Name: Od plamki 2DE-Gel do funkcji białka: lekcja wyciągnięta z HS1 w przewlekłej białaczce limfocytowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Poznaj metodę łączącą elektroforezę 2DE i spektrometrię mas MS do identyfikacji różnicowo ekspresowanych białek w komórkach leukemicznych. Technika ta pozwala odkrywać markery prognostyczne i cele terapeutyczne w przewlekłej białaczce limfocytowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jednostce Nowotworów Limfoidalnych, Elisie ten Hacken, Lydii Scarfò, Massimo Alessio, Antonio Conti, Angeli Bachi i Angeli Cattaneo.
Ten projekt był wspierany przez: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Grant Badacza i Specjalny Program Molekularnej Onkologii Klinicznej – 5 promilów #9965)
C.S. i B.A zaprojektowali badanie, przeprowadzili eksperymenty, przeanalizowali dane i napisali manuskrypt. M.T.S.B., U.R., F.B. P.R. pomagał w pisaniu rękopisu. P.G. i F.C.C. zaprojektowali badanie, dostarczając próbki pacjentów i dane kliniczne.

UWAGA: Wszystkie próbki tkanek zostały pobrane za zgodą instytucjonalnej komisji przeglądowej szpitala San Raffaele (Mediolan, Włochy).
1. Próbki ludzkich tkanek i oczyszczanie komórek (Rysunek 1)
UWAGA: Limfocyty białaczkowe pozyskano z krwi obwodowej (PB) pacjentów z CLL, zdiagnozowanych zgodnie z metodą Mulligan et al. 9
1.1) Separacja komórek białaczkowych z krwi obwodowej
<ol>
	<li>Pobrać krew obwodową do probówek do pobierania krwi typu vacutainer z heparyną sodową.</li>
	<li>Przenieś krew do probówki o objętości 15 ml i dodaj koktajl do wzbogacania ludzkich limfocytów B w ilości 50 μL/mL całej krwi. Wymieszać dokładnie i inkubować przez 20 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbkę równą objętością PBS + 2% FBS, delikatnie wymieszać, a następnie ostrożnie nanieść krew na warstwę Ficollu, dbając o to, aby nie przerwać interfejsu. Należy zachować proporcję co najmniej 1 części Ficollu na 2 części rozcieńczonej próbki (t.j. 4 ml Ficoll + 10 ml krwi w probówce 15 ml).</li>
	<li>Wirować przy 400 x g w temperaturze pokojowej (20 °C) przez 20 min bez hamowania. Komórki mononuklearne znajdą się na granicy faz.</li>
	<li>Ostrożnie odessaj frakcję pośrednią, aby odzyskać komórki, a następnie przelej je do nowej probówki. Przemyj komórki raz buforem PBS i odwiruj z prędkością 300 x g. 4 °C w ciemności przez 5 min. Osad znajdzie się na dnie.</li>
	<li>Odlej nadsącz. Resuspenduj osad w pozostałym nadsączu, delikatnie potrząsając probówką palcami. Rozcieńcz osad w 10 ml kompletnego medium RPMI (RPMI 1640 uzupełnione o 10% płodowej surowicy cielęcej i 15 mg/ml gentamycyny) i policz komórki metodą wykluczania błękitu trypanu.</li>
</ol>
1.2) Ocena czystości
UWAGA: Czystość wszystkich preparatów musi być zawsze powyżej 99%.
<ol>
	<li>100 μl oczyszczonej zawiesiny komórkowej inkubować z następującymi przeciwciałami (dostępnymi komercyjnie; patrz Tabela materiałów): CD3FITC (5 µl/test), CD14PE (5 µl/test), CD19ECD (6 µl/test), CD16-CD56PC5 (2 µl/test), CD5PC7 (4 µl/test), przez 20 min w temperaturze 4 °C w probówce do FACS.</li>
	<li>Próbkę przemyć 4 ml PBS (wirować przez 5 min przy 300 x g), a następnie sprawdzić czystość za pomocą cytometrii przepływowej. Na wykresie zweryfikować procent komórek CLL (&gt; 99%), które koekspresują CD19 i CD5 na swojej powierzchni, jak pokazano na Rysunku 1(6). Upewnić się, że preparaty są praktycznie pozbawione komórek NK, limfocytów T i monocytów, sprawdzając na wykresie procent CD3, CD14 i CD16-56, który powinien być bliski zeru.</li>
</ol>
1.3) Przechowywanie próbek
<ol>
	<li>Do badań proteomicznych zebrać 25 x 106 komórek do probówki 1,5 ml, odwirować komórki przy 300 x g przez 10 min, odrzucić supernatant i liofilizować osad przez 4 hr. Przechowywać w -80 °C do czasu użycia.</li>
	<li>W przypadku testów walidacyjnych resuspenderć komórki w pełnym medium RPMI (ilość zależy od wybranego dalszego testu) i przejść do Kroku 4.</li>
</ol>
2. Elektroforeza dwuwymiarowa (2-DE) (Rycina 2)
2.1) Izoelektroogniskowanie (IEF)
<ol>
	<li>Zsolubilizuj osady komórek CLL w końcowej objętości 380 μl buforu 2-DE (344 μl roztworu RBthio (9 M Urea, 10 mM Tris, 4% CHAPS), 30 μl 65mM DTT, 6 μl 2% buforu IPG ampholine pH 4-7).</li>
	<li>Nałóż próbki białek (1 mg) na 18 pasków IPG (pH 4-7) i przeprowadź IEF zgodnie ze standardowym protokołem opisanym przez Conti et al. 10</li>
	<li>Równoważ paski w 2 ml buforu równoważącego (EB: 50 mM pH 8.8 bufor Tris-HCl zawierający 6 M urea, 30% glicerolu, 2% SDS), uzupełnionego o 2% świeżego DTT, przez 15 minut w RT. Odlej EB+DTT i dodaj 2 ml EB uzupełnionego o 2.5% jodooctanu. Inkubuj przez 15 min w RT na platformie kołyszącej.</li>
</ol>
2.2) SDS-PAGE
<ol>
	<li>Osuszyć paski na papierze, nie dotykając żelu, aby usunąć nadmiar EB. Nałożyć każdy pasek na górną część żelu do elektroforezy SDS-PAGE o gradiencie 9-16%. Dodać niewielką objętość buforu do elektroforezy SDS (Tris 25 mM, glicyna 192 mM, SDS 0,1% w/v) na górę żelu, aby ułatwić nałożenie paska.</li>
	<li>Zapieczętować żel, dodając ~5 ml roztworu agaru (0,8%), aby zapobiec wypływaniu paska, następnie złożyć urządzenie elektroforetyczne i wypełnić je buforem do elektroforezy SDS. Przeprowadzić rozdzielanie przy natężeniu 60 mA/żel przez 4 hr w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wyjąć żel z urządzenia elektroforetycznego i umieścić go w odpowiednim pojemniku do barwienia.</li>
</ol>
2.3) Barwienie srebrem żelu preparatywnego
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>FIXER</td>
			<td>50% metanol, 12% kwas octowy 
			0,05% formalina</td>
			<td>2 godz. (lub przez noc)*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUFOR PŁUKĄCY</td>
			<td> 35% etanolu</td>
			<td>20 min (powtórzyć ten krok trzykrotnie)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uczulanie</td>
			<td> 0,02% tiosiarczan sodu</td>
			<td>2 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PŁUKANIE</td>
			<td> H2O</td>
			<td>5 min (powtórzyć ten krok trzykrotnie) </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZOTAN SREBRA</td>
			<td> 0,2% azotan srebra 0,076% formalina</td>
			<td>20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PŁUKANIE</td>
			<td> H2O</td>
			<td>1 min (powtórzyć ten krok dwukrotnie) </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WYWOŁYWA CZY**WACZ**</td>
			<td>6% węglan sodu, 0,0004% tiosiarczan sodu 
			 0,05% formaliny</td>
			<td>Do momentu uzyskania wystarczającego zabarwienia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STOP</td>
			<td>50% metanol</td>
			<td>30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>* 2 h to minimalny czas wymagany do utrwalenia białek </td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1.
UWAGA: Plamki białkowe można uwidocznić, barwiąc żele metodą barwienia srebrem kompatybilną z MS11. Wszystkie roztwory niezbędne do barwienia srebrem wymieniono w Tabeli 1.
<ol>
	<li>Przygotować około 200 ml każdego roztworu/żelu i postępować zgodnie ze wskazówkami w Tabeli 1. Ostrożnie wlać każdy roztwór do kuwety do barwienia zawierającej żel. Wszystkie inkubacje przeprowadzać na platformie kołyszącej.</li>
	<li>Po zabarwieniu usunąć roztwór zatrzymujący i pozostawić żel w 1% kwasie octowym do czasu akwizycji.</li>
</ol>
2.4) Pozyskiwanie i analiza obrazu żelu
<ol>
	<li>Należy pozyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości za pomocą densytometru w ciągu 3 dni od barwienia.</li>
	<li>Analizę wzorów białkowych 2-D należy przeprowadzić przy użyciu oprogramowania do żeli 2-DE. 
	UWAGA: Oprogramowanie to umożliwia szybkie i wiarygodne porównywanie obrazów.
	<ol>
		<li>Utwórz projekt, wybierając opcję „create a new project” z menu kontekstowego. Utwórz folder i zaimportuj żele, wybierając opcję „import gel images” dla plików z rozszerzeniem .tif, .png lub .gel.</li>
		<li>Po zaimportowaniu żeli i dodaniu ich do obszaru roboczego należy przeprowadzić automatyczną detekcję plamek, zaznaczając żele do analizy i wybierając z menu „edit &gt; spot&gt; detect”.</li>
		<li>Następnie należy przeprowadzić odejmowanie tła, wybierając z menu „subtract background”. Uwaga: Po tym kroku możliwe jest porównanie wielu żeli oraz wykrycie różnic lub podobieństw za pomocą analizy ilościowej i/lub jakościowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Identyfikacja białek za pomocą analizy MALDI-TOF MS (Rysunek 3)
3.1) Trawienie białek
<ol>
	<li>Wypłucz żel wodą, a następnie wycinaj interesujące plamki z żeli, korzystając z metody ręcznej (wycinanie czystym skalpelem) lub automatycznej.</li>
	<li>Przemyj cząsteczki żelu wodą (100-150 μl), odwiruj (30 s przy 400 x g) i odlej ciecz.</li>
	<li>Dodać taką samą objętość (zależnie od objętości żelu) CH3Dodaj CN do fragmentów żelu i odczekaj 10–15 min, aż fragmenty żelu się skurczą. Osusz cząsteczki żelu w wirówce próżniowej.</li>
	<li>Dodać 75-100 µl 10 mM ditiotreitolu rozcieńczonego w 50 mM NH44HCO3 i inkubować przez 30 min w temperaturze 56 °C (Krok redukcji). Ponownie obkurcz fragmenty żelu za pomocą CH3CN opisany w punkcie 3.1.3.</li>
	<li>Kontynuuj alkilację, dodając 75-100 µl roztworu 55 mM jodoacetamidu rozcieńczonego w 50 mM NH4HCO34HCO3 i inkubować przez 20 min w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Ponownie skurcz fragmenty żelu za pomocą CH3CN w objętości wystarczającej do pokrycia fragmentów żelu, zgodnie z opisem w kroku 3.1.3. Osuszyć w wirówce próżniowej.</li>
	<li>Rehydratować cząsteczki w buforze zawierającym 25 mM NH4Cl4HCO3, 5 mM CaCl22,oraz 12,5 ng/μl trypsyny w temperaturze 4 °C przez 20 min. Należy użyć takiej objętości buforu, aby zakryć fragmenty żelu. Usunąć niezaabsorbowany nadsącz z fragmentów żelu i dodać 25 mM NH4HCO3, 5 mM CaCl22 bez użycia trypsyny do pokrycia żelu.</li>
	<li>Pozostawić próbki w 37 °C od co najmniej 3 godz. (minimalny czas wymagany do trawienia peptydów) do nocy.</li>
</ol>
3.2) Analiza spektrometrią mas (technika wysuszonej kropli)
<ol>
	<li>Nanieś 1 μl każdej próbki na stalową płytkę MALDI i wymieszaj z 1 µl kwasu α-cyjanoforksycinnamicowego jako macierzy, przygotowanej w 50% CH3CN i 0,1% TFA.</li>
	<li>Uzyskaj widma mas na spektrometrze mas MALDI–TOF. Zbierz około 200 widm na punkt, dostosowując intensywność lasera tak, aby zapobiec nasyceniu sygnału lub go zwiększyć. Przetwórz widma za pomocą oprogramowania Data Explorer zgodnie z poniższym opisem:
	<ol>
		<li>Zaimportuj plik .dat i wykonaj korekcję linii bazowej, wybierając „process &gt; baseline correction”. Kalibruj masy, wykorzystując produkty autolizy trypsyny oraz piki macierzy, wybierając „process &gt; mass calibration &gt; manual calibration”; zaznacz piki bliskie m/z 855,1 oraz 2163,1 poprzez przeciągnięcie lewym przyciskiem myszy i wybierz odpowiadające im masy referencyjne, a następnie kliknij „plot” i „apply calibration” w oknie kalibracji manualnej.</li>
		<li>Dostosuj próg detekcji pików („peak &gt; peak detection”), zduplikuj aktywny ślad („display &gt; duplicate active trace”), zaznacz nowy ślad i wykonaj deizotopowanie („peak &gt; deisotoping”). Używając makra „getpeaklist”, wygeneruj listę mas do identyfikacji. W razie potrzeby ręcznie usuń sygnały szumu uznane za piki, aby oczyścić listę i uzyskać lepszą identyfikację.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikuj białka poprzez przeszukiwanie kompleksowej, nieredundantnej bazy danych białek przy użyciu silników wyszukiwania ProFound oraz Mascot12.
	<ol>
		<li>We wszystkich wyszukiwaniach zastosuj następujące parametry: jedno pominięte cięcie na peptyd, utlenianie metioniny jako modyfikacja zmienna, karbamidometylowanie cysteiny jako modyfikacja stała oraz początkowa tolerancja masy wynosząca 50 ppm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analizy aktywności cytoszkieletu (Rysunek 4)
UWAGA: Komórki oczyszczone w kroku 1 należy resuspendować w pełnym medium RPMI (106 komórek/200 μl).
4.1) Test migracji. Badanie to umożliwia ilościową ocenę zdolności migracyjnej analizowanych komórek (limfocytów). Należy użyć komory transwell o średnicy 6,5 mm i rozmiarze porów 5,0 μm oraz przeprowadzić test w trzech powtórzeniach. W przypadku różnych typów komórek należy zoptymalizować rozmiar porów oraz czas migracji (krok 4.1.3).
<ol>
	<li>Przygotować dolną komorę, dodając 600 μl kompletnego medium RPMI z lub bez specyficznych stymulatorów (t. j. SDF-1) w celu pomiaru odpowiednio migracji indukowanej i spontanicznej.</li>
	<li>Nałóż na to górną komorę i pozostaw układ do wyrównania parametrów przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze.</li>
	<li>Zasiew 106 komórki/200 μl w górnej komorze (całkowita liczba komórek) i inkubować płytkę przez 4 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze.</li>
	<li>Zdejmij górną komorę, zbierz pożywkę z dolnej komory i raz przemyj dolną komorę 1 ml PBS. Zbierz PBS do probówki.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 300 x g, odlać nadsącz i zawiesić ponownie w 500 μl PBS</li>
	<li>Za pomocą cytometrii przepływowej należy policzyć liczbę zmigrowanych komórek po 1 minucie akwizycji. W przypadku izolowanej populacji komórek nie jest konieczne dodawanie przeciwciał powierzchniowych. Należy sprawdzić liczbę komórek na dwuwymiarowym wykresie kropkowym (dot plot), uwzględniając rozproszenie boczne (side scatter) komórek oraz liczbę zdarzeń zliczonych w ciągu 1 minuty, która będzie wartością wykorzystaną do obliczeń.</li>
	<li>Oblicz indeks migracji (MI) według wzoru: 
	<img alt="Cell migration index equation for quantifying cell movement; formulaic representation in research." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1"></li>
</ol>
4.2) Test adhezji. Test ten pozwala na pomiar zdolności adhezyjnej komórek. Przeprowadzić test w trzech powtórzeniach.
<ol>
	<li>Przed pokryciem płytkę 96-dołkową (z płaskim dnem) 50 μl/dołek roztworu 2% BSA-PBS (jako tło) lub 1 μg ICAM-1 rozcieńczonego w PBS, przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć płytkę dwukrotnie PBS-em i zablokować miejsca niespecyficzne, dodając 2% BSA-PBS (100 μl/dołek) na 1 hr w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W międzyczasie resuspendować komórki w stężeniu 5 x 106/ml w pełnym medium RPMI, oznakować je 1 mM CMFDA-green cell tracker i inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 1 x 106 komórek/dołek do uprzednio pokrytych dołków po odlaniu roztworu blokującego (Krok 4.2.2) i inkubować przez 1 hr w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Ilościowo określić adhezję za pomocą czytnika ELISA (filtr wzbudzenia: 485 nM, filtr emisji: 535 nM). Wykonać pierwszy pomiar całkowitej liczby komórek wejściowych (INPUT).</li>
	<li>Delikatnie przemyć płytkę 2% BSA-PBS (200 μl/dołek) 4 razy (x). Wykonać odczyt płytki po każdym etapie płukania (Adhesionx).</li>
	<li>Po odjęciu tła dla każdego pomiaru, obliczyć adhezję specyficzną (ADHESION): 
	<img alt="Wzór oceny adhezji; równanie do obliczania adhezji; stosunek adhezji do liczby komórek wejściowych pomnożony przez 100." fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"></li>
</ol>
4.3) Test polimeryzacji. Jest to test kolorymetryczny, który pozwala na ilościowe określenie polimeryzacji F-aktyny. Test należy przeprowadzić w trzech powtórzeniach.
<ol>
	<li>Resuspender 1x10^6 komórek w 100 μl uprzednio ogrzanego kompletnego medium RPMI i dodać specyficzny stymulator (i.e. α-IgM 20 μg/ml) na 10 min.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję, dodając 400 μl 4% paraformaldehydu, i utrwalić komórki przez 10 min w RT.</li>
	<li>Przemyć 3 razy buforem PBS (wirować przy 300 x g przez 5 min w 4 °C).</li>
	<li>Odlać nadsącz i poddać komórki permeabilizacji przy użyciu PBS-saponiny 0.2% (200 μl) na lodzie przez 2 min.</li>
	<li>Przemyć 3 razy PBS-saponiną 0.1% (wirować przy 100 x g przez 5 min w 4 °C), odlać nadsącz i resuspender w 100 μl PBS-saponiny 0.1%.</li>
	<li>Barwić Phalloidin-Alexafluorem 488 (3 μg/ml) przez 30 min w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Przemyć 3 razy PBS-saponiną 0.1%. Odlać nadsącz i resuspender w 300 μl PBS.</li>
	<li>Ilościowo określić zawartość F-aktyny za pomocą cytometrii przepływowej, obliczając średnią intensywność fluorescencji (MFI) falloidyny. Przeanalizować uzyskane dane na wykresie jednowymiarowym w celu wygenerowania histogramu na podstawie intensywności fluorescencji; wartość MFI zostanie przedstawiona w raporcie z wykresu.</li>
	<li>Zmierzyć polimeryzację F-aktyny (∆ F-actin) zgodnie z wzorem: 
	<img alt="Wzór na ilościowe oznaczenie F-aktyny, ΔF-actin, MFI_TO/MFI_IgM, równanie równowagi statycznej" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"></li>
</ol>

<ol><li>Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+in+chronic+lymphocytic+leukemia%3A+are+we+getting+closer+to+understanding+the+pathogenesis+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease.</a> J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).</li>
<li>Rawstron, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+B-cell+lymphocytosis+and+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Monoclonal B-cell lymphocytosis and chronic lymphocytic leukemia.</a> N Engl J Med. 359, 575-583 (2008).</li>
<li>Dagklis, A., Fazi, C., Scarfo, L., Apollonio, B., Ghia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+B+lymphocytosis+in+the+general+population%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Monoclonal B lymphocytosis in the general population.</a> Leuk Lymphoma. 50, 490-492 (2009).</li>
<li>Fazi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+population+low-count+CLL-like+MBL+persists+over+time+without+clinical+progression%2C+although+carrying+the+same+cytogenetic+abnormalities+of+CLL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">General population low-count CLL-like MBL persists over time without clinical progression, although carrying the same cytogenetic abnormalities of CLL.</a> Blood. 118, 6618-6625 (2011).</li>
<li>Caligaris-Cappio, F., Bertilaccio, M. T., Scielzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+microenvironment+wires+the+natural+history+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">How the microenvironment wires the natural history of chronic lymphocytic leukemia.</a> Seminars in cancer biology. , (2013).</li>
<li>Damle, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ig+V+gene+mutation+status+and+CD38+expression+as+novel+prognostic+indicators+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 94, 1840-1847 (1999).</li>
<li>Lanham, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+signaling+via+surface+IgM+is+associated+with+VH+gene+mutational+status+and+CD38+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential signaling via surface IgM is associated with VH gene mutational status and CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 101, 1087-1093 (2003).</li>
<li>Wiestner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZAP-70+expression+identifies+a+chronic+lymphocytic+leukemia+subtype+with+unmutated+immunoglobulin+genes%2C+inferior+clinical+outcome%2C+and+distinct+gene+expression+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profile.</a> Blood. 101, 4944-4951 (2003).</li>
<li>Mulligan, C. S., Thomas, M. E., Mulligan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes%2C+B+lymphocytes%2C+and+clonal+CLL+cells%3A+observations+on+the+impact+of+the+new+diagnostic+criteria+in+the+2008+Guidelines+for+Chronic+Lymphocytic+Leukemia+%28CLL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes, B lymphocytes, and clonal CLL cells: observations on the impact of the new diagnostic criteria in the 2008 Guidelines for Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL).</a> Blood. 113, 6496-6497 (2009).</li>
<li>Conti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+study+of+human+cerebrospinal+fluid+following+traumatic+brain+injury+indicates+fibrin%28ogen%29+degradation+products+as+trauma-associated+markers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Proteome study of human cerebrospinal fluid following traumatic brain injury indicates fibrin(ogen) degradation products as trauma-associated markers.</a> J Neurotrauma. 21, 854-863 (2004).</li>
<li>Mortz, E., Krogh, T. N., Vorum, H., Gorg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+silver+staining+protocols+for+high+sensitivity+protein+identification+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization-time+of+flight+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis.</a> Proteomics. 1, 1359-1363 (2001).</li>
<li>Zhang, W., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProFound%3A+an+expert+system+for+protein+identification+using+mass+spectrometric+peptide+mapping+information%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information.</a> Anal Chem. 72, 2482-2489 (2000).</li>
<li>Scielzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HS1+protein+is+differentially+expressed+in+chronic+lymphocytic+leukemia+patient+subsets+with+good+or+poor+prognoses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">HS1 protein is differentially expressed in chronic lymphocytic leukemia patient subsets with good or poor prognoses.</a> J Clin Invest. 115, 1644-1650 (2005).</li>
<li>Muzio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HS1+complexes+with+cytoskeleton+adapters+in+normal+and+malignant+chronic+lymphocytic+leukemia+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">HS1 complexes with cytoskeleton adapters in normal and malignant chronic lymphocytic leukemia B cells.</a> Leukemia. 21 (9), 2067-2070 (2007).</li>
<li>Scielzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HS1+has+a+central+role+in+the+trafficking+and+homing+of+leukemic+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">HS1 has a central role in the trafficking and homing of leukemic B cells.</a> Blood. 116, 3537-3546 (2010).</li>
<li>Kashuba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+B-cell+receptor+signaling+in+chronic+lymphocytic+leukaemia+reveals+a+possible+role+for+kininogen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukaemia reveals a possible role for kininogen.</a> J Proteomics. 91, 478-485 (2013).</li>
<li>Dhamoon, A. S., Kohn, E. C., Azad, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ongoing+evolution+of+proteomics+in+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">The ongoing evolution of proteomics in malignancy.</a> Drug Discov Today. 12, 700-708 (2007).</li>
<li>Ummanni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clinically+relevant+protein+targets+in+prostate+cancer+with+2D-DIGE+coupled+mass+spectrometry+and+systems+biology+network+platform%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of clinically relevant protein targets in prostate cancer with 2D-DIGE coupled mass spectrometry and systems biology network platform.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Celem niniejszego artykułu jest opisanie zoptymalizowanego protokołu identyfikacji cząsteczek biorących udział w patogenezie PBL, nawet jeśli podejście to można rozszerzyć na inne choroby i/lub inne typy próbek16-18. Porównując profile proteomiczne 2 podgrup pacjentów z PBL, dobre i złe rokowanie19, wykazaliśmy, że różnią się one statusem fosforylacji HS1 i że jego aktywacja wpływa na zdolność migracji i adhezji komórek białaczkowych.
W odniesieniu do innych meto...

Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL), najczęstsza białaczka u dorosłych w krajach zachodnich, wywodzi się z nagromadzenia monoklonalnych nowotworowych limfocytów CD5+ B i jest klinicznie bardzo niejednorodna. Może występować w postaci przedbiałaczkowej, zdefiniowanej jako limfocytoza monoklonalna B-komórek B (MBL) 1,2,3. W innych przypadkach choroba może objawiać się albo powolnym przebiegiem klinicznym, który może pozostawać stabilny przez lata, zanim będzie wymagał leczenia, albo jako postępująca choroba chemoreoporna z ponurym rokowaniem pomimo terapii. Wreszcie, może przekształcić się w często śmiertelnego chłoniaka o wysokim stopniu złośliwości (zespół Richtera-RS) 2,3,4. Pacjenci są zwykle klasyfikowani w dwóch głównych podgrupach: dobre i złe rokowanie, w oparciu o zestaw czynników prognostycznych, które dostarczają uzupełniających się informacji na temat predyktorów wyniku choroby i przeżycia. Heterogeniczność kliniczna prawdopodobnie odzwierciedla heterogeniczność biologiczną. Wykazano, że wiele czynników genetycznych, mikrośrodowiskowych i komórkowych współdziała z patogenezą choroby, chociaż nie znaleziono mechanizmów jednoczących 5. Szczegółowo rzecz biorąc, kilka badań wykazało, że różnice w klinicznym przebiegu choroby można częściowo wyjaśnić obecnością (lub brakiem) niektórych markerów biologicznych, które mają wartość prognostyczną 6,7,8. Dane te wykazały, że lepsze zrozumienie biologii choroby może dostarczyć dodatkowych wskazówek dotyczących klinicznego leczenia patologii poprzez identyfikację zarówno markerów prognostycznych, jak i celów terapeutycznych.
Celem niniejszego artykułu jest pokazanie, jak kombinacja różnych technik proteomicznych może być wykorzystana do identyfikacji białek zaangażowanych w początek i progresję CLL. Nasze podejście pokazuje, że możliwe jest połączenie ze sobą podstawowych danych proteomicznych i klinicznych5.
W obecnym przepływie pracy, pierwotne komórki białaczkowe od wybranych pacjentów (dobre vs złe rokowanie) są izolowane, a następnie wykorzystywane lizaty komórkowe do uzyskania map proteomicznych. 2DE pozwala na scharakteryzowanie profilu proteomicznego populacji komórek, w tym modyfikacji potranslacyjnych, dając w ten sposób pośrednią informację o aktywności biologicznej każdego białka. Lizaty całych komórek są rozpuszczane w pierwszym wymiarze w oparciu o punkt izoelektryczny, a następnie w drugim wymiarze w żelu poliakrylamidowym, który rozdziela białka na podstawie ich masy cząsteczkowej. Analiza porównawcza map proteomicznych pozwala na identyfikację białek o zróżnicowanej ekspresji (zarówno pod względem liczebności, jak i modyfikacji potranslacyjnych) jako plamek na żelu, które można ciąć i analizować za pomocą spektrometrii mas. Rola każdego kandydata może być następnie wykorzystana za pomocą różnych testów.
To podejście, ograniczone do CLL w obecnym manuskrypcie, może być łatwo rozszerzone na inne choroby/próbki, dostarczając w ten sposób informacji o proteomicznych/biologicznych różnicach między dwiema grupami (tj. patologiczne vs normalne, stymulowane vs niestymulowane, dzikie typu vs knockdown).

<table><tbody><tr><td>Acetonitryl</td><td>MERCK</td><td>61830025001730&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>SIGMA</td><td>A6141-500G</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Ditioerytrytol</td><td>SIGMA</td><td>D9680-5G</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>SIGMA</td><td>I6125-25G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>SIGMA</td><td>223506-25G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna, klasa sekwencjonowania</td><td>ROCHE</td><td>11418475001</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;- kwas cyjano-4-hydroksycynamonowy</td><td>SIGMA</td><td>C2020-10G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>SIGMA</td><td>T6580</td><td></td></tr><tr><td>ZipTip&micro;-C18</td><td>MILLIPORE</td><td>ZTC18M096</td><td></td></tr><tr><td>RozetaSep Koktajl wzbogacający ludzkie komórki B</td><td>STEMCELL</td><td>15064</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>EUROCLONE</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>DOMINIQUE DUTSCHER</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>SENTINEL DIAGNOSTYKA 1114547</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>SIGMA</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>CD19</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07770</td><td>ECD</td></tr><tr><td>CD5</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07754</td><td>PC5</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07746</td><td>FITC</td></tr><tr><td>CD14</td><td>BD</td><td>345785</td><td>PE</td></tr><tr><td>CD16</td><td>REDLICA BECKMAN</td><td>082A07767</td><td>PC5</td></tr><tr><td>CD56</td><td>REDLICA BECKMAN</td><td>082A07789</td><td>PC5</td></tr><tr><td>Ettan IPGphor 3 Izoelektryczny zespół ostrości</td><td>GE-Healthcare</td><td>11-0033-64&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>SIGMA</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Hcl Bufor</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0799</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>SIGMA</td><td>C2020-10G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>SIGMA</td><td>D9163-5G</td><td></td></tr><tr><td>IPGstrips</td><td>GE-Healthcare</td><td>17-1233-01&nbsp;</td><td>Liniowe pH 4-7 18cm</td></tr><tr><td>IPGbuffer</td><td>GE-Healthcare</td><td>17-6000-86</td><td>pH 4-7</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>SIGMA</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>PROTEAN II XL Cell</td><td>BIO-RAD</td><td>165-3188</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>INVITROGEN</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>INVITROGEN</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>SIGMA</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>VWR</td><td>631000</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>BIO-OPTICAL</td><td>05-K01009</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>9832500</td><td></td></tr><tr><td>Tiosiarczan sodu</td><td>FLUKA</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>Azotan srebra</td><td>FLUKA</td><td>85228</td><td></td></tr><tr><td>Dynamika molekularna Osobisty densytometr laserowy SI</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageMaster 2D Platinum 5.0</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>MERCK</td><td>A0250292</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF Voyager-DE STR</td><td>Oprogramowanie Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Data Explorer (wersja 3.2)&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>transwell chambre o średnicy 6,6 mm</td><td>CORNING</td><td>3421</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>EUROCLONE</td><td>ECB2000L</td><td>Z L-GLUTAMINĄ</td></tr><tr><td>Gentamyna</td><td>SIGMA</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1</td><td>PREPROTECH</td><td>300-28A</td> Płaskodenna płytka 96-dołkowa <td></td></tr><tr><td></td><td>BECTON DICKINSON</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SANTA CRUZ</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R& D Systems</td><td>720-IC</td><td></td></tr><tr><td>CMFDA</td><td>Life Thechnology</td><td>C7025</td><td>Zielona</td></tr><tr><td>IgM</td><td>SOUTHERNBIOTECH</td><td>2020-02</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>SIGMA</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>SIGMA</td><td>S-7900</td><td></td></tr><tr><td>Falloidyna&nbsp;</td><td>Terapia życia</td><td>A12379</td><td>Alexa fluor 488</td></tr></tbody></table>

od plamki 2de-gel do funkcji białka: lekcja wyciągnięta z hs1 w przewlekłej białaczce limfocytowej

From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

Identyfikacja cząsteczek biorących udział w inicjacji i progresji nowotworu jest fundamentalna dla zrozumienia biologii choroby, a w konsekwencji, dla klinicznego postępowania z pacjentami. W niniejszej pracy opiszemy zoptymalizowane podejście proteomiczne do identyfikacji cząsteczek zaangażowanych w progresję przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL). Szczegółowo, lizaty komórek białaczkowych są rozwiązywane przez dwuwymiarową elektroforezę (2DE) i wizualizowane jako "plamy" na żelach 2DE. Analiza porównawcza map proteomicznych pozwala na identyfikację białek o zróżnicowanej ekspresji (pod względem liczebności i modyfikacji potranslacyjnych), które są wybierane, izolowane i identyfikowane za pomocą spektrometrii mas (MS). Funkcja biologiczna zidentyfikowanych kandydatów może być testowana za pomocą różnych testów (tj. migracji, adhezji i polimeryzacji F-aktyny), które zoptymalizowaliśmy dla pierwotnych komórek białaczkowych.

Wyizolowaliśmy pierwotne leukemiczne limfocyty B z krwi obwodowej pacjentów z CLL i przeanalizowaliśmy mapy proteomiczne. Próbki (n = 104) podzielono na dwie główne podgrupy na podstawie cech klinicznych każdego pacjenta (zła prognoza vs dobra prognoza) i przeprowadzono analizę porównawczą żeli 2DE.
Analiza pozwoliła na identyfikację plamek wykazujących różnicową ekspresję pomiędzy dwoma podzespołami (pod względem obecności/braku lub przesunięcia na żelu, co sugeruje zmiany w modyfika...

Tutaj opisujemy protokół, który łączy dwie techniki proteomiczne, mianowicie dwuwymiarową elektroforezę (2DE) i spektrometrię mas (MS), w celu identyfikacji różnie wyrażonych/potranslacyjnych zmodyfikowanych białek wśród dwóch lub więcej grup próbek pierwotnych. Takie podejście, wraz z eksperymentami funkcjonalnymi, pozwala na identyfikację i charakterystykę markerów prognostycznych/celów terapeutycznych.

Od plamki 2DE-Gel do funkcji białka: lekcja wyciągnięta z HS1 w przewlekłej białaczce limfocytowej

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zastosowanie połączonego podejścia proteomicznego w celu zidentyfikowania potencjalnych markerów prognostycznych i/lub celów terapeutycznych w chorobach człowieka. Osiąga się to poprzez wyizolowanie pierwotnych komórek białaczkowych z krwi obwodowej pacjenta, niosących dobre lub złe rokowanie i wyrażających zarówno CD 19, jak i CD 5 markerów powierzchniowych do wykorzystania do analizy proteomicznej jako drugi krok. Lizaty komórek białaczkowych są rozwiązywane przez elektroforezę dwuwymiarową lub dwa de, a porównanie map proteomicznych pozwala na identyfikację plam o zróżnicowanej ekspresji u pacjentów z dobrym i złym rokowaniem, które można następnie zidentyfikować za pomocą spektrometrii mas lub ms.Następnie można zastosować różne testy w celu walidacji i analizy roli zidentyfikowanych białek w naturalnej historii choroby. Wyniki pokazują, że różny status fosforylacji HS one wykryty przez dwa de gele, koreluje z wynikami klinicznymi pacjentów. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii przewlekłej białaczki limfocytowej, ponieważ może ona pomóc w identyfikacji białka zaangażowanego w postęp choroby, które można wykorzystać jako marker prognostyczny i/lub cele terapeutyczne, które pokazują, że ta procedura będzie razem ze mną.Pamela pobiegła do technika w laboratorium i doktora habilitowanego z laboratorium zewnętrznego Przed rozpoczęciem tej procedury należy pobrać krew obwodową w probówkach do pobierania krwi próżniowej z heparyną sodu. Przenieś krew do 15-mililitrowej probówki i dodaj koktajl wzbogacający ludzkie limfocyty B w ilości 50 mikrolitrów na mililitr pełnej krwi. Następnie dobrze wymieszaj i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Po inkubacji delikatnie rozcieńczyć próbkę równą objętością mieszanki PBS plus 2% FBS i ostrożnie nałożyć krew na wezwanie muchy, uważając, aby nie przerwać interfejsu. Odwirować próbkę w temperaturze 400 razy G w temperaturze pokojowej przez 20 minut bez przerwy. Po zakończeniu ostrożnie zassaj interfejs, aby odzyskać komórki i umieść je w nowej probówce.Przemyć komórki raz PBS po odwirowaniu i usunięciu sklarowanego osadu. Resus. Zawiesić osad w pozostałym supernatantze, ręcznie przesuwając probówkę w przód i w tył po rozcieńczeniu. Za pomocą kompletnego podłoża RPMI policz komórki za pomocą metody wykluczenia niebieskiego Triana.Następnie dodać następujące przeciwciała do 100 mikrolitrów oczyszczonej zawiesiny komórek w probówce faksowej. Inkubować próbkę przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Po umyciu próbki czterema mililitrami PBS sprawdzić czystość za pomocą cytometrii przepływowej.Sprawdź procent komórek przewlekłej białaczki limfocytowej lub CLL, które wykazują ekspresję CD 19 i CD 5 na swojej powierzchni. Upewnij się, że preparaty są praktycznie pozbawione limfocytów NK t i monocytów, sprawdzając procent CD 3, CD 14 i CD 1656 na wykresie, który w tym momencie powinien być bliski zeru. Rozpuścić solubilizować granulki komórek CLL o końcowej objętości 380 mikrolitrów dwuwymiarowego buforu do elektroforezy.Nałóż jeden miligram próbek białka na 18 pasków IPG, aby wykonać ogniskowanie elektryczne ISO. Po przebiegu należy zrównoważyć paski w dwóch mililitrach buforu równoważącego, uzupełnionego 2% świeżego naziemnego prądu podwójnego przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu roztworu dodać dwa mililitry buforu równoważącego, uzupełnionego 2,5% octemidem oto.Następnie inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej na platformie bujanej. Następnie wysusz paski na papierze, nie dotykając żelu, aby usunąć nadmiar roztworu. Po wyschnięciu załaduj każdy pasek na żel do strony SDS o nachyleniu od dziewięciu do 16%.Dodaj niewielką objętość buforu do elektroforezy SDS na wierzch żelu, aby ułatwić ładowanie paska. Następnie uszczelnij żel, dodając około pięciu mililitrów 0,8% roztworu agaru, aby zapobiec unoszeniu się paska. Po zmontowaniu jednostki do elektroforezy napełnij ją buforem do elektroforezy SDS.Następnie wykonuj bieg z prędkością 60 miliamperów na żel przez cztery godziny, cztery stopnie Celsjusza lub za pomocą systemu chłodzenia. Po wyjęciu żelu z jednostki elektroforetycznej należy umieścić go w odpowiednim pudełku do barwienia. Przygotuj około 200 mililitrów każdego roztworu.Ostrożnie dodaj każdy roztwór do pudełka barwiącego zawierającego żel. Wszystkie inkubacje wykonuj na platformie bujanej. Po barwieniu usunąć roztwór zatrzymujący i pozostawić żel w roztworze 1% kwasu octowego do momentu nabycia.W teście migracji resus zawiesza wcześniej oczyszczone komórki. W pełnym RPMI przygotuj dolną komorę transwell, dodając 600 mikrolitrów kompletnego RPMI z określonymi bodźcami lub bez nich. Aby zmierzyć odpowiednio migrację indukowaną i spontaniczną, umieść górną komorę na górze i pozwól systemowi zrównoważyć się przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze.Po zakończeniu wysiewaj od 10 do sześciu komórek na 200 mikrolitrów w górnej komorze i inkubuj płytkę przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze. Po inkubacji wyjąć górną komorę i zebrać pożywkę w dolnej komorze. Następnie umyj dolną komorę raz jednym mililitrem PBS.Po zebraniu PBS do probówki, po usunięciu supernatantu należy odwirowywać próbkę przez pięć minut w temperaturze 300 razy G. Zawiesić próbkę w 500 mikrolitrach PBS za pomocą cytometrii przepływowej. Policz liczbę migrowanych komórek po jednej minucie od pobrania.Sprawdź liczbę komórek na dwuwymiarowym wykresie kropkowym, biorąc pod uwagę boczne rozrzuty komórek i liczbę zdarzeń wizualizowanych w ciągu jednej minuty, czyli liczbę, której należy użyć do obliczeń. Izolowane pierwotne próbki komórek białaczkowych od pacjentów z PBL pogrupowano w dwie główne podgrupy w oparciu o cechy kliniczne każdego pacjenta i przeanalizowano za pomocą dwóch mas DE i SM w ramach określonej tolerancji masy. Zostały przypisane do sekwencji peptydowych w bazie danych, a następnie złożone w białko, które uważa się za zidentyfikowane, jeśli przejdzie określony wynik prawdopodobieństwa.Dzięki tej analizie wśród tych białek zidentyfikowano białka biorące głównie udział w aktywności cytoszkieletu i procesach metabolicznych. Linia krwiotwórcze, białko specyficzne dla komórki lub hs. Taki, którego zróżnicowana fosforylacja była silnie związana z klinicznym przebiegiem choroby, była różnie wyrażana.W szczególności pacjenci z jednym plamem doświadczają złego wyniku klinicznego, podczas gdy pacjenci z dwoma plamkami mają dobre rokowanie. Stwierdzono, że komórki PBL niosące HS jeden jako jedną plamkę mają upośledzoną aktywność cytoszkieletu pod względem migracji, adhezji i polimeryzacji aktyny w porównaniu z hipofosforylowanym HS. Jedna, dwie próbki punktowe. Wyjaśniając w ten sposób inne zachowanie kliniczne.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać proteomiki do identyfikacji biologicznych kandydatów zaangażowanych w postęp choroby, którzy mogą być wykorzystywani jako marker prognostyczny i/lub cele terapeutyczne.

from-2de-gel-spot-to-protein-function-lesson-learned-from-hs1-chronic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten protokół opisuje podejście do badania rekombinowanych regionów VDJ łańcucha ciężkiego immunoglobuliny chłoniaków poprzez głębokie sekwencjonowanie i odzyskanie rearanżacji VDJ i statusu hipermutacji somatycznej w celu nakreślenia klonalnej architektury pojedynczego guza. Porównanie architektury klonalnej między sparowaną diagnozą a próbkami nawrotu chłoniaka ujawnia tryby ewolucji klonalnej nawrotu chłoniaka.

VDJ-Seq: Analiza głębokiego sekwencjonowania przegrupowanego genu łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w celu ujawnienia wzorców ewolucji klonalnej chłoniaka z komórek B

Opisany tutaj protokół reprezentuje łatwą i powtarzalną metodę, która wykorzystuje wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconymi fazami (RP-HPLC) do pomiaru metabolizmu puryn na komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL) hodowanych w różnych warunkach.

Test oparty na HPLC do monitorowania zewnątrzkomórkowego metabolizmu nukleotydów/nukleozydów w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej

Istniejące algorytmy generują jedno rozwiązanie dla zestawu danych do wykrywania biomarkerów. Protokół ten pokazuje istnienie wielu podobnie skutecznych rozwiązań i przedstawia przyjazne dla użytkownika oprogramowanie, które pomaga naukowcom biomedycznym badać swoje zestawy danych pod kątem proponowanego wyzwania. Informatycy mogą również zapewnić tę funkcję w swoich algorytmach wykrywania biomarkerów.

Wybór wielu podzbiorów biomarkerów o podobnie skutecznych wynikach klasyfikacji binarnej

Niniejszym przedstawiamy protokół, który szczegółowo opisuje aspekty techniczne i zasadnicze wymagania w celu zapewnienia solidnej analizy sekwencji genów IG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL), w oparciu o zgromadzone doświadczenie Europejskiej Inicjatywy Badawczej nad PBL (ERIC).

Analiza sekwencji genów immunoglobulin w przewlekłej białaczce limfocytowej: od materiału pacjenta do interpretacji sekwencji

Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL) jest najczęstszą białaczką w zachodnim świecie. Czynniki transkrypcyjne NFAT są ważnymi regulatorami rozwoju i aktywacji w wielu typach komórek. W tym miejscu przedstawiamy protokół stosowania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) w ludzkich komórkach PBL w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2.

Test immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Korzystając z wieloetapowych systemów hodowli, raportujemy in vitro model różnicowania komórek B do komórek plazmatycznych.

Model różnicowania in vitro ludzkich komórek B normalnej pamięci do długowiecznych komórek plazmatycznych

Poniżej opisano dwa podejścia do charakteryzacji zdarzeń polaryzacji komórkowej w limfocytach B podczas formowania IS. Pierwsze obejmuje ilościową analizę rekrutacji organelli i reorganizacji cytoszkieletu w błonie synaptycznej. Drugie to podejście biochemiczne, którego celem jest charakterystyka zmian w składzie centrosomy, która ulega polaryzacji w synapsie immunologicznej.

Badanie dynamiki organelli w komórkach B podczas formowania się synapsy immunologicznej

Ten protokół umożliwia optymalizację i późniejsze efektywne generowanie frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych z pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej. Próbki te są wykorzystywane do określenia lokalizacji białek, a także zmian w transporcie białek, które zachodzą między przedziałami jądrowymi i cytoplazmatycznymi po stymulacji komórek i leczeniu farmakologicznym.

Subkomórkowe frakcjonowanie pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej w celu monitorowania transportu białek jądrowych/cytoplazmatycznych

Tutaj prezentujemy protokół używany do przeprowadzania eksperymentów z mikroskopią siły trakcyjnej na komórkach B. Opisujemy przygotowanie miękkich żeli poliakrylamidowych i ich funkcjonalizację, a także pozyskiwanie danych pod mikroskopem i podsumowanie analizy danych.

Mikroskopia sił trakcyjnych do badania aktywacji limfocytów B

Tutaj prezentujemy protokół stopniowej rekonstytucji syntetycznych komórek prezentujących antygen za pomocą dwuwarstw lipidowych wspieranych przez koraliki i ich użycie do badania wyjścia synaptycznego z aktywowanych limfocytów T.

Przygotowanie dwuwarstw lipidowych wspieranych przez kulki w celu zbadania emisji cząstek stałych przez synapsy odpornościowe limfocytów T

Użyliśmy barwienia proliferacji komórek, aby zidentyfikować komórki w stanie spoczynku w modelu T-ostrej białaczki limfoblastycznej u danio pręgowanego. Barwnik jest zatrzymywany w komórkach niedzielących się i redukowany podczas proliferacji komórek, co umożliwia selekcję uśpionych komórek do dalszego badania. Protokół ten zapewnia funkcjonalne narzędzie do badania samoodnowy w kontekście spoczynku komórkowego.

Identyfikacja komórek w stanie spoczynku w modelu ostrej białaczki limfoblastycznej limfoblastycznej limfocytów T danio pręgowanego za pomocą barwienia proliferacji komórek

Poznaj metodę łączącą elektroforezę 2DE i spektrometrię mas MS do identyfikacji różnicowo ekspresowanych białek w komórkach leukemicznych. Technika ta pozwala odkrywać markery prognostyczne i cele terapeutyczne w przewlekłej białaczce limfocytowej.

Od plamki 2DE-Gel do funkcji białka: lekcja wyciągnięta z HS1 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Przeglądaj więcej filmów