Metoda badań przesiewowych i walidacji opornych mutacji przeciwko inhibitorom kinaz

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja i walidacja mutacji opornych na leki. Osiąga się to poprzez utworzenie najpierw biblioteki losowych mutacji docelowego onkogenu. Drugim krokiem jest przeprowadzenie badań przesiewowych in vitro w celu wyłonienia opornych klonów.

Trzecim etapem procedury jest sekwencjonowanie opornych klonów w celu zidentyfikowania opornych mutacji. Ostatnim krokiem jest walidacja opornych mutacji poprzez odtworzenie mutacji za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce, a następnie testów in vitro i in vivo. Ostatecznie klinicznie istotne mutacje lekooporne mogą zostać zidentyfikowane w odniesieniu do danej pary docelowej leku.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak metody oparte na ENU lub PCR, jest to, że jest bezstronna i w przeciwieństwie do METAGENE ssis opartej na PCR, ta nie jest ograniczona do wielkości onkogenu lub zawartości GC w dowolnym genie. Ogólnie rzecz biorąc, ci, którzy są nowicjuszami w tej technice, będą mieli trudności z powodu braku wiedzy z zakresu biologii molekularnej i komórkowej. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie.

Ponieważ etapy neogenezy i badań przesiewowych są trudne do nauczenia. Dzieje się tak, ponieważ wiele osób nie ma doświadczenia w produkcji wirusów, w hodowlach komórkowych i pożywkach półkomórkowych. Procedura ta rozpoczyna się od transformacji XL jeden czerwonych komórek E coli z plazmidem zawierającym JAK dwa V 617 f onkogenna izoforma JAK dwie XL one czerwone komórki E coli są wadliwe w mechanizmach naprawy DNA, co pozwala im na włączenie losowych mutacji podczas replikacji.

Wymieszaj od 50 do 100 nanogramów plazmidowego DNA ze 100 mikrolitrami kompetentnych komórek we wstępnie schłodzonej probówce polipropylenowej. Nie używaj więcej niż 100 nanogramów DNA, ponieważ zmniejsza to wydajność transformacji. Inkubuj na lodzie przez 30 minut, delikatnie mieszając co pięć minut, aby uzyskać dobre pokrycie biblioteki.

Użyj czterech do sześciu probówek z kompetentnymi komórkami. Zanurz rurki polipropylenowe w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza na szok termiczny trwający 45 sekund, a następnie inkubuj na lodzie przez dwie minuty. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki SOC do każdej probówki.

Inkubować probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością od 225 do 250 obr./min przez 90 minut. Komórki płytki na czterech 10-centymetrowych płytkach ślimakowych LB zawierających 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny. Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 24 godzin.

Gdy kolonie są widoczne, zbierz je, zeskrobując płytki sterylnym skrobakiem do płytek. Połącz komórki z każdej płytki. Następnie plazmidowe DNA izoluje się za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji plazmidu, a niejednorodność mutacji w bibliotece ocenia się przez sekwencjonowanie na dzień przed transfekcją, cztery razy 10 do szóstych limfocytów T HEK 2 93, na 100-milimetrowych szalkach w DM EM zawierających 10% FCS, penicylinę, streptomycynę i dwie milimolowe L-glutaminę.

Następnego dnia przygotuj odczynniki do transfekcji dla każdej 100-milimetrowej płytki. Wymieszać pięć mikrogramów z biblioteki plazmidów, pięć mikrogramów plazmidu retrowirusowego i 40 mikrolitrów genu FU do całkowitej objętości 400 mikrolitrów przy użyciu pożywek DM E EM wolnych od surowicy. Inkubować mieszaninę DNA i lipidów przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie zastąp pożywkę limfocytów T HEK 2 93 świeżą pożywką i dodaj kroplami kompleks lipidowy DNA na wierzch komórek. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin. Po sześciu godzinach zastąp pożywkę do transfekcji świeżą pożywką i inkubuj płytki przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza na produkcję wirusa.

Po 48 godzinach inkubacji zebrać supernatanty wirusowe przefiltrowane przez filtr dyskowy acro o średnicy 0,45 mikrometra, aby rozpocząć procedurę badania przesiewowego i identyfikacji lekoopornych JAK: dwa mutanty V 607 F transdukują trzy komórki BAF z supernatantami retrowirusowymi. Wymieszaj 100 milionów BAF trzech komórek ze 100 mililitrami supernatantu wirusa do całkowitej objętości 300 mililitrów przy użyciu pożywki RPMI zawierającej 10% surowicy i poli mózgu. Rozprowadź tę mieszaninę supernatów komórek i wirusów na wiele płytek z sześcioma dołkami, wypełniając każdą studzienkę czterema do pięciu mililitrów.

Odwirować płytki w temperaturze 1 250 GS przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny następnego dnia, połączyć transdukowane komórki dla każdego stężenia leku. Wymieszaj 10 mililitrów komórek z ruksolitynibem w 50-mililitrowej probówce.

Stężenia ruksolitynibu badane w tym przykładzie wynoszą 1, 5, 2, 0,5 i 10 mikromolowych. Uzupełnić objętość do 40 mililitrów za pomocą RPMI zawierającego 20% surowicy. Dodaj 10 mililitrów 1,2% świdra do komórek i dokładnie wymieszaj płytkę w sześciu dołkach.

Dozowanie czterech mililitrów na studzienkę. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa tygodnie. Gdy odporne kolonie są widoczne, użyj końcówek pipet o pojemności 0,2 mililitra, aby wybrać kolonie i potoczyć je indywidualnie.

Na płytkach 24-dołkowych przez trzy do czterech dni zbiera się odporne trzy komórki BAF przez odwirowanie w 450 GS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po wyizolowaniu genomowego DNA za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji genomu DNA, amplifikuj JAK two CDNA na całej długości z genomowego DNA metodą PCR. Produkty PCR są następnie rozdzielane za pomocą elektroforezy żelowej Agar Rose i pasma DNA o długości 3,4 kilozasady.

Reprezentująca dwupowłokową ramę JAK jest izolowana za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu. Na koniec zsekwencjonuj CDNA na całej długości przy użyciu ośmiu wewnętrznych starterów obejmujących sekwencję kodującą i przeanalizuj sekwencje za pomocą komercyjnego oprogramowania w celu walidacji mutacji opornych na leki. Wybrane warianty in vitro są generowane przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce sekwencji JAK two V 617 F i ponownie wprowadzane do trzech komórek BAF.

Dodać 50 mikrolitrów pożywki zawierającej różne stężenia ruksolitynibu do studzienek na płytce osobno, płytkę 10 do czwartej BAF trzy JAK dwie komórki V 617 F do każdej studzienki 96-dołkowej płytki inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 godzin Aby ocenić żywotność komórek, dodaj 10 mikrolitrów WST jeden odczynnik do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do czterech godzin. Zapisać absorbancję przy 450 za pomocą czytnika płytek. Wykonać wszystkie testy w trzech egzemplarzach i wykreślić średnią absorbancję w stosunku do stężeń ruksolitynibu.

Wykonaj krzywą sigmoidalną o najlepszym dopasowaniu, korzystając z wyniku algorytmu dopasowania krzywej nieliniowej. Stężenie leku powodujące 50% żywotność komórek jako komórkowego IC 50, a następnie walidację in vivo opornych mutacji przeprowadza się zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Ponieważ oporne klony komórek powstałe w wyniku mutagenezy losowej mogą być nosicielami więcej niż jednej mutacji, mutacje te muszą zostać zwalidowane w izolacji zarówno za pomocą testów in vitro, jak i in vivo.

W teście in vitro wybrane warianty wygenerowano w drodze mutagenezy ukierunkowanej na miejsce sekwencji JAK two V 607 F i ponownie wprowadzono do trzech komórek BAF, które następnie zmierzono pod kątem zdolności do proliferacji komórek przy różnych dawkach ruksolitynibu w celu oceny wartości IC 50. Ponadto przeprowadzono immuno blot dla fosfotyrozyny lub fosfo STAT 5 na lizatach białkowych komórek BF trzy, które inkubowano z rosnącymi dawkami ruksolitynibu, aby wykluczyć jakąkolwiek oporność niezamierzoną. Mutanty wykazujące podwyższone wartości IC 50 i trwałą autofosforylację przy wyższych stężeniach ruksolitynibu są zatem wariantami opornymi na leki, co pozwala potwierdzić oporność in vivo.

Trzy komórki BF zmodyfikowane do ekspresji JAK, dwóch wariantów V, 17 F i lucyferazy, wiśni wstrzyknięto myszom, którym następnie wstrzyknięto ruksolitynib przez dwa tygodnie. Po dwóch tygodniach. Myszy zobrazowano pod kątem bioluminescencji katalizowanej lucyferazy, chimeryzmu BAF trzech w szpiku kostnym i obwodowego przepływu krwi oceniano, mierząc fluorescencję komórek wiśni dodatnich.

Wyniki pokazują, że myszy z ekspresją JAK dwa V 607 F są leczone ruksolitynibem, podczas gdy warianty oporne wykazują postępujący przyrost bioluminescencji w okresie leczenia. Po opanowaniu, losowa neogeneza może być wykonana w ciągu czterech do pięciu dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak opracować losowo zbilansowany plazmid, bibliotekę DNA do badań przesiewowych in vitro przeciwko dowolnej parze docelowej leku.

Nie zapominaj, że praca z retrowirusami może być niezwykle niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności.