Name: Przygotowanie osadu do hodowli krwi w celu szybkiej identyfikacji bakterii i badania wrażliwości na antybiotyki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Naucz się przygotowywać osad bakteryjny z dodatniej hodowli krwi do szybkiej identyfikacji metodą MALDI-TOF i testowania wrażliwości na antybiotyki. Ta technika skraca czas diagnostyki zakażeń krwi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy technikom z laboratorium bakteriologicznego Centrum Szpitala Uniwersyteckiego w Lozannie za pomoc we wdrożeniu technik w laboratorium.

Ten protokół został opracowany i zweryfikowany zgodnie z procesami badawczo-rozwojowymi oraz zasadami etycznymi naszej instytucji, zanim został wdrożony jako rutynowe narzędzie.
1. Przygotowanie osadu bakteryjnego z krwi za pomocą procedury lizy erytrocytów chlorku amonu
<ol>
	<li>Przygotowanie dodatniego posiewu krwi do późniejszego odwirowania.
	<ol>
		<li>Wysterylizuj nasadkę do hodowli krwi. Dodaj 70% etanolu na nakrętkę butelki i spal go. 
		UWAGA: Nie wykonuj tego kroku pod okapem z przepływem laminarnym.</li>
		<li>Przenieś butelkę do okapu z przepływem laminarnym. Zebrać 5 ml posiewu krwi za pomocą strzykawki 20 G.</li>
		<li>Dodać 5 ml posiewu krwi do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 45 ml sterylnej wody (H2O) i wymieszać próbkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie osadu bakteryjnego do hodowli krwi przez wirowanie lizy.
	<ol>
		<li>Odwirować próbkę o masie 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć supernatant (który zawiera głównieH2Oi komórki krwi) za pomocą laboratoryjnej pompy próżniowej.</li>
		<li>Zawiesić osad w 1 ml domowego roztworu lizy chlorku amonu (0,15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3). Rozbić osad przez zeskrobywanie i wirowanie probówki, a następnie odwirować próbkę o sile 140 x g przez 10 minut w temperaturze suchej masy.</li>
		<li>Odrzucić sklarowany stężenie, które zawiera głównie resztki czerwonych krwinek.
		<ol>
			<li>Jeśli osad pozostał krwotoczny, należy go ponownie zawiesić w 2 ml sterylnego i destylowanego H20 w celu dalszej lizy pozostałych krwinek czerwonych i przepłukania osadu. Odwirować próbkę o masie 140 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zawiesić osad w 200 μlH2O</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Subkultura posiewu krwi na różnych selektywnych i nieselektywnych pożywkach agarowych.
	<ol>
		<li>Zebrać 1 ml posiewu krwi za pomocą strzykawki 20 G.</li>
		<li>Zaszczepić 1 kroplę kultury krwi w czterech ćwiartkach na agarze z krwią, agarze czekoladowym, agarze McConkeya i agarze Schaedlera.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C płytki agaru z krwią i agarem czekoladowym w atmosferze 5%CO2, agar McConkey w normalnej atmosferze, a płytkę agarową Schaedlera w warunkach beztlenowych.</li>
		<li>Śledź rozwój bakterii na różnych podłożach.</li>
		<li>Sprawdź czystość bakteryjną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Identyfikacja przez MALDI-TOF MS
<ol>
	<li>Bezpośrednia identyfikacja na podstawie osadu krwi.
	<ol>
		<li>Przenieść 1 μl osadu krwi na tarczę tarczową MALDI i pozostawić do wyschnięcia na platformie grzewczej o temperaturze 42 °C.</li>
		<li>Nałożyć na próbkę 1 μl 70% kwasu mrówkowego i pozostawić do wyschnięcia na platformie grzewczej o temperaturze 42 °C.</li>
		<li>Nałożyć na próbkę 1 μl matrycy MALDI (nasycony roztwór kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego w 50% acetonitrylu-2,5% kwasie trifluorooctowym) i pozostawić do wyschnięcia na platformie grzewczej o temperaturze 42 °C.</li>
		<li>Przejdź do analizy MALDI-TOF MS za pomocą systemu MALDI-TOF MS zgodnie z opisem producenta.</li>
		<li>Jeżeli wynik identyfikacji jest nieważny na poziomie gatunku (na przykład z wynikiem < 2), należy przeprowadzić ekstrakcję białkową próbki osadu krwi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja po ekstrakcji białka z osadu hodowli krwi.
	<ol>
		<li>Zmieszać 20 μl osadu z 1 ml 70% etanolu i odwirować przy 13 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odrzucić sklarowany osad i dodać do osadu 25 μl 70% kwasu mrówkowego i 25 μl 100% acetonitrylu. Energicznie wirować, aby ponownie zawiesić granulki. Ponownie zawieś twarde granulki, rozbijając je końcówkami pipet przed wirowaniem.</li>
		<li>Odwirować przy 13 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Przenieść 1 μl supernatantu (zawierającego wyekstrahowane białka) na płytkę docelową MALDI i pozostawić do wyschnięcia na platformie grzewczej o temperaturze 42 °C. Postępować zgodnie z opisem w ppkt 2.1.2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Identyfikacja bakterii i badanie wrażliwości na antybiotyki za pomocą zautomatyzowanego systemu mikrobiologicznego
<ol>
	<li>Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej do identyfikacji bakterii i AspAT za pomocą zautomatyzowanego systemu mikrobiologicznego.
	<ol>
		<li>Przygotuj plastikową probówkę zawierającą 3 ml sterylnego 0,45% roztworu NaCl kompatybilnego z automatycznym systemem mikrobiologicznym.</li>
		<li>Dodać wystarczającą objętość osadu z hodowli krwi do 0,45 % roztworu NaCl, aby otrzymać zawiesinę bakteryjną odpowiadającą zmętnieniu McFarlanda wynoszącemu 0,6 do 0,8. Zmierz zmętnienie za pomocą densytometru. 
		UWAGA: Objętość osadu bakteryjnego z hodowli krwi waha się od 50 do 200 μl, aby osiągnąć zmętnienie McFarlanda od 0,6 do 0,8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaszczepić automatyczne karty Gram-dodatnie (GP) lub Gram-ujemne (GN) w celu identyfikacji oraz automatyczne karty AST do badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe ziarniaków Gram-dodatnich i bakterii Gram-ujemnych, zgodnie z opisem producenta. 
	UWAGA: Identyfikacja za pomocą kart GP lub GN nie jest stosowana, jeśli wartość wyniku identyfikacji MALDI-TOF MS wynosi >2. Sprawdź czystość zawiesiny bakteryjnej, umieszczając zawiesinę bakteryjną na płytkach z agordem z krwi (GP i GN) i agarem MacConkey (GN).</li>
</ol>
4. Badanie wrażliwości na antybiotyki za pomocą testu dyfuzji krążkowej
Test dyfuzji krążka jest opisany przez Europejski Komitet ds. Testowania Wrażliwości na Środki Przeciwdrobnoustrojowe (EUCAST, Wersja 3.0, kwiecień 2013, www.eucast.org).
<ol>
	<li>Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej do przeprowadzenia badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą testu dyfuzji krążkowej.
	<ol>
		<li>Przygotować szklaną probówkę zawierającą 3 ml sterylnego 0,9% roztworu NaCl.</li>
		<li>Dodać wystarczającą objętość osadu do hodowli krwi w 0,9% roztworze NaCl, aby uzyskać zawiesinę bakteryjną odpowiadającą zmętnieniu McFarlanda wynoszącemu 0,5. Zmierz zmętnienie za pomocą densytometru. 
		UWAGA: Objętość osadu bakteryjnego z hodowli krwi waha się od 50 do 200 μl, aby osiągnąć zmętnienie McFarlanda od 0,6 do 0,8.</li>
		<li>Odwiruj zawiesinę bakteryjną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inokulacja zawiesiny bakteryjnej na agarze Muellera-Hintona (MH) lub agarze Muellera-Hintona z agarem i organizmami wybrednymi (MHF) (MH uzupełniony 5% zdefibrynowaną krwią końską i 20 mg/L dinukleotydu β-nikotynamidoadeninowego).
	<ol>
		<li>Zanurz sterylny bawełniany wacik w zawiesinie bakteryjnej i delikatnie usuń nadmiar płynu, obracając wacik na wewnętrznej ściance szklanej rurki.</li>
		<li>Zawiesinę bakteryjną rozprowadzić równomiernie na całej powierzchni płytki agarowej MH/MHF, pobierając wymaz w trzech kierunkach lub za pomocą automatycznego rotatora płytek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nakładanie krążków przeciwdrobnoustrojowych na zaszczepione płytki agarowe.
	<ol>
		<li>Nanieść dokładnie krążki na powierzchnię wysuszonych inokulowanych płytek agarowych ręcznie lub za pomocą dozownika krążka do wykrywania wrażliwości.</li>
		<li>Inkubować płytkę w odpowiedniej temperaturze i atmosferze, zgodnie z opisem w metodzie badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe EUCAST (wersja 3.0, kwiecień 2013 r., www.eucast.org).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Zautomatyzowany test diagnostyczny oparty na PCR do wykrywania MRSA
<ol>
	<li>Za pomocą mikropipety przenieś 50 μl osadu z posiewu krwi do fiolki z odczynnikiem do próbki dostarczonej z zestawem do automatycznego testu diagnostycznego opartego na PCR MRSA i wiruj przez 20 sekund.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml dozować próbkę do portu próbki we wkładzie. Włóż wkład do automatycznego systemu PCR i rozpocznij test zgodnie z opisem producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Alberti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+sepsis+and+infection+in+ICU+patients+from+an+international+multicentre+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study.</a> Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).</li>
<li>Angus, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+severe+sepsis+in+the+United+States%3A+analysis+of+incidence%2C+outcome%2C+and+associated+costs+of+care%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care.</a> Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).</li>
<li>Vincent, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis+in+European+intensive+care+units+results+of+the+SOAP+study%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study.</a> Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).</li>
<li>Micek, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Empiric+combination+antibiotic+therapy+is+associated+with+improved+outcome+against+sepsis+due+to+Gram-negative+bacteria+a+retrospective+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).</li>
<li>Seifert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+importance+of+microbiological+findings+in+the+diagnosis+and+management+of+bloodstream+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections.</a> Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).</li>
<li>Barenfanger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+mortality+associated+with+prompt+Gram+staining+of+blood+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+clinical+pathology%22%5BJournal%5D)">Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures.</a> American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).</li>
<li>Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+treatment+of+bloodstream+infection%3A+laboratory+reporting+and+antimicrobial+management%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management.</a> J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).</li>
<li>Clerc, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+on+the+clinical+management+of+patients+with+Gram-negative+bacteremia+a+prospective+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study.</a> Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).</li>
<li>Meex, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+identification+of+bacteria+from+BacT%2FALERT+anaerobic+positive+blood+cultures+by+MALDI-TOF+MS+MALDI+Sepsityper+kit+versus+an+in-house+saponin+method+for+bacterial+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction.</a> Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).</li>
<li>Moussaoui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+identifies+90%25+of+bacteria+directly+from+blood+culture+vials%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials.</a> Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).</li>
<li>Seng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ongoing+revolution+in+bacteriology+routine+identification+of+bacteria+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).</li>
<li>Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+bacteria+in+positive+blood+culture+broths+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry.</a> J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).</li>
<li>Croxatto, A., Prod&34hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+diagnostic+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology.</a> FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).</li>
<li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+bacterial+identification+in+positive+blood+cultures+by+use+of+two+commercial+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems.</a> J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).</li>
<li>Prod&34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+for+direct+bacterial+identification+from+positive+blood+culture+pellets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets.</a> J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).</li>
<li>Prod&34hom, G., Durussel, C., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+blood-culture+bacterial+pellet+preparation+for+faster+accurate+direct+bacterial+identification+and+antibiotic+susceptibility+testing+with+the+VITEK+2+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medical+microbiology%22%5BJournal%5D)">A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system.</a> Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).</li>
<li>Clerc, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+and+PCR-based+rapid+diagnosis+of+Staphylococcus+aureus+bacteraemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia.</a> Clin Microbiol Infect. , (2013).</li>
<li>Martiny, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+rapid+microbial+identification+directly+from+positive+blood+cultures+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry+on+patient+management%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management.</a> Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).</li>
<li>Stoneking, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Would+earlier+microbe+identification+alter+antibiotic+therapy+in+bacteremic+emergency+department+patients%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+emergency+medicine%22%5BJournal%5D)">Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients.</a> The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).</li>
<li>Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+extended-spectrum-beta-lactamase-producing+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae.</a> J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W porównaniu z konwencjonalnymi metodami diagnostycznymi z dodatnim wynikiem posiewu krwi, szybkie pozyskanie osadu bakteryjnego przy użyciu metody wirowania chlorku amonu z wirowaniem do lizy skraca czas identyfikacji o 16 do 24 godzin, a czas zgłaszania AspAT o 24 do 48 godzin (ryc. 1 i 3).
Szybkie wprowadzenie odpowiedniej antybiotykoterapii ma kluczowe znaczenie dla poprawy wyników leczenia pacjentów cierpiących na zakażenia krwi. W związku z tym wczesna identyfikacja czyn...

Zakażenia krwi i sepsa u hospitalizowanych pacjentów są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności. Tak więc śmiertelność związana z zakażeniami krwi obserwuje się u około 14% do 37% hospitalizowanych pacjentów i może wzrosnąć do 35% u pacjentów oddziałów intensywnej terapii 1-3. Szybka identyfikacja czynnika zakaźnego ma zasadnicze znaczenie dla ukierunkowania optymalnego leczenia przeciwbakteryjnego i zwiększenia pomyślnego wyniku terapii przeciwbakteryjnej 4,5. Szybka analiza barwień metodą Grama z dodatniego posiewu krwi ma już znaczący wpływ na adaptację terapii przeciwdrobnoustrojowej 6,7, ale dokładna identyfikacja czynnika zakaźnego jest wymagana, aby zapewnić pacjentom najlepiej przystosowane leczenie antybiotykami. Na przykład po bakteriemii enterokoków i paciorkowców, które są trudne do odróżnienia za pomocą barwienia metodą Grama, konieczne jest wdrożenie różnych schematów leczenia antybiotykami. Podobnie, identyfikacja na poziomie gatunku jest wymagana w celu wykrycia enterobakterii Gram-ujemnych kodujących chromosomalny gen ampC, który nadaje zwiększoną oporność na β-laktamy 8.
Przy dodatnim posiewie krwi, konwencjonalnym podejściem diagnostycznym jest subhodowla czynnika zakaźnego na różnych płytkach agarowych, co wymaga kilku godzin dodatkowej inkubacji przed identyfikacją za pomocą różnych metod, w tym testów biochemicznych, wzrostu na różnych selektywnych pożywkach i zautomatyzowanych systemów identyfikacji mikrobiologicznej. Czas oczekiwania na wyniki konwencjonalnego podejścia diagnostycznego wynosi około 1 do 3 dni.
Pojawienie się technologii spektrometrii mas z laserową desorpcją/jonizacją (MALDI-TOF) do szybkiej identyfikacji mikroorganizmów dostarczyło nowego narzędzia do szybkiej identyfikacji mikroorganizmów z kolonii hodowanych na płytkach agarowych, ale także bezpośrednio z dodatnich kultur krwi (Rysunek 1) 9-12. Zastosowanie MALDI-TOF do identyfikacji czynnika zakaźnego na podstawie posiewów krwi znacznie skróciło czas oczekiwania na wyniki do kilku minut zamiast godzin i dni wymaganych tradycyjnymi metodami. Jak omówili Croxatto i wsp. 13, skuteczność identyfikacji MALDI-TOF zależy od różnych parametrów, w tym czystości i ilości mikroorganizmu. Te dwa kryteria można łatwo uzyskać z dyskretnych kolonii hodowanych na płytkach agarowych, ale wymagały one obróbki wstępnej w celu wzbogacenia i oczyszczenia bakterii ze złożonych próbek, takich jak hodowla krwi, które zawierają wiele składników komórkowych i białkowych, które mogą zakłócać identyfikację MALDI-TOF.
Różne metody izolacji mikroorganizmów z hodowli krwi były używane w wielu badaniach, w tym saponina lub inne łagodne detergenty metoda ekstrakcji bakteryjnej 9,14, metoda separatora surowicy 10, metody wirowania lizy 12 i komercyjne rozwiązania, takie jak zestaw sepsityper. Nasze bakteriologiczne laboratorium diagnostyczne opracowało prosty preparat osadów bakteryjnych do hodowli krwi na bazie lizy erytrocytów chlorku amonu, który umożliwia szybką identyfikację bakterii i drożdży za pomocą MALDI-TOF i automatycznych systemów identyfikacji (ryc. 2) 15. Ten preparat osadów z hodowli krwi stanowi również próbkę do innych bezpośrednich zastosowań końcowych, takich jak barwienie metodą Grama, zautomatyzowane testy diagnostyczne oparte na PCR, TAKIE JAK POCT-PCR do szybkiego wykrywania opornego na metycylinę Staphyloccocus aureus (MRSA) oraz testowanie wrażliwości na antybiotyki za pomocą zautomatyzowanych systemów AST i / lub testów dyfuzji krążkowej na płytkach agarowych (ryc. 3).
W tej pracy opisujemy różne etapy przygotowania osadu bakteryjnego z hodowli krwi, jak wyjaśnili Prod'hom et al.15 (Rysunek 4). Opiszemy również protokoły dla trzech głównych zastosowań, które można wykonać na osadach do hodowli krwi: identyfikacja za pomocą MALDI-TOF 15, identyfikacja (ID) i badanie wrażliwości na antybiotyki (AST) za pomocą zautomatyzowanych systemów 16 dla Enterobacteriaceae i gronkowców oraz zautomatyzowany test diagnostyczny oparty na PCR do wykrywania MRSA 17.

<table><tbody><tr><td>Igła 20 G</td><td>Terumo, Leuven, Belgia</td><td>NN-2038R</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówka Falcon</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>352070</td><td>Probówki wirówkowe 50 ml</td></tr><tr><td>Chlorur amonu</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>101145</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan potasu</td><td>Fluka, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>60340</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone&nbsp;</td><td>F0507</td><td>Łatwopalny,</td></tr><tr><td>&#945;-Kwas cyjano-4-hydroksycynamonowy</td><td>Fluka, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>70990</td><td>Toksyczność ostra</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>271004</td><td>Łatwopalny, toksyczny</td></tr><tr><td>ostry kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>T6508</td><td>, ostra toksyczność</td></tr><tr><td>Vitek 2 60 instrument</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Francja</td><td>27202</td><td>zautomatyzowany instrument do systemu mikrobiologicznego</td></tr><tr><td>Vitek 2 Gram-dodatnia (GP) karta</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Francja</td><td>21342</td><td>automatyczna karta identyfikacyjna GP&nbsp;</td></tr><tr><td>karta identyfikacyjna Vitek 2 AST-P580</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Francja</td><td>22233</td><td>zautomatyzowany mikrobiologiczny system AST</td></tr><tr><td>Vitek 2 Gram-ujemna (GN) karta</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Francja</td><td>21341</td><td>automatyczna karta identyfikacyjna GN&nbsp;</td></tr><tr><td>karta Vitek 2 AST-N242</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Francja</td><td>413391</td><td>zautomatyzowany mikrobiologiczny system AST</td></tr><tr><td>Xpert MRSA</td><td>Cepheid, Sunnyvale, Kalifornia, USA&</td><td>nbsp; GXMRSA-100N-10</td><td>technologia amplifikacji kwasów nukleinowych Instrument MRSA</td></tr><tr><td>GeneXpert IV</td><td>Cepheid, Sunnyvale, Kalifornia, USA</td><td>Przyrząd do amplifikacji kwasów nukleinowych</td><td>GXIV-4-D</td></tr><tr><td>Przyrząd Microflex LT MALDI-TOF MS Bruker</td><td>Daltonics, Brema, Niemcy</td><td>BDAL microflex LT/SH</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 stal celownicza BC</td><td>Bruker Daltonics, Brema, Niemcy</td><td>280799</td><td>tarcza celownicza MALDI</td></tr><tr><td>Densytometr Densicheck przyrząd</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Francja</td><td>27208</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw MALDI Sepsityper 50</td><td>Bruker Daltonics, Brema, Niemcy</td><td>8270170</td><td></td></tr><tr><td>Mac Conkey agar</td><td>Biolife, Mediolan, Włochy</td><td>4016702</td><td></td></tr><tr><td>Agar Mueller-Hinton</td><td>Oxoid, Hampshire, Anglia</td><td>CM0337</td><td>Agar Mueller-Hinton (MH)&nbsp;</td></tr><tr><td>Agar MHF</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Francja</td><td>43901</td><td>Agar Mueller-Hinton agar-wybredne organizmy (MHF)</td></tr><tr><td>BD Columbia III agar</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>254071</td><td>agar z krwią</td></tr><tr><td>Agar czekoladowy BD</td>, <td>Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>254089</td><td>agar czekoladowy</td></tr><tr><td>BD schaedler agar</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>254084</td><td>Agar Schaedler</td></tr></tbody></table>

przygotowanie osadu do hodowli krwi w celu szybkiej identyfikacji bakterii i badania wrażliwości na antybiotyki

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Zakażenia krwi i sepsa są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności. Pomyślny wynik leczenia pacjentów cierpiących na bakteriemię zależy od szybkiej identyfikacji czynnika zakaźnego w celu ukierunkowania optymalnego leczenia antybiotykami. Analiza barwień metodą Grama z dodatniego posiewu krwi może być szybko przeprowadzona i już teraz znacząco wpływa na schemat antybiotykowy. Jednak dokładna identyfikacja czynnika zakaźnego jest nadal wymagana w celu ustalenia optymalnego leczenia celowanego. Przedstawiamy tutaj prosty i szybki preparat osadów bakteryjnych z dodatniej liczby kultur krwi, który można wykorzystać jako próbkę do kilku istotnych dalszych zastosowań, takich jak identyfikacja za pomocą MALDI-TOF MS, badanie wrażliwości na antybiotyki (AST) za pomocą testu dyfuzji krążka lub zautomatyzowanych systemów AST oraz za pomocą zautomatyzowanych testów diagnostycznych opartych na PCR. Wydajność tych różnych systemów identyfikacji i AspAT stosowanych bezpośrednio na osadach bakteryjnych z hodowli krwi jest bardzo podobna do wydajności zwykle uzyskiwanej z izolowanych kolonii hodowanych na płytkach agarowych. W porównaniu z konwencjonalnymi metodami, szybkie pozyskanie osadu bakteryjnego znacznie skraca czas zgłaszania zarówno identyfikacji, jak i AspAT. W związku z tym, po dodatnim wyniku posiewu krwi, identyfikacja za pomocą MALDI-TOF może być zgłoszona w czasie krótszym niż 1 godzina, podczas gdy wyniki AST za pomocą zautomatyzowanych systemów AST lub testów dyfuzji krążków odpowiednio w ciągu 8 do 18 godzin. Podobnie, wyniki szybkiego testu opartego na PCR mogą być przekazane klinicystom w czasie krótszym niż 2 godziny od zgłoszenia bakteriemii. Łącznie wyniki te pokazują, że szybkie przygotowanie osadu bakteryjnego do posiewu krwi ma znaczący wpływ na identyfikację i czas realizacji AST, a tym samym na pomyślne wyniki leczenia pacjentów cierpiących na infekcje krwi.

W badaniu przeprowadzonym przez Prod’homa et al.15 osady bakteryjne uzyskane poprzez wirowanie po lizie chlorkiem amonu z 122 dodatnich posiewów krwi od 78 pacjentów zostały poddane analizie metodą MALDI-TOF MS. Spośród 122 dodatnich posiewów krwi, 95 (77,9%) zidentyfikowano prawidłowo na poziomie gatunkowym, a jeden (0,8%) na poziomie rodzaju. Pozostałe 26 (21,3%) osadów z posiewów krwi nie pozwoliło na wiarygodną identyfikację za pomocą MALDI-TOF. Wśród nich 21 stanowiły bakterie gram-dodatnie, w ty...

Szybki preparat bakteryjny z dodatniego posiewu krwi może być użyty jako próbka do zastosowań takich jak identyfikacja za pomocą MALDI-TOF, barwienie metodą Grama, testowanie wrażliwości na antybiotyki i test oparty na PCR. Wyniki mogą być szybko przekazywane klinicystom w celu poprawy wyników leczenia pacjentów cierpiących na infekcje krwi.

Przygotowanie osadu do hodowli krwi w celu szybkiej identyfikacji bakterii i badania wrażliwości na antybiotyki

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie osadu bakteryjnego z dodatniego wyniku posiewu krwi, który można wykorzystać jako próbkę do różnych zastosowań. Osiąga się to poprzez najpierw zmieszanie dodatniej hodowli krwi ze sterylną wodą po odwirowaniu. Osad jest ponownie zawieszany w chlorku amonu w celu usunięcia z czerwonych krwinek po drugiej rundzie wirowania.Osad jest ponownie zawieszany w wodzie. Ostatnim krokiem jest wykorzystanie otrzymanego granulatu do identyfikacji bakterii za pomocą desorpcji laserowej, jonizacji wspomaganej matrycą, czasu przelotu, barwienia metodą Grama, testów wrażliwości na antybiotyki lub testów opartych na PCR. Ostatecznie uzyskane wyniki można szybko przekazać klinicystom w celu poprawy wyników leczenia pacjentów cierpiących na infekcje krwi.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak subkultura bakteryjna dodatnich posiewów krwi, jest skrócenie identyfikacji bakterii o około sześć do 24 godzin i skrócenie czasu do uzyskania wyników oporności na antybiotyki o około 24 godziny. Metoda ta może pomóc w szybkim dostosowaniu antybiotykoterapii i poprawie wyników leczenia pacjentów cierpiących na infekcje krwi. Chociaż metoda

preparation-blood-culture-pellet-for-rapid-bacterial-identification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Szybki protokół bezpośredniej identyfikacji Enterococcus faecalis oraz innych gatunków Enterococcus z dodatniej posiewu krwi z wykorzystaniem testu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z użyciem kwasów nukleinowych peptydowych (PNA FISH).

Procedura trwająca 1,5 godziny służąca do identyfikacji gatunków Enterococcus bezpośrednio z posiewów krwi

Opracowanie prostego, jednodniowego schematu przepływu pracy w diagnostyce patogenów bakteryjnych umożliwia szybkie rozpoznanie zakażeń krwi. Uwzględnienie ośmiu istotnych klinicznie celów bakteryjnych oraz ich profili oporności na antybiotyki dostarcza lekarzowi wstępnych informacji tego samego dnia, co może prowadzić do zastosowania bardziej odpowiedniej terapii.

Jednodniowy schemat przepływu pracy dla wykrywania patogenów bakteryjnych i badania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe z posiewów krwi

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Źródło: Feltwell, T., et.al. Oddzielanie bakterii według ilości kapsułki za pomocą nieciągłego gradientu gęstości. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia przygotowanie i charakterystykę szczepów bakteryjnych o różnej produkcji kapsułek. Szczepy chorobotwórcze niosące różne mutacje w genach związanych z kapsułkami są hodowane, hodowane w płynnych pożywkach i poddawane wirowaniu w celu rozróżnienia fenotypów kapsułek na podstawie gęstości osadów. Leczenie buforowe stosuje się w celu...

Hodowla i izolacja chorobotwórczych szczepów bakterii tworzących kapsułki

Źródło: Koeth, L. M., et al., A Reference Bulion Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobical. J. Vis. Exp. (2015).Ten film przedstawia metodę mikrorozcieńczenia bulionu w celu określenia minimalnego stężenia hamującego (MIC) antybiotyku lipoglikopeptydowego przeciwko bakteriom Gram-dodatnim. Obejmuje izolację kolonii bakteryjnych, rozcieńczanie, inokulację studzienek mikropłytek o różnych stężeniach antybiotyków oraz weryfikację czystości...

Metoda mikrorozcieńczania bulionu do badania wrażliwości bakterii Gram-dodatnich na antybiotyki

Ten film demonstruje test do badania przesiewowego związków przeciwdrobnoustrojowych, które skutecznie eliminują biofilmy za pomocą płytki kołkowej. Metodologia ta monitoruje stan metaboliczny biofilmu po poddaniu działaniu związków przeciwdrobnoustrojowych, ułatwiając określenie minimalnego stężenia eradykacji biofilmu.

Test biofilmu na płytce kołkowej do badań przesiewowych środków przeciwbakteryjnych

Zastosowanie spektrometrii mas (MS) z laserową desorpcją/jonizacją (MALDI-TOF) bezpośrednio do bulionu z hodowli krwi przyspiesza identyfikację bakterii. Przedstawiona metoda jest szybką i wiarygodną metodą identyfikacji bakterii Gram-ujemnych bezpośrednio z bulionu z posiewów krwi.

Szybka identyfikacja bakterii Gram-ujemnych w bulionie z posiewu krwi przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF

Testy synergii przeciwdrobnoustrojowej są używane do oceny efektu dwóch lub więcej antybiotyków stosowanych w połączeniu i zazwyczaj są wykonywane za pomocą jednej z dwóch metod: szachownicy lub testu zabijania czasu. W tym miejscu przedstawiamy zautomatyzowaną, wspomaganą drukarką atramentową technikę synergii tablicy szachownicowej oraz klasyczne badanie synergii zabijania czasu.

Testowanie synergii przeciwdrobnoustrojowej za pomocą zautomatyzowanej tablicy szachownicy wspomaganej drukarką atramentową i ręcznej metody zabijania czasu

Ten protokół przedstawia szybki test wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) w ciągu 2,5 godziny poprzez stymulowane pojedynczymi komórkami obrazowanie metabolizmu D2O. Metoda ta ma zastosowanie do bakterii w moczu lub środowisku krwi pełnej, które są transformujące dla szybkiego jednokomórkowego fenotypowego AspAT w klinice.

Szybkie badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana indukcji deuteru w pojedynczej bakterii

EUCAST opracował protokół bezpośredniego testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) dla automatycznych hodowli krwi. Jednak jego zależność od identyfikacji mikrobiologicznej opartej na spektrometrii mas można wyeliminować, stosując protokół bezpośredniego przygotowania inokulum w zautomatyzowanym systemie identyfikacji drobnoustrojów. Takie podejście może dostarczyć raporty AST w ciągu 24 godzin od pobrania próbki.

Bezpośrednia identyfikacja mikrobiologiczna przy użyciu zautomatyzowanego systemu identyfikacji drobnoustrojów w celu ułatwienia metody EUCAST RAST bez spektrometrii mas

Naucz się przygotowywać osad bakteryjny z dodatniej hodowli krwi do szybkiej identyfikacji metodą MALDI-TOF i testowania wrażliwości na antybiotyki. Ta technika skraca czas diagnostyki zakażeń krwi.

Przygotowanie osadu do hodowli krwi w celu szybkiej identyfikacji bakterii i badania wrażliwości na antybiotyki

Przeglądaj więcej filmów