Name: Wytwarzanie auksotrofów Enterobacter sp. YSU z wykorzystaniem mutagenezy transpozonów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: Poznaj metodę mutagenezy transpozonów w bakterii Enterobacter sp. YSU do tworzenia auksotrofów. Technika obejmuje elektroporację, replikową płytkową i sekwencjonowanie genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autor chciałby podziękować wszystkim moim studentom studiów licencjackich i wszystkim moim studentom fizjologii mikrobiologicznej, którzy testowali moje pomysły na mutagenezę transpozonów podczas semestrów wiosennych 2010-2014. Praca ta została sfinansowana przez Wydział Nauk Biologicznych Uniwersytetu Stanowego w Youngstown.

1. Elektroporacja kompetentnych komórek5,11
<ol>
	<li>Rozcieńczyć kulturę Enterobacter sp. YSU 1/20 w 50 ml świeżej pożywki LB i rosnąć z wytrząsaniem przy 120 obr./min i 30 °C do średnicy zewnętrznej (600 nm) między 0,4 a 0,6. Opcjonalnie hoduj inne szczepy bakterii w optymalnej temperaturze wzrostu.</li>
	<li>Schłodzić komórki na lodzie przez 5 minut i odwirować w temperaturze 4 °C i 7 000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 50 ml sterylnej, lodowatej wody i odwirować w temperaturze 4 °C i 7 000 x g przez 5 minut. Powtórzyć ten krok.</li>
	<li>Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w objętości lodowatej wody równej objętości osadu komórkowego. W przypadku długotrwałego przechowywania należy umyć ogniwa 10 ml lodowatego glicerolu 10% (v/v), ponownie zawiesić w równej objętości osadu lodowato zimnego 10% (v/v) glicerolu, przechowywać w temperaturze -80 °C i rozmrozić na lodzie przed elektroporacją.</li>
	<li>Dodaj 0,5 μl transposomu do 40 μl komórek. Dostępny na rynku roztwór transposomu jest dostarczany w stężeniu DNA 0,33 μg/μl. Chociaż zalecane jest 0,33 μg, wystarczy 0,165 μg DNA.</li>
	<li>Umieść mieszaninę ogniw/transposomu w lodowatej kuwecie do elektroporacji o średnicy 0,2 mm i strząśnij mieszaninę na dno kuwety. Wstrząs ogniw przy 25 μF, 200 Ω i 2,5 kV. Aby mieć pewność, że ogniwa pozostaną schłodzone, przed użyciem przechowuj kuwety do elektroporacji w zamrażarce o temperaturze -20°C.</li>
	<li>Natychmiast dodaj 960 μl wysterylizowanego filtrem super optymalnego bulionu z pożywką do tłumienia katabolitu (SOC). Wymieszać pipetując w górę i w dół i przenieść komórki do sterylnej probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Komórki zaczynają obumierać po wstrząsie, ale sól zawarta w pożywce SOC pozwala im się zregenerować. Aby zaoszczędzić, nie jest konieczne dodawanie transposomu ani szokowanie ujemnych komórek kontrolnych. Wystarczy dodać do niego 960 μl sterylnej pożywki SOC.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 30 °C przez 45–60 minut, wytrząsając z prędkością 120 obr./min. Daje to czas na rekombinację transposomu z genomem gospodarza i na wyrażenie przez komórki oporności na kanamycynę.</li>
	<li>Rozprowadzić 100 μl komórek na płytce agarowej LB-kan i inkubować płytkę O/N w temperaturze 30 °C. Pozostałą mieszankę transformacyjną przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C. W razie potrzeby rozprowadzić dodatkowe ilości w późniejszym terminie, do 2 tygodni po początkowej elektroporacji.</li>
</ol>
2. Siatka transformantów
<ol>
	<li>Przyklej siatkę do pokrywy pustej szalki Petriego o wymiarach 100 x 15 mm. Skopiuj siatkę z "Krótkiego kursu genetyki bakterii"12.</li>
	<li>Narysuj linię na spodzie płytki agarowej LB-kan. Użyj małego kawałka taśmy, aby zakotwiczyć go do pokrywki z kratką, tak aby siatka była widoczna przez agar. Upewnij się, że linia na dole płyty jest wyrównana z górną, środkową częścią siatki. Zakotwiczenie płyty za pomocą taśmy zapobiega jej przesuwaniu się, co pozwala na równomierne rusztowanie. Linia ułatwia identyfikację kolonii po posiewie repliki.</li>
	<li>Wybierz pojedynczy transformator sterylną wykałaczką i umieść go na środku kwadratu na siatce. Wystarczy dotknąć kolonii i miejsca. Nie wbijaj wykałaczki w agar. Aby uniknąć zanieczyszczenia płytki, wykałaczkę należy chwytać tylko za jeden koniec.</li>
	<li>Znajdź inny transformator w sąsiednim kwadracie, jak w kroku 2.3. Gdy płytka jest pełna, inkubować ją w temperaturze O/N w temperaturze 30 °C. To jest płyta główna.</li>
</ol>
3. Powłoka repliki w celu określenia fenotypu auksotrofu12
<ol>
	<li>Dla każdej płytki, która została zakratowana, ułóż stos trzech świeżych płytek agarowych ponumerowanych od jednego do trzech: jedna dla LB-kan, dwie dla M-9-kan i trzy dla LB-kan. Przed użyciem wysuszyć płytki do góry nogami, O/N, w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Narysuj linię na górze każdej płytki, tak jak w kroku 2.2.</li>
	<li>Przetrzyj narzędzie do galwanizacji repliki 70% etanolem, umieść sterylny aksamitny kwadrat na wierzchu narzędzia do galwanizacji repliki i zaciśnij aksamitny kwadrat w dół. Dłonie roją się od drobnoustrojów nawet po ich umyciu. Zapobiegaj wprowadzaniu zanieczyszczających drobnoustrojów, trzymając aksamitny kwadrat za jego krawędź.</li>
	<li>Wyrównaj linię na płycie głównej z linią narysowaną na clamp i umieść płytkę na aksamitnym kwadracie. Delikatnie dociśnij, aby przenieść bakterie z płytki na aksamitny kwadrat. Uważaj, aby nie rozmazać bakterii. Wyjmij płytkę wzorcową z aksamitnego kwadratu.</li>
	<li>Wyrównaj linię narysowaną na tabliczce numer jeden z linią na zacisku i umieść ją na aksamitnym kwadracie. Delikatnie dociśnij, aby przenieść bakterie z aksamitnego kwadratu na płytkę. Usuń tablicę rejestracyjną numer jeden.</li>
	<li>Wyrzuć aksamitny kwadrat do zlewki z wodą i umieść czysty, sterylny aksamitny kwadrat na narzędziu do powlekania repliki, jak w kroku 3.3. Ten krok zapobiega nadmiernemu zaszczepieniu, które powoduje przełomowy wzrost i fałszywie dodatnie wyniki.</li>
	<li>Wyrównaj linię na tabliczce numer jeden z linią na zacisku i umieść ją na nowym aksamitnym kwadracie. Delikatnie dociśnij, aby przenieść bakterie z płytki numer jeden na aksamitny kwadrat. Usuń tablicę rejestracyjną numer jeden.</li>
	<li>Wyrównaj linię narysowaną na tabliczce numer dwa z linią na zacisku i umieść ją na aksamitnym kwadracie. Zastosuj delikatny nacisk, aby przenieść bakterie z aksamitnego kwadratu na talerz numer dwa. Usuń tablicę rejestracyjną numer dwa.</li>
	<li>Powtórz krok 3.8 dla tablicy rejestracyjnej numer trzy. Trzecia płyta jest kontrolką całkowitego przeniesienia z płyty głównej na pozostałe dwie płyty. Wyrzuć aksamitny kwadrat do zlewki z wodą. Aby ponownie wykorzystać aksamitne kwadraty, należy przelać zlewkę zawierającą zanieczyszczone aksamitne kwadraty do autoklawu, umyć je, wysuszyć, zawinąć w folię aluminiową i ponownie autoklawować.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 30 °C O/N. Kolonie, które rosną na obu płytkach agarowych LB-kan, ale nie rosną na płytkach M-9-kan, uważa się za auksotrofy (ryc. 2).</li>
	<li>Usunąć auksotrofy z tabliczki numer jeden na świeżą płytkę agarową LB-kan i inkubować płytkę w temperaturze 30 °C O/N.</li>
	<li>Usunąć w celu wyizolowania 3 kolonie z płytki smugowej w kroku 3.11 na świeżą płytkę LB-kan. Inkubować płytkę w temperaturze 30 °C O/N. Gwarantuje to, że mutant jest dobrze odizolowany. Podziel płytkę na trzy części i rozłóż każdą kolonię w jednej sekcji.</li>
	<li>Umieść kolonie z prążkowanych kolonii pochodzących z kroku 3.12 na świeżej płytce LB-kan, aby utworzyć siatkę, jak w krokach 2.1-2.4. Każdy mutant jest ponownie testowany w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Powtórzyć płytkę ponownie, jak w krokach 3.1-3.10, aby potwierdzić fenotyp auksotrofu.</li>
</ol>
4. Ratunek genowy
<ol>
	<li>Wyhodować 3 ml kultury O/N izolowanej kolonii mutantów z kroku 3.13 w płynnym podłożu LB-kan w temperaturze 30 °C. Oczyścić genomowe DNA z 1 ml hodowli przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do oczyszczania genomowego DNA.</li>
	<li>Ustawić mieszaninę endonukleazy restrykcyjnej 0,025 U BfuC I i 14 μl genomowego DNA 1 μg/μl w reakcji 20 μl na lodzie. Ponieważ BfuC I przecina transpozon w dwunastu różnych miejscach, bardziej efektywne może być użycie endonukleazy restrykcyjnej, Bfa I lub Hae III, która przecina transpozon odpowiednio w dwóch i trzech różnych miejscach.</li>
	<li>Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 25 minut, a następnie w temperaturze 80 °C przez 20 minut w celu inaktywacji enzymu. Przeanalizuj 3 μl częściowo strawionego DNA na 0,8% żelu agarozowym (ryc. 3). Udane częściowe trawienie powoduje rozmaz od ponad 10 kb do dna żelu.</li>
	<li>Zligować 15 μl częściowo strawionego genomowego DNA przy użyciu 800 jednostek ligazy DNA T4 w reakcji 500 μl. Inkubować reakcję O/N w temperaturze 4 °C. Duża objętość reakcyjna maksymalizuje ligację pojedynczych fragmentów do siebie i minimalizuje interakcje między dwoma lub więcej fragmentami DNA.</li>
	<li>Wytrącić zligowany DNA, dodając 50 μl 3 M octanu sodu o pH 5,5 i 1 ml 95% etanolu i inkubując go w temperaturze -20°C przez 20 minut.</li>
	<li>Mikrofukowal DNA w temperaturze 4 °C i 13 500 x g przez 10 minut, przemyj osad 70% etanolem, wysusz go w odśrodkowym koncentratorze próżniowym i ponownie zawieś w 10 μl wody wolnej od nukleaz. Alternatywnie, DNA można suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Użyj 4 μl zawieszonego DNA do przekształcenia szczepu E. coli ECD100D pir lub ECD100D pir116 przez elektroporację, jak w sekcji 1. Początek replikacji γ R6k wymaga szczepu bakteryjnego z genem pir do replikacji6. Szczep pir powoduje niską liczbę kopii plazmidów, a szczep pir116 zawiera zmutowany gen pir, który powoduje wysoką liczbę kopii plazmidów. Każdy transformant zawiera nowy plazmid z transpozonem i regionem przerwanego chromosomu (ryc. 1E).</li>
	<li>Zaszczepić 5 ml pożywki LB-kan pojedynczą kolonią, wyhodować ją O/N przez wytrząsanie przy 120 obr./min i 37 °C i oczyścić plazmidowe DNA z całej kultury O/N za pomocą zestawu komercyjnego.</li>
	<li>Trawić 14 μl plazmidu za pomocą endonukleazy restrykcyjnej Xho I. Upewnij się, że końcowa objętość reakcji wynosi 20 μl. Enzym ten rozpoznaje miejsce w środku transpozonu na końcu 5' genu oporności na kanamycynę. Przeanalizuj 10 μl niestrawionego i strawionego plazmidu na 0,8% żelu agarozowym (ryc. 3). Plazmid składa się z transpozonu o wielkości 2 kb oraz bocznych DNA gospodarza.</li>
</ol>
5. Sekwencjonowanie DNA
<ol>
	<li>Sekwencjonuj plazmid za pomocą dostępnego na rynku zestawu do sekwencjonowania, starterów, które są homologiczne dla każdego końca transpozonu oraz systemu analizy sekwencjonowania kapilarnego. Alternatywnie plazmid może zostać wysłany do instytucji zewnętrznej w celu sekwencjonowania.</li>
	<li>Użyj wzorca masy cząsteczkowej (drabinka 1 kb) w żelu, aby oszacować rozmiar plazmidu. Następnie oszacuj liczbę nanogramów (ng) plazmidu, która jest wymagana dla 50 fmol.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie plazmidowego DNA za pomocą spektrofotometru przy długościach fal 260 nm (A260) i 280 nm (A280). Upewnij się, że długość ścieżki światła przez kuwetę wynosi 1 cm. Oznaczyć stężenie, mnożąc absorbancję przy 260 nm przez 50 ng/μl. Wysokiej jakości plazmidowe DNA będzie miało stosunek A260 / A280 między 1,8 a 2,0.</li>
	<li>Objętość DNA wymagana dla każdej reakcji sekwencjonowania to liczba ng wymagana dla 50 fmol podzielona przez stężenie plazmidu. Wymieszaj objętość wymaganego plazmidu z wodą, aby uzyskać całkowitą objętość do 10 μl.</li>
	<li>Podgrzewać mieszaninę plazmidu DNA/wody w temperaturze 96 °C przez 1 minutę, a następnie schłodzić do temperatury RT.</li>
	<li>Dodać 8 μl mieszanki wzorcowej z zestawu do sekwencjonowania i 2 μl 1,6 μM jednego ze starterów sekwencjonujących.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z protokołem z zestawu sekwencjonowania dla programu termocyklera i oczyszczania reakcji.</li>
	<li>Przeanalizuj każdą próbkę za pomocą kapilarnego systemu analizy DNA.</li>
	<li>Użyj dostępnego na rynku pakietu oprogramowania, aby wyświetlić sekwencję DNA. Proszę poszukać sekwencji "5'-GAGACAG-3'", która jest ostatnimi 7 pz transpozonu (ryc. 4). Sekwencja przed końcem 5' tego odcinka o długości 7 pz należy do transpozonu. Sekwencja po końcu 3' tego segmentu o długości 7 pz należy do przerwanego genu.</li>
	<li>Określ możliwą funkcję przerwanego genu za pomocą narzędzia Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8. Użyj poniższego linku: <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch" target="_b;ank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch</a>. Wklej sekwencję przerwanego genu w polu zapytania, wybierz "inne" pod bazą danych i kliknij "BLAST" na dole strony. Po wyświetleniu wyniku przewiń stronę w dół, aby wyświetlić wyniki wyrównania (Rysunek 5).</li>
</ol>

<ol><li>Kim, B. H., Gadd, G. M. Bacterial physiology and metabolism. , Cambridge University Press. Cambridge. (2008).</li>
<li>Hayes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-based+strategies+for+microbial+functional+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+genetics%22%5BJournal%5D)">Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics.</a> Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).</li>
<li>Hoffman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+chromosomal+gene+disruption+in+vivo+using+transposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes.</a> Methods in molecular biology. 765, Clifton, N.J. 55-70 (2011).</li>
<li>Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+transposon+mutagenesis+by+electroporation+of+released+Tn5+transposition+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes.</a> Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).</li>
<li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+Transformation+of+E.+coli+by+High+Voltage+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li>
<li>Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+rep+technique+for+allele+replacement+to+construct+new+Escherichia+coli+hosts+for+maintenance+of+R6K%CE%B3+origin+plasmids+at+different+copy+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kγ origin plasmids at different copy numbers.</a> Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).</li>
<li>Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Schäffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Database+indexing+for+production+MegaBLAST+searches%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">a Database indexing for production MegaBLAST searches.</a> Bioinformatics. 24 (16), Oxford, England. 1757-1764 (2008).</li>
<li>Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+computational+biology+a+journal+of+computational+molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).</li>
<li>Holmes, A., Vinayak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+multimetal+resistant+bacterial+strains%3A+Enterobacter+sp.+YSU+and+Stenotrophomonas+maltophilia+OR02%5BTitle%5D)+AND+%22Current+microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02.</a> Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).</li>
<li>Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposome+insertional+mutagenesis+and+direct+sequencing+of+microbial+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes.</a> Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).</li>
<li>Ausubel, F., Brent, R., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+F+%22Short+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Short Protocols in Molecular Biology</a>. , John Wile., & Sons, Inc. New York, NY. (1997).</li>
<li>Miller, J. H. A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, N.Y. (1992).</li>
<li>Gibson, M. I., Gibson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+studies+on+the+isolation+and+metabolism+of+an+intermediate+in+aromatic+biosynthesis%3A+chorismic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid.</a> The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).</li>
<li>Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).</li>
<li>Reznikoff, W., Winterberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-Based+Strategies+for+the+Identification+of+Essential+Bacterial+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Gene+Essentiality%3A+Protocols+and+Bioinformatics+SE%22%5BJournal%5D)">Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes.</a> Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).</li>
<li>Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+genome+deletion+methods+applicable+to+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Random genome deletion methods applicable to prokaryotes.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).</li>
<li>Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knowledge-making+distinctions+in+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays+news+and+reviews+in+molecular%2C+cellular+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Knowledge-making distinctions in synthetic biology.</a> BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).</li>
<li>Zheng, Y. -N., Li, L. -Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Problems+with+the+microbial+production+of+butanol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+industrial+microbiolog.%2C+%26+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Problems with the microbial production of butanol.</a> Journal of industrial microbiolog., & biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Mutageneza transpozonów z wykorzystaniem transposomu jest skutecznym narzędziem do generowania auksotrofów u Enterobacter sp. YSU i innych typów bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich3,4. Proces ten rozpoczęto od wprowadzenia transposomu pochodzącego z Tn5 do gospodarza za pomocą elektroporacji. Aby zidentyfikować kolonie z insercjami, nieprzekształcony szczep docelowy musiał być wrażliwy na kanamycynę, aby wybrać marker oporności przenoszony przez transpozon. Niektórzy gospodarze wytwarzają...

Bakterie prototroficzne rosną w pożywce M-9 zawierającej minimalną ilość soli zawierających glukozę (pożywka M-9), przekształcając glukozę przez centralne szlaki metabolizmu węgla w celu wytworzenia prekursorów, takich jak aminokwasy, kwasy nukleinowe i witaminy, do biosyntezy1. Pożywka M-9 zawiera chlorek amonu jako źródło azotu, fosforan sodu i potasu jako źródło buforowe i fosforowe, siarczan magnezu jako źródło siarki oraz glukozę jako źródło węgla i energii. Pożywka Luria-Bertani (LB) jest bogata w aminokwasy z tryptonu oraz w witaminy i czynniki wzrostu z ekstraktu drożdżowego. Wspomaga wzrost auksotrofów, które nie mogą syntetyzować aminokwasów, witamin i innych czynników wzrostu niezbędnych do wzrostu na pożywce M-9. Tak więc prototrofy będą rosły w pożywce LB i M-9, podczas gdy auksotrofy będą rosły w pożywce LB, ale nie w pożywce M-9. Wprowadzając mutacje do prototroficznej populacji bakterii i identyfikując zmutowane geny, które powodują fenotypy auksotroficzne, możliwe jest lepsze zrozumienie metabolizmu w szczepie bakteryjnym.
Mutageneza transpozonów może być wykorzystana do identyfikacji wielu genów wymaganych do wzrostu glukozy w pożywce M-9. Transpozony wstawiają się losowo do genomu gospodarza2. Poprzez wykrycie transformantów transpozonowych na płytkach agarowych LB i odtworzenie ich na płytkach z agarem M-9, możliwe jest badanie przesiewowe w kierunku auksotrofów. Przerwane geny są identyfikowane poprzez ratowanie genów. W badaniu wykorzystano dostępny na rynku transpozom pochodzący z Tn5, który jest dostarczany jako roztwór liniowego segmentu DNA transpozonu zmieszanego z białkiem transpozy. Segment DNA nie ma genu transporazy, ale zawiera gen oporności na kanamycynę, pochodzenie replikacji γ R6K i dwa motywy mozaikowe, które są sekwencjami DNA do wiązania transpozazy na każdym końcu segmentu3,4. Ponieważ białko transpozazy jest dodawane bezpośrednio do DNA, sam segment DNA jest definiowany jako transpozon, a kompleks DNA/białko transpozazy jest definiowany jako transposom. Transposom jest przekształcany przez elektroporację5 w gospodarza wrażliwego na kanamycynę (ryc. 1A). Kolonie, które rosną na płytkach agarowych LB zawierających kanamycynę (LB-kan), mają wkładki transpozonowe (ryc. 1B), a repliki posianych transformantów, które nie rosną na pożywkach agarowych M-9 zawierających kanamycynę (M-9-kan), są auksotrofami (ryc. 1C). Genomowe DNA z mutanta jest oczyszczane i częściowo trawione za pomocą endonukleazy restrykcyjnej 4-zasadowej, BfuC I (Figura 1D). Ligowane DNA jest przekształcane w szczep Escherichia coli (E. coli), który zawiera gen pir (ryc. 1E). Gen ten umożliwia replikację nowego plazmidu zawierającego transpozon i flankujący region chromosomalny gospodarza w E. coli6. Gen oporności na kanamycynę służy jako selektywny marker dla nowego plazmidu. Wreszcie, sekwencjonowanie przy użyciu starterów komplementarnych do każdego końca transpozonu i analiza7,8 otrzymanej sekwencji za pomocą narzędzia Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) są wykorzystywane do określenia tożsamości przerwanych genów.
Ta strategia mutagenezy transposomów zapewnia trzy korzyści:3. Po pierwsze, ponieważ białko transpozazy jest związane bezpośrednio z transpozonem, insercja nie zależy od ekspresji genu transpozazy w organizmie gospodarza. Gdy transpozon włączy się do genomu gospodarza, transpozaza ulega degradacji, zapobiegając dodatkowemu ruchowi transpozonu. Nie można jednak zapobiec dodatkowemu ruchowi, jeśli żywiciel posiada endogenny element transpozycyjny Tn5. Po drugie, wprowadzenie transposomu przez elektroporację umożliwia jego zastosowanie w wielu różnych gospodarzach. Eliminuje to również konieczność wprowadzania transpozonu przez koniugację bakteryjną lub infekcję wirusową. Oba procesy wymagają podatności gospodarza. Po trzecie, włączenie genu oporności na kanamycynę i pochodzenia replikacji R6Kγ do transposomu ułatwia identyfikację przerwanego genu. Regiony przerwane transpozonami mogą być przechowywane i sekwencjonowane jako plazmidy, eliminując potrzebę stosowania techniki odwrotnej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) do identyfikacji genów.
Protokół przedstawiony w tym filmie opisuje każdy etap transposonowej mutagenezy Enterobacter sp. YSU9 przy użyciu transposomu od momentu wprowadzenia go do komórek bakteryjnych do identyfikacji przypuszczalnego genu, który przerwał. Oprócz wcześniej opublikowanych protokołów3,4,10 przedstawiono szczegółowe metody wykorzystania posiewu replik do badań przesiewowych w kierunku auksotrofów. Ta technika mutagenezy może być wykorzystana do badania innych fenotypów, takich jak oporność na antybiotyki i metale, u różnych typów bakterii, do identyfikacji minimalnej liczby genów wymaganych do wzrostu w określonych warunkach hodowli w badaniach biologii syntetycznej lub do nauczania laboratoryjnego składnika kursu genetyki lub fizjologii drobnoustrojów.

<table><tbody><tr><td>EZ-Tn5 R6K&gamma; Zestaw transposomów Ori / KAN-2 Tnp</td><td>Epicentrum (Illumina)</td><td>TSM08KR</td><td></td></tr><tr><td>EC100D pir+ Elektrokompetentne epicentrum E. coli</td><td>(Illumina)</td><td>ECP09500</td><td>Zdolne do replikacji plazmidów o pochodzeniu replikacji R6K&gamma; przy niskiej liczbie kopii</td></tr><tr><td>EC100D pir-116 Elektrokompetentne epicentrum E. coli</td><td>(Illumina)</td><td>EC6P095H</td><td>Zdolny do replikacji plazmidów z R6K&gamma; pochodzenie replikacji przy wysokiej liczbie kopii</td></tr><tr><td>5X M-9 Sole</td><td>Thermo Fisher</td><td>DF048517</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB Broth</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J637-1KG</td><td>Pożywka stała zawierała 1,6% (w/v)</td></tr><tr><td>siarczanu kanamycyny agaru&nbsp;</td><td>Amresco, Inc.</td><td>0408-25G</td><td>W razie potrzeby nośnik zawierał 50 &mu; g/ml siarczan kanamycyny</td></tr><tr><td>D-glukoza jednowodny</td><td>Amresco, Inc.</td><td>0643-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J850-500G</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J859-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Amresco, Inc.</td><td>X190-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Super optymalny bulion z represją katabolityczną (SOC)</td><td></td><td></td><td>0,5% (w/v) ekstrakt drożdżowy, 2% (w/v) trypton, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 i 20 mM Glukoza</td></tr><tr><td>BfuC I</td><td>NEB</td><td>R0636S</td><td>Częściowe trawienie genomowego DNA</td></tr><tr><td>Xho I</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td>Trawienie plazmidowe</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Amresco, Inc.</td><td>E476-1L</td><td>Do rozpuszczania wytrąconego DNA i reakcji endonukleazy restrykcyjnej</td></tr><tr><td>GenomeLab DTCS - Zestaw szybkiego startu</td><td>Beckman Coulter</td><td>608120</td><td>Sekwencjonowanie DNA</td></tr><tr><td>Wizard Zestaw do oczyszczania genomowego DNA</td><td>Promega</td><td>A1120A</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps System oczyszczania DNA</td><td>Promega</td><td>A1460</td><td>Replika do oczyszczania plazmidu</td></tr><tr><td>Blok galwaniczny</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-718-1</td><td></td></tr><tr><td>Aksamitne kwadraty</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-718-2</td><td>Replika poszycia</td></tr><tr><td>PetriStickers</td><td>Zróżnicowana biotechnologia</td><td>PSTK-1100</td><td>Siatka do repliki galwanizacji</td></tr><tr><td>szalek Petriego</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroporacja Kuwety do elektroporacji &ndash; 2 mm</td><td>BioExpress</td><td>E-5010-2</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator próżniowy DNA CentriVap</td><td>Labconco</td><td>7970010</td><td>Suszenie DNA</td></tr><tr><td>System analizy DNA CEQ 2000XL Wektor</td><td>sekwencjonowania DNA</td><td>Beckman Coulter</td><td></td></tr><tr><td>NTI Advance 11.5.0</td><td>Life Technologies</td><td>12605099</td><td>analiza sekwencji DNA</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie auksotrofów enterobacter sp. ysu z wykorzystaniem mutagenezy transpozonów

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Bakterie prototroficzne rosną na pożywce M-9 z minimalną ilością soli uzupełnioną glukozą (pożywka M-9), która jest używana jako źródło węgla i energii. Auksotrofy można wytwarzać za pomocą transposomu. Dostępny na rynku transposom pochodzący z Tn5 stosowany w tym protokole składa się z liniowego segmentu DNA zawierającego pochodzenie replikacji R6K γ, gen oporności na kanamycynę i dwa końce sekwencji mozaiki, które służą jako miejsca wiązania transpozazy. Transposom, dostarczony jako kompleks białkowy DNA/transpozazy, jest wprowadzany przez elektroporację do szczepu prototroficznego, Enterobacter sp. YSU, i losowo włącza się do genomu tego gospodarza. Transformanty są replikowane na płytkach agarowych Luria-Bertani zawierających kanamycynę (LB-kan) i na pożywkach M-9 zawierających kanamycynę (M-9-kan). Transformanty, które rosną na płytkach LB-kan, ale nie na płytkach M-9-kan, są uważane za auksotrofy. Oczyszczony genomowy DNA z auksotrofu jest częściowo trawiony, ligowany i przekształcany w szczep pir+ Escherichia coli (E. coli). Pochodzenie replikacji R6Kγ umożliwia replikację plazmidu w szczepach pir + E. coli, a marker oporności na kanamycynę pozwala na selekcję plazmidu. Każdy transformant posiada nowy plazmid zawierający transpozon otoczony przerwanym regionem chromosomalnym. Sekwencjonowanie Sangera i narzędzie Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) sugerują przypuszczalną tożsamość przerwanego genu. Stosowanie tej strategii mutagenezy transposomów ma trzy zalety. Po pierwsze, nie opiera się na ekspresji genu transpozazy przez gospodarza. Po drugie, transposom jest wprowadzany do gospodarza docelowego przez elektroporację, a nie przez koniugację lub transdukcję, a zatem jest bardziej wydajny. Po trzecie, pochodzenie replikacji R6Kγ ułatwia identyfikację zmutowanego genu, który jest częściowo odzyskiwany w rekombinowanym plazmidzie. Technika ta może być wykorzystana do zbadania genów zaangażowanych w inne cechy Enterobacter sp. YSU lub szerszej gamy szczepów bakteryjnych.

Transformacja Enterobacter sp. YSU poprzez elektroporację z wykorzystaniem transposomu zainicjowała losową insercję do genomu gospodarza (Rysunek 1A,B). Udana elektroporacja pozwoliła na uzyskanie kilku tysięcy transformantów, które rosły na płytkach LB-kan. Aby uzyskać od 300 do 400 dobrze rozdzielonych kolonii na płytce, zoptymalizowano ilość mieszaniny transformacyjnej wysiewanej na każdą płytkę z agarem LB-kan. Każdy transformant zawierał co najmniej jedną insercję transposonu, jednak bez pr...

Enterobacter sp. YSU rośnie w pożywce z minimalnymi solami glukozy. Auksotrofy są generowane przez przekształcenie go w transposom, który losowo wstawia się do genomu gospodarza. Mutanty są znajdowane przez replikowanie posiewu ze złożonej pożywki do minimalnej pożywki. Przerwane geny są identyfikowane przez ratowanie genów i sekwencjonowanie.

Wytwarzanie auksotrofów Enterobacter sp. YSU z wykorzystaniem mutagenezy transpozonów

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wyprodukowanie TRO dzikiego szczepu bakterii, który rośnie w pożywce o minimalnej ilości soli uzupełnionej glukozą. Osiąga się to poprzez przekształcenie strefy transpo w szczep żywiciela typu dzikiego w celu uzyskania populacji bakterii opornych na mycynę konopną z losową transpozycją na wstawkach. Następnie transformanty są przesiewane przez posiewanie replik, które identyfikuje TRO, które rosną na bogatym podłożu, ale nie rosną na minimalnej ilości soli, pożywce uzupełnionej glukozą.Następnie genomicznie, DNA z mutanta jest trawione, ligowane i przekształcane w E. coli w celu uzyskania plazmidu zawierającego transpozon otoczony z każdej strony przez segmenty przerwanego genu. Uzyskano wyniki, które pokazują przypuszczalną tożsamość przerwanego genu na podstawie sekwencjonowania DNA i analizy podstawowego narzędzia do wyszukiwania dopasowania lokalnego. Transpozon używany w tej technice ma pochodzenie replikacyjne, gen oporności na kanamycynę i końce mozaiki.Do transpozycji wiązania białek. Brakuje mu genu białka transponującego, dlatego musimy dodać ten gen transpozycyjny z fragmentem transpozonu DNA, a następnie kompleks między transpo

generation-enterobacter-sp-ysu-auxotrophs-using-transposon

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Systematyczne, wielkoskalowe przesiewy syntetycznych interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych powiązań między szlakami sygnałowymi. W niniejszej pracy opisujemy opracowaną przez nas technologię wysokoprzepustowych ilościowych przesiewów macierzy syntetycznych interakcji genetycznych, nazwaną eSGA, służącą do wyjaśniania relacji epistatycznych i badania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

Źródło: Kazi, M. I., et al., Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych do sekwencjonowania wysokoprzepustowego. J . Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje selekcję, kwantyfikację i zachowanie bakterii biorców Gram-ujemnych przenoszących inserpozycje transpozonów w oparciu o oporność na kanamycynę.

Izolacja bakterii Gram-ujemnych z insercją transpozonów genomowych

Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący mutagenezę za pośrednictwem transpozonu mini-himar1 mariner do generowania biblioteki mutantów insercyjnych o wysokiej gęstości do badania, izolacji i identyfikacji nowych regulatorów alginianu w prototypowym szczepie Pseudomonas aeruginosa PAO1.

Identyfikacja nowych genów związanych z produkcją alginianów u Pseudomonas aeruginosa przy użyciu mutagenezy za pośrednictwem transpozonu Mini-himar1 Mariner

Coxiella burnetii jest obligatoryjną wewnątrzkomórkową bakterią Gram-ujemną odpowiedzialną za chorobę odzwierzęcą Q gorączkę. W tym miejscu opisujemy metody generowania mutantów transpozonów fluorescencyjnych Coxiella, a także automatyczną identyfikację i analizę powstałych fenotypów internalizacji, replikacji i cytotoksyczności.

Wytwarzanie i wielofenotypowe badania przesiewowe o wysokiej zawartości mutantów transpozonów Coxiella burnetii

Tutaj moc losowej insercji niekodującego elementu DNA za pośrednictwem transpozonu została wykorzystana do określenia jego optymalnej pozycji chromosomalnej.

Określenie optymalnej lokalizacji chromosomalnej dla elementu DNA w Escherichia coli przy użyciu nowatorskiego podejścia opartego na transpozonach

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda tworzenia biblioteki wstawiania transpozonów o dużej gęstości w Escherichia coli lub Shigella flexneri przy użyciu koniugacji bakteryjnej. Protokół ten pozwala na stworzenie kolekcji setek tysięcy unikalnych mutantów w bakteriach poprzez losową insercję genomową transpozonu.

Stworzenie gęstej biblioteki insercji transpozonów za pomocą koniugacji bakteryjnej w szczepach enterobakteryjnych, takich jak Escherichia coli czy Shigella flexneri

Opisujemy tutaj technikę, która łączy mutagenezę transpozonów z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji i ilościowego określenia transpozonów mutantów leptospiralnych w tkankach po wyzwaniu chomików. Protokół ten może być stosowany do badań przesiewowych mutantów pod kątem przeżycia i rozprzestrzeniania się u zwierząt, a także może być stosowany w badaniach in vitro.

Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie równoległe w celu pomiaru sprawności Leptospira interrogans Mutanty insercji transpozonów podczas infekcji złotego chomika syryjskiego

Zakażenie Pseudomonas aeruginosa powoduje znaczną zachorowalność u wrażliwych gospodarzy. Nieredundantna biblioteka mutantów insercji transpozonów szczepu PA14 P. aeruginosa, oznaczona jako PA14NR Set, ułatwia analizę funkcjonalności genów w wielu procesach. Przedstawiono tutaj protokół do generowania wysokiej jakości kopii biblioteki mutantów PA14NR Set.

Replikacja uporządkowanej, nieredundantnej biblioteki mutantów insercji transpozonów Pseudomonas aeruginosa szczepu PA14

Wzajemna hemizygotyczność poprzez sekwencjonowanie (RH-seq) to nowa, potężna metoda mapowania genetycznych podstaw różnic między gatunkami. Pule hemizygot są generowane przez mutagenezę transpozonów, a ich sprawność jest śledzona poprzez wzrost konkurencyjności przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej długości czasu. Analiza uzyskanych danych wskazuje geny leżące u podstaw tej cechy.

Mapowanie genetyczne różnic w termotolerancji między gatunkami drożdży Saccharomyces za pomocą analizy wzajemnej hemizygotyczności całego genomu

Opisujemy metodę generowania nasyconych bibliotek mutantów transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych i późniejszego przygotowania bibliotek amplikonów DNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Jako przykład skupiamy się na patogenie ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ale ten protokół jest podatny na szeroką gamę organizmów Gram-ujemnych.

Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Poznaj metodę mutagenezy transpozonów w bakterii Enterobacter sp. YSU do tworzenia auksotrofów. Technika obejmuje elektroporację, replikową płytkową i sekwencjonowanie genów.

Wytwarzanie auksotrofów Enterobacter sp. YSU z wykorzystaniem mutagenezy transpozonów

Przeglądaj więcej filmów