Izolacja białka z rozwijającego się zarodkowego regionu zastawki serca myszy
23 września 2014
Analiza ekspresji białek w młodych embrionalnych zastawkach myszy została utrudniona przez ograniczoną dostępną tkankę. Manuskrypt ten zawiera protokół przygotowania białka z rozwijających się embrionalnych obszarów zastawki myszy do analizy western blot.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie i wyekstrahowanie białka z zarodkowych zastawek serca. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie zarodka od ciężarnej myszy. W drugim etapie serce jest wycinane z zarodka, a następnie w ostatnim etapie pobierane są zastawki serca.
Tkanka poddaje się lizie, a otrzymaną próbkę białka przygotowuje się do dalszej analizy. Ostatecznie, zachodnia analiza BLO może być wykorzystana do oceny poziomów ekspresji białek. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy sekcji są trudne do nauczenia się ze względu na mały, zwarty kształt rozwijającego się serca.
W pożądanym dniu rozwoju embrionalnego użyj 70% etanolu do sterylizacji brzucha ciężarnej samicy. Następnie unieś skórę i mięśnie dolnej części brzucha do góry i odsuń od narządów wewnętrznych, a następnie rozetnij dolną jamę brzuszną, aby umożliwić dostęp do rogu macicy. Następnie przytrzymaj szyjkę macicy kleszczami i ostrożnie przytnij dupkę do końcówek.
Następnie podnieś róg macicy, przecinając tkankę łączną, która utrzymuje róg na miejscu, i zakończ usuwanie, przecinając połączenie rogu macicy z uct. Wypreparowany róg macicy umieścić na szalce Petriego zawierającej zimny 0,1 molowy bufor tris i spłukać w razie potrzeby. Następnie przetnij róg macicy.
Otwórz wzdłuż, aby odsłonić worki embrionalne. Aby odsłonić zarodek, rozetnij worek embrionalny na styku łożyska i zarodka i przetnij naczynia pępowinowe, aby uwolnić zarodek. Umieścić wypreparowany zarodek na drugiej szalce Petriego z zimnym 0,1 molowym buforem trisa i umieścić pierwszą szalkę Petriego z pozostałymi i wypreparowanymi zarodkami do lodu aż do następnego rozbioru zarodka.
Po ścięciu głowy umieść zarodek na plecach i przetnij ścianę klatki piersiowej pionowo wzdłuż boku klatki piersiowej w pobliżu utykania i poziomo powyżej przepony. Aby uwidocznić serce, otwórz ścianę klatki piersiowej. Następnie trzymaj kleszcze wysoko wzdłuż wielkich naczyń, podnieś serce i przetnij naczynia poniżej.
Następnie przetnij nad kleszczami, aby uwolnić serce. Jeśli naczynia płucne pozostają nieprzecięte, należy usunąć płuca z sercem przed kontynuacją opisanych tutaj stadiów embrionalnych, tętnica płucna jest lekko nieprzezroczysta. Po zidentyfikowaniu tętnicy przetnij ją i usuń powyżej poziomu zastawki.
Teraz przeciąć tuż poniżej zastawki płucnej, unikając mięśnia sercowego komory ECD, i usuń nadmiar buforu tris z obszaru zainteresowania. Przed umieszczeniem zastawki w probówce einor zawierającej dwa mikrolitry buforu do lizy, takiej jak tętnica płucna, aorta będzie wydawać się lekko nieprzezroczysta. Po jego zidentyfikowaniu przeciąć tuż pod zastawką aortalną.
Ponownie, unikając bełkowania mięśnia sercowego komorowego. Usuń nadmiar roztworu tri, a następnie przenieś zastawkę do rurki einor zawierającej lizę, bufor i tkankę tętnicy płucnej. Po zebraniu całej tkanki natychmiast umieść próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszej temperatury.
Użyj do ekstrakcji białka, rozmrozić zebrane tkanki na lodzie, a następnie granulować próbki przez jedną minutę w temperaturze 13, 100 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Sprawdź objętość otrzymanej próbki i użyj buforu do lizy, aby zwiększyć całkowitą objętość do 40 mikrolitrów. Następnie dodaj pięciomilimetrowe kulki ze stali nierdzewnej, aby rozbić i homogenizować próbki w lyrze przez dwie do czterech minut przy 50 hercach, zgodnie z instrukcjami producenta.
Po homogenizacji należy krótko odwirować probówki i przenieść próbki do nowych probówek, pozostawiając nierozpuszczalne resztki do dalszej analizy eksperymentalnej. Za pomocą tej techniki przygotowania można wykryć fosforylowany smad 1 5 8 w pojedynczych obszarach zastawki aortalnej z zarodków E 13,5. Na przykład białko wyizolowane nawet z pojedynczego obszaru zastawki jest wystarczające do wykrycia słabego pasma p smad, w którym intensywność sygnału wzrasta proporcjonalnie do liczby połączonych obszarów zastawki.
Co ważne, stosunek beta aktyny p smad pozostaje wyraźnie stały dla różnych wielkości próbek ze względu na niski poziom dostępnego białka, ta sama plama nie może być usunięta i ponownie zbadana pod kątem całkowitego smad. Jednak oddzielny blot pokazujący całkowity smad jeden i beta aktynę wykazuje ten sam wzorzec ekspresji. Te obszary zastawki są prawie całkowicie pozbawione zanieczyszczającego mięśnia sercowego komory przy użyciu tej techniki przygotowania w połączeniu z próbkami z prawej komory, markerem mięśnia sercowego komory, NP nie jest wykrywalny w obszarach zastawki aortalnej, podczas gdy marker ten jest łatwo wykrywalny w komorze.
Co więcej, marker komorowy mięśnia sercowego łańcuch lekki miozyny dwa V jest również łatwo wykrywalny w próbce komorowej, ale jest ledwo wykrywalny w obszarach zastawki aortalnej, co podkreśla precyzję sekcji Po tej sekcji. Inne MES, takie jak QPCR lub RN AIC, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jakie geny są dotknięte na różnych etapach rozwoju.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół do izolacji i ekstrakcji białka z zaworów sercowych embrionalnych u myszy. Metoda radzi sobie z wyzwaniami w analizie ekspresji białek związanymi z ograniczonym dostępem do tkanki.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Badania nad układem krążenia
Tło
- Analiza ekspresji białek w tkankach embrionalnych jest często ograniczona przez wielkość próbki.
- Rozumienie poziomów białek w zastawkach serca jest kluczowe dla badań rozwojowych.
- Analiza Western blot jest częstą techniką oceny ekspresji białek.
- Sekcja małych tkanek, takich jak serca embrionalne, może być trudne technicznie.
Cel badania
- Dostarczyć szczegółowy protokół ekstrakcji białka z embrionalnych zaworów sercowych u myszy.
- Ułatwić analizę Western blot do badania poziomów ekspresji białek.
- Poprawić reprodukowalność i dokładność analizy białek z ograniczonych próbek.
Zastosowane metody
- Izolacja embrionów od ciężarnych myszy.
- Sekcja serca z zarodka.
- Zbieranie zaworów sercowych do ekstrakcji białka.
- Lizys tkanki w celu przygotowania próbek białkowych do analizy.
Główne wyniki
- Udana ekstrakcja białka z embrionalnych zaworów sercowych.
- Przygotowanie próbek nadających się do analizy Western blot.
- Demonstracja technik sekcji dla efektywnego uczenia się.
- Ocena poziomów ekspresji białek w rozwijających się tkankach serca.
Wnioski
- Protokół umożliwia efektywne badanie ekspresji białek w embrionalnych zaworach sercowych.
- Pomoce wizualne są niezbędne do opanowania technik sekcji.
- Ta metoda może rozwijać badania nad rozwojem serca i powiązanymi dziedzinami.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Protein isolation from limited embryonic tissue enables detection of signaling pathway activation in early developmental models. This approach supports target validation by providing semi-quantitative data on phosphorylated proteins from pooled microdissected valve regions. The method addresses a key bottleneck in preclinical research where sample scarcity hinders mechanistic de-risking of cardiovascular targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in cardiac valve development through detection of phosphorylated signaling proteins like pSmad1/5/8.
- Operational Value: Provides a reproducible workflow for protein extraction from four E13.5 mouse aortic valve regions, each yielding ~1 µg protein.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing semi-quantitative assessment of pathway activation in disease-relevant embryonic systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological samples for downstream western blot analysis, enabling reliable compound evaluation in phenotypic screening.
- Operational Value: Standardizes lysis and homogenization protocols using Tris-based buffer with protease inhibitors and SDS-sample buffer for denaturation.
- Scalability: Enables platform reuse across developmental timepoints by pooling tissue to overcome low protein yield limitations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase protein expression data to preclinical validation through consistent pSmad/β-actin ratios across sample sizes.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target engagement by confirming ventricular myocardium exclusion via absence of MYL2V and ANP markers in valve regions.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions by linking protein expression patterns to developmental stages using internal controls.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing mechanistic readouts from disease-relevant embryonic systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through detection of phosphorylated signaling proteins in valve tissue.
- Screening: Delivers assay-ready samples with standardized protein extraction, enabling reproducible western blot outputs for compound screening.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements via chemiluminescent signal intensity proportional to protein pool size, supporting comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains continuity from embryonic discovery to preclinical models by preserving pathway-specific expression patterns detectable in separate blots for total Smad and β-actin.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable capability for protein isolation across embryonic cardiovascular studies, reducing redundant protocol development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by enabling detection of low-abundance phosphorylated proteins from microdissected tissues.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined lysis volumes, bead-based homogenization, and consistent sample preparation for western blot.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in early cardiovascular target assessment.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by providing semi-quantitative pathway activation data from embryonic valve regions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection of embryonic cardiac structures to isolate valve regions without ventricular myocardium contamination.
- Dependent on instrumentation for homogenization (lyser with stainless steel beads) and centrifugation at 13,100 × g for sample clarification.
- Necessitates cross-team standardization of lysis buffer volumes (40 µL final volume) and protease inhibitor use to ensure sample consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to other embryonic tissues or developmental stages beyond E13.5 aortic valve regions.
- Includes practical limitations such as inability to quantify total protein via spectrophotometry due to low yield, requiring reliance on semi-quantitative western blot analysis.
