Name: Metoda mikroiniekcji zygot Patiria minata (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Poznaj metodę mikroiniekcji zygot Patiria miniata w biologii rozwoju. Technika obejmuje pobieranie gamet, zapłodnienie i wstrzykiwanie reagentów perturbujących, umożliwiając badanie sieci regulacyjnych genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation IOS 0844948 i IOS 1024811

Utrzymuj całą wodę morską lub sztuczną wodę morską (SW), dorosłe zwierzęta i kultury w temperaturze 15 °C na tyle, na ile jest to możliwe. Upewnij się, że jaja i zygoty są zanurzone w SW.
Komercyjnie przygotowane sole morskie odtwarzane za pomocą wody destylowanej lub z odwróconej osmozy dobrze służą jako źródło SW. Sprawdź zasolenie za pomocą areometru i dostosuj sole lub wodę, aby osiągnąć optymalny poziom. Utrzymuj poziom ciężaru właściwego od 1,020 do 1,025. Przechowuj wszystkie naczynia szklane i plastikowe oddzielnie od wszystkich innych urządzeń laboratoryjnych, aby uniknąć zanieczyszczenia chemikaliami. Wyczyść sprzęt laboratoryjny klasy zarodkowej, spłukując go wodą dejonizowaną lub od czasu do czasu mocząc w rozcieńczonym podchlorynie sodu, a następnie kilkakrotnie spłukując w wodzie.
1. Pozyskiwanie i dojrzewanie gamet od dorosłych Patiria miniata
<ol>
	<li>Wybierz zwierzę, aby wyciąć gonady. Określ płeć po wycięciu, szukając obecności jajników lub jąder, ponieważ P. miniata nie są dymorficzne płciowo.</li>
	<li>Wytnij mały otwór, nie większy niż 1 cm, wzdłuż boku ramienia gwiazdy morskiej za pomocą ostrza skalpela (Rysunek 1A). Za pomocą małych kleszczy z końcami odciągnij krawędzie nacięcia, aby uzyskać dostęp do tkanki gonady i wyciągnij tkankę gonady przez nacięcie. 
	UWAGA: Unikaj wyciągania tkanki jelitowej, która jest luźną szarą lub brązową tkanką (ryc. 1B). Jajniki są zazwyczaj pomarańczowe, żółte lub jasnobrązowe (ryc. 1C), podczas gdy jądra są białe lub beżowe, a po zakłóceniu spowodują, że woda morska stanie się mleczna lub mętna (ryc. 1D).</li>
	<li>Przywróć samice do akwariów. Izoluj samce przez godzinę lub dwie w pojemniku SW, ponieważ stres związany z obchodzeniem się z nim może wywołać tarło. Zwierzęta goją się wzdłuż miejsca nacięcia i dostarczają gamety przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Zbierz jądra do 1,5 ml probówki Eppendorf z jak najmniejszą ilością SW i przechowuj na lodzie do czasu użycia. Niewykorzystane jądra należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia, które nie zostały wykorzystane w dniu pobrania.</li>
	<li>Zbierz jajniki w małym szklanym naczyniu hodowlanym w kilku mililitrach SW. Aby uwolnić oocyty z tkanki jajnika, rozdziel tkankę dwiema parami kleszczy, aż nie pozostaną żadne duże kawałki. 
	UWAGA: Optymalnie większość oocytów jest w pełni rozwinięta. Takie oocyty są duże, okrągłe i jasnożółte lub jasnobrązowe z wyraźnym pęcherzykiem zarodkowym w oocycie (ryc. 2A), w porównaniu z podzbiorem nierozwiniętych oocytów, które są mniejsze, brązowe, ziarniste i nieprzezroczyste (ryc. 2B). Jeśli więcej niż około 25% oocytów należy do odmiany nierozwiniętej, wybierz inną samicę w celu uzyskania oocytów.</li>
	<li>Przelej oocyty i pozostałą tkankę przez siatkowy kubek filtracyjny o wielkości porów 200 μm i zbierz przez nie przepływ. Będzie on zawierał wszystkie odmiany oocytów, ale usunie tkankę jajnikową. Usuń pozostałe oocyty z tkanki złapanej przez filtr, spryskując je SW z butelki ze spryskiwaczem. Kubki filtracyjne są wykonane przy użyciu stożkowej rurki o pojemności 50 ml (rysunek 3A-A').</li>
	<li>Przelej przepływ z kroku 1.6 przez kubek filtracyjny o siatkowej siatce 100 μm. Odrzuć małe oocyty w przepływie. Duże, w pełni rozwinięte oocyty, które są gotowe do dojrzewania, pozostaną na filtrze. Opłucz oocyty do czystej zlewki o pojemności 200 ml.</li>
	<li>Dodać 95 ml SW do szklanej zlewki z oocytami o pojemności 200 ml. Dodać 5 ml 200 μM 1-metyladeniny, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM.</li>
	<li>Przenieść oocyty do dużego, płytkiego naczynia do hodowli i umieścić w temperaturze 15 °C. Naczynie hodowlane o dużej powierzchni do objętości pozwala na wymianę tlenu. Oocyty nie dojrzewają lub mogą nie rozwijać się dobrze, jeśli są przepełnione w tej fazie dojrzewania. Podzielić na kilka szalek z SW plus 10 μM 1-metlyadeniny, aż hodowla będzie mniejsza niż 200 oocytów/ml.</li>
	<li>Pozwól oocytom dojrzeć przez 45-90 minut, ale nie dłużej, ponieważ uniemożliwi to zapłodnienie oocytów. Aby ustalić, czy dojrzewanie jest zakończone, przyjrzyj się oocytom pod zakresem preparacyjnym. Pęcherzyk rozrodczy porusza się w kierunku błony komórkowej i łączy się z nią podczas dojrzewania. Następnie rozpada się i dlatego nie jest już widoczny w dojrzałych oocytach (ryc. 2C).</li>
</ol>
2. Zapłodnienie dojrzałych oocytów
<ol>
	<li>Wybierz małe skupisko tkanki jądra, mniej więcej wielkości ziarnka grochu, i zmiel w małym szklanym naczyniu hodowlanym z około 1 ml SW.</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura przenieś 2-3 krople powstałej mlecznej wody morskiej do około 100 ml dojrzałych oocytów i zakręć szalką hodowlaną w celu wymieszania. Unikaj przenoszenia kawałków tkanki jąder. Unikaj dodawania większych ilości plemników, ponieważ może to spowodować polispermię, a następnie słaby rozwój.</li>
	<li>Po kilku minutach obserwuj oocyty pod lunetą preparacyjną. Zapłodnione jaja lub zygoty mają otoczkę zapłodnienia, która jest przezroczystym pęcherzykiem, który unosi się z błony komórkowej (ryc. 2D). 
	UWAGA: Nie kontynuuj hodowli, jeśli zapłodnionych jest mniej niż około 90% jaj, ponieważ słabe wskaźniki zapłodnienia wskazują na niezdrową kulturę, która również może nie rozwijać się dobrze.</li>
	<li>Po zakończeniu zapłodnienia zmień SW na zygotach, przelewając przez filtr siatkowy 100 μm i spłukując do naczynia hodowlanego ze świeżym SW. Ważne jest, aby usunąć nadmiar plemników, aby zapobiec głodowi tlenu. Umieścić naczynie hodowlane w temperaturze 15 °C na 15-30 minut.</li>
</ol>
3. Usuwanie galaretek i wiosłowanie zapłodnionych jaj
<ol>
	<li>Przygotować naczynia iniekcyjne, zdejmując pokrywkę z polistyrenowej szalki Petriego o wymiarach 60 x 15 mm.
	<ol>
		<li>Narysuj linię markera permanentnego na odwrocie naczynia, wokół obszaru, który odpowiada polu widzenia na mikroskopie do mikroiniekcji. Gwarantuje to, że wszystkie zarodki rzędowe znajdują się w polu widzenia mikroskopu.</li>
		<li>Użyj szklanej pipety Pasteura, aby naciąć linię przez okrąg, najlepiej z jednej strony okręgu (Rysunek 3B). Użyj tej linii później, aby złamać igły iniekcyjne (krok 4.5). 
		UWAGA: Odczynniki powszechnie stosowane do przylegania zarodków jeżowców, np. siarczan protaminy lub poli-L lizyna, są zbędne. Pozbawione galaretki zygoty P. miniata bardzo dobrze przylegają do niepowlekanego plastiku. Należy pamiętać, że nie przylegają dobrze do szklanych naczyń.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj około 10 ml SW do każdego naczynia, tak aby powierzchnia była pokryta, ale woda nie rozpryskiwała się nadmiernie w naczyniu, ponieważ może to zakłócić pracę zarodków.</li>
	<li>Przed wiosłowaniem należy usunąć galaretkę zygoty P. miniata kwasem SW. Ta galaretowa sierść jest bardziej rozległa niż obserwowana u modelowych gatunków jeżowców.
	<ol>
		<li>Przygotować kwas SW w zakresie pH 4,0-4,2. pH ma kluczowe znaczenie dla skutecznego usuwania galaretki przy jednoczesnym umożliwieniu normalnego rozwoju.</li>
		<li>Dodać pojedyncze krople 1 N (1 M) HCl w SW do 1 l zapasu SW. Pozwól każdej kropli całkowicie się wymieszać i monitoruj pH przed dodaniem większej ilości HCl. 
		UWAGA: Od jednego do kilku ml HCl daje odpowiednie pH, ale nie należy dodawać całej objętości na raz. 
		UWAGA: Przygotować 1 N HCl w dygestorium z SW i 12 N (12 M) HCl.</li>
		<li>Usuń SW z zygot, wylewając je na filtr siatkowy 100 μm. Wypłukać do zlewki o pojemności 200 ml w najmniejszej możliwej ilości SW (około 10 ml). Napełnić zlewkę do 150 ml kwasem SW (pH 4,0) i pozostawić zygoty na 3 minuty w kwasie SW.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń galaretkę z zygot, wlewając je tam iz powrotem między dwie zlewki o pojemności 200 ml, za każdym razem przepuszczając zygoty przez filtr siatkowy o wielkości 200 μm. Przelej zygoty przez filtr około 5-10 razy w ciągu około 2 minut.</li>
	<li>Usuń kwaśny SW, wylewając zygoty na filtr siatkowy 100 μm. Opłucz zygoty w małym szklanym naczyniu hodowlanym z SW. Pozbawione galaretki zygoty mogą przyklejać się do plastikowych naczyń. Natychmiast rzędź zarodki; Zaczynają wytwarzać więcej galaretowatej powłoki, co z czasem prowadzi do słabej przyczepności do plastikowych naczyń.</li>
	<li>Za pomocą pipety doustnej (ryc. 3C-C') pobrać zygoty ze szklanego naczynia do hodowli i umieścić je w prostych liniach na szalkach do wstrzykiwań. Rozpuść środek cienkiej strony pipety Pasteura nad płomieniem, aż szklanka będzie miękka. Szybko rozsuń końce szklanki, aby uzyskać bardzo cienki odcinek szkła. Gdy szklanka ostygnie, odłam małą końcówkę pipety Pasteura (dodatkowe informacje na temat przygotowania pipety doustnej można znaleźć w Wessel i in. 200417 lub Sweet i wsp. 200418).
	<ol>
		<li>Zrób pipetę wiosłową tak, aby średnica była tylko większa niż średnica zarodków, tak aby tylko jedna zygota wchodziła i wychodziła z pipety na raz. Umożliwi to utworzenie pojedynczego rzędu. Pipety o mniejszej średnicy mogą zdzierać otoczkę zapłodnienia i zakłócać działanie zygot, ponieważ zygoty P. miniata nie mają szklistej błony i są dość miękkie.</li>
		<li>Jeśli zygoty nie przykleją się do plastikowego naczynia, trzymaj je przez dodatkowy czas w kwaśnym SW (jeszcze do kilku minut). Alternatywnie, pipeta o mniejszej średnicy może pomóc w usunięciu galaretowatego płaszcza, aby zygoty mogły skuteczniej się przyklejać.</li>
		<li>Zygoty są lekko dodatnio wyporne i mają tendencję do unoszenia się lub unoszenia się tuż nad dnem naczynia. W takim przypadku należy ustawić pipetę wiosłową tak, aby zygoty były delikatnie dociskane do powierzchni naczynia podczas wychodzenia z pipety (Rysunek 3D). 
		UWAGA: Dopuszczalne jest zmieszczenie wielu rzędów na tych naczyniach. Błony embrionalne P. miniata nie stają się z czasem trudniejsze do przeniknięcia, dlatego można wstrzyknąć setki zygot na jedną szalkę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wstrzyknięcie zygot
<ol>
	<li>Przygotować roztwory iniekcyjne o odpowiednich stężeniach oligonukleotydów antysensownych morfolino (MASO), mRNA lub DNA w końcowym stężeniu 200 mM KCl. 400-800 μM MASO i 2,5 ng/μl DNA mają tendencję do wytwarzania fenotypów morfantowych przy jednoczesnej minimalizacji toksyczności. Końcowe stężenie w jaju wyniesie 1/125stężenia początkowego14. W przypadku roztworów do wstrzykiwań zawierających MASO, należy podgrzewać do temperatury 65 °C przez 5 minut bezpośrednio przed użyciem, a następnie przechowywać w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>W celu ułatwienia sortowania wstrzykniętych zarodków należy dodać znacznik dekstranu rodaminy do roztworu do wstrzykiwań, aby uzyskać stężenie 0,1%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować igły do wstrzykiwań, ciągnąc szklaną rurkę kapilarną (1,0 mm średnicy zewnętrznej x 0,75 mm średnicy, długość 100 mm) w przyrządzie do ciągnięcia igły zgodnie z instrukcjami producenta. Igły nadające się do wstrzykiwań u jeżowców sprawdzają się również w przypadku gwiazd morskich, dlatego należy stosować podobne parametry19.</li>
	<li>Załadować około 2 μl roztworu do wstrzykiwań do igły iniekcyjnej za pomocą końcówki pipety do mikroładowarki.</li>
	<li>Włóż koniec igły do manipulatora. Ustaw picospritzer na impuls 100 ms i ciśnienie powietrza 40 PSI.</li>
	<li>Umieść naczynie z rzędowymi zarodkami na stoliku mikroskopu i umieść wszystkie zarodki w polu widzenia. Ustaw naczynie tak, aby nacięta linia znajdowała się po stronie najbliższej igły. Ustawić igłę pod kątem około 60° tak, aby końcówka znajdowała się blisko środka linii i tuż nad powierzchnią wody.</li>
	<li>Skoncentruj się na naciętej linii i opuść igłę, aż końcówka stanie się ostra. Opuść końcówkę nieco bardziej i rozłam ją, delikatnie wbijając ją w grzbiety naciętej linii. Podnieś końcówkę z powierzchni naczynia i umieść ją na górze pierwszego rzędu zygot i skup się na zygotach.</li>
	<li>Opuść końcówkę tak, aby przebiła środek zygoty wchodzący pod kątem około 60°. Igła łatwo wnika w zygoty P. miniata. Nadepnąć na pedał nożny (lub w inny sposób wypchnąć materiał z igły do wstrzykiwań) w celu wprowadzenia bolusa roztworu do wstrzykiwań do zarodka.</li>
	<li>Celuj w bolus, który ma średnicę 20-30% zarodka, czyli od 25 do 80 pl. Jeśli bolus jest większy lub mniejszy, należy dostosować czas wstrzyknięcia na pikospritzerze i wstrzyknąć następny zarodek. Kontynuuj dostosowywanie czasu trwania, aby uzyskać żądany rozmiar bolusa. Zacznij od czasu trwania 100 ms. Ponownie złamać igłę, jeśli czas potrzebny jest na więcej niż około 200 ms, aby wprowadzić odpowiedni bolus. Wyrzucić igłę i przygotować nową, jeśli do uzyskania tego rozmiaru bolusa potrzeba mniej niż 15-20 ms, ponieważ rozmiar igły jest zbyt duży i może zakłócić normalny rozwój.</li>
	<li>Przystąp do wstrzykiwania pozostałych zygot na szalkę iniekcyjną. Zarodki można z łatwością wstrzykiwać do momentu rozpoczęcia rozszczepienia i do pojedynczych blastomerów po pierwszym rozszczepieniu. Okresowo podnoś igłę ponad powierzchnię wody, aby usunąć zygoty, które przyklejają się do igły. W razie potrzeby ponownie złamać końcówkę igły lub załadować nową igłę, jeśli wystąpi zablokowanie.</li>
</ol>
5. Pobieranie wstrzykniętych zarodków do dalszej analizy
<ol>
	<li>Pozwolić zarodkom rozwinąć się w temperaturze 15 °C na południowym zachodzie. Utrzymać dużą powierzchnię do objętości w kulturach, aby umożliwić wymianę tlenu. Upewnij się, że zarodki nie są stłoczone; utrzymywać kultury na poziomie lub niższym niż 200 zarodków/ml. W zależności od pożądanego stadium zarodka, należy zaplanować pobranie wstrzykniętych zarodków około 20-24 godzin po zapłodnieniu. 
	UWAGA: Jest to często idealny czas na sortowanie i zbieranie, a także dlatego, że normalnie rozwijające się zarodki są łatwo rozróżniane morfologicznie, ale jeszcze nie pływają.</li>
	<li>Jeśli wykluły się zarodki, delikatnie posolić solą, aby zapobiec pływaniu. Dodać 200 μl 5 M NaCl do 10 ml SW w naczyniu iniekcyjnym, delikatnie obracając SW. Po kilku minutach zarodki opadną na dno naczynia. Zbierz je i przenieś do normalnego zasolenia SW.</li>
	<li>Pobrane zarodki należy pobrać pod odpowiednim źródłem światła fluorescencyjnego, zgodnym ze znacznikiem stosowanym w roztworze do wstrzykiwań. Jeśli nie użyto znacznika, posortuj zarodki, aby wybrać je pod kątem prawidłowej morfologii.</li>
	<li>Za pomocą pipety doustnej narysuj fluorescencyjne zarodki z minimalną ilością SW i przedmuchnij je do małego naczynia hodowlanego wypełnionego SW. Idealne pipety doustne mają wystarczająco duży otwór, aby zarodki można było wciągać i wyjmować bez ich uszkadzania, ale nie tak duże, aby niepożądane zarodki i obce SW również były wyciągane.</li>
	<li>Gdy wszystkie pożądane zarodki zostaną zebrane do nowego naczynia, obserwuj je w świetle fluorescencyjnym i usuń wszelkie niewstrzyknięte zarodki lub słabo rozwinięte zarodki.</li>
	<li>Hodowla posortowała zarodki do pożądanych etapów w inkubatorze i przystąpiła do obrazowania lub innych pożądanych protokołów.</li>
</ol>

<ol><li>Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+fluorescence+in+thick+specimens%2C+with+an+application+to+cyclin+B-GFP+expression+in+starfish+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell+Auspices+Eur.+Cell+Biol.+Organ%22%5BJournal%5D)">Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes.</a> Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).</li>
<li>Terasaki, M., Runft, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-stage+dependence+for+1-methyladenine+induced+reinitiation+of+meiotic+maturation+in+starfish+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes.</a> Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).</li>
<li>O'Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+multiple+Src+family+kinases+at+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization.</a> J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).</li>
<li>McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+wnt+and+frizzled+genes+during+early+sea+star+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.+Patterns+GEP%22%5BJournal%5D)">Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development.</a> Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).</li>
<li>Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+network+for+neurogenesis+in+a+sea+star+embryo+connects+broad+neural+specification+and+localized+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).</li>
<li>McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+embryonic+skeletogenic+mesenchyme+lineage+in+a+sea+cucumber+reveals+the+trajectory+of+change+for+the+evolution+of+novel+structures+in+echinoderms%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms.</a> EvoDevo. 3, 17(2012).</li>
<li>Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+cluster+and+chordate-like+expression+of+ParaHox+genes+in+a+sea+star%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star.</a> BMC Biol. 11, 68(2013).</li>
<li>Morino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochronic+activation+of+VEGF+signaling+and+the+evolution+of+the+skeleton+in+echinoderm+pluteus+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Evol.+Dev%22%5BJournal%5D)">Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae.</a> Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).</li>
<li>Hart, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+evolution+of+the+sea+star+egg+receptor+for+sperm+bindin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin.</a> Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).</li>
<li>McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergence+genetics+analysis+reveals+historical+population+genetic+processes+leading+to+contrasting+phylogeographic+patterns+in+co-distributed+species%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species.</a> Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).</li>
<li>Keever, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discordant+distribution+of+populations+and+genetic+variation+in+a+sea+star+with+high+dispersal+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Evol.+Int.+J.+Org.+Evol%22%5BJournal%5D)">Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential.</a> Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).</li>
<li>Lambert, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLambert%2C+P+%22Sea+Stars+of+British+Columbia%2C+Southeast+Alaska%2C+and+Puget+Sound%22">Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound</a>. , UBC Press. (2000).</li>
<li>Dorée, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+control+of+meiosis%3A+specificity+of+the+1-methyladenine+receptors+in+starfish+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).</li>
<li>Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+gene+regulatory+network+architecture+across+500+million+years+of+echinoderm+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).</li>
<li>Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caught+in+the+evolutionary+act%3A+precise+cis-regulatory+basis+of+difference+in+the+organization+of+gene+networks+of+sea+stars+and+sea+urchins%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins.</a> Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).</li>
<li>McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+gene+regulatory+network+subcircuit+drives+different+developmental+fates+in+the+vegetal+pole+of+highly+divergent+echinoderm+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos.</a> Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).</li>
<li>Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+and+handling+echinoderm+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Obtaining and handling echinoderm oocytes.</a> Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).</li>
<li>Sweet, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastomere+isolation+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Blastomere isolation and transplantation.</a> Methods Cell Biol. 74, 243-271 (2004).</li>
<li>Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+microinjection+of+fertilized+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid microinjection of fertilized eggs.</a> Methods Cell Biol. 74, 287-310 (2004).</li>
<li>Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantropic+retroviruses+as+a+transduction+tool+for+sea+urchin+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).</li>
</ol>

Brak deklarowanego przez autorów konfliktu interesów.

Istnieją dwa krytyczne kroki, które są trudne dla początkujących użytkowników tej techniki, ale są niezbędne do pomyślnego tworzenia zarodków morfantów. Pierwszym z nich jest selekcja zdrowych komórek jajowych, które będą prawidłowo dojrzewać i zapłodnić. Procent normalnego rozwoju w kulturze zależy od pory roku, stanu zdrowia zwierzęcia i liczby pobranych oocytów od jednego osobnika. Oocyty są zwykle lepszej jakości od kwietnia do października. Ważne jest, aby dokładnie przyjrzeć się oocytom przed kontynuowaniem, aby up...

Gwiazda morska, Patiria miniata, (powszechnie znana jako gwiazda nietoperza) staje się interesującym i wszechstronnym systemem modelowym dla różnych badań komórkowych1-3, rozwojowych4,5, ewolucyjnych6-8 i ekologicznych9-11. Dorosłe osobniki P. miniata występują wzdłuż wybrzeża Pacyfiku od Sitka na Alasce do Bajaw Kalifornii 12 i są łatwo utrzymywane w akwariach morskich. Oocyty są dostępne przez cały rok, a każda samica może zrzucić dziesiątki tysięcy komórek jajowych. Oocyty łatwo dojrzewają i zapładniają się zewnętrznie13. Powstałe zarodki są przezroczyste, co ułatwia obserwację; Rozwijają się synchronicznie i do rozwoju potrzebują tylko wody morskiej. Dla P. miniata (<a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">Echinobase.org dostępny jest również zbiór całego genomu i wiele transkryptomów</a>). Takie zalety sprawiają, że idealnie nadają się do wielu celów badawczych i dydaktycznych.
W ostatnich latach P. miniata stał się modelowym systemem do analiz rozwojowych sieci regulacji genów14-16. Celem takich badań jest zidentyfikowanie całego zestawu genów regulatorowych i określenie sieci ich interakcji. Wiele z tych prac wiąże się z zaburzeniami ekspresji genów poprzez wprowadzenie oligonukleotydów antysensownych lub mRNA syntetyzowanych in vitro. Dodatkowo analizy regulacyjne cis są wykorzystywane do scharakteryzowania funkcji regulatorowego DNA15. Analizy te wymagają wprowadzenia do zarodków odczynników perturbacyjnych i/lub konstruktów reporterowych DNA. Ponadto, aby scharakteryzować dalsze skutki tych perturbacji, należy przebadać wiele zarodków pod kątem zmian w ekspresji genów potencjalnych celów. Techniki mikroiniekcji wielu setek zygot mają kluczowe znaczenie dla tej pracy.
Szkarłupnie, w tym P. miniata, potrzebują wielu miesięcy, aby osiągnąć dojrzałość płciową. Z tego powodu na ogół nie jest praktyczne rozwijanie i utrzymywanie transgenicznych linii tych zwierząt do celów doświadczalnych. Dlatego hodowla dorosłych osobników transgenicznych nie może skutecznie tworzyć zmodyfikowanych zarodków. Zamiast tego perturbacja musi wystąpić de novo poprzez mikroiniekcję. Mikroiniekcja daje możliwość modyfikacji zarodków za pomocą odczynników, które nie są przepuszczalne dla komórek. Poniższy protokół opisuje metodę wprowadzania DNA, mRNA, znaczników komórkowych i oligonukleotydów antysensownych morfoliny do setek zapłodnionych jaj w ciągu jednych 2-3 godzin siedzenia przez mikroiniekcję. W ten sposób powstaje materiał wystarczający do różnych dalszych eksperymentów, w tym między innymi qPCR, hybrydyzacji in situ, sekwencjonowania RNA i western blot.

<table><tbody><tr><td>1-metyladenina</td><td>Acros Organics (Fisher Scientific)</td><td>AC20131-1000</td><td></td></tr><tr><td>190 mikronowy filtr nylonowy nitex</td><td>Małe części (oryginalnie Sefar)</td><td>CMN-0185-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>Filtr nylonowy niteksowy 100 mikronów</td><td>Małe części (oryginalnie Sefar)</td><td>CMN-0105-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowe szalki Petriego, 60 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Rurka kapilarna</td><td>FHC, Inc</td><td>30-30-0</td><td>Do wyciągania igieł do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Model P-97 Ściągacz igieł</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran, rodamina Green</td><td>Life Technologies</td><td>D7163</td><td>W przypadku wstrzykiwania reportera ekspresji GFP pomocne jest zastąpienie dekstranu Texas Red jako znacznika iniekcji</td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Lekarze Foster i Smith</td><td>CD-116528</td><td>Dostępne również w wielu sklepach zoologicznych</td></tr><tr><td>Końcówki do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda mikroiniekcji zygot patiria minata

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Szkarłupnie od dawna są ulubionym systemem modelowym do badań nad reprodukcją i rozwojem, a ostatnio do badań nad regulacją genów i ewolucją procesów rozwojowych. Gwiazda morska, Patiria miniata, zyskuje na popularności jako system modelowy dla tego typu badań, które wcześniej były wykonywane prawie wyłącznie na jeżowcach, Strongylocentrotus purpuratus i Lytechinus variegatus. Zaletą tych systemów modelowych jest łatwość wytwarzania zmodyfikowanych zarodków, w których określony gen jest regulowany w górę lub w dół, znakowanie grupy komórek lub wprowadzanie genu reporterowego. Pojedyncza metoda mikroiniekcji jest w stanie stworzyć szeroką gamę takich zmodyfikowanych zarodków. W tym miejscu przedstawiamy metodę pozyskiwania gamet z P. miniata, wytwarzania zygot i wprowadzania odczynników zakłócających za pomocą mikroiniekcji. Zdrowe zarodki morfantów są następnie izolowane w celu ilościowych i jakościowych badań funkcji genów. Dostępność danych genomowych i transkryptomicznych dla tego organizmu zwiększyła liczbę rodzajów przeprowadzanych badań i łatwość ich wykonywania.

Celem niniejszego protokołu jest wprowadzenie odczynników do embrionów. Skuteczność protokołu demonstrujemy poprzez wstrzyknięcie reporterowej konstrukcji DNA, która indukuje ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). Wstrzyknięte embriony wykazują ekspresję GFP w postaci clonal patches (Rycina 4A-B), ponieważ DNA wbudowuje się podczas wczesnych podziałów. Wiele odczynników, których wprowadzenie do embrionów jest pożądane, jest toksycznych w dużych ilościach oraz w przypadku suboptimalnych parti...

Metody tworzenia morfujących zarodków są niezbędne do badania mechanizmów rozwojowych i sieci regulacji genów. Gwiazda morska Patiria miniata jest wyłaniającym się systemem modelowym dla tych badań. W tym miejscu przedstawiamy protokół pozyskiwania gamet, produkcji kultur zarodków oraz szybkiej mikroiniekcji zygot tego gatunku.

Metoda mikroiniekcji zygot Patiria minata

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Ogólnym celem tej procedury jest modyfikacja zarodków Miata za pomocą odczynników zakłócających poprzez wprowadzenie ich za pomocą mikroiniekcji. Osiąga się to poprzez pierwsze zbieranie i dojrzewanie gamet od dorosłych zwierząt. Drugim etapem zabiegu jest zapłodnienie dojrzałych komórek jajowych.Trzecim krokiem jest usunięcie zygot i ułożenie ich w rzędach na naczyniu do wstrzykiwań. Ostatnim krokiem jest wstrzyknięcie zygotom pożądanych odczynników zakłócających, ostatecznie wprowadzonych obcych odczynników, takich jak GFP Reporter, można oglądać poprzez obrazowanie fluorescencyjne wstrzykniętych zarodków. Wizualna demonstracja tej techniki jest bardzo ważna, ponieważ trudno jest nauczyć się mikroiniekcji, a w szczególności orientacji igły w przestrzeni trójwymiarowej i wprowadzania do komórki jajowej prawidłowego rozmiaru bolusa.Tak więc dzisiaj tę technikę zademonstruje doktorantka z mojego laboratorium, Elise tla. Zacznij od kolekcji zwierząt. Określanie płci odbywa się poprzez wycięcie gamet.Podobnie jak P Miata, gwiazdy morskie nie są dymorficzne płciowo. Aby usunąć gonady, użyj ostrza, aby wyciąć mały otwór o wielkości nie większej niż jeden centymetr wzdłuż boku ramienia.

a-method-for-microinjection-of-patiria-minata-zygotes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikroiniekcja jest uznaną i skuteczną metodą wprowadzania obcych substancji do zapłodnionych embrionów danio pręgowanego. W niniejszej pracy prezentujemy niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u danio pręgowanego.

Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

W niniejszym filmie pokazano, w jaki sposób morpholino lub mRNA można wstrzyknąć do embrionów zebrafish w stadium jednej komórki, aby obniżyć lub zwiększyć poziom produktów konkretnych genów podczas dalszego rozwoju.

Mikroiniekcja embrionów ryb danio w celu analizy funkcji genów

Medaka i zebrafish są komplementarne w kontekście genetycznej analizy funkcji genomu kręgowców. Niniejszy protokół podkreśla kluczowe punkty niezbędne do skutecznego mikroiniekcji do embrionów medaka, co stanowi istotną technikę w analizach embriologicznych i genetycznych z wykorzystaniem medaka i zebrafish w warunkach laboratoryjnych.

Mikroiniekcja embrionów ryby medaka w celu zastosowania jako modelowego organizmu genetycznego

Ten film opisuje technikę mikroiniekcji zarodka w celu dostarczenia związków do woreczka z żółtkiem danio pręgowanego.

Mikroiniekcja zarodka: technika dostarczania związku do żółtka danio pręgowanego

Mikroiniekcja jest powszechną techniką używaną do dostarczania konstruktów DNA, mRNA, oligonukleotydów antysensownych morfolino lub innych zabiegów do jaj, embrionułów i komórek różnych gatunków.

Wysokoprzepustowe mikroiniekcje zygot jeżowców

Mikroiniekcja zarodków i larw danio pręgowanego jest kluczową, ale wymagającą techniką stosowaną w wielu modelach danio pręgowanego. W tym miejscu przedstawiamy szereg narzędzi w mikroskali, które pomagają w stabilizacji i orientacji danio pręgowanego zarówno do mikroiniekcji, jak i obrazowania.

Urządzenia mikrostrukturalne do zoptymalizowanej mikroiniekcji i obrazowania larw danio pręgowanego

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Techniki mikroiniekcji są niezbędne do wprowadzenia egzogennych genów do genomów komarów. Protokół ten wyjaśnia metodę stosowaną przez laboratorium Jamesa do mikrowstrzykiwania konstruktów DNA do embrionów Anopheles gambiae w celu wygenerowania przekształconych komarów.

Metoda mikroiniekcji dla zarodków Anopheles gambiae

Obecny protokół opisuje mikroiniekcję zygoty z CRISPR-Cas9 i DNA dawcy w celu efektywnej produkcji myszy z kasetą z genami i myszami z klapkami.

Mikroiniekcja zygoty do tworzenia alleli knock-in i flox kasety genów u myszy

W tym filmie Nijole Jasinskiene prezentuje metodologię wykorzystywaną do tworzenia transgenicznych komarów Aedes aegypti, które są wektorami gorączki Denga. Przedstawione zostają techniki prawidłowego przygotowania igieł do mikroiniekcji, wysuszania embrionów oraz przeprowadzania mikroiniekcji.

Mikroiniekcja zarodków A. aegypti w celu uzyskania transgenicznych komarów

Poznaj metodę mikroiniekcji zygot Patiria miniata w biologii rozwoju. Technika obejmuje pobieranie gamet, zapłodnienie i wstrzykiwanie reagentów perturbujących, umożliwiając badanie sieci regulacyjnych genów.

Metoda mikroiniekcji zygot Patiria minata

Przeglądaj więcej filmów