów przerywanych 5-0 (ryc. 2H, I).</li>
	<li>Należy wyciąć półokrągły obszar skóry po bokach małego paska skóry o średnicy 2 mm, tj. po drugiej stronie płata, aby obserwować unaczynienie płata. Umożliwia to bezpośredni widok przez okno obserwacyjne komory o powierzchni 90 mm2.</li>
	<li>Usunąć żelatynową luźną tkankę otoczki z mięśnia prążkowanego za pomocą narzędzi mikrochirurgicznych i optycznej soczewki powiększającej lub mikroskopu w celu poprawy jakości obrazu podczas mikroskopii. Staraj się nie uszkadzać naczyń w obrębie warstw tkanki mięśniowej.</li>
	<li>Na koniec uszczelnić komorę, montując odpowiednik ramy, który wcześniej został wyposażony w samoprzylepne paski pianki z przodu, czaszki i z tyłu, zalać klapę miejscowym bisbenzimidem i solą fizjologiczną (ryc. 2J). Następnie przymocować okienko obserwacyjne ze szkłem nakrywkowym za pomocą pierścienia osadczego sprężynującego. Staraj się nie zatrzymywać pęcherzy powietrznych pod szkłem (rys. 2K, L). Skóra przylega do szkła nakrywkowego dzięki siłom adhezji.</li>
</ol>
2. Mikroskopia epifluorescencyjna przyżyciowej
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Po przygotowaniu chirurgicznym należy odczekać 24 godziny na pierwszą analizę mikroskopową, aby uzyskać idealną jakość optyczną. Analiza ta stanowi punkt odniesienia dla mikroskopii i jest powtarzana w 3., 5., 7. i 10. dniu po operacji. Za każdym razem znieczulaj mysz zgodnie z opisem w kroku 1.2. Umieść zwierzę w bocznej pozycji odleżynowej na specjalnie wykonanym transporterze z pleksiglasu. W ten sposób warstwy tkanki mięśniowej klapki przylegające do szkła nakrywkowego są skierowane do góry.</li>
	<li>Wstrzyknąć 0,05 ml 5% dekstranu zielonej fluorescencji (masa cząsteczkowa 150 000) i 0,05 ml 1% wysoce fluorescencyjnego barwnika z rodziny rodaminy do żyły ogonowej lub splotu żylnego zapuszkowego. Zielony fluorescencyjny dekstran barwi niekomórkowe składniki krwi, jeśli jest podawany dożylnie (dożylnie). Fluorescencyjna rodamina barwi leukocyty i płytki krwi, które można odróżnić od innych składników komórkowych i niekomórkowych. Wreszcie bisbenzimid barwi składniki jądrowe, które emitują mniej lub bardziej fluorescencję w zależności od stanu kondensacji.</li>
	<li>Następnie umieść mysz pod mikroskopem. Upewnij się, że mikroskop zawiera system LED - kombinacje wiązki LED dla 470 i 425 nm, 365 i 490 nm oraz 540 i 580 nm, a także odpowiednie zestawy filtrów (62 HE BFP/GFP/HcRed, zakres 1: długość fali wzbudzenia 350–390 nm, podział 395 nm / 402–448 nm; zakres 2: 460–488 nm, podział 495 nm / 500–557 nm; Zakres 3: 567–602 nm, podział 610 nm / 615 nm na nieskończoność. 20 Rodamina, zakres: 540–552 nm, split 560 nm, emisja 575–640 nm).</li>
	<li>Nagrywaj zdjęcia i filmy za pomocą kamery wideo z urządzeniem sprzężonym z ładowaniem i zapisuj je na dysku twardym komputera w celu dalszej analizy w trybie off-line.</li>
	<li>Używaj różnych obiektywów (2,5X, NA (apertura numeryczna) = 0,06 dla panoramicznych widoków komory; 5X, NA = 0,16; 10X, NA = 0,32; 20X, NA = 0,50; 50X, NA = 0,55) dla nagrań obszarów zainteresowania.</li>
	<li>Wirtualnie należy podzielić powierzchnię klapy, która jest widoczna przez okno komory, na trzy obszary o równej wysokości, tj. obszar bliższy, centralny i dystalny najbardziej oddalony od dopływu naczyniowego (ryc. 3F). W celu uzyskania obrazu należy postępować w następujący sposób w każdym punkcie czasowym obserwacji:
	<ol>
		<li>Skanuj tkankę obraz po obrazie w oknie komory od proksymalnego do dystalnego za pomocą obiektywu 5X.</li>
		<li>W każdym obszarze płata wybierz tętniczki drugiego lub trzeciego rzędu i towarzyszące im żyłki z łatwymi do zidentyfikowania wzorami rozgałęzień. Korzystając z obiektywu 5X, 10X lub 20X, wykonaj wydruki pęczków tętniczo-komorowych, aby łatwo przemieścić pęczki przez cały okres obserwacji.</li>
		<li>W przypadku obiektywów 20X i 50X dodatkowo rejestruj odpowiednio 5–6 pól kapilarnych i pól "apoptotycznych" na obszar płatka. Wszystkie obrazy zarejestrowane obiektywami 10X i 20X wykorzystują filtr światła niebieskiego (dekstran fluorescencyjny) i światła zielonego (rodamina), natomiast obrazy zarejestrowane obiektywem 5X i 50X wykorzystują odpowiednio filtr światła niebieskiego (dekstran fluorescencyjny) i filtra światła białego (bisbenzimid).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza zarejestrowanych danych
UWAGA: Za pomocą systemu wspomaganej komputerowo analizy obrazu określ ilościowo wszystkie zarejestrowane parametry off-line w następujący sposób29.
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Pomiar powierzchni nieperfundowanej, odpowiednio martwiczej tkanki (mm2).
	<ol>
		<li>Pełny obraz z okna zeskanowanej komory zarejestrowany obiektywem 5X (z 2.6.1) i fluorescencyjnym dekstranem służy do pomiaru nieperfundowanej lub martwiczej tkanki. Użyj funkcji "AreaBo", aby zmierzyć nieperfuzjowany ciemny obszar: Obramuj obszar nieperfuzyjny i oblicz obszar w mm2 za pomocą algorytmów pomiaru obszaru oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar średnicy mikronaczyniowej w tętniczkach, naczyniach włosowatych i żyłkach (μm).
	<ol>
		<li>Załaduj do oprogramowania wideo lub zdjęcia z nagranych wiązek AV lub pól kapilarnych. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy używać zdjęć lub filmów o największym powiększeniu, na których wyraźnie widoczne są wyraźne granice naczynia.</li>
		<li>Użyj funkcji "DiamPe" w oprogramowaniu, aby upewnić się, że pomiary są wykonywane prostopadle do ściany naczynia. W tym celu zaznacz dwa punkty na ścianie naczynia, a trzecim kliknięciem zaznacz prostopadłą średnicę naczynia. Oprogramowanie wykona pomiar w μm.</li>
		<li>Powtórz pomiary na tych samych naczyniach dla wszystkich nagrań w tym samym miejscu. Zmierz wiele naczyń włosowatych, aby uzyskać średnią średnicę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza prędkości czerwonych krwinek (RBC) w tętniczkach, naczyniach włosowatych i żyłkach (mm/s).
	<ol>
		<li>Do pomiarów prędkości (mm/s) tętniczek krwinek czerwonych (RBC) należy użyć funkcji "VeloLSD" oprogramowania i wybrać te same naczynia w oknie fluorescencyjnym dekstranu, dla których zmierzono średnice.</li>
		<li>Przeanalizuj go za pomocą systemu komputerowej analizy obrazu przy użyciu metody przesunięcia linii, która opiera się na pomiarze przesunięcia (mm) indywidualnego wewnątrznaczyniowego wzorca poziomu szarości w czasie (s).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar objętościowego przepływu krwi w naczyniach (pl/s).
	<ol>
		<li>Obliczyć objętościowy przepływ krwi (pl/s) w tętniczkach, żyłkach i naczyniach włosowatych na podstawie prędkości RBC i pola przekroju poprzecznego naczynia (π * r2) zgodnie z równaniem Grossa i Aroesty'ego, czyli Q = V * π * r2, przyjmując cylindryczny kształt naczynia30.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar funkcjonalnej gęstości kapilarnej naczyń włosowatych perfundowanych przez erytrocyty (perfuzja odżywcza: cm/cm2).
	<ol>
		<li>Załaduj do oprogramowania zarejestrowane fluorescencyjne pole kapilarne z 20-krotnym powiększeniem obiektywu. Użyj funkcji "DensLA" do pomiaru funkcjonalnej gęstości kapilarnej mikronaczyń perfundowanych przez erytrocyty.</li>
		<li>Obrysuj perfundowane naczynia włosowate kursorem i zaznacz perfundowane naczynia. Nie oznaczać nieperfundowanych naczynek, tętniczek ani żyłek. Oprogramowanie będzie mierzyć funkcjonalną gęstość kapilar perfundowanych naczyń włosowatych w cm/cm2. Powtórz kroki dla innych zarejestrowanych pól kapilarnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar krętości mikronaczyń (przebudowa mikronaczyniowa), wczesnych objawów angiogenezy, takich jak tworzenie pąków i kiełków oraz nowo powstałych mikronaczyń.
	<ol>
		<li>Załaduj nagrane filmy lub klatki fluorescencyjnych pól kapilarnych do oprogramowania. Zidentyfikuj naczynia żyroskowe i skorzystaj z funkcji "TorqIx" w oprogramowaniu. Śledź określony przepływ statku wraz z kursem i zakończ prawym kliknięciem. Oprogramowanie narysuje linię prostą dla drogi bezpośredniej i ustawi ją w stosunku do wyznaczonej ścieżki. 
		UWAGA: Uważaj na oznaki angiogenezy, takie jak pąki, kiełki i nowo powstałe naczynia włosowate, które zwykle emanują prostopadle z wcześniej istniejących naczyń włosowatych. Zmierz gęstość tych nowo utworzonych naczyń zgodnie z opisem w kroku 3.5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja cech apoptotycznej śmierci komórki, takich jak kondensacja jądrowa, fragmentacja i/lub marginesacja (komórki/mm2).
	<ol>
		<li>Załaduj filmy nagrane przez bisbenzimid (obiektyw 50X) do oprogramowania. Użyj funkcji "DenseNA". Zaznacz komórki apoptotyczne zgodnie z wymienionymi cechami, takimi jak kondensacja jądrowa, fragmentacja i marginesacja, lewym przyciskiem myszy.</li>
		<li>Po zaznaczeniu wszystkich charakterystycznych komórek w całym filmie, kliknij "Nie dotyczy" w oprogramowaniu, które automatycznie policzy wszystkie zaznaczone komórki i podzieli je na cały obszar. Wynikiem będą komórki apoptotyczne/mm2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza przylegania leukocytów do śródbłonka naczyniowego reprezentującego stan zapalny. Przerywane przyleganie leukocytów (toczące się leukocyty; przyleganie < 30 sek.: liczba rolek/mm2 powierzchnia śródbłonka) i mocne przyleganie leukocytów (leukocyty sklejające; przyleganie > 30 sek.: liczba naklejek/mm2 powierzchni śródbłonka).
	<ol>
		<li>Przeanalizuj odpowiedź zapalną, licząc liczbę leukocytów znakowanych rodaminą, które przylegały do wyściółki śródbłonka żyłek pozakapilarnych przez okres ≥30 sekund ("naklejki") i sporadycznie przylegających leukocytów (<30 sekund, "rolki"). Przyleganie leukocytów komorowych jest wyrażone w komórkach na mm2 powierzchni śródbłonka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar wewnątrznaczyniowych i śródmiąższowych poziomów szarości jako parametr przecieku mikronaczyniowego (wynaczynienie makrocząsteczkowe E=E1/E2).
	<ol>
		<li>Oceń przeciek makromolekularny jako parametr przepuszczalności mikronaczyniowej po wstrzyknięciu dożylnym dekstranu fluorescencyjnego. Densytometrycznie oznacz wiele poziomów szarości w tkance bezpośrednio przylegającej do ściany naczynia włosowatego (E1), a także w brzeżnym osoczu bezkomórkowym naczynia (E2). Następnie oblicz wynaczynienie makromolekularne (E) jako stosunek E1/E2 31.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Opieka pooperacyjna
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Zwierzę należy umieścić w osobnej klatce, aby uniknąć towarzystwa innych zwierząt do czasu pełnego wyzdrowienia. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku. Codziennie monitoruj zwierzęta pod kątem krwawienia, miejscowych i ogólnoustrojowych objawów infekcji oraz położenia komory.</li>
	<li>Oceń ogólny stan zwierzęcia, obserwując aktywność motoryczną, masę ciała, oznaki bólu, tolerancję na opatrunek i samookaleczenie.</li>
	<li>Trzymaj myszy po jednej na klatkę, aby uniknąć wzajemnej manipulacji komorą. W przypadku jakichkolwiek oznak bólu należy podawać buprenorfinę w dawce 0,05–0,1 mg/kg masy ciała podskórnie w odstępach 8-godzinnych.</li>
</ol>
5. Eutanazja i eksplantacja komory fałdów skórnych
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>W 10 dniu należy złożyć ofiary ze zwierząt, stosując przedawkowanie leku znieczulającego (150 mg/kg pentobarbitalu).</li>
	<li>Wyjąć komorę i pobrać próbkę tkanki płatowej do testów immunohistochemicznych i molekularnych białek. Próbki tkanek do konwencjonalnej histologii (formalina) i ilościowych testów białek (ciekły azot lub suchy lód).</li>
</ol>

<ol><li>McFarlane, R., De Young, G., Henry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+a+pedicle+flap+in+the+rat+to+study+necrosis+and+its+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">The design of a pedicle flap in the rat to study necrosis and its prevention.</a> Plast Reconstr Surg. 35, 177-182 (1965).</li>
<li>Finseth, F., Cutting, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+neurovascular+island+skin+flap+for+the+study+of+the+delay+phenomenon%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">An experimental neurovascular island skin flap for the study of the delay phenomenon.</a> Plast Reconstr Surg. 61, 412-420 (1978).</li>
<li>Petry, J. J., Wortham, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomy+of+the+epigastric+flap+in+the+experimental+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat.</a> Plast Reconstr Surg. 74, 410-413 (1984).</li>
<li>Achauer, B. M., Black, K. S., Litke, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcutaneous+PO2+in+flaps%3A+a+new+method+of+survival+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Transcutaneous PO2 in flaps: a new method of survival prediction.</a> Plast Reconstr Surg. 65, 45-45 (1980).</li>
<li>Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+microvascular+oxygen+supply+and+tissue+oxygenation+in+hepatic+ischemia%2Freperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of microvascular oxygen supply and tissue oxygenation in hepatic ischemia/reperfusion.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 428, 403-408 (1997).</li>
<li>Menger, M. D., Barker, J. H., Messmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+blood+perfusion+during+postischemic+reperfusion+in+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Capillary blood perfusion during postischemic reperfusion in striated muscle.</a> Plast Reconstr Surg. 89, 1104-1114 (1992).</li>
<li>Uhl, E., Rösken, F., Curri, S. B., Menger, M. D., Messmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+skin+flap+necrosis+by+transdermal+application+of+buflomedil+bound+to+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Reduction of skin flap necrosis by transdermal application of buflomedil bound to liposomes.</a> Plast Reconstr Surg. 102, 1598-1604 (1998).</li>
<li>Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T., Sasaki, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+fluorescein+dye+test+for+prediction+of+skin+flap+viability+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Assessment of the fluorescein dye test for prediction of skin flap viability in pigs.</a> J Surg Res. 41, 173-181 (1986).</li>
<li>Hjortdal, V. E., Hansen, E. S., Henriksen, T. B., Kjolseth, D., Soballe, K., Djurhuus, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microcirculation+of+myocutaneous+island+flaps+in+pigs+studied+with+radioactive+blood+volume+tracers+and+microspheres+of+different+sizes%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">The microcirculation of myocutaneous island flaps in pigs studied with radioactive blood volume tracers and microspheres of different sizes.</a> Plast Reconstr Surg. 89, 116-122 (1992).</li>
<li>Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+microsphere+technique+for+measurement+of+capillary+blood+flow+in+random+skin+flaps+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Assessment of microsphere technique for measurement of capillary blood flow in random skin flaps in pigs.</a> Plast Reconstr Surg. 74, 513-521 (1984).</li>
<li>Sandison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+microscopic+study+of+living+growing+tissues+by+the+introduction+of+a+transparent+chamber+in+the+rabbit%27s+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear.</a> The Anatomical Record. 28, 281-287 (1924).</li>
<li>Algire, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Adaptation+of+the+Transparent-Chamber+Technique+to+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">An Adaptation of the Transparent-Chamber Technique to the Mouse.</a> Journal of the National Cancer Institute. 4, 1-11 (1943).</li>
<li>Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+skinfold+chamber+technique+for+intravital+microscopy+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice.</a> Am J Pathol. 4, 1055-1062 (1993).</li>
<li>Barker, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+animal+model+to+study+microcirculatory+changes+associated+with+vascular+delay%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Plast+Surg%22%5BJournal%5D)">An animal model to study microcirculatory changes associated with vascular delay.</a> Br J Plast Surg. 52, 133-142 (1999).</li>
<li>Erni, D., Sakai, H., Banic, A., Tschopp, H. M., Intaglietta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+microhemodynamics+in+ischemic+skin+flap+tissue+by+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Plast+Surg%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of microhemodynamics in ischemic skin flap tissue by intravital microscopy.</a> Ann Plast Surg. 43, 405-414 (1999).</li>
<li>Roesken, F., Schäfer, T., Spitzer, W. J., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+the+microcirculation+of+osteomyocutaneous+flaps+using+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Plast+Surg%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of the microcirculation of osteomyocutaneous flaps using fluorescence microscopy.</a> Br J Plast Surg. 52, 644-652 (1999).</li>
<li>Harder, Y., Amon, M., Erni, D., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+ischemic+tissue+injury+in+a+random+pattern+flap%3A+a+new+mouse+model+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Evolution of ischemic tissue injury in a random pattern flap: a new mouse model using intravital microscopy.</a> J Surg Res. 121, 197-205 (2004).</li>
<li>Harder, Y., Contaldo, C., Klenk, J., Banic, A., Jakob, S. M., Erni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preconditioning+with+monophosphoryl+lipid+A+improves+survival+of+critically+ischemic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Preconditioning with monophosphoryl lipid A improves survival of critically ischemic tissue.</a> Anesth Analg. 100, 1786-1792 (2005).</li>
<li>Rezaeian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoieton+protects+critically+perfused+flap+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Erythropoieton protects critically perfused flap tissue.</a> Ann Surg. 248, 919-929 (2008).</li>
<li>Harder, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+reduces+necrosis+in+critically+ischemic+myocutaneous+tissue+by+protecting+nutritive+perfusion+in+a+dose-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin reduces necrosis in critically ischemic myocutaneous tissue by protecting nutritive perfusion in a dose-dependent manner.</a> Surgery. 145, 10-1016 (2009).</li>
<li>Rezaeian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin-induced+upregulation+of+endothelial+nitric+oxide+synthase+but+not+vascular+endothelial+growth+factor+prevents+musculocutaneous+tissue+from+ischemic+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin-induced upregulation of endothelial nitric oxide synthase but not vascular endothelial growth factor prevents musculocutaneous tissue from ischemic damage.</a> Lab Invest. 90, 40-51 (2010).</li>
<li>Rezaeian, F., Ong, M. F., Harder, Y., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylcysteine+attenuates+leukocytic+inflammation+and+microvascular+perfusion+failure+in+critically+ischemic+random+pattern+flaps%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">N-acetylcysteine attenuates leukocytic inflammation and microvascular perfusion failure in critically ischemic random pattern flaps.</a> Microvasc Res. 82, 28-34 (2011).</li>
<li>Rezaeian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ghrelin+protects+musculocutaneous+tissue+from+ischemic+necrosis+by+improving+microvascular+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ghrelin protects musculocutaneous tissue from ischemic necrosis by improving microvascular perfusion.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, 603-610 (2012).</li>
<li>Rezaeian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+preconditioning+with+Erythropoietin+reduces+ischemia-induced+skin+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Long-term preconditioning with Erythropoietin reduces ischemia-induced skin necrosis.</a> Microcirculation. , (2013).</li>
<li>Harder, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+preconditioning+reduces+ischemic+tissue+necrosis+by+heat+shock+protein+%28HSP%29-32-mediated+improvement+of+the+microcirculation+rather+than+induction+of+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Heat shock preconditioning reduces ischemic tissue necrosis by heat shock protein (HSP)-32-mediated improvement of the microcirculation rather than induction of ischemic tolerance.</a> Ann Surg. 242, 869-878 (2005).</li>
<li>Tobalem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+shockwave-induced+capillary+recruitment+improves+survival+of+musculocutaneous+flaps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Local shockwave-induced capillary recruitment improves survival of musculocutaneous flaps.</a> J Surg Res. 184, 1196-1204 (2013).</li>
<li>Lindenblatt, N., Calcagni, M., Contaldo, C., Menger, M. D., Giovanoli, P., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+for+studying+the+revascularization+of+skin+grafts+in+vivo%3A+the+role+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">A new model for studying the revascularization of skin grafts in vivo: the role of angiogenesis.</a> Plast Reconstr Surg. 122, 169-1680 (2008).</li>
<li>Schweizer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+hemodynamics+during+vascular+regeneration+in+critically+ischemic+murine+skin+studied+by+intravital+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Morphology and hemodynamics during vascular regeneration in critically ischemic murine skin studied by intravital microscopy techniques.</a> Eur Surg Res. 47, 222-230 (2011).</li>
<li>Klyscz, T., Jünger, M., Jung, F., Zeintl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap+image%E2%80%94a+new+kind+of+computer-assisted+video+image+analysis+system+for+dynamic+capillary+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Tech%22%5BJournal%5D)">Cap image—a new kind of computer-assisted video image analysis system for dynamic capillary microscopy.</a> Biomed. Tech. 42, 168-1675 (1997).</li>
<li>Gross, J. F., Aroesty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+models+of+capillary+flow%3A+a+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Mathematical models of capillary flow: a critical review.</a> Biorheology. 9, 225-264 (1972).</li>
<li>Menger, M. D., Pelikan, S., Steiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+ischemiareperfusion+injury+in+striated+muscle%3A+significance+of+%E2%80%98reflow+paradox%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microvascular ischemiareperfusion injury in striated muscle: significance of ‘reflow paradox.</a> Am J Physiol. 263 (6 part 2), 1901-1906 (1992).</li>
</ol>

W celu zmniejszenia powikłań niedokrwiennych, a tym samym poprawy wyników klinicznych, wymagana jest bardziej szczegółowa wiedza na temat procesów patofizjologicznych w krytycznie perfundowanej tkance płatowej. Opracowanie nowych modeli zwierzęcych, które naśladują ostre, uporczywe niedokrwienie, jest zatem obowiązkowe. W związku z tym udało nam się opracować łatwo powtarzalny i wiarygodny model pozwalający na powtarzalną morfologiczną, dynamiczną i funkcjonalną ocenę w czasie rzeczywistym różnych parametrów unaczynienia...

Pokrycie odsłoniętych ścięgien, kości i implantów w chirurgii rekonstrukcyjnej opiera się na użyciu płatów. Płat to blok tkanki, który jest przenoszony na szypułce naczyniowej, która gwarantuje dopływ tętniczy i odpływ żylny. Pomimo szerokiej wiedzy specjalistycznej i dostępności różnych płatów do przeniesienia, nadal występują powikłania wywołane niedokrwieniem, od rozpadu rany po całkowitą utratę tkanki. Podczas gdy leczenia zachowawczego i gojenia z zamiarem wtórnym można oczekiwać po niewielkiej martwicy tkanek, znaczna martwica płatów zwykle wymaga rewizji chirurgicznej, w tym oczyszczenia, kondycjonowania rany i wtórnej rekonstrukcji. Zwiększa to zachorowalność, wydłuża pobyt w szpitalu, a w konsekwencji prowadzi do wzrostu kosztów opieki zdrowotnej.
Płaty z nieokreślonym wzorem unaczynienia lub losowo perfundowanymi obszarami w strefie dystalnej najbardziej oddalonej od dopływu tętniczego są szczególnie podatne na uszkodzenia niedokrwienne. W związku z tym w licznych badaniach eksperymentalnych i klinicznych oceniano rozwój martwicy zarówno w płatach osiowych (zdefiniowany dopływ krwi), jak i płatach o losowym wzorze (nieokreślony dopływ krwi)1-3. Główne wyniki są zwykle oparte na makroskopowej ocenie wielkości obszaru martwiczego. Aby bardziej szczegółowo ocenić przyczyny i mechanizmy martwicy tkanek, kilka badań koncentrowało się na analizie mikrokrążenia. Do pomiaru perfuzji tkanek zastosowano różne techniki, w tym analizę napięcia tlenu w tkankach za pomocą elektrod polarograficznych4-5, a także pomiar przepływu krwi za pomocą laserowej przepływomierza dopplerowskiego6-7, dyfuzji barwnika8 i mikrosfer9-10. Techniki te pozwalają jednak jedynie na pomiar pośrednich parametrów perfuzji tkanek i nie umożliwiają analizy morfologicznej procesów mikrohemodynamicznych w obrębie indywidualnego obszaru zainteresowania płata.
Sandison jest znany jako pierwszy, który użył przezroczystej komory do długotrwałych badań in vivo, które przeprowadził na królikach11. W 1943 roku – około 20 lat później – Algire jako pierwszy zaadaptował taką przezroczystą komorę do zastosowania u myszy w celu zbadania zachowania mikroimplantów komórek nowotworowych12. Ze względu na fakt, że myszy są tak zwanymi zwierzętami o luźnej skórze i po pewnych udoskonaleniach technicznych w ciągu następnych lat, Lehr i współpracownicy byli w stanie zaadaptować taką grzbietową komorę fałdu skórnego, opracowując mniejszą i lżejszą komorę tytanową. Komora ta umożliwiła ocenę za pomocą przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej, techniki, która umożliwia bezpośrednią i powtarzalną wizualizację szeregu cech morfologicznych i mikrokrążenia oraz ich zmian w czasie w różnych warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych, takich jak uraz niedokrwienno-reperfuzyjny13.
W badaniu perfuzji płatów skóry, mięśni i kości w normalnych i patologicznych warunkach wystąpiły dwa trendy: Po pierwsze, "ostre" modele płatów, które nie wykorzystują grzbietowej komory fałdu skórnego, takie jak uszypułowana klapka uszna u myszy14, bocznie oparty płat wyspy u chomika15 i szypułkowy klapa kompozytowa u szczura16. Po drugie, "przewlekły" model płata, w którym połączenie płata z grzbietową komorą fałdu skórnego umożliwia powtarzalne analizy mikrokrążenia przez kilka dni za pomocą przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej. Składa się z losowo perfundowanego płata mięśniowo-skórnego, który jest zintegrowany z komorą fałdu skórnego myszy 17. Jego stosunek szerokości do długości został dobrany tak, aby sytuacja ostrego uporczywego niedokrwienia konsekwentnie powodowała ~50% martwicę tkanek płata 10 do 14 dni po uniesieniu płata. Ten powtarzalny zakres martwicy tkanek pozwala na dalszą ocenę zarówno czynników ochronnych (tj. rozwój mniejszej martwicy), jak i szkodliwych (tj. rozwój większej martwicy) w patofizjologii płata. W ciągu ostatnich lat pojawiło się kilka publikacji eksperymentalnych demonstrujących wpływ różnych procedur przed, około- i po kondycjonowaniu, w tym podawania substancji chroniących tkanki18-24 oraz lokalnego stosowania stresorów fizjologicznych, takich jak ciepło25 i fale uderzeniowe26.
Analizy ilościowe martwicy, morfologii mikrokrążenia i parametrów mikrokrążenia mogą być dalej skorelowane z analizami immunohistochemicznymi i testami białek. Wykazano, że różne białka i cząsteczki, w tym czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF), syntazy tlenku azotu (NOS), czynnik jądrowy kappa B (NF-κB) i białka szoku cieplnego (HSP-32: oksygenaza hemowa 1 (HO-1) i HSP-70) odgrywają rolę w ochronie tkanek. W oparciu o ten model płata komorowego opracowano dwie modyfikacje w celu analizy neowaskularyzacji i mikrokrążenia podczas gojenia przeszczepu skóry27 oraz zmian angiogennych w płatze szypułkowym z perfuzją o wzorze osiowym28. Przedstawiamy powtarzalny i wiarygodny model, który obejmuje niedoczynnie upośledzony płat mięśniowo-skórny w komorze fałdu skórnego myszy. Model ten umożliwia wizualizację i kwantyfikację mikrokrążenia i hemodynamiki za pomocą przyżyciowej mikroskopii epifluorescencyjnej.

<table><tbody><tr><td>Myszy C57Bl/6, 6-8 w, 20-22 g</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Balea</td><td></td><td>Dowolny krem do depilacji</td></tr><tr><td>Tytanowa komora</td><td>Irola</td><td>160001</td><td>Halteblech M</td></tr><tr><td>Wykonana na zamówienie rama</td><td></td><td></td> montażowa z pleksi <td>Rama do zabezpieczenia komory, aby uniknąć ruchu komory z powodu oddychania zwierzęcia.</td></tr><tr><td>Śruba z sześciokątnym z rowkiem</td><td>i więcej</td><td>842210</td><td>DIN84 M2x10</td></tr><tr><td>z pełną nakrętką sześciokątną</td><td>i inne</td><td>93422</td><td>DIN934 M2</td></tr><tr><td>Pierścień osadczy</td><td>Schaefer-Peters 472212</td><td></td><td>DIN472 J12x1,0</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>Volab</td><td></td><td>Szkło osłonowe wykonane na zamówienie, o średnicy 11,8 mm.</td></tr><tr><td>Pianka mocująca</td><td>tesamoll</td><td>05559-100</td><td>tesamoll Standardowy profil I-Chlorowodorek</td></tr><tr><td>ketaminy</td><td>Parke Davis</td><td></td><td>Ketavet&reg;</td></tr><tr><td>Chlorowodorek dihydroksylidynotiazyny</td><td>Bayer</td><td></td><td>Rompun&reg;</td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td>Essex Pharma</td><td></td><td>Temgesic&reg;</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna 0,9%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkohol</td><td></td><td></td><td></td>do dezynfekcji</tr><tr><td>Vicryl 5-0</td><td>Ethicon</td><td>V 490 H</td><td></td></tr><tr><td>Ethilon 5-0</td><td>Ethicon</td><td>EH 7823 H</td> Strzykawki <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Marker chirurgiczny do skóry z elastyczną linijką</td><td>Fioletowy chirurgiczny</td><td>PS3151</td><td>Dowolny chirurgiczny marker do skóry i elastyczna linijka</td></tr><tr><td>Szpiczaste nożyczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normalne nożyczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 zaciski</td> Drobne kleszcze anatomiczne Mikrokleszcze <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sześciokątny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>wkrętak do orzechów wiha</td><td></td><td>1018</td><td></td></tr><tr><td>Śrubokręt</td><td>wiha</td><td>685</td><td></td></tr><tr><td>Szczypce do pierścieni osadczych</td><td>Knipex</td><td>4411J1</td><td>12-25 mm</td></tr><tr><td>Przecinak do drutu</td><td>Knipex</td><td>70 02 160</td><td>Przecinak do drutu służy do krótkiego obcinania; 160 mm</td></tr><tr><td>Światło trans-illumination</td><td>IKEA</td><td>501.632.02</td><td>Światło LED Jansj&ouml;; dowolne światło&nbsp;</td></tr><tr><td>Okulary</td><td></td><td></td><td></td>powiększające</tr><tr><td>Mikroskop przyżyciowy</td><td>Zeiss</td><td>490035-0001-000</td><td>Scope.A1.System LED Axiotech</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>423052-9501-000</td><td>Moduł LED Colibri.2</td></tr><tr><td>365nm</td><td>Zeiss</td><td>423052-9011-000</td><td></td></tr><tr><td>Moduł LED 470nm</td><td>Zeiss</td><td>423052-9052-000</td><td></td></tr><tr><td>Moduł LED 540-580nm</td><td>Zeiss</td><td>423052-9121-000</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw filtrów 62 62 HE BFP + GFP + HcRed</td><td>Zeiss</td><td>489062-9901-000</td><td>Zakres 1: długość fali wzbudzenia 350-390 nm, podział 395 nm / 402-448 nm; zakres 2: 460-488 nm, podział 495 nm / 500-557 nm; zakres 3: 567-602 nm, podział 610 nm / 615 nm do nieskończoności.</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów 20 Rodamina</td><td>Zeiss</td><td>485020-0000-000</td><td>540-552 nm, split 560 nm, emisja 575-640 nm</td></tr><tr><td>2,5X obiektyw NA=0,06</td><td>Zeiss</td><td>421020-9900-000</td><td>A-Plan 2,5X/0,06</td></tr><tr><td>5X obiektyw NA=0,16</td><td>Zeiss</td><td>420330-9901-000</td><td>EC Plan-Neofluar 5X/0,16 M27</td></tr><tr><td>10X cel NA=0,30</td><td>Zeiss</td><td>420340-9901-000</td><td>EC Plan-Neofluar 10X/0,30 M27</td></tr><tr><td>Obiektyw 20X NA=0,50</td><td>Zeiss</td><td>420350-9900-000</td><td>EC Plan-Neofluar 20X/0,50 M27</td></tr><tr><td>Obiektyw 50X NA=0,55</td><td>Zeiss</td><td>422472-9960-000</td><td>LD Epiplan-Neofluar 50X/0,55 DIC 27</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania ZEN</td><td>Zeiss</td><td></td><td>ZenPro 2012</td></tr><tr><td>CapImage</td><td>Dr. Zeintl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny-dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45946</td><td></td></tr><tr><td>trichlorowodorek bisBenzimide H 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Działa szkodliwie po połknięciu; powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenie oczu, może powodować podrażnienie dróg oddechowych.</td></tr><tr><td>Chlorek rodaminy 6G</td><td>Invitrogen</td><td>R634</td><td>Działa szkodliwie po połknięciu, może powodować wady genetyczne, może powodować raka, może działać szkodliwie na płodność lub dziecko w łonie matki.</td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Merial</td><td></td><td>Narcoren&reg;</td></tr></tbody></table>

niedokrwienne uszkodzenie tkanki w grzbietowej komorze fałdu skórnego myszy: model płata skóry do badania ostrego uporczywego niedokrwienia

Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia

Pomimo dogłębnej wiedzy specjalistycznej i zaawansowanych technik chirurgicznych, nadal występują powikłania spowodowane niedokrwieniem, począwszy od rozpadu rany, a skończywszy na rozległej martwicy tkanek, szczególnie w chirurgii rekonstrukcyjnej płata. Opracowano wiele eksperymentalnych modeli płatów w celu analizy przyczyn i mechanizmów leżących u podstaw oraz zbadania strategii leczenia w celu zapobiegania powikłaniom niedokrwiennym. Czynnikiem ograniczającym większość modeli jest brak możliwości bezpośredniej i powtarzalnej wizualizacji architektury mikrokrążenia i hemodynamiki. Celem protokołu było przedstawienie dobrze ugruntowanego modelu myszy łączącego te wcześniej wymienione brakujące elementy. Harder i wsp. opracowali model płata mięśniowo-skórnego z losowym wzorcem perfuzji, który ulega ostremu uporczywemu niedokrwieniu i powoduje ~50% martwicę po 10 dniach, jeśli nie jest leczony. Za pomocą przyżyciowej mikroskopii epifluorescencyjnej ten model komory umożliwia powtarzalną wizualizację morfologii i hemodynamiki w różnych obszarach zainteresowania w czasie. Powiązane procesy, takie jak apoptoza, stan zapalny, przeciek mikronaczyniowy i angiogeneza, mogą być badane i korelowane z immunohistochemicznymi i molekularnymi testami białek. Do tej pory model udowodnił wykonalność i odtwarzalność w kilku opublikowanych badaniach eksperymentalnych badających wpływ kondycjonowania wstępnego, około- i końcowego tkanki z niedoczynnością fizjologiczną.

Nekroza
Główny punkt końcowy tego modelu — martwica tkanki po uniesieniu płata (tj. indukcja ostrego, uporczywego niedokrwienia) — jest wielokrotnie mierzony i przedstawiany makroskopowo, jak pokazano na Rysunku 3 w okresie 10 dni. Ostateczne wyznaczenie granicy martwicy płata następuje zazwyczaj między 5. a 7. dniem po operacji i charakteryzuje się czerwoną obwódką, tj. strefą rozszerzenia naczyń i przebudowy mikro naczyniowej, powstającą mi...

Przedstawione okno mysiej komory grzbietowego fałdu skórnego wizualizuje strefę ostrego, uporczywego niedokrwienia płata mięśniowo-skórnego. Przyżyciowa mikroskopia epifluorescencyjna pozwala na bezpośrednią i powtarzalną ocenę mikrokrążenia i ilościowe określenie hemodynamiki. Wyniki morfologiczne i hemodynamiczne można dodatkowo skorelować z analizami histologicznymi i molekularnymi.

Niedokrwienne uszkodzenie tkanki w grzbietowej komorze fałdu skórnego myszy: model płata skóry do badania ostrego uporczywego niedokrwienia

Despite profound expertise and advanced surgical techniques, ischemia-induced complications ranging from wound breakdown to extensive tissue necrosis are ...

Ogólnym celem tej procedury jest ustanowienie powtarzalnego i wiarygodnego modelu niedokrwiennie uproszczonego płata mięśniowo-skórnego w komorze fałdu skórnego myszy. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie komory fałdu skórnego i grzbietu myszy. Następnie płat jest uniesiony i losowo perfundowany, aby rozwinęła się martwica.Następnie klapka jest wkładana do tytanowej komory fałdu skórnego. Na koniec komora okienna jest uszczelniona szkłem nakrywkowym, aby zapewnić szczelność komory. Ostatecznie mikrokrążenie jest wizualizowane przez okno komory za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej intrażyciowej przez okres 10 dni lub dłużej.Główną przewagą tego modelu mysiego nad istniejącymi metodami jest to, że pozwala on na obserwację w czasie rzeczywistym zmian mikrokrążenia i morfologicznych mikrokrążenia tkanki mięśniowo-skórnej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przyżyciowej przez okres około dwóch tygodni. Model umożliwia między innymi badanie procedur kondycjonowania, które ostatecznie poprawiają przeżywalność tkanek. Po znieczuleniu myszy, zgodnie z protokołem tekstowym, użyj golarki elektrycznej, aby usunąć włosy z tyłu, a następnie nałóż krem zubożający, aby usunąć pozosta

ischemic-tissue-injury-dorsal-skinfold-chamber-mouse-skin-flap-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Uraz chirurgiczny wywołuje odpowiedź zapalną. Wiadomo, że cytokiny i ligandy endogenne modulują wielkość zawału mięśnia sercowego po niedokrwieniu i reperfuzji. Przedstawiamy zmodyfikowany model niedokrwienia i reperfuzji u myszy z zamkniętą klatką piersiową, wykorzystujący obciążniki wiszące w celu zminimalizowania efektów torakotomii.

Mysi model zamkniętoklatkowy niedokrwienia i reperfuzji mięśnia sercowego

Darmowy transfer tkanek jest szeroko stosowany w chirurgii rekonstrukcyjnej w celu przywrócenia formy i funkcji po resekcji onkologicznej i urazu. Wstępne przygotowanie tej tkanki przed operacją może poprawić wyniki. W tym artykule opisano płat mięśniowo-skórny poprzeczny mięśnia prostego brzucha (TRAM) in situ u szczurów jako sposób na przetestowanie strategii kondycjonowania wstępnego.

In situ Płat mięśniowo-skórny mięśnia prostego brzucha: szczurzy model uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwienia mięśni i skóry

Opisujemy modele umiarkowanego i ciężkiego uszkodzenia nerek wywołanego niedokrwieniem i reperfuzją, w których myszy przechodzą jednostronne zaciskanie szypułki nerki, po którym następuje równoczesna lub opóźniona nefrektomia przeciwległa. Modele te konsekwentnie powodują dysfunkcję nerek i zwłóknienie pourazowe, ale ciężkość urazu i przeżycie zależą od pochodzenia myszy, wieku i sprzętu chirurgicznego.

Model niedokrwienno-reperfuzyjny ostrego uszkodzenia nerek i zwłóknienia pourazowego u myszy

Szczur, ze względu na swoje rozmiary, dostępność i raczej łagodne zachowanie, był wykorzystywany jako model badawczy przez wiele lat. Celem tego protokołu jest wykorzystanie szczura jako niedokrwiennego modelu gojenia się ran skóry, aby zapewnić cenny wgląd w patofizjologię ran przewlekłych.

Demonstracja modelu rany na skórze z niedokrwieniem skóry u szczura

Chirurgiczna indukcja niedokrwienia kończyn tylnych u myszy jest przydatna do badania angiogenezy, jednak jest ona zagrożona u niektórych szczepów myszy wsobnych, które wykazują wyraźną nekrozę tkanek wywołaną niedokrwieniem. Opisano metody wywoływania podostrego niedokrwienia kończyn za pomocą ameroidowych zwężaczy w celu obejścia tego problemu poprzez indukcję stopniowej niedrożności tętnic.

Metody leczenia ostrego i podostrego mysiego niedokrwienia kończyn tylnych

Ten protokół opisuje indukcję modelu niedokrwienia-reperfuzji (IR) na skórze ucha myszy za pomocą zaciskania magnesem. Korzystając z niestandardowego modelu obrazowania przyżyciowego, badamy in vivo reakcje zapalne po reperfuzji. Uzasadnieniem dla opracowania tej techniki jest poszerzenie wiedzy na temat tego, w jaki sposób leukocyty reagują na uszkodzenia skóry w podczerwieni.

Indukowanie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w skórze ucha myszy w celu przyżyciowego obrazowania wielofotonowego odpowiedzi immunologicznych

Mysi model niedokrwienia i reperfuzji mózgu został stworzony w celu zbadania patofizjologii udaru. Podwiązujemy dystalnie prawą środkową tętnicę mózgową i prawą tętnicę szyjną wspólną i przywracamy przepływ krwi po 10 lub 40 minutach niedokrwienia.

Mysi model zamknięcia dwóch naczyń niedokrwienia mózgu-reperfuzji

Tutaj prezentujemy protokół dla testu in vitro z użyciem pierwotnych fibroblastów oraz dla testu in vivo gojenia ran skóry na myszach. Oba testy są prostymi metodami oceny gojenia się ran in vitro i in vivo.

Test migracji zadrapań i komora grzbietowego fałdu skórnego do analizy gojenia się ran in vitro i in vivo

Ten artykuł demonstruje model do badania przebudowy serca po kriouszkodzeniu mięśnia sercowego u myszy.

Model kriouszkodzeń do badania zawału mięśnia sercowego u myszy

Tutaj opisujemy przedkliniczny model zwierzęcy do badania patofizjologii uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w mikrochirurgii rekonstrukcyjnej. Ten model wolnego płata skóry oparty na powierzchownych naczyniach nadbrzusza ogonowego u szczura może również pozwolić na ocenę różnych terapii i związków przeciwdziałających uszkodzeniom związanym z uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym.

Przedkliniczny model szczurzy do badania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w mikrochirurgii rekonstrukcyjnej

Ten protokół opisuje pobieranie, zszywanie i monitorowanie płatów powięziowo-skórnych u szczurów, które pozwalają na dobrą wizualizację i manipulację przepływem krwi przez powierzchowne dolne naczynia nadbrzusza za pomocą zaciskania i podwiązywania naczyń udowych. Ma to kluczowe znaczenie dla badań obejmujących wstępne kondycjonowanie niedokrwienne.

Powierzchowny dolny płat osiowy tętnicy nadbrzusza do badania efektów kondycjonowania wstępnego niedokrwiennego w modelu szczurzym

Poznaj model niedokrwiennego płata skóry w grzbietowej komorze skórnej myszy. Ta metoda umożliwia wizualizację mikrokrążenia przez 10 dni przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej in vivo.

Niedokrwienne uszkodzenie tkanki w grzbietowej komorze fałdu skórnego myszy: model płata skóry do badania ostrego uporczywego niedokrwienia (Wideo) | JoVE Journal

Niedokrwienne uszkodzenie tkanki w grzbietowej komorze fałdu skórnego myszy: model płata skóry do badania ostrego uporczywego niedokrwienia

Przeglądaj więcej filmów