Name: Namnażanie wirusa Homalodisca coagulata-01 za pośrednictwem hodowli komórkowej Homalodisca vitripennis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Poznaj metodę namnażania wirusa HoCV-1 w hodowli komórkowej Homalodisca vitripennis z ekstrakcją i ilościowym oznaczaniem RNA. Technika umożliwia badanie dynamiki replikacji wirusowej in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Texas Pierce's Disease Research and Education Program oraz USDA-APHIS za wsparcie finansowe dla tego projektu. Chcielibyśmy również podziękować Hema Kothari z University of Texas Health Science Center w Tyler za jej pomoc w mikroskopii konfokalnej.

1. Hodowla komórkowa
UWAGA: Linie komórkowe Homalodisca vitripennis założone przez laboratorium Dr. Wayne Hunter w USDA Agricultural Research Service (Ft. Pierce, FL USA) zostały użyte do zainicjowania laboratoryjnego zapasu składającego się z mieszanych etapów komórkowych, w tym początkowych fibroblastów i monowarstw.
<ol>
	<li>Następujące procedury należy wykonać w sterylnym środowisku laboratoryjnym utrzymywanym w zakresie temperatur 20-24 °C za pomocą kolb hodowlanycho średnicy 25 cm2.</li>
	<li>Hodować i utrzymywać kultury w kolbach tkankowych o średnicy 25 cm2 przy użyciu pożywki H2G+ Leafhopper, zmodyfikowanej pożywki dla pszczół miodnychWH2 10 (Tabela 1).</li>
	<li>Inkubować kolby hodowlane w temperaturze 24 °C przy wilgotności ~53%.</li>
	<li>Użyj odwróconego mikroskopu o całkowitym powiększeniu (TM) 100X, aby monitorować wzrost hodowli, np. sprawdzić, czy nie ma nieprawidłowego wzrostu komórek, monitorować pod kątem potencjalnych zanieczyszczeń i sprawdzać postęp wzrostu na całej powierzchni hodowli.</li>
	<li>Przeprowadzić pełną zmianę pożywki (~4 ml pożywki na kolbę) co 7 - 10 dni bez naruszania powierzchni hodowli.</li>
	<li>Przekaż kultury, gdy powierzchnia hodowli jest w około 80% pokryta wzrostem komórek (zlewającym się) przy użyciu 0,25% trypsyny zawierającej kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) w celu dysocjacji komórek. Dodaj ~ 2 - 3 ml trypsyny do każdej kolby hodowlanej i wystawiaj kulturę (kultury) na działanie enzymu przez krótki czas (5 - 10 minut), aby uzyskać całkowitą dysocjację komórek.</li>
	<li>Dodać równą ilość świeżej pożywki do kolby(-i) hodowlanej(-ych) (~2 - 3 ml) w celu zatrzymania aktywności enzymu i przenieść cały roztwór do stożkowej probówki w celu odwirowania.</li>
	<li>Komórki osadu przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przez 6 minut przy 350 x g.</li>
	<li>Usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego i dodać ~8 ml świeżej pożywki do każdej probówki. Delikatnie homogenizuj komórki za pomocą pipety.</li>
	<li>Podzielić kultury w stosunku 1:2 na kolby o średnicy 25 cm(~ 4 ml roztworu komórkowego na kolbę) i pozostawić świeżo przekazane kultury w spokoju przez 48 godzin, aby umożliwić komórkom w zawiesinie bezpieczne przyczepienie się do powierzchni kolby. 
	UWAGA: Hodowla komórek na 48-dołkowych sterylnych płytkach do hodowli tkankowych o powierzchni wzrostu 1cm2 jest również możliwa i może być utrzymywana w taki sam sposób jak kolby hodowlane ze zmniejszeniem objętości pożywki hodowlanej do ~250 μl.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja całego wirusa
<ol>
	<li>Homogenizować całe ciała wiruso-dodatniego H. vitripennis w buforze fosforanowym o pH ~ 7,2 z 0,02% trójwodzianu dietyloditiokarbaminianu sodu (DETCA) poprzez wirowanie przez ~ 10 sekund przerwy, aż nie będzie już obecnych dużych grudek tkanki. Ekstrakcja wirusa przez szybkie wirowanie w temperaturze 124 500 x g przez 4 godziny w temperaturze 4 °C lub 22 000 x g przez 16 godzin w temperaturze 4 °C. Jeśli na górze utworzy się osad, usuń go sterylnym wacikiem11.</li>
	<li>Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zebrać osad i rozpuścić w 5 ml 10 mM buforu fosforanowego (bez DETCA), pH ~7,2, zawierającego 0,4% kwasu Na-deoksycholowego i 4% eteru sześciorakadecylowego glikolu polietylenowego (Brij 52).
	<ol>
		<li>Aby dobrze wymieszać osad, usuń osad z boku rurki i w razie potrzeby zmiażdż go aż do roztworu.</li>
		<li>Dodaj więcej 10 mM buforu fosforanowego w odstępach co ~ 5 ml, aby w razie potrzeby pomóc osadkowi przejść do roztworu i połączyć w 2 probówki11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować roztwór o stężeniu 300 x g przez 15 minut11.</li>
	<li>Usunąć supernatant i przepuścić roztwór przez filtr 0,45 μm, a następnie zebrać filtrat do dużej probówkizbiorczej 11.</li>
	<li>W razie potrzeby przenieść filtrat do membrany dializacyjnej o odciętej masie cząsteczkowej (MWCO) 3,5 kD, używając niewielkich ilości 10 mM buforu fosforanowego (pH 7) niezawierającego DETCA11.</li>
	<li>Umieścić membranę dializacyjną w dużej zlewce wypełnionejddH2O w temperaturze 4 °C. Zmieniać ddH2O co godzinę przez 5-6 godzin, aż w membranieutworzy się biały osad 11.</li>
	<li>Zebrać oczyszczonego wirusa z wnętrza membrany i poddać 100% roztwór wirusa serii 10-krotnego rozcieńczenia, dodając 10 μl roztworu do 90 μl ddH2O. Następnie dodać 10 μl rozcieńczenia do kolejnych 90 μl ddH2O, aż do uzyskania rozcieńczenia 1:100 000.</li>
	<li>Roztwór wirusa należy przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Replikacja wirusa
<ol>
	<li>Komórki nasienne w 48-dołkowych płytkach hodowlanych i rosną we wszystkich rzędach, aż wzrost komórek będzie zlewał się w 80% (około 72 godziny po przejściu, jeśli komórki rosną w średnim tempie).</li>
	<li>Zaszczepić każdy rząd komórek seryjnie rozcieńczonym wirusem, gdy wzrost komórek osiągnie zbieg, tj. jeden rząd rozcieńczenia 1:10, jeden rząd rozcieńczenia 1:100 itd., z wyjątkiem górnego rzędu. Użyj górnego rzędu jako kontrolki i dodaj 10 μl ddH2O do każdej studzienki jako regulatora głośności.
	<ol>
		<li>W celu ustalenia początkowego stężenia komórek w celu porównania z eksperymentalną liczbą komórek, należy przeprowadzić dysocjację i policzyć pierwszą studzienkę z każdego rzędu przed początkowym zaszczepieniem wirusem jakichkolwiek studzienek w kulturach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monitorować płytki hodowlane co 24 godziny po inokulacji wirusa pod kątem wszelkich zmian koloru pożywki wskazujących na zmianę pH oraz wszelkich zmian w morfologii komórek.</li>
	<li>Wyobraź sobie jedną kolumnę płytki testowej w każdym punkcie czasowym za pomocą mikroskopu odwróconego przy 100X TM.</li>
	<li>Usunąć całe podłoże z kolumny, która została zobrazowana w każdym 24-godzinnym punkcie czasowym i przechowywać je krótkotrwale w temperaturze -20 °C w celu ekstrakcji RNA i kwantyfikacji wirusa lub długotrwale w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Oddziel komórki od studzienek po usunięciu pożywki, jak opisano wcześniej w krokach 1.6 – 1.9, używając tylko ~250 μl 0.25% trypsyny EDTA i świeżej pożywki do zatrzymania aktywności enzymu oraz ~250 μl świeżej pożywki do ponownego zawieszenia osadu komórkowego.</li>
	<li>Dodaj 10 μl 0,4% barwienia błękitem trypanowym do każdej probówki zawierającej komórki, aby przeprowadzić liczenie komórek po dysocjacji komórek przez każdy 24-godzinny okres przez jeden tydzień. Pozostaw plamę na 10 minut przed wykonaniem liczenia komórek.
	<ol>
		<li>Przeprowadź liczenie komórek w ciągu 1 godziny od wystawienia na działanie barwnika, w przeciwnym razie żywe komórki zaczną wchłaniać barwnik, a także komórki nieżywotne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powoli dodawać 10 μl barwionego roztworu komórek z każdej strony standardowego hemocytometru za pomocą mikropipety. Pozwolić, aby roztwór został wchłonięty przez działanie kapilarne, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Policz liczbę żywotnych (niebarwionych) komórek po obu stronach hemocytometru (odpowiednik 4 zliczeń z 16 kwadratów hemocytometru). Wykonaj inwentaryzację komórek dla każdego dołka kolumny, która została usunięta.</li>
	<li>Uśrednij liczbę komórek z każdej kolumny i użyj następującego wzoru, aby uzyskać całkowitą liczbę komórek: (średnia liczba komórek / 4) x współczynnik rozcieńczenia = liczba komórek x 104 ml. Jest to gęstość komórek lub liczba żywotnych komórek w hodowli.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja wirusa z hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Usunąć leczone komórki H. vitripennis z kolb hodowlanych, jak opisano wcześniej w krokach 1.6 – 1.8, używając tylko ~250 μl 0,25% trypsyny EDTA i świeżej pożywki, aby zatrzymać aktywność enzymu.</li>
	<li>Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ekstrahować wirusa z komórek hodowlanych zgodnie z protokołem opisanym wcześniej w krokach 2.3 – 2.8.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja RNA
<ol>
	<li>Ekstrahować RNA z pożywki próbek pobranych podczas każdej tygodniowej próby z użyciem tiocyjanianu guanidyny, ekstrakcji fenolem i chloroformem guanidyny, przeznaczonej do próbek ciekłych zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Wyekstrahowane próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
6. RT-PCR
<ol>
	<li>Ustal standardy wirusowe dla RT-PCR, przeprowadzając tradycyjną PCR przy użyciu pary starterów HoCV RT-PCR starter 1 (naprzód 5′-GCTCCCCGGCTGCTGCTGGTT-3′, odwrotny 5′-ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3′) z izolatem wirusa z całego ciała H. vitripennis.</li>
	<li>Poddaj produkt PCR elektroforezie żelowej przez 60 minut przy napięciu 120 V w 2% żelu agarozowym zawierającym 0,1% bromku etydyny.</li>
	<li>Usuń pasma z żelu i oczyść za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Zebrać wszystkie wycięte i oczyszczone w żelu produkty i dalej oczyścić przez podstawowe wytrącanie etanolu. Eluować produkt wytrącania w około 30 μl Tris EDTA (TE) w celu zwiększenia całkowitego stężenia próbki.</li>
	<li>Określ ilościowo poziom cDNA w próbkach zbiorczych za pomocą spektrofotometrii przy użyciu ustawień długości fali 260/230 do wykrywania kwasów nukleinowych.</li>
	<li>Wykonać dziesięciokrotną serię seryjnych rozcieńczeń oczyszczonej próbki w zakresie od 57 ng/μl do 57 ag/μl (10-18). Przeprowadzić rozcieńczanie seryjne podobne do opisanego w ppkt 2.8 z dostosowaniem do różnicy w wymaganiach dotyczących stężenia.</li>
	<li>Określić granice wykrywalności serii rozcieńczeń, wykonując qRT-PCR przy użyciu zestawu qRT-PCR z wiarygodnym oznaczaniem ilościowym transkryptów o niskiej liczebności. 
	UWAGA: Stężenia wirusa niższe niż 5 x 10-3 kopie nie są wykrywalne.</li>
	<li>Wyodrębnić RNA z próbek eksperymentalnych, jak opisano wcześniej w kroku 5.1, i określić ilościowo za pomocą spektrofotometrii.</li>
	<li>Znormalizować wszystkie wyekstrahowane próbki do 5 ng/μl za pomocą wody wolnej od nukleaz.</li>
	<li>Przeprowadzić qRT-PCR na wszystkich próbkach, w duplikatach, jako reakcje 25 μl przy użyciu jednoetapowego zestawu qRT-PCR z możliwością wykrywania niskiej liczby kopii w następujący sposób: 50 °C utrzymać przez 10 minut; 95 °C utrzymać przez 5 minut; 30 cykli po 95 °C przez 10 sekund, 60 °C przez 30 sekund; stopić w temperaturze od 50 do 99 °C przez 5 sekund na każdym etapie.
	<ol>
		<li>Przygotować mieszankę wzorcową tak, aby każda mieszanina reakcyjna zawierała 12,5 μl 1x mieszanki wzorcowej, 1,0 μl (0,3 μM) startera wstępnego, 1,0 μl (0,3 μM) startera odwrotnego, 0,25 μl odwrotnej transkryptazy i zmienne ilości matrycy w oparciu o wartości standaryzacji.</li>
		<li>Doprowadzić całkowitą objętość reakcji do 25 μl za pomocą wody wolnej od RNazy.</li>
		<li>Włączyć pięć standardowych stężeń do każdej serii PCR z następującymi numerami kopii: 5 x 10-10, 5 x 10-8, 5 x 10-6, 5 x 10-4 i 5 x 10-2 kopii. Ustaw próg dla każdego przebiegu na nieco poniżej fluorescencji 10x-2,5, aby zredukować szum podczas wczesnej akwizycji na początku każdego przebiegu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Mikroskopia konfokalna
<ol>
	<li>Hodować komórki Homalodisca vitripennis na dwunastodołkowej płytce zawierającej szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm w każdym dołku.</li>
	<li>Zaszczepiać jedną kolumnę na płytce co 24 godziny przez okres czterech dni, po uzyskaniu monowarstwy. Upewnij się, że każda kolumna zawiera studzienkę kontrolną, studzienkę o niskim rozcieńczeniu wirusa (1:10) i studzienkę o wysokim rozcieńczeniu wirusa (1:100 000). Użyj rozwiązań antywirusowych uzyskanych w kroku 2.8.</li>
	<li>Usuń wszystkie podłoża piątego dnia i przemyj komórki dwukrotnie 1x PBS (pH 7,4).</li>
	<li>Utrwalić komórki zimnym 4% paraformaldehydem w temperaturze 4 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Dodaj 500 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do komórek i myj je przez 10 minut w temperaturze pokojowej na kołysku z niską prędkością. Umyj komórki trzy razy.</li>
	<li>Dodaj 500 μl 0,1% Triton X-100 do komórek, aby je przepuszczalne. Pozostaw na 10 minut w RT.</li>
	<li>Ponownie umyj komórki, jak opisano wcześniej w kroku 7.5.</li>
	<li>Dodać 500 μl 5% roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA), aby zablokować komórki w temperaturze pokojowej. Odstawić na 2 godziny, a następnie wyjąć.</li>
	<li>Rozcieńczyć falloidynę sprzężoną z czerwienią rodaminą (RCP) w stosunku 1:250 w 1x PBS zawierającym 5% BSA i dodać 250 μl rozcieńczenia do każdego dołka w celu wybarwienia F-aktyny.</li>
	<li>Przykryj płytkę folią aluminiową, aby zapobiec bieleniu barwnika i inkubować komórki w temperaturze 4 °C O/N.</li>
	<li>Usunąć RCP po 12 godzinach inkubacji i zastąpić go 250 μl 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) (250 μg/ml) rozcieńczonego w 1x PBS zawierającym 5% BSA, w celu zabarwienia jąder komórek.</li>
	<li>Inkubować komórki zawierające DAPI w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Umyj komórki trzykrotnie 1x PBS, jak opisano wcześniej w kroku 7.5.</li>
	<li>Delikatnie wyjmij szkiełka nakrywkowe z dołków i zamontuj na szkiełkach mikroskopowych za pomocą nośnika montażowego z odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu.</li>
	<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w światłoszczelnych pudełkach, dopóki nie zostaną obejrzane pod mikroskopem konfokalnym. Przeglądaj przygotowane preparaty tak szybko, jak to możliwe, ponieważ barwniki mogą szybko blaknąć.</li>
	<li>Obrazowanie barwionych komórek za pomocą systemu konfokalnego wyposażonego w mikroskop zawierający soczewkę planapochromatyczną 63X (olej).
	<ol>
		<li>Ustaw długości fal lasera na 543 ± wzbudzenie 10 nm i emisję 575 ± 10 nm dla falloidyny sprzężonej z czerwienią Rhoadmine oraz 369 ± wzbudzenie 10 nm i emisję 450 ± 30 nm dla DAPI.</li>
		<li>Użyj identycznych ustawień wzmocnienia i przesunięcia dla detektora, aby uzyskać wszystkie obrazy.</li>
		<li>Przetwarzaj obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania i sortowania obrazów, a następnie importuj żądane obrazy do oprogramowania do zarządzania obrazami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+Homalodisca+and+of+H.+vitripennis+as+the+Name+for+Glassy-winged+Sharpshooter+%28Hemiptera%3A+Cicadellidae%3A+Cicadellinae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae).</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).</li>
<li>Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+capsid+protein+of+Homalodisca+coagulata+Virus-1%2C+a+new+leafhopper-infecting+virus+from+the+glassy-winged+sharpshooter%2C+Homalodisca+coagulata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata.</a> J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).</li>
<li>Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+and+molecular+characterization+of+Homalodisca+coagulata+virus-1%2C+a+novel+virus+discovered+in+the+glassy-winged+sharpshooter+%28Hemiptera%3A+Cicadellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae).</a> Virology. 350 (1), 67-78 (2006).</li>
<li>Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+natural+host+range+of+Homalodisca+coagulata+virus-1+%28HoCV-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1).</a> Virology. 153, 61-67 (2008).</li>
<li>Jones, W. A., Setamou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+Biometry+of+Sharpshooter+Homalodisca+coagulata+%28Homoptera%29+Cicadellidae%29+Reared+on+Cowpea%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea.</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).</li>
<li>Turner, W. F., Pollard, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+histories+and+behavior+of+five+insect+vectors+of+phony+peach+disease%5BTitle%5D)+AND+%22US+Dep.+Agric.+Tech.+Bull%22%5BJournal%5D)">Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease.</a> US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).</li>
<li>Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+primary+nutrients+by+the+polyphagous+xylophage%2C+Homalodisca+coagulata%2C+reared+on+single+host+species%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).</li>
<li>Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+total+dietary+nitrogen+and+nitrogen+form+on+the+development+of+xylophagous+leafhoppers%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).</li>
<li>Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Cell+Lines+Developed+from+the+Glassy-winged+Sharpshooter%2C+Homalodisca+coagulata+%28Hemiptera%3A+Cicadellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cell+Dev.-An%22%5BJournal%5D)">Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae).</a> In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).</li>
<li>Hunter, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+for+development+of+bee+cell+cultures+%28Apis+mellifera%3A+Hymenoptera%3A+Apidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cell+Dev.-An%22%5BJournal%5D)">Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae).</a> In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).</li>
<li>Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. CA Pierce’s Disease Symposium, Sacramento, CA, , 9-12 (2009).</li>
<li>Rhoades, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Economics+of+baculovirus+%E2%80%93+insect+cell+production%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Economics of baculovirus – insect cell production.</a> Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).</li>
<li>Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+culture+time+and+passage+number+on+the+morphological+and+physiological+development+of+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Soc.+Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells.</a> P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).</li>
<li>Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+Rescues+the+Adverse+Effects+of+Telomere+Loss+and+Cooperates+with+Telomere+Dysfunction+to+Accelerate+Carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis.</a> Cell. 97 (4), 527-538 (1999).</li>
<li>Counter, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+shortening+associated+with+chromosome+instability+is+arrested+in+immortal+cells+which+express+telomerase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity.</a> Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).</li>
<li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+some+antibiotics+on+the+growth+of+human+diploid+skin+fibroblasts+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture.</a> In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).</li>
<li>Coriell, L. L. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoriell%2C+LL+%22Contamination+in+Tissue+Culture%22">Contamination in Tissue Culture</a>. Fogh, J. . , Academic Press. 29-49 (1973).</li>
<li>Hambor, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+Design+and+Bioprocess+Controls+for+Industrialized+Cell+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+Tech.+Bull%22%5BJournal%5D)">Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing.</a> Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).</li>
<li>Abbot, A., Cyranoski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology%E2%80%99s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biology’s new dimension.</a> Nature. 424, 870-872 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rosnące obawy związane z napływem inwazyjnych gatunków rolniczych doprowadziły do zwiększonego zapotrzebowania na nowe metodologie obrony przed pojawiającymi się szkodnikami i patogenami. Skupienie się na zapobieganiu chorobom i leczeniu ich obejmuje zarządzanie wektorami patogenów i było głównym celem tego badania. Ekonomia odgrywa kluczową rolę w podejmowaniu decyzji o produkcji tego rodzaju biopestycydów w celu zwalczania wektorów patogenów w rolnictwie, ponieważ praktyczne zastosowanie musi obejmować duże ilości na d...

Strzelec wyborowy o szklistych skrzydłach (Homalodisca vitripennis Germar 1821) został zidentyfikowany jako dominujący wektor Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), czynnika wywołującego chorobę winorośli Pierce'a (PD) w Ameryce Północnej1. Zarządzanie populacją owadów szybko stało się przedmiotem badań mających na celu zwalczanie tego niszczycielskiego problemu dla przemysłu winiarskiego w Kalifornii i w całych południowych Stanach Zjednoczonych. Jednoniciowy wirus RNA o pozytywnym sensie, należący do rodziny Dicistroviridae, wirus Homalodisca coagulata-01 (HoCV-01) został zidentyfikowany w dzikich populacjach H. vitripennis i wykazano, że zwiększa śmiertelność w tych populacjach2-4, jednocześnie obniżając odporność owadów na insektycydy.
Opracowanie metod skutecznego wychowania zakażonego H. vitripennis do dorosłości w warunkach laboratoryjnych było trudne, ponieważ H. vitripennis ma różne specyficzne dla danego etapu potrzeby żywieniowe, które wymagają różnych roślin żywicielskich5-8. Do hodowli żywego H. vitripennis w Stanach Zjednoczonych wymagane są specjalne obiekty; w związku z tym hodowla komórkowa jest bardziej ekonomiczną i realną alternatywą, a także coraz bardziej istotną dla wykrywania i replikacji HoCV-012,9. Chociaż opisano podstawowe metody zakładania kultur komórkowych H. vitripennis, metody te nie zostały jeszcze wykorzystane do komercyjnej produkcji środków kontroli biologicznej, takich jak wirusy2.
Ogólnym celem poniższych procedur jest wytworzenie wysokiego stężenia HoCV-01 odpowiedniego do wykorzystania jako środek kontroli biologicznej. Replikacja wirusa wymaga żywej komórki, dlatego skuteczna hodowla i optymalizacja kultur H. vitripennis ma kluczowe znaczenie dla postępu w produkcji opłacalnych poziomów wirusa.

<table><tbody><tr><td>Kolby do hodowli komórek Corning</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430168</td><td>Powierzchnia 25 cm2, nasadka skośna, nasadka (uszczelka korkowa)</td></tr><tr><td>Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td>Mikroskop odwrócony i kamera</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td>0,25%, sterylnie filtrowany, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych, 2,5 g trypsyny wieprzowej i 0,2 g EDTA i byka; 4Na na litr Hanks&prime; Zrównoważony roztwór soli z czerwienią fenolową</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR wielodołkowe płytki hodowlane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8937</td><td>48 dołków (TC traktowane pokrywką)</td></tr><tr><td>DETCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>228680</td><td>Dityloditiokarbaminian sodu trihydrat</td></tr><tr><td>System filtrów próżniowych butelkowych Corning</td><td>Sigma</td><td>Aldrich CLS431206</td><td>Membrana z octanu celulozy, wielkość porów 0,45 i mu; m, Powierzchnia membrany 54,5 cm2, Pojemność filtra 500 ml</td></tr><tr><td>Brij 52</td><td>Sigma Aldrich</td><td>388831</td><td>Eter sześciokątny glikolu polietylenowego</td></tr><tr><td>Roztwór buforowy fosforanu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td>Otrzymany w postaci 100 mM rozcieńczony do 10 mM sterylną wodą</td></tr><tr><td>TRIzol LS</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5304</td><td>Do elektroforeza</td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7637</td><td>BioReagent, do biologii molekularnej, proszek</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect qRT-PCR kit</td><td>Qiagen</td><td>204243</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Klasa odczynnika, krystaliczny</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fosforan Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td> buforowana sól fizjologiczna</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Falloidyna sprzężona z czerwoną rodaminą</td><td>Life Technologies</td><td>R415</td><td>Falloidyna rodaminy to sonda F-aktyny o wysokim powinowactwie sprzężona z czerwono-pomarańczowym barwnikiem fluorescencyjnym, tetrametylorodaminą</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antiblade Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 Meta Confocal System</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen 2007 Software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grace' s Pożywka dla owadów (uzupełniona, 1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8142</td><td>H2G+ skoczek do liści pożywka składnik</td></tr><tr><td>L-histydyna monohydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8125</td><td>H2G+ skoczek do liści średni składnik</td></tr><tr><td>Medium 199 (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4530</td><td>H2G+ skoczek średni składnik</td></tr><tr><td>Medium 1066 (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0422</td><td>H2G+ skoczek do liści średni składnik</td></tr><tr><td>Hank' s Sole zrównoważone (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51322C</td><td>H2G+ skoczek liściowy średni składnik</td></tr><tr><td>L-glutamina (100x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td>H2G+ skoczek</td></tr> liściowy <tr><td>średni składnik MEM, mieszanka aminokwasów (50x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56419C</td><td>H2G+ skoczek liściowy średni składnik</td></tr><tr><td>1 M roztwór MgCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>H2G+ skoczek liściowy średni składnik</td></tr><tr><td>Pen-Strep (w/ glutamina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6784</td><td>H2G+ skoczek liściowy średni składnik</td></tr><tr><td>Nystatyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6261</td><td>H2G+ skoczek liściowy średni składnik</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46305</td><td>H2G+ skoczek liściowy średni składnik</td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>H2G+ skoczek liściowy średni składnik</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>Skoczek do liści H2G+ średni składnik</td></tr></tbody></table>

namnażanie wirusa homalodisca coagulata-01 za pośrednictwem hodowli komórkowej homalodisca vitripennis

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Szklistoskrzydły strzelec wyborowy (Homalodisca vitripennis) to wysoce ruchliwy i polifagiczny owad występujący w południowo-zachodnich Stanach Zjednoczonych. Owady te są dominującymi wektorami Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), bakterii ograniczonej do ksylemu, która jest czynnikiem sprawczym choroby Pierce'a (PD) winorośli. Choroba Pierce'a jest szkodliwa ekonomicznie; w związku z tym H. vitripennis stał się celem strategii zarządzania patogenami. Dicystrowirus zidentyfikowany jako Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) jest związany ze zwiększoną śmiertelnością w populacjach H. vitripennis. Ponieważ do replikacji HoCV-01 wymagana jest komórka gospodarza, hodowla komórkowa zapewnia jednolite środowisko dla ukierunkowanej replikacji, które jest logistycznie i ekonomicznie cenne dla produkcji biopestycydów. W ramach tego badania opracowano system do namnażania komórek H. vitripennis na dużą skalę za pomocą hodowli tkankowej, zapewniając mechanizm replikacji wirusa. HoCV-01 został wyekstrahowany z owadów na całym ciele i wykorzystany do inokulacji hodowanych komórek H. vitripennis na różnych poziomach. Pożywkę hodowlaną usuwano co 24 godziny przez 168 godzin, RNA ekstrahowano i analizowano za pomocą qRT-PCR. Komórki barwiono błękitem trypanowym i policzono w celu ilościowego określenia przeżywalności komórek za pomocą mikroskopii świetlnej. Całe cząsteczki wirusa ekstrahowano do 96 godzin po zakażeniu, co było punktem czasowym określonym jako poprzedzający całkowite załamanie się hodowli komórkowej. Komórki poddano również barwieniu fluorescencyjnemu i obejrzano za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu zbadania aktywności wirusa na przyłączanie F-aktyny i integralność jąder. Wniosek z tego badania jest taki, że komórki H. vitripennis mogą być hodowane i wykorzystywane do masowej produkcji HoCV-01 na odpowiednim poziomie, aby umożliwić produkcję biopestycydu.

Przyczepienie i wzrost komórek obserwowano w ciągu 48 hr od pasażowania zarówno w małych, jak i dużych kolbach hodowlanych, zarówno w hodowlach pierwotnych, jak i w kolejnych pasażach. W tym samym przedziale czasowym zaobserwowano również wzrost i rozwój fibroblastów. W przypadku zakłócenia nowo zaszczepionych kolbach przed upływem 48 hr odnotowano widoczny spadek przyczepienia komórek, co prowadziło do wolniejszego wzrostu kultur, a niekiedy do całkowitego braku przyczepienia lub wzrostu. Komórki osiągały około 80% konf...

Tutaj prezentujemy protokół do rozmnażania komórek Homalodisca vitripennis i HoCV-1 in vitro. Pożywkę usunięto z kultur dodatnich w stosunku do HoCV-1 i ekstrahowano RNA co 24 godziny przez 168 godzin. Przeżywalność komórek określono ilościowo za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Całe cząsteczki wirusa zostały wyekstrahowane po zakażeniu. Wyekstrahowany RNA oznaczono ilościowo metodą qRT-PCR.

Namnażanie wirusa Homalodisca coagulata-01 za pośrednictwem hodowli komórkowej Homalodisca vitripennis

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ustalenie, czy wirus Homalodisca coagulata virus one lub HOCV-one może być replikowany z użyciem kultur komórkowych Homalodisca vitripennis, a następnie wyekstrahowany do dalszych zastosowań. Cel ten osiąga się poprzez skuteczną hodowlę H. vitripennis w celu wprowadzenia do niej oczyszczonego HOCV-one do replikacji. W drugim kroku medium i komórki zawierające wirusa są usuwane z hodowli, a następnie poddawane ekstrakcji wirusa i RNA.Następnie wyekstrahowany RNA z zainfekowanych kultur poddawano reakcji PCR w celu ustalenia, czy w komórkach obecny jest RNA wirusa. Wyniki pokazują, że HOCV one może replikować się in vivo, co potwierdzono na podstawie zliczeń żywych komórek przed i po infekcji oraz analizy qRT-PCR.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak hodowla zakażonych żywych owadów, jest to, że jest ona bardziej ekonomiczna i łatwiejsza w zarządzaniu przy minimalnym zapleczu i wyposażeniu. Zastosowanie tej metody może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologicznej kontroli szkodników. Na przykład, czy wirus owadzi lub wirus specyficzny dla konkretnego gatunku owada może zostać wykorzystany do zwalczania szkodnika na szeroką skalę?Chociaż metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat zwalczania tego konkretnego owada, można ją również zastosować w innych systemach, takich jak zwalczanie rudej mrówki ogniowej przy użyciu wirusa z tej samej rodziny co HOCV one. Przed rozpoczęciem tej procedury należy wyhodować i utrzymywać kultury w kolbach do hodowli tkanek o powierzchni 25 cm² z wykorzystaniem pożywki H2G plus dla skoczków, która jest zmodyfikowaną pożywką WH-two dla pszczół miodnych. Homogenizować całe ciała H. vitripennis dodatnich pod kątem obecności wirusa w buforze fosforanowym z 0,02% DETCA, mieszając w wstrząsarce w odstępach około dziesięciu sekund, aż do całkowitego usunięcia dużych grudek tkanki. Wyekstrahować wirusa za pomocą wirowania ultracentryfugą przy 22 000 g przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.Po odlaniu nadsączu należy zebrać osad i rozpuścić go w pięciu mililitrach 10 milimolarnego buforu fosforanowego zawierającego 0,4% kwasu deoksycholowego oraz 4% polietylenoglikolu heksadecylu eteru. Aby dokładnie wymieszać osad, należy oddzielić go od ścianek probówki i w razie potrzeby rozetrzeć. Następnie przeprowadza się wirowanie przy 300 g przez 15 minut. Po usunięciu nadsączu roztwór należy przepuścić przez filtr 0,45 mikrometra i zebrać filtrat do dużej probówki zbiorczej.Przenieś filtrat do membrany dializacyjnej o progu odcięcia masy cząsteczkowej 3,5 kilodaltona, w razie potrzeby używając niewielkich ilości 10 milimolarnego buforu fosforanowego niezawierającego DETCA. Umieść membranę dializacyjną w dużym zlewce wypełnionej podwójnie destylowaną wodą w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wymieniaj wodę co godzinę przez pięć do sześciu godzin, aż w membranie powstanie biały osad. W tym momencie zasiej komórki w 48-dołkowych płytkach hodowlanych.Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, zaszczep każdy rząd komórek wirusem w rozcieńczeniach seryjnych. Następnie dodaj 10 µL wody dwukrotnie destylowanej do każdej studzienki w celu kontroli objętości. Aby ustalić początkowe bazowe stężenie komórek do porównania z eksperymentalną liczbą komórek, zdysocjuj komórki z pierwszej studzienki każdego rzędu przed pierwszą inokulacją studzienek w kulturach wirusem. Następnie dokonaj zliczenia komórek.Następnie usuń całe medium z kolumny, która była obrazowana w każdym 24-godzinnym punkcie czasowym, i przechowuj je w temperaturze -20 °C w celu ekstrakcji RNA i kwantyfikacji wirusa. Po wyekstrahowaniu wirusa z hodowli komórkowych zgodnie z wcześniej opisanym protokołem, wyekstrahuj RNA z próbek medium pobranych podczas każdego tygodniowego badania wirusa, stosując ekstrakcję fenolowo-chloroformową z tiocyjanianem guanidynium przeznaczoną do próbek ciekłych, zgodnie z protokołem producenta. W celu przeprowadzenia RT PCR ustal standardy wirusowe, wykonując tradycyjny PCR z użyciem pary starterów HOCV RT PCR primer-one oraz izolatu wirusa z całego ciała H. vitripennisNastępnie wykonaj dziesięciokrotny szereg rozcieńczeń próbki oczyszczonej w zakresie od 57 nanogramów na mikrolitr do 57 attogramów na mikrolitr. Określ granice detekcji szeregu rozcieńczeń za pomocą qRT-PCR, wykorzystując zestaw do qRT-PCR umożliwiający wiarygodną kwantyfikację transkryptów o niskiej liczności.Po wyekstrahowaniu RNA z próbek doświadczalnych zgodnie z wcześniejszym opisem, należy określić jego ilość metodą spektrofotometrii. Następnie przeprowadzić qRT-PCR dla wszystkich próbek w dubletach w reakcjach o objętości 25 µL, wykorzystując zestaw do jednokrokowego qRT-PCR umożliwiający detekcję niskich liczb kopii, w następujący sposób. Przygotować mieszaninę Master Mix tak, aby każda mieszanina reakcyjna zawierała 12,5 µL 1x master mix, 1,0 µL 0,3 µM startera forward, 1,0 µL 0,3 µM startera reverse, 0,25 µL odwrotnej transkryptazy oraz zmienną ilość matrycy w zależności od wartości standaryzacji. Następnie dopełnić całkowitą objętość reakcji do 25 µL wodą wolną od RNaz. W każdym przebiegu PCR uwzględnić pięć stężeń wzorca: 5×10⁻¹⁰, 10, 5×10⁻⁸, 5×10⁻⁶, 5×10⁻⁴ oraz 5×10⁻² kopii. Ustawić próg dla każdego przebiegu tuż poniżej fluorescencji 10 × 10⁻².⁵, aby zredukować szum podczas wczesnego etapu akwizycji na początku każdego przebiegu.Po wyhodowaniu komórek Homalodisca vitripennis na płytce 12-dołkowej zawierającej szkiełka podstawowe, należy inokulować jedną kolumnę co 24 godziny przez cztery dni, po uzyskaniu monowarstwy, przy użyciu wyizolowanego wirusa. Po zakończeniu procesu utrwalić komórki zimną 4% paraformaldehydem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodać do komórek 500 µl 1X PBS i przemywać je przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z niską prędkością. Po trzykrotnym przemyciu komórek dodać 500 µl 0,1% TritonX-100 w celu permeabilizacji komórek przez 10 minut.Po przemyciu komórek 1X PBS, dodaj 500 µL 5% roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA), aby zablokować komórki w temperaturze pokojowej. Po dwóch godzinach usuń roztwór z komórek. Następnie do każdej studni dodaj 250 µL rozcieńczonego roztworu stockowego falloidyny sprzężonej z rodaminą czerwoną, aby wybarwić f-aktynę. Przykryj płytkę folią aluminiową, aby zapobiec blaknięciu barwnika, i inkubuj komórki w temperaturze 4 °C przez noc. Po inkubacji usuń roztwór rodaminy i zastąp go 250 µL DAPI rozcieńczonego w 1X PBS zawierającym 5% BSA, aby wybarwić jądra komórkowe. Po inkubacji komórek w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, przemyj je trzykrotnie 1X PBS w sposób opisany wcześniej.Na koniec ostrożnie wyjmij szkiełka nakrywkowe z dołków i zamocuj je na preparatach do mikroskopu, używając medium montażowego z odczynnikiem Antifade.Przywieranie komórek i rozwój fibroblastów obserwowano w ciągu 48 godzin od pasażu w małych i dużych kolbach hodowlanych. W przypadku zakłócenia nowo zasianych kolb odnotowano spadek przywierania komórek, co prowadziło do wolniejszego wzrostu kultur, a niekiedy do braku przywierania lub wzrostu.Komórki osiągnęły około 80% konfluencji w ciągu jednego tygodnia i utworzyły monowarstwę w ciągu 10 do 14 dni. Zainfekowane hodowle wykazywały oznaki utraty integralności kształtu komórek, a na powierzchniach komórek w 48 godzinach po infekcji pojawiły się struktury przypominające duże otwory. Komórki kurczyły się i odrywały od powierzchni hodowli około 72 do 96 godzin po zainfekowaniu nierozcieńczonym HOCV-one. Średnie liczby żywych komórek przedstawiono na wykresie, aby zobrazować różnice w liczebności żywych komórek w zależności od dawki wirusa w czasie. Grupy poddane działaniu wyższych dawek wirusa wykazują znacznie bardziej wyraźny spadek kondycji hodowli, z gwałtownym spadkiem liczby żywych komórek między 48 a 72 godziną. W grupach z niższymi dawkami wirusa spadek był powolny, aż do gwałtownego załamania około 144 godziny. Prawdopodobieństwo przeżycia komórek inokulowanych wyższymi dawkami wirusa było niższe, co potwierdziły krzywe Kaplana-梅yera, korelując z analizami średniej liczby żywych komórek. Choć wynik nie jest istotny statystycznie, dane sugerują, że komórki eksponowane na wirusa mają o 88% większą tendencję do wykazywania niższych wskaźników przeżywalności w czasie. Spadek liczby jąder oraz zniekształcona struktura f-aktyny w komórkach eksponowanych na HOCV-one wskazują na znaczący wpływ na hodowlę.Komórki zdrowe poddane działaniu wyższego ładunku wirusowego (do 10) wykazały większy stopień stresu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o terminowym realizowaniu każdego kroku protokołu, ponieważ niektóre z nich są zależne od czasu i temperatury. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak ELISA, aby odpowiedzieć na kluczowe pytania, na przykład: jaka ilość wirusa znajduje się w hodowli komórkowej po zaszczepieniu różnych ilości wirusa do tej hodowli? Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wykorzystać linię komórkową owadów do replikacji wirusa RNA, jak wydzielić ten wirus, a następnie go skwantyfikować za pomocą qRT-PCR.

propagation-homalodisca-coagulata-virus-01-via-homalodisca

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Rozprzestrzenianie się Homalodisca coagulata virus-01 przez Homalodisca vitripennis w hodowli komórkowej

W tym filmie wykorzystujemy adenowirus niosący gen rekombinazy Cre do zakażenia pierwotnych embrionalnych fibroblastów myszy posiadających floxowany allel Rac1.

Genetyczne usuwanie cząsteczek sygnałowych w hodowanych pierwotnych fibroblastach embrionalnych myszy za pomocą adenowirusów

Opisujemy metodę przetwarzania i przesiewania komarów zebranych w terenie pod kątem różnorodnych wirusów za pomocą testu z hodowlą komórek Vero. Stosując tę technikę, wykryliśmy 9 różnych wirusów z 4 rodzin taksonomicznych w komarach zebranych w Connecticut.

Wykrywanie wirusów zakaźnych z komarów zebranych w terenie za pomocą testu hodowli komórek Vero

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Propagation and Harvesting of Oncolytic Herpes Simplex Virus in Mammalian Cells

Source: Huang, D., et al. Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the step-by-step procedure for the in vitro isolation of mosquito-associated viruses from mosquito homogenates using fibroblast-like mammalian cells.

Isolation of Mosquito-Associated Virus from Mosquito Homogenate

Wirus krowianki (VV) jest szeroko stosowany w badaniach biomedycznych i poprawie zdrowia ludzkiego. W tym artykule opisano prostą, bardzo wydajną metodę edycji genomu VV przy użyciu systemu CRISPR-Cas9.

Proste i skuteczne podejście do konstruowania zmutowanych wektorów wirusa krowianki

Herpeswirus indyków (HVT) jest szeroko stosowany jako platforma wektorowa do generowania rekombinowanych szczepionek przeciwko wielu chorobom ptaków. W artykule opisano proste i szybkie podejście do wytwarzania rekombinowanych szczepionek wektorowych HVT przy użyciu zintegrowanego systemu NHEJ-CRISPR/Cas9 i Cre-Lox.

Generowanie rekombinowanych wektorów herpeswirusa ptasiego z edycją genów CRISPR/Cas9

Ten protokół opisuje, jak ustalić infekcję wirusową in vivo u Drosophila melanogaster przy użyciu metody nanoiniekcji i podstawowych technik analizy interakcji wirus-gospodarz.

Ustalenie infekcji wirusowej i analiza interakcji gospodarz-wirus u Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje eksperymentalny proces wytwarzania zakaźnych cząsteczek pseudotypowych wirusa o wysokim mianie (pp) z glikoproteinami otoczkowymi z dwóch szczepów grypy A i jak określić ich zakaźność. Protokół ten jest wysoce elastyczny do tworzenia pps dowolnego innego typu wirusów otoczkowych z różnymi glikoproteinami otoczki.

Produkcja zakaźnych cząstek pseudotypowanych grypy zakaźnej o wysokim mianie z glikoproteinami otoczkowymi z wysoce zjadliwych wirusów H5N1 i ptasich H7N9

Opisana tutaj jest skuteczna metoda wytwarzania zapasów wirusa zapalenia wątroby typu E (HEV) o wysokim mianie w celu skutecznego infekowania komórek wątroby. Dzięki przedstawionej metodzie można zbierać zarówno bezotoczkowe, jak i otoczkowe cząstki wirusa i wykorzystywać je do inokulacji różnych linii komórkowych.

Model hodowli komórkowej do produkcji zapasów wirusa zapalenia wątroby typu E o wysokim mianie

Liczne nowe sekwencje wirusopodobne zostały znalezione u komarów dzięki szerokiemu zastosowaniu technologii sekwencjonowania. Zapewniamy skuteczną procedurę izolacji i amplifikacji wirusów przy użyciu linii komórkowych kręgowców i komarów, która może posłużyć jako podstawa do przyszłych badań nad wirusami związanymi z komarami, w tym wirusami przenoszonymi przez komary i specyficznymi dla komarów.

Izolacja wirusa związanego z komarami od komarów zebranych na polu

Poznaj metodę namnażania wirusa HoCV-1 w hodowli komórkowej Homalodisca vitripennis z ekstrakcją i ilościowym oznaczaniem RNA. Technika umożliwia badanie dynamiki replikacji wirusowej in vitro.

Namnażanie wirusa Homalodisca coagulata-01 za pośrednictwem hodowli komórkowej Homalodisca vitripennis

Przeglądaj więcej filmów