Name: Metody leczenia ran skóry i oznaczania reakcji na rany u C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj metody ranienia C. elegans igłą mikroinjekcyjną i laserem oraz wizualizacji odpowiedzi nabłonka. Techniki te pozwalają badać sygnalizację wapniową i dynamikę aktyny w gojeniu ran skóry.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Metody ranienia igłami u C. elegans zostały po raz pierwszy opracowane przez Nathalie Pujol i Jonathana Ewbanka; dziękujemy Nathalie Pujol za komentarze do manuskryptu. Prace w naszym laboratorium nad naprawą ran naskórkowych C. elegans są wspierane przez grant NIH dla A.D.C. (R01 GM054657).

Poniższe protokoły opisują szczegółową procedurę leczenia ran skórnych C. elegans oraz oceny reakcji na rany.
1. Ranienie igły3,4
<ol>
	<li>Hoduj zdrowe, niewygłodzone robaki na standardowych płytkach NGM (pożywka do wzrostu nicieni) z bakteriami E. coli OP50 jako pokarmem, utrzymywane w inkubatorze o temperaturze 20 °C. 
	UWAGA: Metody dotyczące płytek agarowych NGM i rutynowej uprawy C. elegans można znaleźć na www.wormbook.org6.</li>
	<li>Zebrać 25 robaków etapowych L4 na świeżo wysianą płytkę na 1 dzień przed zranieniem i wyhodować w temperaturze 20 °C O/N.</li>
	<li>Przed zranieniem wyciągnąć igły z naczyń włosowatych za pomocą ściągacza do igieł. Igły używane do ranienia są identyczne z tymi używanymi do mikroiniekcji C. elegans.</li>
	<li>Upewnij się, że wszystkie robaki są w fazie młodego dorosłego. Umieść talerz robaków na lodzie na około 30 minut. Chłodzenie powoduje, że zwierzęta są ospałe, co ułatwia zranienie igłą. 
	UWAGA: W ciągu 5 minut od usunięcia z lodu robaki zaczną się normalnie poruszać. Możliwe jest, ale trudne, aby zranić poruszające się robaki. Z doświadczeniem 5 minut to wystarczająco dużo czasu, aby zranić 25 robaków. Unieruchomić za pomocą leków, takich jak lewamizol (stosowany w ranieniu laserowym, patrz poniżej), chociaż zwierzęta będą potrzebowały więcej czasu, aby dojść do siebie.</li>
	<li>Wyjmij płytkę agarową z lodu do preparacyjnego mikroskopu stereoskopowego. Za pomocą kilofa do robaków przenieś 25 robaków na środek płytki agarowej.</li>
	<li>Umieść igłę w końcówce pipety o pojemności 100 μl, aby łatwiej trzymać igłę. Nakłuć igłą przednią lub tylną część ciała robaka, unikając gonady. Ogólnie rzecz biorąc, spróbuj zranić się między tylną gardłem a przednią gonadą lub między tylną gonadą a odbytnicą. Używaj igieł wiele razy, aż pękną. 
	UWAGA: Upewnij się, że rany są krótkimi, delikatnymi nakłuciami, które nakłuwają naskórek i skórę, wnikając ~5-10 μm w głąb zwierzęcia. Igła powinna wejść w zwierzę mniej więcej pod kątem prostym do skóry. Rany nie powinny powodować widocznych uszkodzeń narządów wewnętrznych ani natychmiastowego pęknięcia ciała. Obserwuj niewielką ilość cytoplazmy sączącą się przez kilka sekund po ranie; Jeśli jednak zawartość komórkowa wycieknie przez dłuższy czas, zwierzęta nie przeżyją. Aby uzyskać optymalne obrazowanie, owiń boczne syncytium naskórka (hyp7) lub szew boczny. 
	UWAGA: Ta procedura obejmuje użycie szklanej igły.</li>
	<li>Pozwolić robakom na regenerację w temperaturze pokojowej, a następnie przeprowadzić hodowlę w temperaturze 20 °C. Ocenić powodzenie zranienia igłą za pomocą kilku testów opisanych poniżej. Ponad 95% zwierząt typu dzikiego przeżywa 24 godziny po zranieniu igłą w stadium młodego dorosłego osobnika. Wpływ zranień u larw lub osób starszych nie został jeszcze dokładnie przeanalizowany.</li>
</ol>
2. Ranienie laserowe3
Użyj femtosekundowego naświetlania laserem (800 nm), aby wykonać bardziej precyzyjne nawijanie.
<ol>
	<li>Przygotuj podkładki agarowe na szklanym szkiełku z roztopionym 2% agarem7. Upewnij się, że elektrody są podobne do padów agarowych używanych do obrazowania na żywo C. elegans.</li>
	<li>Przenieś 10 młodych dorosłych robaków na podkładkę agarozową za pomocą wykałaczki do robaków i dodaj 2 μl kropli 12 mM roztworu lewamizolu. Przykryj zwierzęta i płyn szkiełkiem nakrywkowym. Odczekaj 1-2 minuty, aż robaki sparaliżują.</li>
	<li>Umieść szkiełko podstawowe na mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem. Przesuń scenę, aby znaleźć robaki i skup się na bocznym przednim lub tylnym naskórku syncytialnym za pomocą obiektywu 100X (NA 1,4-1,46).</li>
	<li>Ustaw moc lasera femtosekundowego na 140 mW (mierzoną przed obiektywem). Używaj lasera femtosekundowego z częstotliwością powtarzania 80 MHz. 
	UWAGA: Dwa impulsy po 200 ms każdy (oddalone od siebie o 20 ms) wystarczą, aby zranić się w dłonie.</li>
	<li>Skoncentruj się na wierzchołkowej powierzchni komórki naskórka i zranij naskórek. Obserwuj miejscowe przerwanie cytoplazmy (bulgotanie) lub miejscowe blaknięcie dowolnego użytego markera fluorescencyjnego. 
	UWAGA: Podczas korzystania z lasera femtosekundowego należy przestrzegać odpowiednich procedur bezpieczeństwa lasera. Skany liniowe lub punktowe przy użyciu laserów femtosekundowych, takich jak te w dwóch mikroskopach fotonowych, powinny zapewnić wystarczającą moc do zranienia laserowego. 
	UWAGA: Chociaż nie mamy bezpośredniego doświadczenia w stosowaniu innych laserów, w zasadzie zranienie powinno być możliwe przy użyciu konwencjonalnych laserów UV (stosowanych w ablacjach komórek C. elegans). Opcjonalnie użyj modułu Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) na wirującym dysku konfokalnym w celu nawinięcia naskórka (N. Pujol, komunikacja osobista).</li>
</ol>
3. Wizualizacja reakcji naskórka Ca2+ na zranienia
<ol>
	<li>Stosować transgeniczne szczepy C. elegans, które eksprymują czujniki Ca2 + (takie jak te z serii GCaMP) w naskórku, pod kontrolą dorosłego swoistego dla naskórka promotora col-19 (Figura 1A; transgeny są wymienione w Tabeli 1). Użyj transgenu wyrażającego białko czerwonej fluorescencji, takie jak tdTomato, jako wewnętrznej kontroli poziomu ekspresji transgenu. 
	UWAGA: Użyliśmy tdTomato jako wewnętrznej kontroli ekspresji transgenu, ponieważ fluorescencja naskórka tdTomato jest stosunkowo stabilna i nie zakłóca obrazowania GCaMP.</li>
	<li>Zarówno zranienie igłą, jak i laserem powoduje uniesienie Ca2+ w naskórku. Ponieważ jednak nawijanie igłą nie może być łatwo wykonane na konfokalu z wirującym dyskiem, nawijanie laserowe jest preferowane do analizy ilościowej odpowiedzi Ca2+ (ryc. 1).</li>
	<li>Pozyskiwanie obrazów poklatkowych w trybie akwizycji wielowymiarowej (czas interwału 2 sekundy przy ekspozycji lasera wzbudzenia 114 ms) za pomocą wirującego dysku konfokalnego z obiektywem 100X (NA 1.4-1.46) i odpowiednimi zestawami filtrów (filtry GFP będą działać dla GCaMP3). 
	UWAGA: Rób zdjęcia poklatkowe co 30 sekund przez około 2 godziny, aby zbadać reakcję Ca2+ na zranienia w dłuższym czasie.</li>
	<li>Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, zmierz średnią fluorescencję GCaMP w dziesięciu równoważnych regionach zainteresowania (ROI), z których pięć jest wyśrodkowanych na cytozolu komórek naskórka, a pięć w tle.</li>
	<li>Uzyskaj wyjściową fluorescencję (F0), uśredniając fluorescencję w 5 ROI w naskórku, a następnie odejmując średnią 5 ROI w tle przed urazem. Wyrazić zmianę fluorescencji ΔF jako stosunek zmian w stosunku do linii podstawowej [(Ft-F 0)/F0].</li>
</ol>
4. Wizualizacja dynamiki F-aktyny po zranieniu
<ol>
	<li>UWAGA: W odpowiedzi na zranienie igłą należy obserwować pierścień aktynowy w miejscu rany, który stopniowo zamyka się wokół rany. Ten odcinek protokołu bada zamknięcie rany, mierząc średnicę pierścienia aktynowego.</li>
	<li>Generuj transgeniczne robaki, które wyrażają marker F-aktyny, taki jak domena wiążąca aktynę moesyny Drosophila połączona z GFP, wyrażana pod kontrolą specyficznego dla naskórka promotora, takiego jak col-19 (Figura 2A) (transgen juIs352). 
	UWAGA: Uzyskaliśmy podobne wyniki przy użyciu innych markerów domeny wiążącej aktynę, takich jak Lifeact lub F-tractin (wyniki niepublikowane).</li>
	<li>Wykonaj nawijanie igłą transgenicznych robaków Pcol-19-GFP-moesin. Po zranieniu igłą należy obserwować pierścień GFP-mezyny wokół miejsca rany przez ~5 min. Pierścień aktynowy staje się mniejszy i ostatecznie zamyka się 2-3 godziny po zranieniu u zwierząt typu dzikiego (ryc. 2A).</li>
	<li>Przygotuj 2% wacik agarowy na szkiełku podstawowym i przenieś 10 robaków na podkładkę w 2 μl 12 mM roztworu lewamizolu. Zobrazuj pierścienie GFP-mezyny 1 godzinę po zranieniu za pomocą konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej. 
	UWAGA: Użyj mikroskopii konfokalnej, aby uzyskać stosy z (13 x 0,5 μm) pierścieni aktynowych 1 godzinę po zranieniu.</li>
	<li>Zmierz średnicę pierścienia aktynowego po zranieniu. Aby określić ilościowo naskórkową GFP-mezynę, najpierw wykonaj projekcję maksymalnej intensywności stosu z, a następnie narysuj 4 skany liniowe (pod kątem 45° względem siebie) nad pierścieniem GFP-mezyny. Średnica pierścienia jest zdefiniowana jako średnia odległość między pikami czterech skanów liniowych (rysunek 2B). W przypadku pierścieni, które zostały już zamknięte, średnica jest definiowana jako 0 μm. 
	UWAGA: Pierścienie F-aktyny są wygodnie mierzone 1 godzinę po zranieniu, ponieważ jest to mniej więcej połowa procesu zamykania rany w typie dzikim. Pierścienie F-aktyny można również mierzyć w wielu punktach czasowych, aby określić przebieg zamykania się rany w czasie. Filmy poklatkowe z zamykania ran można uzyskać za pomocą robaków unieruchomionych lewamizolem i mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.</li>
</ol>
5. Indukcja testu naskórkowych peptydów przeciwdrobnoustrojowych

UWAGA: Ranienie również wywołuje wrodzone reakcje immunologiczne u skóry C. elegans. W naskórku indukowana jest transkrypcja genów kodujących peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP). AMP nlp-29 (białko podobne do neuropeptydu) jest silnie indukowane przez zranienie4. Aby określić, w jaki sposób naskórek kontroluje ekspresję AMP po zranieniu, użyj transgenicznych reporterów lub PCR w czasie rzeczywistym do wykrycia indywidualnych poziomów transkryptów AMP.
<ol>
	<li>Transgeniczny test reporterowy dla wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na zranienia4.</li>
	<li>Przeprowadzić nakłuwanie igłą (jak w protokole 1) na dorosłych zwierzętach wykazujących ekspresję transgenicznego reportera frIs7, który zawiera Pnlp-29-GFP i Pcol-12-DsRed jako kontrolę wewnętrzną. Obserwuj niezranione dorosłe zwierzęta jako ciemnoczerwone lub pomarańczowe w filtrze długoprzepustowym GFP. 
	UWAGA: Ranienie robaków typu dzikiego wywoła ekspresję Pnlp-29-GFP, ale nie wpłynie na Pcol-12-dsRed, co spowoduje, że robaki będą wyglądać na pomarańczowe, żółte lub zielone przy oświetleniu długoprzepustowym GFP. Utrata funkcji genów w szlaku p38 MAPK, takich jak pmk-1 lub nsy-1, zablokuje indukcję nlp-29-GFP po zranieniu4. Pnlp-29-GFP ulega ekspresji na wysokich poziomach w stadiach larwalnych</li>
	<li>Wykonaj testy indukcji AMP u młodych dorosłych zwierząt. Upewnij się, że niezranione zwierzęta kontrolne mają niski poziom GFP. 
	UWAGA: Ekspresja Pnlp-29-GFP jest również indukowana przez stres osmotyczny8 i może być wrażliwa na inne stresy środowiskowe.</li>
	<li>6 godzin po zranieniu oceń liczbę robaków, które mają indukcję Pnlp-29-GFP (ryc. 3)9 za pomocą fluorescencyjnej lunety z filtrem długoprzepustowym GFP. 
	UWAGA: Po 1 godzinie od zranienia Pnlp-29-GFP jest widocznie indukowany, osiągając szczyt około 6 godzin po zranieniu, a następnie pozostając podwyższonym do 24 godzin po zranieniu. Kwantyfikacja ekspresji za pomocą oceny wizualnej4,9. Alternatywnie, określ ilościowo poziomy ekspresji za pomocą sortownika robaków aktywowanego fluorescencją4. W przypadku sortownika robaków należy zranić co najmniej 50 zwierząt.</li>
	<li>Test PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego określania poziomów transkryptów poszczególnych genów AMP. Oznacz poziomy transkryptów dla kilku genów: nlp-29, nlp-30, cnc-1 i cnc-5.</li>
	<li>Wykonać nakłuwanie igłą na robakach typu dzikiego lub zmutowanych (patrz protokół 1)</li>
	<li>Zbierz 50 rannych robaków i 50 niezranionych robaków w żądanym czasie (np. 3, 6, 24 godzin) po zranieniu.</li>
	<li>Ekstrahuj RNA za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wykonaj odwrotną transkrypcję, aby uzyskać całkowite 20 μl cDNA za pomocą komercyjnego zestawu do odwrotnej transkryptazy.</li>
	<li>W przypadku RT-PCR należy użyć 0,2 μl cDNA (1/40) z każdej próbki w połączeniu z zielonym supermiksem z fluoresceiną i starterami 0,2 μM. Aby porównać jakość RNA, użyj ama-1 lub snb-1 RT-PCR jako odniesienia; porównać względny poziom ekspresji AMP przez normalizację do kontroli wewnętrznej (ama-1 lub snb-1) lub porównać indukcję fałdowania po zranieniu (indukcja AMP u zranionych robaków/niezranionych robaków) przez normalizację do kontroli wewnętrznej. 
	UWAGA: cnc-1 i cnc-5 to peptydy przeciwdrobnoustrojowe z rodziny caenacin, których transkrypcja jest aktywowana przez zranienie10. Zazwyczaj zranienie igłą wywołuje ekspresję (~500-krotność dla cnc-1) w ciągu 4 godzin10. Elementarze użyte w opublikowanych pracach wymieniono w tabeli 2.</li>
</ol>
6. Test przeżycia po zranieniu
<ol>
	<li>UWAGA: Ranie aktywuje co najmniej dwa niezależne szlaki sygnałowe w naskórku: zależny od Ca2+ szlak gojenia ran i szlak wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Obie drogi są niezbędne do pełnego przeżycia jałowych ran. Aby sprawdzić, czy leczenie mutantem lub RNAi wpływa na gojenie się ran, zmierz przeżycie po 24-48 godzinach od zranienia. Opcjonalnie należy użyć konwencjonalnych testów długości życia, aby określić wpływ zranienia na długowieczność4,9.</li>
	<li>Wykonaj nakłuwanie igłą młodych dorosłych (L4 + 24 godziny) robaków (50 robaków, powtórz kilka razy) zgodnie z protokołem 1 powyżej. Utrzymuj równoważną liczbę niezranionych robaków jako kontrole.</li>
	<li>Sprawdzaj przeżywalność co 24 godziny (co 24 godziny przenosić zranione robaki na nową płytkę agarową). Obserwuj ~50% przeżycia 24 godziny po zranieniu u mutantów, które są wadliwe w gojeniu się ran, takich jak gtl-2 lub tir-1, po znormalizowaniu do nierannych zwierząt kontrolnych. Śmierć definiuje się jako brak reakcji lokomotorycznej na dotyk robaka.</li>
</ol>

<ol><li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li>
<li>Sonnemann, K. J., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair%3A+toward+understanding+and+integration+of+single-cell+and+multicellular+wound+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 237-263 (2011).</li>
<li>Xu, S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+G%CE%B1q-Ca2%2B+signaling+pathway+promotes+actin-mediated+epidermal+wound+closure+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A Gαq-Ca2+ signaling pathway promotes actin-mediated epidermal wound closure in C. elegans.</a> Curr Biol. 21, 1960-1967 (2011).</li>
<li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr Biol. 18, 481-489 (2008).</li>
<li>Chisholm, A. D., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+epidermis+as+a+model+skin.+II%3A+differentiation+and+physiological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. II: differentiation and physiological roles.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 879-902 (2012).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook+%3A+the+online+review+of+C.+elegans+biology%22">WormBook : the online review of C. elegans biology</a>. , 1-11 Forthcoming.</li>
<li>Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+killing+of+cells+in+Caenorhabditis+elegans.+Methods+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in cell biology.</a> 48, 225-250 Forthcoming.</li>
<li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, (2008).</li>
<li>Tong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+Caenorhabditis+elegans+epidermal+damage+responses+by+death-associated+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of Caenorhabditis elegans epidermal damage responses by death-associated protein kinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1457-1461 (2009).</li>
<li>Zugasti, O., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+regulation+of+antimicrobial+peptide+expression+by+a+noncanonical+TGF-beta+signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune regulation of antimicrobial peptide expression by a noncanonical TGF-beta signaling pathway in Caenorhabditis elegans epidermis.</a> Nat Immunol. 10, 249-256 (2009).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chip-based+C.+elegans+microinjection+system+for+investigating+cell-cell+communication+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensor.%2C+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chip-based C. elegans microinjection system for investigating cell-cell communication in vivo.</a> Biosensor., & Bioelectronics. 50, 28-34 (2013).</li>
<li>Jansson, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Conidia+of+Drechmeria+coniospora+to+Caenorhabditis+elegans+Wild+Type+and+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nematol%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Conidia of Drechmeria coniospora to Caenorhabditis elegans Wild Type and Mutants.</a> J Nematol. 26, 430-435 (1994).</li>
<li>Hodgkin, J., Kuwabara, P. E., Corneliussen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+bacterial+pathogen%2C+Microbacterium+nematophilum%2C+induces+morphological+change+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel bacterial pathogen, Microbacterium nematophilum, induces morphological change in the nematode C. elegans.</a> Curr Biol. 10, 1615-1618 (2000).</li>
<li>Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgenic+C.+elegans+by+biolistic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li>
<li>Hashmi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+nematodes+using+arrays+of+micromechanical+piercing+structures%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.</a> BioTechniques. 19, 766-770 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie są świadomi istnienia sprzecznych interesów.

Przedstawione tutaj metody nawijania igłami i laserem zapewniają uzupełniające podejścia do oceny zdolności nabłonka naskórka do naprawy uszkodzeń. Ranienie laserowe jest stosunkowo miejscowe i (w zależności od konfiguracji lasera) może być ograniczone do naskórka, podczas gdy zranienie igłą narusza naskórek, naskórek i prawdopodobnie wewnętrzne błony podstawne. Ranienie igłą może bardziej przypominać rany zadane przez patogeny lub uszkodzenia mechaniczne w środowisku naturalnym. Z reguły nawijanie igłą wymaga więcej pra...

Mechanizmy gojenia się ran skóry są podstawowym interesem biologicznym i mają znaczenie dla zdrowia ludzkiego. Gojenie się ran u kręgowców i ssaków składa się ze złożonej serii skoordynowanych reakcji wielu tkanek i sygnalizacji1. Wiele prostych organizmów modelowych genetycznie jest również zdolnych do leczenia ran skóry2. W związku z tym interesująca jest analiza genetycznie wykonalnych modeli gojenia się ran skóry. My i inni zaczęliśmy używać Caenorhabditis elegans jako nowego modelu gojenia się ran skóry3,4. Celem tego protokołu jest umożliwienie szerszemu gronu badaczy wykorzystania C. elegans jako narzędzia do badania molekularnych i komórkowych mechanizmów gojenia się ran naskórka.
Skóra C. elegans składa się z naskórka (znanego również jako tkanka podskórna) i naskórka zewnątrzkomórkowego5. Dorosły naskórek składa się z niewielkiej liczby syncytii wielojądrowych, z których największą jest syncytium znana jako hyp7. Naskórek to prosty nabłonek, który wydziela naskórek na swojej wierzchołkowej powierzchni. Skóra może aktywnie bronić się przed patogenami penetrującymi skórę i naprawiać małe rany4. Naprawa ran na skórze C. elegans jest solidna, ponieważ prawie wszystkie zwierzęta typu dzikiego przeżywają małe rany kłute spowodowane igłami lub miejscowe uszkodzenia skóry spowodowane promieniowaniem laserowym. Zranienie skóry C. elegans wyzwala szereg reakcji, w tym wrodzoną odpowiedź immunologiczną naskórka, zamykanie ran i tworzenie się blizn4. Dorosły naskórek jest postmitotyczny, a gojenie się ran obejmuje lokalne reakcje komórkowe, a nie proliferację naskórka lub migrację komórek. Wykazaliśmy, że zranienie skóry powoduje duży i trwały wzrost naskórkowego Ca2 +, co wymaga kanału TRPM błony GTL-2 i wewnętrznych magazynów Ca2 + 3. Naskórkowy sygnał Ca2+ jest niezbędny do tworzenia i zamykania pierścieni F-aktyny w miejscu rany. Zranienie indukuje również wrodzone odpowiedzi immunologiczne, które aktywują transkrypcję AMP, takich jak nlp-29. Indukowana zranieniem transkrypcja AMP jest zależna od kaskady kinazy MAP TIR-1 / PMK-1 p38 działającej autonomicznie w naskórku4. Defekty w szlaku sygnałowym Ca2 + lub we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej prowadzą do niższego przeżycia po zranieniu. Stosunkowo prosta struktura naskórka C. elegans, jego podatność genetyczna i zalety w obrazowaniu in vivo sprawiają, że jest to doskonały system do badania wielu aspektów gojenia się ran.
Tutaj prezentujemy protokoły dla dwóch popularnych metod ranienia: ranienia igłą i ranienia laserowego. Zwijanie igł nie wymaga specjalistycznego sprzętu (poza ściągaczem igieł), a przy doświadczeniu można je wykonać na setkach robaków dziennie. Ranienie igłą wykonuje się na zwierzętach rosnących na płytkach agarowych. W przeciwieństwie do tego, ranienie laserowe jest wykonywane na znieczulonych zwierzętach zamontowanych na podkładkach agarowych pod szkiełkiem nakrywkowym i nadaje się do obrazowania na żywo odpowiedzi komórek na uszkodzenie.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa płytka Petriego</td><td>Tritech Research</td><td>T3308</td><td>60 mm</td></tr><tr><td>Lewamisola</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td>12 mM</td></tr><tr><td>Kapilara ze szkła borokrzemianowego</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz igieł</td><td>Sutter Instrument&nbsp;</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Ślimak (drut platynowy)</td><td>Tritech Research</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>M9 roztwór</td><td>Domowe</td><td></td><td>3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O do 1 litra. Sterylizuj w autoklawie</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>Użyj 500 ml na 50 robaków</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>1708882</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000/CFX96</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe probówki do PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9601</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Metamorf</td><td></td> <td>urządzeń molekularnych</td></tr></tbody></table>

metody leczenia ran skóry i oznaczania reakcji na rany u c. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Naskórek i naskórek C. elegans tworzą prostą, ale wyrafinowaną warstwę skóry, która może naprawić miejscowe uszkodzenia wynikające z zranienia. Badania nad reakcjami i gojeniem się ran w tym modelu rzuciły światło na naszą wiedzę na temat reakcji cytoszkieletu i genomu na uszkodzenie tkanek. Dwie najczęściej stosowane metody ranienia skóry dorosłych C. elegans to nakłucia igłami do mikroiniekcji oraz miejscowe naświetlanie laserowe. Ranienie igłą miejscowo narusza naskórek, naskórek i związaną z nim macierz zewnątrzkomórkową, a także może uszkodzić tkanki wewnętrzne. Naświetlanie laserowe powoduje bardziej miejscowe uszkodzenia. Ranienie wywołuje szereg łatwych do zbadania reakcji, w tym podwyższone naskórkowe Ca2+ (sekundy-minuty), tworzenie i zamykanie pierścienia zawierającego aktynę w miejscu rany (1-2 godziny), zwiększoną transkrypcję genów peptydów przeciwdrobnoustrojowych (2-24 godziny) i tworzenie się blizn. Zasadniczo wszystkie dorosłe zwierzęta typu dzikiego przeżywają zranienia, podczas gdy mutanty wadliwe w gojeniu ran lub innych reakcjach wykazują zmniejszoną przeżywalność. Przedstawiono szczegółowe protokoły nakłuwania igłami i laserem oraz testy do oceny ilościowej i wizualizacji reakcji ran i procesów gojenia (dynamika Ca, dynamika aktyny, indukcja peptydów przeciwdrobnoustrojowych i przeżycie).

Zranienie laserem lub igłą wywołuje szybki i trwały wzrost poziomu Ca w naskórku, co można zwizualizować za pomocą czujników Ca, takich jak GCaMPs (Rycina 1). Wzrost poziomu Ca następuje w ciągu kilku sekund i utrzymuje się przez dziesiątki minut. Zranienie igłą w sposób powtarzalny prowadzi do tworzenia się pierścieni F-aktyny w miejscach zranienia (Rycina 2); pojawiają się one w ciągu kilku minut i stopniowo zamykają się w ciągu 1-2 hr&#160;po zranieniu. Pierścienie aktynowe tworzą się...

Skóra dorosłego C. elegans jest łatwym modelem do badań nad reakcjami na rany nabłonkowe, w tym zamykaniem ran, tworzeniem blizn i odpornością wrodzoną.

Metody leczenia ran skóry i oznaczania reakcji na rany u C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zademonstrowanie metod stosowanych do ranienia elegancji widzenia oraz wizualizacja reakcji naskórka na zranienie. Można to osiągnąć poprzez zranienie naskórka małymi nakłuciami spowodowanymi ukłuciami igły do mikroiniekcji. Druga metoda nawijania wykorzystuje promieniowanie laserowe.Można to wykonać na zwierzętach zamontowanych do mikroskopii i pozwala na natychmiastowe zobrazowanie reakcji na zranienie. Wyniki pokazują, że zranienie powoduje szybkie uniesienie wapnia w naskórku, a następnie nagromadzenie pierścienia aktynowego wokół miejsca rany, który zamyka się w ciągu kilku godzin, umożliwiając w ten sposób zagojenie się rany. A pokazane tutaj metody ranienia laserowego są obecnie najpowszechniej stosowanymi metodami ranienia skóry u nicienia C Elgan.Metody te są stosowane w celu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące pola nerkowego rany, takie jak sposób, w jaki komórki skóry wykrywają uraz i reagują na niego. Połóż talerz z młodymi dorosłymi robakami na lodzie na około pół godziny, aby spowolnić zwierzęta. To mrożące krew w żyłach odrętwienie jest ważne dla precyzyjnego nawijania igły.Ponieważ robaki zwykle poruszają się zbyt szybko, aby zranić je pod mikroskopem stereoskopowym, obejrzyj robaki i za pomocą kilofa przesuń je wszystkie na środek płytki. Następnie chwyć wyciągniętą igłę, taką jak ta używana do mikroiniekcji, z końcówką pipety o pojemności 100 mikrolitrów. Jako uchwyt igły, przyłóż czubek igły do dowolnego końca robaka, unikając gonad, albo między tylnym gardłem pH a gonadą wewnętrzną, albo między tylną gonadą a odbytnicą.Następnie dodaj w przybliżeniu kąt prosty do naskórka. Wykonaj krótkie, delikatne nakłucie, które wnika około pięciu do 10 mikronów w głąb robaka. Te rany igłowe mogą również uszkadzać narządy wewnętrzne, takie jak jelito.Poczekaj chwilę, aby zaobserwować wyciek zawartości komórkowej z rany. Kilka sekund wycieku jest w porządku, ale więcej sugeruje, że rana będzie śmiertelna. Obrazowanie reakcji na ranę będzie najłatwiejsze, jeśli rana zostanie wykonana w bocznym syncytium naskórka lub w szwie bocznym.W przypadku zraniania igłą bardzo ważne jest, aby zadać małe nakłucie, a nie duże ukłucie. Ponieważ drabina może szybko zabić robaki, potrzebna jest praktyka, aby w powtarzalny sposób spowodować minimalne uszkodzenia niezbędne do wywołania reakcji na ranę: Kontynuuj ranienie każdego zwierzęcia za pomocą tej samej igły, aż pęknie lub się zabrudzi. Z doświadczeniem zranienie wszystkich 25 zwierząt na talerzu w ciągu pięciu minut jest całkiem wykonalne, a dokładnie na nicienie.Protokół ten wykorzystuje laser segmentowy femto przymocowany do mikroskopu ogniskowego z wirującym dyskiem, linię lub skany punktowe przy użyciu femtosekundowych litrów, takich jak te w dwóch mikroskopach fotograficznych. To też powinno wystarczyć. Zacznij od zebrania 10 młodych dorosłych na podkładce świdra.Sparaliżuj je w dwumikrolitrowej kropli 12-milimolowego roztworu lail. Następnie przykryj je szkiełkiem nakrywkowym i odczekaj kilka minut, aż sparaliżują. Konieczne jest, aby zwierzę było całkowicie sparaliżowane.12 mili więcej nie wpłynie tylko na odpowiedź. Można jednak zastosować również inne metody unieruchomienia. Upewnij się, że moc lasera femtosekundowego jest ustawiona na 140 miliwatów, mierzona przed obiektywem, a częstotliwość powtarzania lasera wynosi 80 megaherców.Teraz zlokalizuj robaki pod mikroskopem konfokalnym z wirującym dyskiem za pomocą obiektywu 100 x z dużą aperturą numeryczną, skupiając się na bocznym, przednim lub tylnym syncytialnym naskórku docelowego robaka, skupiając się na wierzchołkowej powierzchni komórki naskórka. Świec laserem na dwa impulsy o długości 200 milisekund w odstępie 20 milisekund. Powinno to wystarczyć do zranienia naskórka.Poczekaj chwilę i obserwuj miejscowe rozerwanie cytoplazmy, które objawi się bulgotaniem. Jeśli obecny jest marker fluorescencyjny, można zaobserwować miejscowe wybielanie. Protokół ten wykorzystuje elegancję C, która wyraża czujniki wapnia w naskórku, takie jak G Camp trzy, a także wyraża czerwone białko fluorescencyjne, takie jak pomidor TD, jako wewnętrzną kontrolę poziomu ekspresji transgenów.Chociaż obie metody nawijania wywołują uniesienie wapnia, aby zobrazować to za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem, zranienie laserowe musi być stosowane po utworzeniu obrazów poklatkowych z interwałem dwóch sekund oraz wzbudzeniem i ekspozycją lasera 114 milisekund. To samo powiększenie, które jest używane do ranienia laserowego, jest odpowiednie w dłuższych cyklach czasowych, takich jak dwugodzinne obrazy mogą być wykonywane co 30 sekund lub dłużej. Protokół tekstowy sugeruje procedury analizy.Protokół ten wykorzystuje robaki, które wyrażają marker aktyny F mosynę GFP pod kontrolą specyficznego dla naskórka promotora, takiego jak call 19 po hodowli zranienia igły. Zranione robaki w inkubatorze o temperaturze 20 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie zabierają Zacksa do obrazowania tworzenia pierścienia aktynowego, aby zbadać dynamikę aktyny natychmiast po zranieniu igłą, przenieść zranione zwierzęta na podkładkę ślimakową na szkiełku i znieczulić je lailem. Następnie zobrazuj zwierzęta za pomocą konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej.Zdobądź Zacks w odstępie 0,5 mikrometra przez jedną do dwóch godzin, aby zmierzyć pierścień aktynowy w celu ilościowego określenia średnicy pierścienia. Najpierw wykonaj projekcję maksymalnej intensywności stosu Z i narysuj cztery skany linii pod kątem 45 stopni od siebie nad MOI GFP i pierścieniem. Następnie oblicz średnicę pierścienia jako średnią odległość wierzchołka piku czterech skanów dla pierścieni, które się zamknęły.Średnica jest zdefiniowana jako laser zero O lub nawijanie igłą powoduje szybki i trwały wzrost poziomu wapnia w naskórku, co jest wizualizowane przez czujnik wapnia G camp. Widok boczny naskórka w przedniej części ciała pokazuje ranę laserową oznaczoną X i N DeMars jądra naskórka. Wzrost wapnia szybko rozprzestrzenia się z miejsca rany Kwantyfikacja poziomu wapnia na poziomie 2040 i 60 mikronów z jednego miejsca rany pomaga zilustrować tę wczesną kinetykę odpowiedzi wapnia.Podwyższony poziom wapnia utrzymuje się przez dziesiątki minut, a nakłucie igłą niezawodnie. Powoduje tworzenie się pierścieni f aktynowych, które stopniowo zamykają się w miejscach rany w ciągu dwóch godzin. Zostało to zwizualizowane za pomocą P call 19 GFP MOI u zwierząt.Pierścienie te są rzadziej wytwarzane przez precyzyjne nawijanie laserowe. Średnicę pierścienia aktonowego określono ilościowo za pomocą czteroliniowego skanu. Kwantyfikacja skanów linii ilustruje, w jaki sposób pierścień aktynowy ma różną intensywność w różnych odległościach od rany. Miejsce.Opracowanie tych metod gojenia ran pozwoliło naukowcom wykorzystać morską elegancję jako model dla wielu aspektów gojenia się ran, w tym wrodzonych odpowiedzi immunologicznych i zamykania ran. Nie zapominaj, że lasery segmentowe femto stanowią zagrożenie. Każdy, kto pracuje z laserem segmentowym Femto, powinien ukończyć szkolenie w zakresie bezpieczeństwa lasera.

methods-for-skin-wounding-and-assays-for-wound-responses-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film przedstawia metodę laserowego ranienia, która jest używana do powodowania bardzo precyzyjnych uszkodzeń naskórka robaka. Przykładowy protokół pochodzi z badania reakcji i naprawy ran.

Laserowe ranienie naskórka: wywoływanie miejscowych uszkodzeń w celu zbadania procesów naprawczych u C. elegans

Embrionalny naskórek zarodków Drosophila w bardzo późnym stadium dostarcza systemu in vivo do szybkiej analizy reakcji na nakłucie rany i może być łączony z manipulacjami genetycznymi lub chemicznymi zabiegami mikroiniekcji w celu przyspieszenia badań nad gojeniem się ran w celu translacji na modele ssaków.

Test mikroiniekcji rany i lokalizacja in vivo reporterów odpowiedzi naskórka na ranę w zarodkach Drosophila.

Opisano protokół, który wykorzystuje anoksję/głód u C. elegans do modelowania niedokrwienia/reperfuzji. Wyniki funkcjonalne obejmują zwiększoną śmiertelność, widoczne nieprawidłowości w procesach neuronalnych znakowanych GFP oraz upośledzone reakcje behawioralne, które wymagają funkcji neuronalnej.

Model niedokrwienia/reperfuzji beztlenowej u C. elegans

Nowe narzędzia do badań mechanobiologii są potrzebne, aby zrozumieć, jak stres mechaniczny aktywuje szlaki biochemiczne i wywołuje reakcje biologiczne. W tym artykule prezentujemy nową metodę selektywnej stymulacji mechanicznej unieruchomionych zwierząt za pomocą pułapki mikroprzepływowej, umożliwiającej obrazowanie odpowiedzi komórkowych w wysokiej rozdzielczości.

Wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do stymulacji mechanicznej i obrazowania C. elegans w wysokiej rozdzielczości

Ten manuskrypt opisuje, w jaki sposób zmiany przypominające nacięcia wykonane na monowarstwach hodowanych komórek nabłonkowych wygodnie modelują gojenie się ran in vitro, umożliwiając obrazowanie za pomocą konfokalnej lub laserowej mikroskopii skaningowej, i które mogą dostarczyć wysokiej jakości danych ilościowych i jakościowych do badania zarówno zachowania komórek, jak i mechanizmów związanych z migracją.

Mikroskopowe metody oceny migracji komórek nabłonka podczas gojenia się ran in vitro

Opisujemy nieinwazyjny protokół obrazowania in vivo, który jest uproszczony i opłacalny, wykorzystując L-012, chemiluminescencyjny analog luminolu, do wizualizacji i ilościowego określenia reaktywnych form tlenu (ROS) generowanych w mysim modelu rany wycinającej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie reaktywnych form tlenu w mysim modelu rany

Tutaj prezentujemy protokół dla testu in vitro z użyciem pierwotnych fibroblastów oraz dla testu in vivo gojenia ran skóry na myszach. Oba testy są prostymi metodami oceny gojenia się ran in vitro i in vivo.

Test migracji zadrapań i komora grzbietowego fałdu skórnego do analizy gojenia się ran in vitro i in vivo

Tutaj opisane są dwa modele gojenia ran u myszy, jeden przeznaczony do oceny reakcji na gojenie się ran komórkowych i cytokinowych, a drugi do ilościowego określania szybkości zamykania ran. Metody te mogą być stosowane w złożonych modelach chorób, takich jak cukrzyca, w celu określenia mechanizmów różnych aspektów złego gojenia się ran.

Ocena ostrego gojenia się ran za pomocą grzbietowej podskórnej implantacji gąbki z polialkoholu winylowego i wycinających raki skóry ogona.

Poliploidyzacja wywołana raną to zachowana strategia naprawy tkanek, w której komórki rosną zamiast dzielić, aby zrekompensować utratę komórek. Oto szczegółowy protokół, w jaki sposób wykorzystać muszkę owocową jako model do pomiaru ploidalności i jej regulacji genetycznej w naprawie ran nabłonkowych.

Model Drosophila do badania poliploidyzacji indukowanej raną

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowaną technikę oceny gojenia ran za pomocą ludzkiej skóry ex vivo w połączeniu z podejściem polegającym na barwieniu całego wierzchowania. Metodologia ta stanowi przedkliniczną platformę do oceny potencjalnych terapii ran.

Ludzki model ran ex vivo i barwienie całej góry w celu dokładnej oceny naprawy skóry

Ten artykuł opisuje metodę tworzenia ran w nabłonku żywej Clytia hemisphaerica medusa i obrazowania gojenia ran w wysokiej rozdzielczości in vivo. Dodatkowo przedstawiono technikę wprowadzania barwników i leków w celu zakłócenia procesów sygnalizacyjnych w komórkach nabłonka i macierzy zewnątrzkomórkowej podczas gojenia się ran.

Charakterystyka gojenia się ran nabłonkowych in vivo przy użyciu parzydełkowego organizmu modelowego Clytia hemisphaerica

Poznaj metody ranienia C. elegans igłą mikroinjekcyjną i laserem oraz wizualizacji odpowiedzi nabłonka. Techniki te pozwalają badać sygnalizację wapniową i dynamikę aktyny w gojeniu ran skóry.

Metody leczenia ran skóry i oznaczania reakcji na rany u C. elegans

Przeglądaj więcej filmów