Name: Zwyrodnienie i regeneracja siatkówki wywołane przez metylonitromocznik (MNU) u danio pręgowanego: charakterystyka histologiczna i funkcjonalna (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj model zwyrodnienia i regeneracji siatkówki u danio pręgowanego wywołany toksyną MNU. Metoda łączy pomiar ostrości wzroku z analizą histologiczną i immunohistochemiczną zmian w oku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Monice Kilchenmann, Federice Bisignani i Agathe Dudzie za ich doskonałą pomoc techniczną.

Wszystkie eksperymenty były zgodne z Oświadczeniem o wykorzystaniu zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Oczami (ARVO).
1. Zwierzęta
<ol>
	<li>Utrzymuj danio pręgowanego (Danio rerio) typu dzikiego (Danio rerio) szczepu AB (Oregon) w wieku od 6 do 12 miesięcy w standardowych warunkach w wodzie o temperaturze 26,5 °C i 14/10 godzinnym cyklu światła/ciemności 15.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami obowiązującymi w zaangażowanych instytucjach dotyczących doświadczeń na zwierzętach po zatwierdzeniu przez Kantonalny Urząd Weterynaryjny.</li>
</ol>
2. Leczenie MNU
<ol>
	<li>Przygotować wodę zawierającą 150 mg/l suchej masy N-metylo-N-nitrozomocznika (MNU). OSTROŻNOŚĆ! MNU jest toksyczny; może powodować raka, dziedziczne uszkodzenia genetyczne lub szkody dla nienarodzonego dziecka.</li>
	<li>Inkubować danio pręgowanego w wodzie zawierającej MNU przez 60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Szybko opłucz danio pręgowanego świeżą wodą i umieść rybę w nowym akwarium bez MNU. Utrzymuj ryby w standardowych warunkach tak długo, jak jest to pożądane dla eksperymentów.</li>
</ol>
3. Pomiar ostrości wzroku
<ol>
	<li>Uruchom układ optomotoryczny, wybierz z menu "testowanie" i ustaw opcje na "Proste schody", "Ostrość (częstotliwość)" i "Losowe/oddzielne" 16.</li>
	<li>Zainstalować butelkę infuzyjną wypełnioną 500 ml wody około 1 m powyżej układu optomotorycznego.</li>
	<li>Umieść jednego danio pręgowanego w komorze badawczej i podłącz go do butelki infuzyjnej. Umieścić komorę badawczą w układzie optomotorycznym.</li>
	<li>Rozpocznij pomiar i obserwuj ruch gałek ocznych w czasie rzeczywistym na ekranie komputera. W ten sposób odpowiedź pozytywna ("tak") jest definiowana jako kolejne sakkady we właściwym kierunku, podczas gdy odpowiedź negatywna ("nie") reprezentuje przypadkowe ruchy gałek ocznych podobne do tych obserwowanych w przypadku nieruchomych siatek. Jeśli oczy danio pręgowanego wykazują trzy lub więcej następujących po sobie reakcji optokinetycznych (OKR), naciśnij "tak"; Jeśli nie, naciśnij "Nie".</li>
	<li>Wyodrębnij ostrość wzroku, która została obliczona przez oprogramowanie poprzez określenie progu częstotliwości przestrzennej bodźca optokinetycznego, w sekcji "Wyniki" w menu.</li>
</ol>
4. Histologia
<ol>
	<li>Poddaj danio pręgowanego eutanazji przez przedawkowanie metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (200-300 mg/L) i wyłuszczej oczy.</li>
	<li>Utrwalić całe oczy w 4% paraformaldehydzie (PFA) w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS) w temperaturze 4 °C przez 12 godzin, a następnie odwodnić próbki w serii stopniowanych alkoholi.</li>
	<li>Zanurz próbki w parafinie, przetnij odcinki 5 μm przez głowicę nerwu wzrokowego (ONH) i zamontuj je na szkiełku podstawowym.</li>
	<li>Zabarwić odparafinowane skrawki parafiny hemalem przez 4 minuty i zanurzyć szkiełka dwukrotnie w wodzie destylowanej, a następnie w 0,2% kwasie solnym i 0,8% amoniaku. Skrawki barwić eozyną przez 3 minuty po wytworzeniu się barwienia hemalamu w wodzie z kranu przez co najmniej 10 minut (H&E).</li>
	<li>Osadź odwodnione szkiełka w podłożu montażowym i obserwuj szkiełka pod mikroskopem świetlnym.</li>
</ol>
5. Immunohistochemia
<ol>
	<li>Znakowanie końcowego końca deoksynukleotydylotransferazy dUTP (TUNEL)
	<ol>
		<li>Inkubować odparafinowane skrawki z 20 μg/ml proteinazy K w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Przemyć skrawki trzykrotnie buforowanym roztworem soli fizjologicznej Tris (TBS) przez 5 minut każda.</li>
		<li>Inkubować skrawki z 50 μl mieszaniny reakcyjnej TUNEL (10% roztwór znakujący i 90% roztwór enzymatyczny) w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 60 min. Przemyć trzy razy TBS przez 5 min każda.</li>
		<li>Zamontuj szkiełka z medium montażowym zawierającym DAPI i obserwuj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie antygenem jądrowym proliferacji komórek (PCNA)
	<ol>
		<li>Gotować odparafinowane skrawki w buforze do odzyskiwania antygenu (Tris-EDTA + 0,05% Tween 20, pH 9,0) przez 3 minuty i przemywać trzykrotnie TBS przez 5 minut każda. Blok ze 100 μl roztworu blokującego (TBS + 10% koziej normalnej surowicy + 1% albuminy surowicy bydlęcej, pH 7,6) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wybarwić pierwszorzędowymi przeciwciałami anty-PCNA w rozcieńczeniu 1:200 w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C przez noc. Umyj trzy razy za pomocą TBS + Tween 20 przez 5 minut każdy.</li>
		<li>Zakończyć wykrywanie odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi w rozcieńczeniu 1:500 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Zamontuj szkiełka z medium montażowym zawierającym DAPI i obserwuj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+age-related+macular+degeneration%3A+a+review+of+progress+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Surv.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date.</a> Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).</li>
<li>Bhatti, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%2C+pigmentary+retinopathies%2C+and+neurologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Neurol.+Neurosci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases.</a> Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6 (5), 403-413 (2006).</li>
<li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368, 1795-1809 (2006).</li>
<li>Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+retinitis+pigmentosa+induced+by+MNU%3B+disease+progression%2C+mechanisms+and+therapeutic+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials.</a> Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).</li>
<li>Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura,, Usui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenic+comparative+study+on+rasH2+mice+produced+by+two+breeding+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities.</a> J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).</li>
<li>Morton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Methyl-N-Nitrosourea+%28MNU%29%3A+A+positive+control+chemical+for+p53%2B%2F-+mouse+carcinogenicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies.</a> Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).</li>
<li>Terracini, B., Testa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenicity+of+a+single+administration+of+N-nitrosomethylurea%3A+a+comparison+between+newborn+and+5-week-old+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats.</a> 24, 588-598 (1970).</li>
<li>Zulliger, R., Lecaudé, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-3-independent+photoreceptor+degeneration+by+N-methyl-N-nitrosourea+%28MNU%29+induces+morphological+and+functional+changes+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 859-869 (2011).</li>
<li>Tappeiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+rod+regeneration+in+a+novel+zebrafish+retinal+degeneration+model+using+N-methyl-N-nitrosourea+%28MNU%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Characteristics of rod regeneration in a novel zebrafish retinal degeneration model using N-methyl-N-nitrosourea (MNU).</a> PLOS One. 12, (2013).</li>
<li>Bilotta, J., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model visual system.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 19, 621-629 (2001).</li>
<li>Fleisch, C., Neuhauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Behavior+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Visual Behavior in Zebrafish.</a> Zebrafish. 3, 191-201 (2006).</li>
<li>Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+development+of+light+adaptation+processes+in+the+outer+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22InterScience%22%5BJournal%5D)">Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina.</a> InterScience. 288, 653-662 (2006).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+photoreceptor+degeneration+and+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish.</a> Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).</li>
<li>Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+acuity+and+contrast+sensitivity+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Zool%22%5BJournal%5D)">Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish.</a> Front. Zool. 9 (1), 10(2012).</li>
<li>Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitor+of+phagocytosis%2C+O-phospho-L-serine%2C+suppresses+M%C3%BCller+glia+proliferation+and+cone+cell+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).</li>
<li>Nelson, C. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glia+as+a+source+of+neuronal+progenitor+cells+to+regenerate+the+damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).</li>
<li>Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+adult+and+developing+mouse+spatial+vision+using+a+virtual+optomotor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system.</a> Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45 (12), 4611-4616 (2004).</li>
<li>Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+ontogeny+of+optokinetic+and+vestibulo-ocular+behaviors+in+zebrafish%2C+medaka%2C+and+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish.</a> J. Neurophysiol. 92 (6), 3546-3561 (2004).</li>
<li>Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Inner+Retinal+Neurons+after+Intravitreal+Injection+of+Ouabain+in%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in.</a> Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).</li>
<li>Sherpa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion+cell+regeneration+following+whole-retina+destruction+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).</li>
<li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+M%C3%BCller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wcześniej nasza grupa przeniosła model MNU degeneracji fotoreceptorów od gryzoni do systemu danio pręgowanego 9. Następujące po tym zdarzenia były opisywane i obserwowane przez okres do 30 dni. W tym okresie nastąpiło całkowite zwyrodnienie morfologiczne siatkówki i regeneracja po początkowym leczeniu. Po pierwsze, histologia ujawnia zmniejszoną liczbę pręcików od 3 dnia z minimum w 8 dniu. Odpowiednio, barwienie TUNEL identyfikuje apoptozę fotoreceptorów pręcików 3 dni po leczeniu MNU. Regeneracja rozpoczyna ...

Wzrok jest najważniejszym zmysłem dla człowieka, a jego upośledzenie ma duży wpływ społeczno-ekonomiczny. W krajach rozwiniętych choroby zwyrodnieniowe siatkówki są główną przyczyną utraty wzroku i ślepoty wśród osób starszych 1. Przyczyna większości chorób zwyrodnieniowych siatkówki jest tylko częściowo poznana, a rozwiązania terapeutyczne mające na celu odzyskanie utraconego wzroku są bardzo ograniczone. Barwnikowe zwyrodnienie siatkówki jest typowym przykładem choroby zwyrodnieniowej siatkówki z pierwotną utratą fotoreceptorów 2-3. N-metylo-N-nitrozomocznik (MNU) indukuje zwyrodnienie siatkówki i dlatego jest szeroko stosowany u gryzoni do modelowania chorób z pierwotną śmiercią komórki fotoreceptora 4. Jest środkiem alkilującym i prowadzi do łagodnych i złośliwych nowotworów, które zwykle pojawiają się kilka miesięcy po ekspozycji 5-7. Ponadto powoduje specyficzną śmierć komórki fotoreceptorowej w krótkim okresie obserwacji. W związku z tym zaobserwowano utratę struktury warstwy siatkówki i znaczne ścieńczenie siatkówki w sposób zależny od stężenia. Komórki glejowe siatkówki były aktywowane, ale nie stwierdzono zmian w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE). Apoptoza związana ze stresem retikulum endoplazmatycznego (ER) wydaje się być główną ścieżką działania MNU w siatkówce 8.
Niedawno wprowadziliśmy MNU jako model chemiczny do wywoływania degeneracji fotoreceptorów u danio pręgowanego 9. Danio pręgowany (Danio rerio) stał się ważny w badaniach wizualnych między innymi ze względu na podobieństwa jego układu wzrokowego do innych kręgowców 10. Zewnętrzna siatkówka zawiera fotoreceptory, które można podzielić na cztery różne typy czopków o szczytowej czułości w ultrafiolecie, krótkiej, średniej i długiej długości fali widm widzialnych oraz jeden typ fotoreceptora pręcikowego. W wewnętrznej warstwie jądrowej (INL) znajdują się ciała komórkowe interneuronów dwubiegunowych, poziomych i amakrynowych, a także soma komórkowa komórek glejowych Mullera. W zewnętrznej warstwie splotowatej (OPL) powstają kontakty synaptyczne między fotoreceptorami a siatkówką wewnętrzną, natomiast warstwą komórkową najbliżej soczewki jest warstwa komórek zwojowych (GC), której składowe tworzą długie aksony składające się na nerw wzrokowy i przewód wzrokowy. Kontakty synaptyczne między komórkami zwojowymi a komórkami w wewnętrznej warstwie jądrowej powstają w wewnętrznej warstwie splotowatej (IPL) 11. RPE leży na zewnątrz siatkówki neurosensorycznej i otacza zewnętrzne segmenty fotoreceptora długimi mikrokosmkami wierzchołkowymi 12. Co więcej, danio pręgowany jest wysoce regeneracyjny i zdolny do odbudowy uszkodzonego mózgu, siatkówki, rdzenia kręgowego, serca i innych tkanek 13. Kiedy dochodzi do uszkodzenia siatkówki, komórki w INL, które uważa się za komórki Müllera, są aktywowane i mają potencjał do różnicowania się w różne typy komórek siatkówki. Ponadto generują również przodki pręcików, które znajdują się w ONL. Innym źródłem, które zaopatruje siatkówkę dorosłego danio pręgowanego w nowe komórki, jest rzęskowa strefa brzeżna. Źródło to jest potrzebne do osiągnięcia stałej gęstości fotoreceptorów pręcików w stale rosnącym oku danio pręgowanego 14.
Model MNU może być używany jako proste i powtarzalne podejście do degeneracji/regeneracji tkanki siatkówki. Ze względu na pewne podobieństwa procesów biologicznych u danio pręgowanego i u ludzi, może to otworzyć drzwi do identyfikacji zaangażowanych szlaków śmierci komórkowej i badań przesiewowych potencjalnych leków neuroprotekcyjnych. Opierając się na poprzednim badaniu przeprowadzonym przez naszą grupę, ilustrujemy teraz metody tego indukowanego przez MNU modelu degeneracji siatkówki i wynikającej z niej regeneracji, w tym zmian funkcjonalnych, za pomocą odpowiednich filmów laboratoryjnych 9.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Amoniak</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>294993</td><td>0,80%</td></tr> <tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>05470</td><td></td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>Dako, Glostrup, Dania</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe DAPI</td><td>Vector Labs, Burlingame, CA, USA</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>45260</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>2860</td><td>100%, 96%, 70%</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>E10521</td><td>Trikaina</td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-królik Alexa 594</td><td>Life Technologies, Zug, Szwajcaria&nbsp;</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Kozia normalna surowica</td><td>Dako, Glostrup, Dania</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>320331</td><td>0,20%</td></tr> <tr><td>Zestaw do wykrywania śmierci komórkowej in situ</td><td>Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Szwajcaria</td><td>11684795910</td><td>TUNEL</td></tr><tr><td>Kit Roztwór hemalumu Mayera</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>109249</td><td></td></tr><tr><td>Methylnitrosourea (MNU)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>N4766</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>OptoMotry</td><td>CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Kanada</td><td>n.a.Paraformaldehyd</td><td></td></tr> <tr><td>(PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>S3004</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-PCNA&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Stany Zjednoczone</td><td>sc-33756</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane Superfrost Plus</td><td>Gehard Menzel GmbH, Brunszwik, Niemcy</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana Tris (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>P5912</td><td></td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Danio rerio (Danio rerio) AB (Oregon)</td><td>szczep Uniwersytet we Fryburgu, Wydział Biologii</td><td>n.a.Własny</td> <td>zakład rybny</td></tr></tbody></table>

zwyrodnienie i regeneracja siatkówki wywołane przez metylonitromocznik (mnu) u danio pręgowanego: charakterystyka histologiczna i funkcjonalna

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Choroby zwyrodnieniowe siatkówki, np. barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, z wynikającym z nich uszkodzeniem fotoreceptorów, odpowiadają za większość utraty wzroku w świecie przemysłowym. Modele zwierzęce mają kluczowe znaczenie dla badania takich chorób. W związku z tym specyficzna dla fotoreceptorów toksyna N-metylo-N-nitrozomocznika (MNU) jest szeroko stosowana u gryzoni w celu farmakologicznego wywoływania zwyrodnienia siatkówki. Wcześniej ustaliliśmy model zwyrodnienia siatkówki wywołanego przez MNU, u danio pręgowanego, innego popularnego systemu modelowego w badaniach wizualnych.
Fascynującą różnicą w stosunku do ssaków jest trwała neurogeneza w siatkówce dorosłego danio pręgowanego i jej regeneracja po uszkodzeniu. Aby określić ilościowo tę obserwację, zastosowaliśmy pomiary ostrości wzroku u dorosłego danio pręgowanego. W ten sposób odruch optokinetyczny został wykorzystany do śledzenia zmian funkcjonalnych u ryb nieznieczulonych. Uzupełniono to badaniem histologicznym, a także barwieniem immunohistochemicznym w kierunku apoptozy (TUNEL) i proliferacji (PCNA) w celu skorelowania rozwijających się zmian morfologicznych.
Podsumowując, apoptoza fotoreceptorów następuje trzy dni po leczeniu MNU, po której następuje wyraźna redukcja komórek w zewnętrznej warstwie jądrowej (ONL). Następnie obserwuje się proliferację komórek w wewnętrznej warstwie jądrowej (INL) i ONL. W tym miejscu ujawniamy, że nie tylko pełna regeneracja histologiczna, ale także funkcjonalna zachodzi w ciągu 30 dni. Teraz ilustrujemy metody ilościowego określania i monitorowania degeneracji i regeneracji siatkówki danio pręgowanego za pomocą MNU w formacie wideo.

Ostrość wzroku:
Układ eksperymentalny [częstotliwość przestrzenna: 0,042 circles/degree (c/d); kontrast: 100%; prędkość dryfu: 20 degrees/second (d/src); luminancja podświetlenia: 152 cd/m2] w niniejszym badaniu umożliwił ocenę OKR u dorosłych danio pręgowanych. Średni czas pomiaru VA wynosił około 5 – 10 minut dla każdej ryby, która dobrze znosiła procedurę. Ostrość wzroku przed ekspozycją na MNU wynosiła 0,577 ± 0,014 cycles/degree (c/d). Rysunek 1 przedstawia prz...

Tutaj pokazujemy ilościowe określenie de- i regeneracji siatkówki oraz jej wpływu na funkcje wzrokowe za pomocą N-metylo-N-nitrozourea u dorosłego danio pręgowanego. Utrata ostrości wzroku i zmniejszenie liczby fotoreceptorów wiązały się z proliferacją w wewnętrznej warstwie jądrowej. Całkowita regeneracja morfologiczna i funkcjonalna nastąpiła po 30 dniach od pierwszego zabiegu.

Zwyrodnienie i regeneracja siatkówki wywołane przez metylonitromocznik (MNU) u danio pręgowanego: charakterystyka histologiczna i funkcjonalna

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie zwyrodnienia siatkówki i wynikającej z niego regeneracji u dorosłego danio pręgowanego za pomocą n metylu i nitro ueaa. Osiąga się to poprzez pierwszą inkubację danio pręgowanego typu dzikiego w wodzie zawierającej N. metylo-N, azot mocznik lub MNU. Następna funkcja wzrokowa jest określana ilościowo poprzez pomiar odpowiedzi optokinetycznej lub OKR i obliczanie ostrości wzroku w różnych punktach czasowych.Po leczeniu danio pręgowany jest poddawany eutanazji, a oczy w jądrze do badań histologicznych przy użyciu barwienia h i e w celu zaobserwowania zmian morfologicznych w tkance siatkówki. Wreszcie, zmiany komórkowe są wizualizowane w siatkówce ze specyficznym barwieniem dla śmierci i proliferacji komórki. Ostatecznie pomiar ostrości wzroku i kwantyfikacja zmian morfologicznych i komórkowych służą do wizualizacji D siatkówki i regeneracji.Główną zaletą tego modelu farmakologicznego jest to, że jest prosty i szybki w użyciu oraz indukuje niezawodną regionalną degenerację i regenerację u dorosłych ryb danio pręgowanego Aby przeprowadzić leczenie NM metylo-n nitrozomoczkiem lub MNU, zacznij od przygotowania wody zawierającej 150 miligramów na litr suchego MNU. Należy postępować ostrożnie podczas pracy z nm metylowym i azotowym mocznikiem, ponieważ jest on toksyczny i może powodować raka, dziedziczne uszkodzenia genetyczne lub szkody. Nienarodzone dziecko utrzymuje się w wieku od sześciu do 12 miesięcy w standardowych warunkach, podczas gdy szczep AB jest dwany.Przenieś danio pręgowanego do wody MNU i inkubuj go przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Następnie użyj świeżej wody, aby szybko opłukać ryby przed przeniesieniem ich do nowego akwarium bez MNU. Utrzymuj ryby w standardowych warunkach tak długo, jak jest to pożądane do eksperymentów.Przygotuj się do wykonania pomiarów ostrości wzroku, uruchamiając układ motoryczny. Następnie z menu wybierz testowanie i ustaw opcje na proste schody. Zainstaluj butelkę infuzyjną wypełnioną 500 mililitrami wody około jednego metra nad układem silnika.Umieść jednego danio pręgowanego w komorze badawczej i podłącz go do butelki infuzyjnej. Następnie umieść komorę badawczą w układzie samochodowym. Następnie rozpocznij pomiar i obserwuj ruch gałek ocznych w czasie rzeczywistym na ekranie komputera.Odpowiedź pozytywna lub tak jest definiowana jako następujące po sobie sekundy we właściwym kierunku, podczas gdy odpowiedź negatywna lub brak reprezentują losowe ruchy gałek ocznych podobne do tych obserwowanych w przypadku nieruchomych siatek. Jeśli oczy danio pręgowanego wykazują trzy lub więcej następujących po sobie reakcji optokinetycznych lub OKR-ów, naciśnij tak. Jeśli nie, naciśnij nie.Pod wynikami w menu wyodrębnij ostrość wzroku, która została obliczona przez oprogramowanie poprzez określenie progu częstotliwości przestrzennej bodźca kinetycznego wzrokowego w celu przeprowadzenia analizy histologicznej. Po eutanazji danio pręgowanego zgodnie z protokołem tekstowym i zarodkowaniu, oczy wykorzystują 4% mocy formaldehydu w PBS, aby utrwalić nienaruszone oczy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 godzin przed użyciem serii stopniowanych alkoholi do odwodnienia próbek, osadzenia próbek w parafinie, a następnie przecięcia pięciu odcinków mikrometra przez głowę nerwu wzrokowego lub ONH i zamontowania ich na szkiełkach podstawowych. Następnie użyj Alam do barwienia zdekarbonizowanych sekcji przez pięć minut, a następnie dwukrotnie zanurz szkiełka w wodzie destylowanej, a następnie 0,2% kwasu solnego i 0,8% amoniaku.Przenieś szkiełka do wody z kranu na co najmniej 10 minut. Przenieś skrawki do eozyny na trzy minuty po umyciu i odwodnieniu szkiełek serią etanolu. Użyj podłoża montażowego, aby je osadzić i mikroskopu świetlnego, aby obserwować próbki pod kątem terminalazy, transferazy tlenowej nukleotydów, etykietowania DUPT Nick n lub tunelu.Dodaj 20 mikrogramów na mililitr pronazy K do skrawków de parize i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po użyciu tris buforowanej soli fizjologicznej do trzykrotnego mycia sekcji przez pięć minut każda, dodać 50 mikrolitrów tunelowej mieszaniny reakcyjnej do sekcji i inkubować je w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut. Po umyciu próbek i trzykrotnym próbowaniu przez pięć minut każda, należy użyć podłoża montażowego zawierającego dappy, aby zamontować szkiełka przed nimi pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu przeprowadzenia barwienia proliferującego antygenu jądrowego komórki lub PCNA.Umieścić próbki w celu pobrania antygenu, buforować i gotować przez trzy minuty przed myciem w TB S3 razy przez pięć minut co godzinę przy użyciu buforu blokującego, inkubować próbki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie z rozcieńczeniem anty-PC NA od 1 do 200. Przeciwciała pierwszorzędowe, inkubować próbki w wilgotnej komorze przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza po umyciu próbek TBS plus dwanaście razy 23 razy przez pięć minut każda. Użyć rozcieńczenia przeciwciał drugorzędowych w proporcji od 1 do 500 do inkubacji próbek przez godzinę w temperaturze pokojowej.Po zamontowaniu szkiełek z podłożem montażowym zawierającym dpi obserwuj je pod mikroskopem fluorescencyjnym. Rysunek ten przedstawia przebieg ostrości wzroku u dorosłych ryb danio pręgowanego po zastosowaniu 150 mikrogramów na litr MNU. Począwszy od pierwszego dnia, pomiary wykazały wyraźny spadek ostrości wzroku, osiągając minimalne wartości w trzecim dniu przed wzrostem wartości.Kontynuowano w ósmym dniu i osiągnięto pełną regenerację w 30 dniu, co widać w analizie histologicznej zwyrodnienia siatkówki oka danio pręgowanego, które obserwowano przez 30 dni po leczeniu MNU, w tym zakłócenie INL z tworzeniem się ubytku ONL począwszy od trzeciego dnia i z maksymalną utratą pręcika ONL obserwowaną w ósmym dniu poprzez dodatnie barwienie tunelowe w różnych warstwach siatkówki czuciowej. Zaobserwowano, że zwyrodnienie siatkówki po leczeniu MNU było spowodowane apoptozą, przy czym większość komórek tunelowo-dodatnich znaleziono w ONL w trzecim dniu. Jednak w tym samym czasie zaobserwowano również umierające komórki w INL.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać zwyrodnienie siatkówki u dorosłych zebry za pomocą leczenia m and U, a także jak określić ilościowo zmiany funkcjonalne i morfologiczne za pomocą pomiaru OKR i procedur immunohistochemicznych.

methylnitrosourea-mnu-induced-retinal-degeneration-regeneration

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano wiele protokołów uszkodzeń światłem, które uszkadzają fotoreceptory i w konsekwencji wywołują reakcję regeneracji siatkówki u dorosłych ryb pręgowanych. Protokół ten opisuje ulepszoną metodę, która może być stosowana u zwierząt pigmentowanych i która uszkadza zdecydowaną większość fotoreceptorów pręcików i czopków w całej siatkówce.

Nowy paradygmat uszkodzeń spowodowanych światłem do wykorzystania w badaniach nad regeneracją siatkówki u dorosłych danio pręgowanych

Ponieważ wiele modeli chorób neurologicznych i nieneurologicznych u danio pręgowanego jest badanych na dorosłych rybach, a nie na zarodkach/larwach, opracowaliśmy ilościowy test regeneracyjny linii bocznej, który może być zastosowany do modeli chorób u dorosłych ryb danio pręgowanego. Test polegał na rozdzielczości na poziomie 1) neuromastu i 2) poszczególnych komórek rzęsatych.

Test do regeneracji linii bocznej u dorosłych danio pręgowanych

Dorosła nerka danio pręgowanego jest doskonałym systemem do regeneracji nerek i badań nad chorobami.  Istotnym aspektem takich badań jest ocena struktury i funkcji nefronu. Protokół ten opisuje kilka metodologii, które można zastosować do oceny składu kanalików nefronowych i oceny wchłaniania zwrotnego przez nerki.

Analiza składu i funkcji nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego

Aby pomóc ocenić mechanizmy molekularne leżące u podstaw regeneracji wątroby u danio pręgowanego za pomocą dróg żółciowych, stworzyliśmy model uszkodzenia wątroby, w którym hepatocyty wykazujące ekspresję nitroreduktazy są genetycznie ablowane po leczeniu metronidazolem.  W tym protokole opisujemy, jak umiejętnie manipulować, monitorować i analizować ablację hepatocytów i regenerację wątroby napędzaną przez żółć.

Ablacja specyficzna dla hepatocytów u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji wątroby napędzanej przez drogi żółciowe

Narażenie na teratogeny może powodować wady wrodzone. Danio pręgowany jest przydatny do określania potencjału teratogennego chemikaliów. Wykazujemy użyteczność danio pręgowanego, wystawiając zarodki na działanie różnych poziomów azotynów, a także w różnych momentach ekspozycji. Pokazujemy, że azotyny mogą być toksyczne i powodować poważne wady rozwojowe.

Danio pręgowany jako model do oceny potencjału teratogennego azotynów

Regeneracja siatkówki danio pręgowanego była głównie badana przy użyciu stałych siatek oka. Jednak dynamiczne procesy, takie jak interkinetyczna migracja jądrowa, zachodzą podczas odpowiedzi regeneracyjnej i wymagają obrazowania żywych komórek w celu zbadania mechanizmów leżących u ich podstaw. W tym miejscu opisujemy warunki hodowli i obrazowania w celu monitorowania międzykinetycznej migracji jądrowej (INM) w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej

Danio pręgowany jest popularnym modelem zwierzęcym do badania mechanizmów degeneracji/regeneracji siatkówki u kręgowców. Protokół ten opisuje metodę wywoływania miejscowego urazu zakłócającego zewnętrzną siatkówkę przy minimalnym uszkodzeniu wewnętrznej siatkówki. Następnie monitorujemy in vivo morfologię siatkówki i odpowiedź glejową Müllera przez cały okres regeneracji siatkówki.

Aktywacja komórek glejowych Müllera w indukowanym laserowo modelu zwyrodnienia i regeneracji siatkówki u danio pręgowanego

Ten protokół opisuje metodologię genetycznej ablacji nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) przy użyciu transgenicznego modelu danio pręgowanego. Dostosowanie protokołu w celu włączenia modulacji szlaku sygnałowego za pomocą związków farmakologicznych jest bardzo szczegółowe. Opracowano platformę MATLAB do ilościowego określania regeneracji RPE na podstawie pigmentacji, która została zaprezentowana i omówiona.

Ablacja za pośrednictwem nitroreduktazy/metronidazolu oraz platforma MATLAB (RpEGEN) do badania regeneracji nabłonka barwnikowego siatkówki danio pręgowanego

W celu oceny nowych terapii komórkami macierzystymi istotne jest nieinwazyjne śledzenie wstrzykniętych komórek in vivo. W tym filmie dowiedzą się Państwo, jak znakować ludzkie mezenchymalne i embrionalne komórki macierzyste za pomocą środków kontrastowych opartych na tlenku żelaza w celu późniejszego obrazowania MR in vivo.

Znakowanie hESC i hMSC nanocząsteczkami tlenku żelaza w celu nieinwazyjnego śledzenia in vivo za pomocą obrazowania MR

Ostre uszkodzenie nerek (AKI) u ludzi jest częstym problemem klinicznym spowodowanym uszkodzeniem komórek nabłonkowych tworzących nefrony nerkowe, a AKI wiąże się z wysoką śmiertelnością na poziomie 50-70%1. Po zniszczeniu komórek nabłonkowych nefrony mają ograniczoną zdolność do regeneracji, choć mechanizmy i ograniczenia sterujące tym zjawiskiem pozostają słabo poznane. W niniejszym artykule wideo opisujemy naszą technikę celowanej ablacji laserowej komórek nefronu nerki w nerce zarodka ryby...

Ablacja laserowa pronefry ryby danio w celu badania regeneracji nabłonka nerkowego

Poznaj model zwyrodnienia i regeneracji siatkówki u danio pręgowanego wywołany toksyną MNU. Metoda łączy pomiar ostrości wzroku z analizą histologiczną i immunohistochemiczną zmian w oku.

Zwyrodnienie i regeneracja siatkówki wywołane przez metylonitromocznik (MNU) u danio pręgowanego: charakterystyka histologiczna i funkcjonalna (Wideo) | JoVE Journal

Zwyrodnienie i regeneracja siatkówki wywołane przez metylonitromocznik (MNU) u danio pręgowanego: charakterystyka histologiczna i funkcjonalna

Przeglądaj więcej filmów