Zadanie zmiany zestawu uwagi: miara elastyczności poznawczej u myszy
4 lutego 2015
Celem tego protokołu jest przeprowadzenie testu behawioralnego, takiego jak zadanie zmiany nastawienia uwagi (AST), aby ocenić elastyczność poznawczą za pośrednictwem kory przedczołowej u myszy.
Ogólnym celem tej procedury jest pomiar elastyczności poznawczej za pośrednictwem kory przedczołowej w modelu mysim. Osiąga się to, ucząc najpierw myszy testowej, jak kopać mały garnek, aby odzyskać nagrodę w postaci jedzenia w drugim kroku. Nagroda w postaci zakopanego jedzenia jest powiązana z określoną kolejką kontekstową, dzięki czemu mysz może poprawnie zlokalizować i odzyskać nagrodę w ośmiu kolejnych próbach bez błędów.
Następnie, poprzez serię zmian w parowaniu nagród w kolejce w odpowiednim wymiarze. Mysz uczy się zwracać uwagę na odpowiedni wymiar kolejki, ignorując nieistotny wymiar, aby zlokalizować i odzyskać nagrodę. W ostatnim kroku parowanie nagród w kolejce jest zamieniane tak, aby wcześniej nieistotny wymiar był teraz istotny, aby ułatwić pomyślne zlokalizowanie i odzyskanie nagrody.
Ostatecznie wzrost średniej liczby prób prowadzących do osiągnięcia kryterium między grupami eksperymentalnymi na etapach odwrócenia jest interpretowany jako brak elastyczności poznawczej. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w podstawową neurobiologię funkcji poznawczych, w których pośredniczy kora przedczołowa, może być również stosowana do wielu innych systemów modelowych, takich jak modele chorób transgenicznych lub przewlekłych, z korzyścią dla doskonałej trafności translacyjnej. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ myszy nie zostały odpowiednio przyzwyczajone lub przeszkolone przed rozpoczęciem testów.
Procedurę zademonstruje Jillian Heisler, świeżo upieczona doktorantka z mojego laboratorium, w asyście Lainey Ritas i Juana Moralesa, asystentów badawczych w laboratorium przed rozpoczęciem. Ograniczenie jedzenia obchodzi się z każdą myszą od dwóch do trzech minut dziennie przez osiem dni, aby zmniejszyć stres związany z obsługą podczas testów. Jeśli wielu eksperymentatorów ma być zaangażowanych w testowanie zestawu myszy, upewnij się, że każdy eksperymentator uczestniczy w procesie obsługi.
Zważyć i zapisać masę ciała każdego zwierzęcia w każdym dniu obchodzenia się z nim. Następnie, począwszy od czterech dni przed rozpoczęciem aklimatyzacji, umieść dwie kokilki z przodu każdej klatki domowej, aby umożliwić myszom zaaklimatyzowanie się w doniczkach testowych. Dodaj dwa gramy jedzenia i jedną nagrodę w postaci jedzenia w kokilkach każdego dnia przez cztery dni, aby utrzymać myszy na poziomie 80 do 85% ich masy ciała podczas swobodnego karmienia.
Następnie, w dniu poprzedzającym procedurę aklimatyzacyjną, zmień legowisko w klatce domowej na dwa dni przed rozpoczęciem treningu i podczas cyklu ciemności w czerwonym świetle, rozprowadź niewielką ilość brudnej ściółki z klatki domowej po całej komorze, aby wprowadzić znajomy zapach i zmniejszyć stres związany z przebywaniem w nowym środowisku. Umieść czystą kokilkę z wodą w poczekalni komory i dwie kokilki, które zostały użyte do ograniczenia żywności w obszarze testowym, z około 20 miligramami nagrody w postaci żywności w każdym pojemniku. Następnie przenieś mysz do poczekalni i zdejmij bramkę startową.
Pozwól myszy eksplorować komnatę przez godzinę. Ciągłe dodawanie kawałków zbóż do pustych kokilek, aby zachęcić myszy do częstego eksplorowania obszaru testowego i doniczek. Zadbaj o to, aby mysz widziała eksperymentatora również przez cały okres aklimatyzacji, aby obecność eksperymentatora nie była dodatkowym stresorem.
Podczas testowania. Rozpocznij trening w dniu 15 od umieszczenia myszy w poczekalni. Następnie umieść puste kokilki, z których każda zawiera nagrodę w postaci jedzenia, w obszarze testowym i podnieś bramkę startową.
Poczekaj trzy minuty na pobranie obu nagród w postaci jedzenia po kilkukrotnym powtórzeniu tego pobierania nagrody w postaci jedzenia. Stopniowo dodawaj czystą ściółkę z klatki do doniczek w każdej kolejnej próbie. Kontynuując, pozwól myszy na trzy minuty na pobranie nagrody w postaci jedzenia z każdego garnka przed zakończeniem próby.
Gdy mysz pobierze nagrodę w postaci jedzenia z każdego garnka, przejdź do następnej próby. Jeśli mysz nie podejmuje prób kopania, po częściowym pokryciu nagrody w postaci jedzenia można ją zapewnić. Kontynuuj dodawanie ściółki po każdej próbie, aż nagroda w postaci jedzenia zostanie całkowicie pokryta, a mysz niezawodnie zademonstruje zdolność do kopania w pełnym garnku.
Aby znaleźć nagrodę w postaci jedzenia w czasie obchodzenia się z nią w dniu testu, daj każdej myszy po jednej nagrodzie w postaci jedzenia, aby uniknąć braku koncentracji podczas testu z powodu głodu. Na etapie dyskryminacji symboli występuje tylko jeden wymiar Q. Przykładem jest tutaj podłoże do kopania, całkowicie przykryj nagrodę żywnościową pożywką i posyp wszystkie doniczki pyłem zbożowym.
Należy pamiętać, że gdy zapach jest odpowiednim wymiarem Q, podłożem do kopania w obu doniczkach jest ściółka z trocin. Następnie umieść mysz w poczekalni przy zamkniętej bramce startowej i doniczkach po obu stronach komory testowej. Teraz zdejmij bramkę i uruchom timer, aby rozpocząć testowanie.
Pozostawienie myszy trzech minut na próbę na dokonanie wyboru, zarejestruj, czy podjęto poprawną, czy nieprawidłową próbę kopania lub dokonano wyboru, oraz czas, w którym mysz dokonała wyboru dla każdej próby. Jeśli mysz nie dokonała wyboru w ciągu trzech minut, zapisz ten wybór jako nieprawidłowy. Po dokonaniu wyboru dla dowolnej doniczki wyjmij doniczkę, która nie została wybrana, z komory testowej.
Jeśli właściwy wybór zostanie wyczuwalny, w tym przykładzie pozwól myszy dokończyć nagrodę w postaci jedzenia. Jeśli nieprawidłowy wybór zostanie wykonany na papierze, w tym przykładzie pozwól myszy zbadać garnek, aby pokazać, że za ten wybór nie ma nagrody w postaci jedzenia. Niezależnie od wyboru.
Pod koniec każdej próby umieść mysz z powrotem w poczekalni i wymień bramkę startową. Następnie, w kolejnych próbach, używając sparowanych pożywek i zmysłów, jak pokazano w tabeli, użyj kleszczy, aby umieścić kawałek nagrody w postaci jedzenia w doniczce, która wskazuje na prawidłowy wybór, zgodnie z tą samą procedurą, jak właśnie pokazano. Należy pamiętać, że należy wysłać POTS z dużym wyprzedzeniem, aby silny początkowy zapach mógł się rozproszyć przed testowaniem. Testowanie.
Na tym wykresie przedstawiono średnią liczbę prób spełniających kryterium na każdym etapie u nieleczonych C 57 czarnych sześciu myszy J. Za pomocą zadania zmiany zestawu uwagi lub pokazane jest ST. Różnice na etapie zwykłej dyskryminacji znajdują odzwierciedlenie w zwiększonej liczbie prób mających na celu spełnienie kryterium, w przypadku gdy zapach jest istotną kolejką.
Jak pokazano tutaj, normalizacja danych dotyczących wydajności zmniejsza zmienność związaną z uczeniem się początkowo istotnej kolejki i poprawia wizualizację poprawy wydajności na kolejnych etapach przesunięcia międzywymiarowego. Znaczny wzrost liczby prób wymaganych do spełnienia kryterium podczas przesunięcia pozawymiarowego w stosunku do poprzedniego przesunięcia międzywymiarowego jest ważną miarą kontrolną ważności badania. Przed etapem przesunięcia międzywymiarowego myszy nauczyły się zwracać uwagę na jeden istotny wymiar Q, aby zlokalizować nagrodę.
Co ciekawe, analiza przesunięć wewnątrz- i pozawymiarowych w surowych danych ujawnia znaczny wzrost liczby prób wymaganych do osiągnięcia kryterium między drugim przesunięciem wewnątrz- i pozawymiarowym. Co więcej, widoczne było znaczące przesunięcie wewnątrzwymiarowe zarówno między drugim, jak i trzecim przesunięciem międzywymiarowym w porównaniu z przesunięciem pozawymiarowym, gdy dane zostały znormalizowane do wydajności na etapie prostej dyskryminacji Po opanowaniu, technika ta może zostać ukończona w mniej niż trzy tygodnie na mysz testową, przy czym każdy badacz testuje do dwóch myszy jednocześnie, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zminimalizowaniu zakłóceń środowiskowych, takich jak ruch pieszy, wnętrze w pobliżu obszaru testowego, rozpraszające zapachy, takie jak silne perfumy lub zmiany klatki podczas faz treningu i testów.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać zadanie zmiany zestawu uwagi u myszy przy użyciu łatwo dostępnych materiałów i zwykłych materiałów laboratoryjnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje test behawioralny, a konkretnie zadanie przesunięcia zestawu uwagi (AST), służące do oceny elastyczności poznawczej mediowanej przez korę przedczołową u myszy. Procedura polega na trenowaniu myszy w kojarzeniu nagrody pokarmowej z określonymi wskazówkami kontekstowymi, a następnie zmianie tych wskazówek w celu oceny ich zdolności adaptacyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Testy behawioralne
- Elastyczność poznawcza
Wstęp
- Kora przedczołowa ma kluczowe znaczenie dla elastyczności poznawczej.
- Testy behawioralne pomagają w zrozumieniu mechanizmów neuronalnych.
- Zadania z przesunięciem zestawu uwagi są powszechnie stosowane w modelach zwierzęcych.
- Umiejętność adaptacji do zmieniających się wskazówek jest niezbędna do przetrwania.
Cel badania
- Pomiar elastyczności poznawczej u myszy.
- Ocena roli kory przedczołowej w adaptacji behawioralnej.
- Dostarczenie informacji na temat procesów poznawczych istotnych dla neuronauki.
Zastosowane metody
- Trenowanie myszy w kopaniu w celu uzyskania nagrody pokarmowej.
- Ustalanie wskazówek kontekstowych powiązanych z nagrodą.
- Zmiana parowań nagród w celu przetestowania uwagi skupionej na istotnych wymiarach.
- Ocena wyników w wielu próbach.
Główne wyniki
- Myszy z powodzeniem nauczyły się lokalizować nagrody na podstawie wskazówek kontekstowych.
- Wyniki poprawiały się w kolejnych próbach, co wskazuje na proces uczenia się.
- Elastyczność behawioralna została wykazana poprzez zmianę wskazówek.
- Wyniki podkreślają znaczenie kory przedczołowej w zadaniach poznawczych.
Wnioski
- Test AST skutecznie mierzy elastyczność poznawczą u myszy.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia funkcji kory przedczołowej.
- Model ten może być wykorzystany w dalszych badaniach z zakresu neuronauki poznawczej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zadanie przesunięcia zestawu uwagi (AST) zapewnia translacyjnie poprawny behawioralny odczyt elastyczności poznawczej zapośredniczonej przez korę przedczołową u myszy, co umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku kandydatów na leki neuropsychiatryczne. Poprzez kwantyfikację nieelastyczności poznawczej w postaci zwiększonej liczby prób do osiągnięcia kryterium podczas etapów odwrócenia, test ten wspiera walidację celów terapeutycznych i zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkrywania leków. Jego konserwatywność międzygatunkowa zwiększa ciągłość translacyjną od modeli gryzoni do patofizjologii człowieka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar elastyczności poznawczej zależnej od kory przedczołowej jako funkcjonalnego wskaźnika zaangażowania celu.
- Wartość operacyjna: Umożliwia biologiczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów zaangażowanych w deficyty poznawcze w modelach depresji, PTSD, schizofrenii oraz zaburzeń spektrum autyzmu.
- Wartość prognostyczna: Wspomaga selekcję portfolio poprzez identyfikację związków odwracających nieelastyczność poznawczą, zwiększając tym samym pewność co do możliwości translacji klinicznej.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Generuje ilościowe pomiary zmiennych zależnych (liczba prób do osiągnięcia kryterium), które umożliwiają zestandaryzowany i powtarzalny screening bibliotek związków.
- Gotowość do screeningu: Dostarcza zwalidowane systemy biologiczne (przeszkolone myszy) gotowe do dalszej oceny interwencji farmakologicznych w zakresie elastyczności poznawczej.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Wspiera skalowalną implementację w modelach transgenicznych, modelach chorób przewlekłych oraz modelach farmakologicznych przy minimalnych różnicach proceduralnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Zgodność z dysfunkcją kory przedczołowej obserwowaną w zaburzeniach neuropsychiatrycznych i neurorozwojowych, co zwiększa trafność zewnętrzną oraz konstrukcyjną.
- Ciągłość translacyjna: Łączy fazę odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez pomiar elastyczności poznawczej jako zachowanego punktu końcowego badania zachowania.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspomaga podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wykrywanie nieelastyczności poznawczej jako biomarkera skuteczności zapośredniczonej przez cel terapeutyczny.
Integracja potoku i przepływu pracy
Test AST wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od weryfikacji hipotez we wczesnej fazie badań po identyfikację związków wiodących i przedkliniczne badania skuteczności, w szczególności w odniesieniu do punktów końcowych dotyczących funkcji poznawczych w wskazaniach neuropsychiatrycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez wyizolowanie roli kory przedczołowej w przełączaniu uwagi i elastyczności poznawczej.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość testów i wyniki ilościowe (liczba prób, wskaźniki błędów), które umożliwiają wiarygodną ocenę związków i mapowanie zależności struktura-aktywność.
- Analityka: Dostarcza wyników statystycznych (średnia liczba prób do osiągnięcia kryterium, wydajność specyficzna dla przełączania), które pomagają zespołom porównywać efekty leków w stosunku do kontroli nośnika lub kontroli genetycznych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez pomiar zachowanej domeny poznawczej, która jest upośledzona w ludzkich schorzeniach neuropsychiatrycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako wielokrotnie wykorzystywalna platforma behawioralna w wielu projektach ukierunkowanych na funkcje poznawcze zapośredniczone przez korę przedczołową.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w zakresie poznawczych efektów leków dzięki bezpośredniemu pomiarowi zachowań zależnych od kory przedczołowej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki stałym parametrom prób, progom kryterialnym i protokołom ślepej oceny.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje go/no-go poprzez wczesną identyfikację skuteczności poznawczej, co redukuje ryzyko niepowodzeń w późnych etapach rozwoju leków neuropsychiatrycznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków wykazujących odwrócenie nieelastyczności poznawczej w modelach istotnych dla danej choroby, z uwzględnieniem korekty o ryzyko.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w dziedzinie neuronauki behawioralnej gryzoni, w szczególności w zakresie habituacji, restrykcji pokarmowej oraz automatycznego lub manualnego scoringu zachowań kopania.
- Zależy od spójnej kontroli czynników środowiskowych (oświetlenie, zapach, ściółka) oraz higieny aparatury w celu zminimalizowania zmiennych zakłócających podczas testów.
- Wymaga standaryzacji procedur obchodzenia się ze zwierzętami, treningu i testowania pomiędzy zespołami, aby zapewnić odtwarzalność wyników w różnych ośrodkach lub przy różnych operatorach.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy przenoszeniu metody na różne szczepy myszy, grupy wiekowe lub modele chorobowe, co może wpływać na bazową motywację do kopania lub tempo uczenia się.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak trzytygodniowy harmonogram dla każdej myszy oraz podatność na zmienność wyników indukowaną stresem w przypadku niewystarczającej habituacji.
