Od plamki 2DE-Gel do funkcji białka: lekcja wyciągnięta z HS1 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zastosowanie połączonego podejścia proteomicznego w celu zidentyfikowania potencjalnych markerów prognostycznych i/lub celów terapeutycznych w chorobach człowieka. Osiąga się to poprzez wyizolowanie pierwotnych komórek białaczkowych z krwi obwodowej pacjenta, niosących dobre lub złe rokowanie i wyrażających zarówno CD 19, jak i CD 5 markerów powierzchniowych do wykorzystania do analizy proteomicznej jako drugi krok. Lizaty komórek białaczkowych są rozwiązywane przez elektroforezę dwuwymiarową lub dwa de, a porównanie map proteomicznych pozwala na identyfikację plam o zróżnicowanej ekspresji u pacjentów z dobrym i złym rokowaniem, które można następnie zidentyfikować za pomocą spektrometrii mas lub ms.

Następnie można zastosować różne testy w celu walidacji i analizy roli zidentyfikowanych białek w naturalnej historii choroby. Wyniki pokazują, że różny status fosforylacji HS one wykryty przez dwa de gele, koreluje z wynikami klinicznymi pacjentów. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii przewlekłej białaczki limfocytowej, ponieważ może ona pomóc w identyfikacji białka zaangażowanego w postęp choroby, które można wykorzystać jako marker prognostyczny i/lub cele terapeutyczne, które pokazują, że ta procedura będzie razem ze mną.

Pamela pobiegła do technika w laboratorium i doktora habilitowanego z laboratorium zewnętrznego Przed rozpoczęciem tej procedury należy pobrać krew obwodową w probówkach do pobierania krwi próżniowej z heparyną sodu. Przenieś krew do 15-mililitrowej probówki i dodaj koktajl wzbogacający ludzkie limfocyty B w ilości 50 mikrolitrów na mililitr pełnej krwi. Następnie dobrze wymieszaj i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji delikatnie rozcieńczyć próbkę równą objętością mieszanki PBS plus 2% FBS i ostrożnie nałożyć krew na wezwanie muchy, uważając, aby nie przerwać interfejsu. Odwirować próbkę w temperaturze 400 razy G w temperaturze pokojowej przez 20 minut bez przerwy. Po zakończeniu ostrożnie zassaj interfejs, aby odzyskać komórki i umieść je w nowej probówce.

Przemyć komórki raz PBS po odwirowaniu i usunięciu sklarowanego osadu. Resus. Zawiesić osad w pozostałym supernatantze, ręcznie przesuwając probówkę w przód i w tył po rozcieńczeniu. Za pomocą kompletnego podłoża RPMI policz komórki za pomocą metody wykluczenia niebieskiego Triana.

Następnie dodać następujące przeciwciała do 100 mikrolitrów oczyszczonej zawiesiny komórek w probówce faksowej. Inkubować próbkę przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Po umyciu próbki czterema mililitrami PBS sprawdzić czystość za pomocą cytometrii przepływowej.

Sprawdź procent komórek przewlekłej białaczki limfocytowej lub CLL, które wykazują ekspresję CD 19 i CD 5 na swojej powierzchni. Upewnij się, że preparaty są praktycznie pozbawione limfocytów NK t i monocytów, sprawdzając procent CD 3, CD 14 i CD 1656 na wykresie, który w tym momencie powinien być bliski zeru. Rozpuścić solubilizować granulki komórek CLL o końcowej objętości 380 mikrolitrów dwuwymiarowego buforu do elektroforezy.

Nałóż jeden miligram próbek białka na 18 pasków IPG, aby wykonać ogniskowanie elektryczne ISO. Po przebiegu należy zrównoważyć paski w dwóch mililitrach buforu równoważącego, uzupełnionego 2% świeżego naziemnego prądu podwójnego przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu roztworu dodać dwa mililitry buforu równoważącego, uzupełnionego 2,5% octemidem oto.

Następnie inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej na platformie bujanej. Następnie wysusz paski na papierze, nie dotykając żelu, aby usunąć nadmiar roztworu. Po wyschnięciu załaduj każdy pasek na żel do strony SDS o nachyleniu od dziewięciu do 16%.

Dodaj niewielką objętość buforu do elektroforezy SDS na wierzch żelu, aby ułatwić ładowanie paska. Następnie uszczelnij żel, dodając około pięciu mililitrów 0,8% roztworu agaru, aby zapobiec unoszeniu się paska. Po zmontowaniu jednostki do elektroforezy napełnij ją buforem do elektroforezy SDS.

Następnie wykonuj bieg z prędkością 60 miliamperów na żel przez cztery godziny, cztery stopnie Celsjusza lub za pomocą systemu chłodzenia. Po wyjęciu żelu z jednostki elektroforetycznej należy umieścić go w odpowiednim pudełku do barwienia. Przygotuj około 200 mililitrów każdego roztworu.

Ostrożnie dodaj każdy roztwór do pudełka barwiącego zawierającego żel. Wszystkie inkubacje wykonuj na platformie bujanej. Po barwieniu usunąć roztwór zatrzymujący i pozostawić żel w roztworze 1% kwasu octowego do momentu nabycia.

W teście migracji resus zawiesza wcześniej oczyszczone komórki. W pełnym RPMI przygotuj dolną komorę transwell, dodając 600 mikrolitrów kompletnego RPMI z określonymi bodźcami lub bez nich. Aby zmierzyć odpowiednio migrację indukowaną i spontaniczną, umieść górną komorę na górze i pozwól systemowi zrównoważyć się przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze.

Po zakończeniu wysiewaj od 10 do sześciu komórek na 200 mikrolitrów w górnej komorze i inkubuj płytkę przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze. Po inkubacji wyjąć górną komorę i zebrać pożywkę w dolnej komorze. Następnie umyj dolną komorę raz jednym mililitrem PBS.

Po zebraniu PBS do probówki, po usunięciu supernatantu należy odwirowywać próbkę przez pięć minut w temperaturze 300 razy G. Zawiesić próbkę w 500 mikrolitrach PBS za pomocą cytometrii przepływowej. Policz liczbę migrowanych komórek po jednej minucie od pobrania.

Sprawdź liczbę komórek na dwuwymiarowym wykresie kropkowym, biorąc pod uwagę boczne rozrzuty komórek i liczbę zdarzeń wizualizowanych w ciągu jednej minuty, czyli liczbę, której należy użyć do obliczeń. Izolowane pierwotne próbki komórek białaczkowych od pacjentów z PBL pogrupowano w dwie główne podgrupy w oparciu o cechy kliniczne każdego pacjenta i przeanalizowano za pomocą dwóch mas DE i SM w ramach określonej tolerancji masy. Zostały przypisane do sekwencji peptydowych w bazie danych, a następnie złożone w białko, które uważa się za zidentyfikowane, jeśli przejdzie określony wynik prawdopodobieństwa.

Dzięki tej analizie wśród tych białek zidentyfikowano białka biorące głównie udział w aktywności cytoszkieletu i procesach metabolicznych. Linia krwiotwórcze, białko specyficzne dla komórki lub hs. Taki, którego zróżnicowana fosforylacja była silnie związana z klinicznym przebiegiem choroby, była różnie wyrażana.

W szczególności pacjenci z jednym plamem doświadczają złego wyniku klinicznego, podczas gdy pacjenci z dwoma plamkami mają dobre rokowanie. Stwierdzono, że komórki PBL niosące HS jeden jako jedną plamkę mają upośledzoną aktywność cytoszkieletu pod względem migracji, adhezji i polimeryzacji aktyny w porównaniu z hipofosforylowanym HS. Jedna, dwie próbki punktowe. Wyjaśniając w ten sposób inne zachowanie kliniczne.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać proteomiki do identyfikacji biologicznych kandydatów zaangażowanych w postęp choroby, którzy mogą być wykorzystywani jako marker prognostyczny i/lub cele terapeutyczne.