Wytwarzanie auksotrofów Enterobacter sp. YSU z wykorzystaniem mutagenezy transpozonów

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wyprodukowanie TRO dzikiego szczepu bakterii, który rośnie w pożywce o minimalnej ilości soli uzupełnionej glukozą. Osiąga się to poprzez przekształcenie strefy transpo w szczep żywiciela typu dzikiego w celu uzyskania populacji bakterii opornych na mycynę konopną z losową transpozycją na wstawkach. Następnie transformanty są przesiewane przez posiewanie replik, które identyfikuje TRO, które rosną na bogatym podłożu, ale nie rosną na minimalnej ilości soli, pożywce uzupełnionej glukozą.

Następnie genomicznie, DNA z mutanta jest trawione, ligowane i przekształcane w E. coli w celu uzyskania plazmidu zawierającego transpozon otoczony z każdej strony przez segmenty przerwanego genu. Uzyskano wyniki, które pokazują przypuszczalną tożsamość przerwanego genu na podstawie sekwencjonowania DNA i analizy podstawowego narzędzia do wyszukiwania dopasowania lokalnego. Transpozon używany w tej technice ma pochodzenie replikacyjne, gen oporności na kanamycynę i końce mozaiki.

Do transpozycji wiązania białek. Brakuje mu genu białka transponującego, dlatego musimy dodać ten gen transpozycyjny z fragmentem transpozonu DNA, a następnie kompleks między transpos DNA a białkiem jest elektropostowany do gospodarza. Głównymi zaletami elektroporacji jest wyeliminowanie konieczności transdukcji lub koniugacji.

Brak transpozycji genu zwykle powoduje stabilne insercje, a obecność początku replikacji i genu oporności CIN pozwala na łatwą identyfikację zmutowanego genu, który jest odzyskiwany jako rekombinowany plazmid. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii drobnoustrojów, takie jak identyfikacja genów wymaganych do biosyntezy aminokwasów, kwasów nukleinowych i witamin. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, kiedy szukałem genów oporności na metale u gatunków enterobacter YSU i postanowiłem włączyć ją do laboratorium fizjologii drobnoustrojów, które opracowywałem, aby elektroporować kompetentne komórki przy użyciu nocnej hodowli gatunków enterobacter.

YSU przygotować rozcieńczenie 1 do 20 w świeżej pożywce LB i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 120 obr./min do OD 600 między 0,4 a 0,6. Gdy komórki osiągną odpowiednią gęstość, schładzaj je na lodzie przez pięć minut, a następnie odwiruj w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 7 000 G przez pięć minut. Wyrzucić supernatant i użyć równej objętości lodowatej wody do Resus.

Zawiesić odwirowanie komórek w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 7 000 G na pięć minut. Po powtórzeniu płukania wyrzucić supernatant i za pomocą lodowatej wody zawiesić komórki w objętości równej objętości osadu komórkowego. Następnie dodaj 0,5 mikrolitra strefy transpo do 40 mikrolitrów komórek.

Następnie umieść mieszaninę stref transpo ogniw w lodowatym weterynarzu do elektroporacji i postukaj mieszaniną na dno Q Vet, wstrząsnij ogniwa przy 25 mikro phs, 200 omach i 2,5 kilowoltach. Natychmiast dodaj 960 mikrolitrów wysterylizowanej przez filtr pożywki SOC, zmieszanej przez pipetowanie w górę iw dół przed przeniesieniem komórek do sterylnej 1,5-mililitrowej mikroprobówki fuge. Inkubować komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 120 obr./min przez 45 do 60 minut.

Następnie rozprowadź 100 mikrolitrów komórek na płytce agarowej LB Can przed inkubacją płytki przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aby siatkować transformanty. Przyklej siatkę do pokrywy pustej szalki Petriego o wymiarach 100 na 15 milimetrów. Narysuj linię na dnie płytki agarowej LB Can i użyj małego kawałka taśmy, aby zakotwiczyć ją do pokrywki z kratką, tak aby siatka była widoczna przez ślimak Za pomocą sterylnej wykałaczki.

Wybierz pojedynczy transformator i umieść go w środku kwadratu w siatce, znajdź inny transformator w sąsiednim kwadracie i kontynuuj, aż płyta się zapełni. Następnie inkubuj go przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Jest to blacha wzorcowa dla każdej blachy, która została umieszczona w siatce.

Ułóż stos trzech świeżych talerzy ślimakowych ponumerowanych od jednego do trzech. Numer jeden dla LB może numer dwa dla M dziewięć może. I numer trzy dla LB może wysuszyć płytki do góry nogami przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed użyciem.

Po narysowaniu linii na górze każdej płytki, jak pokazano wcześniej, użyj 70% etanolu, aby wytrzeć narzędzie do galwanizacji repliki i umieść na nim sterylny kwadrat veltin przed zaciśnięciem kwadratu veltin w dół. Następnie wyrównaj linię na płycie głównej z linią narysowaną na zacisku i umieść płytkę na kwadracie veltin. Delikatnie dociśnij, aby przenieść bakterie z płytki na kwadrat veltin.

Następnie wyrównaj linię narysowaną na tabliczce numer jeden z linią na zacisku i umieść ją na kwadracie veltin. Zastosuj delikatny nacisk, aby przenieść bakterie z kwadratu veltin na płytkę. Usuń tablicę rejestracyjną numer jeden.

Wyrzuć aksamitny kwadrat nastolatka do zlewki z wodą i umieść czysty, sterylny aksamitny kwadrat na narzędziu do galwanizacji repliki. Tak jak poprzednio, wyrównaj linię na tabliczce numer jeden z linią na zacisku i umieść ją na nowym aksamitnym kwadracie. Delikatnie dociśnij, aby przenieść bakterie z płytki numer jeden na aksamitny kwadrat.

Usuń tabliczkę numer jeden, wyrównaj linię narysowaną na tablicy numer dwa z linią na zacisku i umieść ją na aksamitnym kwadracie. Zastosuj delikatny nacisk, aby przenieść bakterie z aksamitnego kwadratu nastolatka na talerz numer dwa, usuń tabliczkę numer dwa po powtórzeniu procesu dla tabliczki numer trzy, inkubuj płytki przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Kolonie, które rosną na obu płytkach LB, ale nie rosną na dziewięciu płytkach M, są uważane za skarby.

Wybierz TRO z talerza numer jeden i rozprowadź na świeżym talerzu LB Can. Po całonocnej inkubacji wybierz trzy kolonie z płytki smugowej i następnego dnia wyłóż je na świeżą puszkę LB. Umieść kolonie z nowo pokrytej płytki smugami na siatce puszki LB i użyj tej płytki, aby powtórzyć poszycie repliki, jak właśnie pokazano.

Przeprowadź ratowanie genów. Użyj izolowanej kolonii zmutowanych zwierząt, aby wyhodować trzy mililitry funta. Można hodować przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Następnie użyj dostępnego na rynku zestawu do oczyszczania genomowego DNA, aby oczyścić DNA z jednego mililitra kultury w 0,025 jednostki BFUC jednej endonukleazy restrykcyjnej do 14 mikrolitrów jednego mikrograma na mikrolitr genomowego DNA w 20-mikrolitrowej reakcji na lodzie. Następnie inkubuj reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 25 minut, a następnie przenieś ją do 80 stopni Celsjusza na 20 minut. Aby dezaktywować enzym, przeanalizuj trzy mikrolitry częściowo strawionego DNA na 0,8% żelu AROS.

Następnie dodaj 800 jednostek ligazy DNA T 4 do 15 mikrolitrów częściowo strawionego genomowego DNA w reakcji 500 mikrolitrów i inkubuj reakcję w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc następnego dnia. Wytrącić ligowane DNA, dodając 50 mikrolitrów trzech molowych octanów sodu o pH 5,5 i jeden mililitr 95% etanolu inkubować w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza przez 20 minut. Mikro fugetacja DNA w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 13 500 G przez 10 minut.

Wylej miejsca supernat, siedem 70% etanolu, aby umyć granulki. Wysuszyć go w odśrodkowym koncentratorze próżniowym i użyć 10 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz. Aby ponownie zawiesić DNA, użyj czterech mikrolitrów zawieszonego DNA do przekształcenia za pomocą elektroporacji szczepu e coli, ECD 100 DPIR lub ECD 100 DPIR jeden 16 zaszczepić pięć mililitrów LB może pożywki pojedynczą kolonią.

Uprawiaj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 120 obr./min przez noc. Następnego dnia po oczyszczeniu DNA z całej kultury, użyj Joe One do strawienia 14 mikrolitrów plazmidu. Przeanalizuj 10 mikrolitrów niestrawionego i strawionego plazmidu na 0,8% żelu agarro.

Po sekwencjonowaniu plazmidu należy poszukać sekwencji pięć pierwszych GA, G-A-C-A-G trzy pierwsze, które są ostatnimi siedmioma parami zasad transpozycji, a po nich nastąpi sekwencja dla przerwanego genu. Użyj blastu, aby określić możliwą funkcję przerwanego genu. Udana elektroporacja dała kilka tysięcy transformantów, z których każdy miał co najmniej jedną transpozycję na wkładce na tym rysunku.

Czarne kwadraty pokazują dwie kolonie, które wyrosły na płytce puszki LB, ale nie na minimalnej średniej płytce M. Te TRO prawdopodobnie zawierały przerwy w genach zaangażowanych w syntezę aminokwasu, kwasu nukleinowego lub witaminy, które znajdują się w funtach, ale nie w M dziewięciu, minimalnym podłożu. Pozostałe 86 kolonii nie miało przerwy w genie, który jest wymagany do wzrostu na M 9.

Minimalne podłoże, jak widać tutaj, częściowo strawione genomowe DNA z wyizolowanego TRO ma rozmiar od ponad 10 kilozasad do poniżej 0,5 kilozasad. Uratowany plazmid składa się z dwóch kilozasadowych transpozonów oraz flankującego DNA gospodarza. Ten rysunek pokazuje wynik wybuchu dla plazmidu, który został wyizolowany z tro.

Przerwana sekwencja jest podobna do genu enterobacter cloy dla mutazy ate, który bierze udział w biosyntezie L tyrozyny, L fenyloalaniny i L tryptofanu ze względu na wiele etapów wzrostu z dnia na dzień. Ta technika może być wykonana w ciągu 10 lub 11 dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Chociaż replika pla, ważne jest, aby pamiętać, aby nie rozmazywać talerzy, a można temu zapobiec, używając suchych płyt i nie przesuwając płytek po umieszczeniu ich na kwadracie veltin.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak klonowanie lub eksperymenty z komplementacją, w celu zweryfikowania funkcji zidentyfikowanego genu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować TRO za pomocą mutagenezy transpozonów i jak wstępnie zidentyfikować zmutowane geny.