Name: Izolacja i hodowla zdysocjowanych neuronów czuciowych z zarodków piskląt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Naucz się izolować i hodować neurony czuciowe z zarodków piskląt, wykorzystując metodę zdysocjowanych komórek z ganglionów korzeniowych. Ta technika umożliwia badanie biologii komórkowej neuronów w kontrolowanych warunkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Alison Philbrook, Belindzie Barbagallo i Michaelowi Francisowi za wnikliwe komentarze do tego artykułu. Badania przedstawione w tej publikacji zostały poparte nagrodą R15 AREA 1R15NS070172-01A1 przyznaną MLL.

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych: mycie kwasem i pieczenie
<ol>
	<li>Co najmniej 2 dni przed sekcją (krok 2) rozpocznij następujące kroki w celu przygotowania szkiełek nakrywkowych. Wykonaj etap mycia kwasem, aby usunąć oleje i dokładnie wyczyścić szkiełka nakrywkowe.</li>
	<li>Załaduj szkiełka nakrywkowe do porcelanowego uchwytu, który ustawia szkiełka nakrywkowe w pionie i zapobiega ich stykaniu się. Zanurz uchwyt i szkiełka nakrywkowe w szklanym pojemniku histologicznym wypełnionym 2 M kwasem solnym (HCl). Alternatywnie, jeśli uchwyt na porcelanę nie jest dostępny, rozłóż ~20 szkiełek nakrywkowych poziomo, aby przykryć dno szklanej szalki Petriego o średnicy 100 mm i zanurz szkiełka nakrywkowe w 2 M HCl.</li>
	<li>Umieść szklane naczynie (ze szkiełkami nakrywkowymi zanurzonymi w kwasie) na stole bujanym w dygestoriach i pozwól na delikatne kołysanie przez co najmniej 5 godzin w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, szkiełka nakrywkowe należy myć kwasem przez noc w tych samych warunkach.</li>
	<li>Umyć szkiełka nakrywkowe destylowanymH2O(dH2O), przenosząc porcelanowy uchwyt załadowany szkiełkami nakrywkowymi z 2 M HCl do czystego szklanego pojemnika histologicznego wypełnionegodH2O. Alternatywnie, zdekantować 2 M HCl ze szklanej szalki Petriego z szkiełkami nakrywkowymi i ponownie napełnićdH2O.</li>
	<li>Umyć przez ponowne opróżnienie dH2O i ponowne napełnienie szklanego naczynia świeżą dH2O. Powtórz w sumie 3 szybkie mycia.</li>
	<li>Dłuższy cykl mycia należy rozpocząć od ponownego umieszczenia szklanego naczynia (z szkiełkami nakrywkowymi i dH2O) na bujaku. Pozostawić do delikatnego mieszania przez 10-30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zdekantować dH2O i dodać świeże dH2O. Powtórz w sumie co najmniej dziesięć prań. Alternatywnie kontynuuj mycie przez noc.</li>
	<li>Umyte szkiełka nakrywkowe umieścić w piecu nagrzanym do temperatury 350 °C. W przypadku korzystania z uchwytu porcelanowego należy wyjąć uchwyt z pojemnika szklanego wypełnionego dH2O, a następnie umieścić uchwyt z szkiełkami nakrywkowymi bezpośrednio w piecu. W przypadku użycia szklanej szalki Petriego zdekantować dH2O i umieścić szklane naczynie z szkiełkami nakrywkowymi w piecu.</li>
	<li>Piec szkiełka nakrywkowe przez co najmniej pięć godzin lub przez noc w temperaturze 350 °C.</li>
	<li>Po zakończeniu pieczenia usuń szkiełka nakrywkowe z porcelanowego uchwytu za pomocą drobnych kleszczyków i umieść w sterylnej szklanej szalce Petriego o średnicy 100 mm. Pozostaw szkiełka nakrywkowe, które nie były pierwotnie umieszczone w porcelanowym uchwycie, w szklanej szalce Petriego.</li>
</ol>
2. Sekcja piskląt i izolacja DRG
<ol>
	<li>Wyjąć z inkubatora płodne, wyprofilowane jajo piskląt White Leghorn (utrzymywane w temperaturze 37-38,5 °C z delikatnym kołysaniem). 
	UWAGA: Poprzednie badania wykorzystywały dzień embrionalny 7-10 do izolacji DRG2,8,11-13,16.</li>
	<li>Umieść wybrane jajko w okapie z przepływem laminarnym. Wszystkie wymienione poniżej procedury należy przeprowadzić w warunkach aseptycznych w okapie z przepływem laminarnym przy użyciu sterylnych roztworów i narzędzi. Podgrzej wszystkie roztwory w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Rozbij jajko i umieść jego zawartość na plastikowej szalce Petriego o średnicy 100 mm. Użyj standardowych kleszczy, aby przenieść zarodek na inną 100-milimetrową szalkę Petriego.</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura dodaj podgrzany 1x PBS do szalki Petriego, aby tkanka była mokra. Odetnij głowę zarodkowi, szczypiąc szyję drobnymi kleszczami. Przenieść ciało na inną czystą szalkę Petriego o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Dodaj ciepłe F12HS10 (F12 szynki, 10 mM HEPES, 100 jednostek/ml penicyliny, 0,1 mg/ml streptomycyny, 10% płodowej surowicy bydlęcej) do naczynia za pomocą pipety Pasteura, aby tkanka była mokra. Użyj kleszczy, aby ustawić zarodek na jego grzbietowej stronie (ryc. 1A).</li>
	<li>Umieścić 100 mm plastikową szalkę Petriego zawierającą tkankę zarodkową na lornetkowym stereowizyjnym mikroskopie preparacyjnym w kapturze z przepływem laminarnym. Użyj cienkich kleszczyków, aby wykonać pionowe nacięcie w linii środkowej od ogona do szyi, ściskając rozwijającą się skórę właściwą, aby odsłonić serce, płuca i inne narządy. Alternatywnie wykonaj serię małych łez, aby odsłonić narządy wewnętrzne.</li>
	<li>Delikatnie użyj 2 zestawów sterylnych cienkich kleszczy, aby: a) chwycić za szyję i b) chwycić aortę lub inną tkankę znajdującą się bezpośrednio nad sercem i pociągnąć w kierunku ogona, patrosząc zwierzę.</li>
	<li>Nałóż ciepłą F12HS10 pipetą Pasteura na chusteczkę. Użyj kleszczy, aby usunąć wszelkie pozostałe narządy sercowo-naczyniowe, oddechowe lub trawienne, aby odsłonić rozwijające się żebra, kręgosłup i DRG (ryc. 1B-1D).</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym użyj drobnych kleszczy, aby dalej usunąć narządy i zebrać DRG po obu stronach kręgosłupa lędźwiowego, poniżej żeber. Zbieraj DRG, wyrywając nienaruszone DRG z zarodka. Ściśnij i odetnij korzenie, które sięgają od DRG w kierunku rdzenia kręgowego i chwytając rozwijający się nerw, który sięga od DRG w kierunku obwodu lub odwrotnie.</li>
	<li>Umieść nienaruszone DRG w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm wypełnionym ciepłym F12HS10. Usuń nadmiar tkanki, takiej jak korzenie grzbietowe lub brzuszne, które mogły przylgnąć do DRG, z nienaruszonych DRG w szalce 35 mm, ściskając drobnymi kleszkami.</li>
	<li>Aby uzyskać DRG lepsze niż odcinek lędźwiowy, należy usunąć brzuszną połowę kręgosłupa piersiowego i szyjnego. Odbywa się to poprzez wykonanie nacięcia w rozwijającym się kręgosłupie prostopadłym do osi rdzenia kręgowego w górnej części odcinka szyjnego i kolejnego cięcia w górnym odcinku lędźwiowym. Następnie wykonaj nacięcia równoległe do osi rdzenia kręgowego wzdłuż prawej i lewej strony kręgosłupa. Podnieś brzuszną połowę kręgosłupa z zarodka, który odsłania rdzeń kręgowy (ryc. 1E-1F).</li>
	<li>Aby umożliwić łatwy dostęp do DRG, usuń rdzeń kręgowy w odcinku piersiowym i szyjnym, chwytając rdzeń kręgowy cienkimi kleszczami. Użyj kleszczy, aby wyjąć rdzeń kręgowy z kręgosłupa. W przybliżeniu rdzeń kręgowy klatki piersiowej znajduje się na poziomie żeber, a obszar szyjny jest wyższy od żeber.</li>
	<li>Zbierz nienaruszone DRG klatki piersiowej i szyjki macicy za pomocą cienkich kleszczy i umieść je w ciepłym F12HS10 z innymi DRG. Usuń nadmiar tkanki, która może przylegać do DRG.</li>
	<li>Przepłucz wnętrze nowej szklanej pipety Pasteura za pomocą F12HS10, aby zapobiec przywieraniu DRG do ścianek pipety. Za pomocą przepłukanej pipety przenieś wszystkie DRG i F12HS10 z małej szalki Petriego do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i natychmiast przejdź do kroku 3. 
	UWAGA: Dodatkowe zarodki mogą być preparowane w celu zwiększenia liczby DRG. DRG powinny być przechowywane w F12HS10 w temperaturze 37 °C do momentu przygotowania do etapu 3.</li>
</ol>
3. Dysocjacja, wzbogacanie i kulturowanie neuronów DRG – część 1
<ol>
	<li>Umieść stożkową probówkę z nienaruszonymi DRG w wirówce i delikatnie wiruj (200 x g) przez 2-3 minuty. Upewnij się, że DRG opadły na dno probówki. Jeśli nie, zakręć ponownie.</li>
	<li>Za pomocą pipety delikatnie usuń F12HS10, pozostawiając granulki DRG w spokoju. Dodaj 2 ml 1x PBS bez wapnia i magnezu (CMF), usuwając osad DRG. Ponownie odwiruj i usuń CMF PBS, pozostawiając nienaruszoną osadę DRG. Powtórz ten etap płukania, w sumie trzy płukania, aby usunąć płodową surowicę bydlęcą w F12HS10, która zakłóciłaby trawienie trypsyny w następnym kroku.</li>
	<li>Dodać 2 ml podgrzanej trypsyny do 15 ml probówki zawierającej 2 ml CMF PBS i DRG. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10-15 minut, aby strawić DRG do zdysocjowanych komórek.</li>
	<li>Podczas inkubacji przygotować F12H + suplement zawierający pożywkę (F12 Ham's, 10 mM HEPES 100 jednostek/ml penicyliny, 0,1 mg/ml streptomycyny, 10 ng/ml NT3, 10 ng/ml NGF, 200 mM l-glutaminy i N2) i ogrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Zazwyczaj 10 ml całkowitej pożywki wystarcza na 4-5 szalek o średnicy 35 mm pierwotnych neuronów czuciowych. Rozpocznij również rozmrażanie lamininy-1 do powlekania szkiełek nakrywkowych (krok 4).</li>
	<li>Delikatnie rozcierać DRG w roztworze trypsyny za pomocą pipety p1000 i wizualnie sprawdzić, czy nie ma nienaruszonych DRG. Kontynuować rozcieranie do momentu, gdy nienaruszone DRG nie będą już widoczne gołym okiem i/lub pozwolić na dłuższą inkubację trypsyny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż do dysocjacji nienaruszonych DRG. Aby chronić neurony DRG przed uszkodzeniem, unikaj pęcherzyków powietrza podczas rozcierania i ogranicz trawienie trypsyny do <30 min.</li>
	<li>Probówka wirówkowa zawierająca zdysocjowane DRG i trypsynę w ilości 200 x g przez 3-5 minut w celu uzyskania osadu. W razie potrzeby wiruj dłużej, aż utworzy się granulka.</li>
	<li>Ostrożnie odessać trypsynę, nie przerywając osadu. Dodać 2 ml F12HS10 do granulek. Delikatnie rozcierać DRG za pomocą końcówki do pipet p1000.</li>
	<li>Przenieść całą zawartość z 15 ml stożkowej probówki do naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm. Przepłukać probówkę 8 ml F12HS10 i przenieść ją do naczynia hodowlanego, po 2 ml na raz, w sumie 10 ml. Ten etap płukania pomaga zebrać komórki, które mogły pozostać przyklejone do ścianek probówki.</li>
	<li>Umieścić 100 mm naczynie hodowlane (z 10 ml F12HS10 i zdysocjowanymi komórkami DRG) w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C na 3 godziny 
	UWAGA: CO2 nie jest wymagany w inkubatorze, ponieważ HEPES buforuje pH pożywki przy braku CO2 . Podczas inkubacji komórki glejowe wiążą się z powierzchnią plastiku hodowli tkankowej, a neurony mają tendencję do luźnego przylegania do podłoża glejowego.</li>
</ol>
4. Powlekanie krykieł mytych kwasem i pieczonych szkiełek nakrywkowych Lamininą-1
<ol>
	<li>Rozmrozić sterylne porcje zamrożonej lamininy-1 na lodzie.</li>
	<li>W sterylnych warunkach dodać 1 ml sterylnego 1x PBS do 50 μl podwielokrotności lamininy-1.</li>
	<li>Za pomocą spektrofotometru uzyskać wartość absorbancji lamininy-1 przy długości fali 280 nm. Użyj tej wartości w poniższym równaniu, aby określić stężenie lamininy-1.</li>
</ol>
ABS 280 = (stężenie mg/ml) * (współczynnik ekstynkcji białka) 
Współczynnik ekstynkcji dla lamininy-1 wynosi 0,86.
<ol start="4">
	<li>W sterylnych warunkach rozcieńczyć lamininę-1 1X PBS, aby uzyskać stężenia 1 mg/ml i 20 mg/ml. Użyć tych dwóch zastosowanych stężeń lamininy-1, aby uzyskać dziesięciokrotną różnicę lamininy-1 związanej ze szkiełkiem nakrywkowym (odpowiednio 30 ng/cm2 i 300 ng/cm2) po inkubacji7,8,10.</li>
	<li>W okapie z przepływem laminarnym za pomocą cienkich kleszczyków umieść jedno umyte kwasem i upieczone szkiełko nakrywkowe na dnie jednego naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm. Powtórz w razie potrzeby, aby uzyskać potrzebną liczbę potraw.</li>
	<li>Poddaj szkiełka nakrywkowe działaniu światła UV przez 20-30 minut, aby dodatkowo zapewnić sterylizację. Na tym etapie trzymaj pokrywkę naczynia zdjętą.</li>
	<li>Dodać 400 μl przygotowanej lamininy-1 do każdego szklanego szkiełka nakrywkowego. Użyj końcówki pipety, aby rozprowadzić lamininę-1, aby zapewnić pełne pokrycie szkiełka nakrywkowego. Napięcie powierzchniowe pozwoli lamininie-1 pozostać na szkiełku nakrywkowym i nie rozprzestrzeniać się na dnie naczynia hodowlanego, co jest wymagane.</li>
	<li>Przykryj naczyniem i pozwól lamininie-1 inkubować przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej (optymalnie 3 godziny).</li>
	<li>Po inkubacji lamininy-1 przepłukać szkiełka nakrywkowe techniką aseptyczną sterylnym PBS w kapturze z przepływem laminarnym. Usunąć roztwór ze szkiełka nakrywkowego i dodać 400 μl PBS. Odczekaj 5-10 min. Powtórz w sumie 3 płukania.</li>
	<li>Pozostaw PBS na szkiełku nakrywkowym po ostatnim płukaniu. Nie należy łamać napięcia powierzchniowego podczas płukania i nie dopuszczać do wyschnięcia szkiełek nakrywkowych. Pozostaw pokrywkę, aż będzie gotowa do nałożenia zdysocjowanych neuronów na pokrywę.</li>
</ol>
5. Dysocjacja, wzbogacanie i kulturowanie neuronów DRG – część 2
<ol>
	<li>Po inkubacji za pomocą sterylnej pipety o pojemności 10 ml delikatnie przepłukać dno naczynia o średnicy 100 mm zawierającego zdysocjowane komórki DRG. Trzymaj naczynie pod kątem ~45°, wyciągnij ~7 ml F12HS10 za pomocą pipety, a następnie delikatnie wylej 7 ml na około 1/3 naczynia. Powtórz 5 razy, delikatnie usuwając neurony.</li>
	<li>Obróć naczynie i powtórz procedurę płukania, przez kolejne sześć płukań, na kolejnej 1/3 naczynia. Powtórz procedurę ponownie dla pozostałej 1/3 naczynia. W ten sposób delikatnie spłucz całe dno naczynia F12HS10, aby usunąć neurony.</li>
	<li>Za pomocą tej samej pipety przenieś F12HS10 zawierające neurony z szalki o średnicy 100 mm do stożkowej rurki o średnicy 15 mm. Wirować przez 5-10 minut przy 200 g do komórek osadzania.</li>
	<li>Usuń F12HS10, pozostawiając granulat w spokoju. Zawiesić osad z 2 ml podgrzanych suplementów F12H +.</li>
	<li>Użyj hemocytometru, aby określić gęstość komórek.</li>
	<li>W razie potrzeby rozcieńczyć komórki suplementami F12H +, aby uzyskać pożądane stężenie posiewu (120 000 komórek/ml dla szkiełek nakrywkowych pokrytych 1 μg/ml lamininy-1 i 40 000 komórek/ml dla szkiełek nakrywkowych pokrytych 20 μg/ml lamininy-18,16).</li>
	<li>Usunąć PBS z szkiełek nakrywkowych pokrytych lamininą i natychmiast umieścić 400 μl komórek na szkiełkach nakrywkowych. Ostrożnie przenieść naczynie do nawilżonego inkubatora do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C. Pozostaw do inkubacji przez co najmniej 1 godzinę i do 3 godzin, aby umożliwić neuronom przyleganie do lamininy-1.</li>
	<li>W sterylnych warunkach delikatnie zalej 35-milimetrowe szalki zawierające neurony 1,6 ml suplementów F12H +. 
	UWAGA: W tym czasie napięcie powierzchniowe na szkiełku nakrywkowym może zostać przerwane. Neurony odpowiednio przylegały do lamininy-1 na szkiełku nakrywkowym.</li>
	<li>Włóż komórki z powrotem do inkubatora i inkubuj przez noc. Następnego dnia wykonaj eksperymenty, takie jak immunocytochemia.</li>
</ol>
6. Immunocytochemia
<ol>
	<li>Przed immunocytochemią ciepły roztwór utrwalający (4% paraformaldehydu, 30% sacharozy 2X PBS) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Przed utrwaleniem komórek potraktuj różnymi odczynnikami, takimi jak netryna-1, Mn2+, jeż soniczny, semaforyna i efryna16,29-31.</li>
	<li>Powoli wyjąć 1 ml z 2 ml suplementów F12H + z naczynia hodowlanego. Delikatnie dodaj 1 ml podgrzanego roztworu utrwalającego. Pozostawić do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć roztwór utrwalający i dodać 2 ml PBS. Nanieść roztwór w kierunku krawędzi naczynia, unikając możliwego przemieszczenia się utrwalonych komórek w wyniku zastosowania PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Powtórz pranie PBS, w sumie 5 prań. Nie pozwól, aby komórki wyschły podczas jakiegokolwiek etapu immunocytochemii.</li>
	<li>Usuń PBS. Zastosuj 1 ml roztworu blokującego (0,1% Triton-X, 1X PBS, 5% normalna surowica kozia). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, aby zabarwić cząsteczki powierzchniowe, nie należy używać Triton-X w roztworze blokującym8.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w roztworze blokującym zgodnie z zaleceniami producenta. Użyj 1:500 dla przeciwciał przeciwko NCAM i aktywowanych integryn β116. Usunąć roztwór blokujący, dodać 1 ml roztworu przeciwciał pierwszorzędowych i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć roztwór przeciwciał pierwszorzędowych i dodać 2 ml 1X PBS. Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz w sumie 4 prania PBS. W razie potrzeby pranie można przedłużyć.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w stosunku 1:1,000 w roztworze blokującym. Usunąć PBS, dodać 1 ml roztworu przeciwciał drugorzędowych i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Przeciwciała drugorzędowe są wrażliwe na światło. Od tego momentu utrzymuj roztwory i komórki w ciemności tak bardzo, jak to możliwe.</li>
	<li>Usuń wtórny roztwór przeciwciał i przepłucz 5x 1x PBS, tak jak poprzednio.</li>
	<li>Nałóż ~60-80 μl Fluoromount G na szkiełko mikroskopowe. Za pomocą cienkich szczypiec delikatnie wyjmij szkiełko nakrywkowe z naczynia i opuść szkiełko nakrywkowe do Fluoromount G na szkiełko mikroskopowe. Unikaj pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Szkiełka należy przechowywać poziomo w temperaturze 4 °C w ciemności. Po 12-24 godzinach Fluormount G ulegnie polimeryzacji, a szkiełko nakrywkowe zostanie mocno przymocowane do szkiełka mikroskopowego. Obrazowanie komórek po tym etapie polimeryzacji jest zakończone.</li>
</ol>

<ol><li>Millet, L. J., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+a+century+of+neuron+culture%3A+from+the+hanging+drop+to+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22The+Yale+journal+of+biology+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices.</a> The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).</li>
<li>Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+neuron+subtypes+have+unique+substratum+preference+and+receptor+expression+before+target+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).</li>
<li>Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+way+to+go%3F+Cytoskeletal+organization+and+polarized+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons.</a> Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).</li>
<li>Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics in dendritic spines.</a> Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).</li>
<li>Snow, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioneering+studies+on+the+mechanisms+of+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration.</a> Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).</li>
<li>Melli, G., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Root+Ganglia+Sensory+Neuronal+Cultures%3A+a+tool+for+drug+discovery+for+peripheral+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies.</a> Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).</li>
<li>Condic, M. L., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-induced+changes+in+integrin+expression+regulate+neuronal+adhesion+and+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth.</a> Nature. 389, 852-856 (1997).</li>
<li>Lemons, M. L., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+integrin+activation+and+intracellular+cAMP+cause+Rho+GTPase+dependent+growth+cone+collapse+on+laminin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1.</a> Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).</li>
<li>Beller, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+sensory+neuron+growth+cone+and+filopodial+responses+to+structurally+diverse+aggrecan+variants%2C+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro.</a> Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).</li>
<li>Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+neurons+adapt+to+the+inhibitory+proteoglycan+aggrecan+by+increasing+integrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).</li>
<li>Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+sensory+neurons+to+hyalectin+and+decorin+proteoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).</li>
<li>Guan, W., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Netrin-1%2C+Neogenin+and+cUNC-5H3+expression+during+chick+dorsal+root+ganglia+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development.</a> Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).</li>
<li>Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shh+influences+cell+number+and+the+distribution+of+neuronal+subtypes+in+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia.</a> Developmental biology. 314, 317-328 (2008).</li>
<li>Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+has+a+dual+effect+on+the+growth+of+retinal+ganglion+axons+depending+on+its+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).</li>
<li>Kolpak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+guidance+factor-induced+macropinocytosis+in+the+growth+cone+plays+a+critical+role+in+repulsive+axon+turning%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).</li>
<li>Lemons, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+and+cAMP+mediate+netrin-induced+growth+cone+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse.</a> Brain research. 1537, 46-58 (2013).</li>
<li>Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+sulfate+proteoglycan+elevates+cytoplasmic+calcium+in+DRG+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons.</a> Developmental biology. 166, 87-100 (1994).</li>
<li>Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+behavior+in+the+presence+of+soluble+chondroitin+sulfate+proteoglycan+%28CSPG%29%2C+compared+to+behavior+on+CSPG+bound+to+laminin+or+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin.</a> Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).</li>
<li>Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfated+proteoglycans+in+astroglial+barriers+inhibit+neurite+outgrowth+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro.</a> Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).</li>
<li>Snow, D. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+on+a+step+gradient+of+chondroitin+sulfate+proteoglycan+%28CS-PG%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG).</a> Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).</li>
<li>Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nervous+system-derived+chondroitin+sulfate+proteoglycans+regulate+growth+cone+morphology+and+inhibit+neurite+outgrowth%3A+A+light%2C+epifluorescence%2C+and+electron+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study.</a> Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).</li>
<li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological%2C+morphological%2C+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li>
<li>Firnhaber, C., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-specific+feeding+RNAi+in+C.+elegans+and+its+use+in+a+screen+for+essential+genes+required+for+GABA+neuron+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function.</a> PLoS genetics. 9, e1003921(2013).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).</li>
<li>Hollyday, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+wing+innervation.+I.+Time+course+of+innervation+and+early+differentiation+of+the+peripheral+nerve+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern.</a> The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).</li>
<li>Hollyday, M., Morgan-Carr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+wing+innervation.+II.+Morphology+of+motor+and+sensory+axons+and+their+growth+cones+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development.</a> The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).</li>
<li>Honig, M. G., Kueter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+cell+adhesion+molecules+on+the+growth+cones+of+chick+cutaneous+and+muscle+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons.</a> Developmental biology. 167, 563-583 (1995).</li>
<li>Tosney, K. W., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+major+pathways+for+neurite+outgrowth+in+the+chick+hindlimb%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb.</a> Developmental biology. 109, 193-214 (1985).</li>
<li>Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+and+semaphorin+3A+signaling+pathways+interact+in+regulating+sensory+neuronal+growth+cone+motility%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).</li>
<li>Munoz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephrin-A5+inhibits+growth+of+embryonic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons.</a> Developmental biology. 283, 397-408 (2005).</li>
<li>Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+in+distal+axons+is+not+required+for+growth+cone+responses+to+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).</li>
<li>Condic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neuronal+regeneration+induced+by+transgenic+integrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression.</a> Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).</li>
<li>Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin+3+supports+the+survival+of+developing+muscle+sensory+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).</li>
<li>Toyofuku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FARP2+triggers+signals+for+Sema3A-mediated+axonal+repulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion.</a> Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).</li>
<li>Steinmetz, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+enhancement+of+the+intrinsic+growth+capacity+of+sensory+neurons+combined+with+the+degradation+of+inhibitory+proteoglycans+allows+functional+regeneration+of+sensory+axons+through+the+dorsal+root+entry+zone+in+the+mammalian+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj przedstawiamy szczegółowe protokoły izolacji i hodowli zdysocjowanych neuronów czuciowych z zarodka pisklęcia. Procedura ta generuje wzbogaconą populację silnie rosnących neuronów in vitro7,8,10,16. Do tych hodowanych neuronów można zastosować liczne techniki komórkowe i molekularne, w tym immunocytochemię, która jest opisana tutaj. Protokół ten został niedawno wykorzystany do ilościowej oceny intensywności aktywowanych integryn znakowanych immunologicznie w czuciowych stożkach wzrostu8,16<...

Neurony to złożone komórki, które przenoszą informacje niezbędne do różnych funkcji, w tym czucia, widzenia, ruchu motorycznego, uczenia się i pamięci. Inaczej niż w przypadku innych typów komórek, neurony wydłużają procesy przypominające ramiona, zwane aksonami, tworząc niezbędne autostrady neuronalne do komunikacji. Podczas rozwoju wyspecjalizowane przedziały znajdujące się na końcach rosnących aksonów, zwane stożkami wzrostu, przechodzą przez koncert sygnałów zewnątrzkomórkowych, aby doprowadzić akson do odpowiedniego miejsca docelowego. Skomplikowane mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw nawigacji stożka wzrostu, nie są w pełni poznane. Aby lepiej zrozumieć te mechanizmy, badacze wykorzystali modele hodowli komórkowych do badania neuronów w zdefiniowanym i uproszczonym środowisku in vitro. Badanie neuronów w kulturze1 doprowadziło do znacznego postępu w naszym zrozumieniu biologii komórek neuronalnych, w tym: różnicowanianeuronów2, dynamiki cytoszkieletu, endocytozy i transportu, regulacji dendrytów3,4, regeneracji aksonów5 oraz stanów klinicznych, takich jak neuropatie6. Ponadto hodowane neurony są wysoce podatne na szeroki zakres technik badawczych, w tym immunocytochemię, koimmunoprecypitację powierzchni komórek, Western blot, transfekcję, RNAi i obrazowanie na żywo, takie jak analiza poklatkowa ruchliwości stożka wzrostu. Tak więc hodowla neuronów pierwotnych jest potężnym podejściem do wyjaśnienia wielu aspektów biologii komórkowej neuronów.
Model hodowli komórkowej zapewnia badaczom szczegółową kontrolę nad warunkami środowiskowymi i zmiennymi. Na przykład podłoże, na którym neurony są pokryte (i na których rosną), mogą być łatwo manipulowane. W tym miejscu podajemy szczegółowe instrukcje dotyczące generowania dwóch różnych substratów, jednej o niskim stężeniu lamininy-1, a drugiej o nasyconych stężeniach lamininy-1. Co zaskakujące, różne stężenia tej samej cząsteczki mogą mieć dramatyczny wpływ na stan wewnętrzny neuronów, a także na skład ich powierzchni komórki. Na przykład wewnątrzkomórkowe poziomy cAMP i powierzchniowe poziomy integryn znacznie różnią się w neuronach pokrytych tymi dwoma podłożami7,8. Dodatkowe badania wykazały, że inne cząsteczki, w tym fibronektyna i proteoglikany siarczanu chondroityny, wpływają na ekspresję cząsteczek na powierzchni komórki i ruchliwość neuronów7-11. Ponadto rozpuszczalne cząsteczki, takie jak neurotrofiny i neurotropiny, również wpływają na skład błony komórkowej i ruchliwość neuronów12-16 i mogą być łatwo i dokładnie manipulowane w modelu hodowli komórkowej.
Tutaj opisujemy metody izolacji i hodowli zdysocjowanych neuronów czuciowych z zarodków piskląt. Procedura ta została wykorzystana do dokonania znaczących przełomów w neurobiologii, w tym wzrostu aksonów5,7,8,10,11,16-21 i została zmodyfikowana z procedury zaprojektowanej do izolacji komórek zwojowych22. Takie podejście ma kilka zalet. Po pierwsze, wiele cech rozwoju ganglionu korzenia grzbietowego piskląt (DRG) jest dobrze scharakteryzowanych, w tym ramy czasowe narodzin, wydłużenie aksonów i profile ekspresji białek2,23-28, zapewniając w ten sposób pouczającą podstawę, na której można budować pouczające eksperymenty in vitro. Po drugie, zdysocjowane kultury neuronalne pozwalają badaczowi na bardziej bezpośrednie badanie neuronów w porównaniu z alternatywnymi podejściami wykorzystującymi nienaruszone eksplantaty DRG (które zawierają neurony i komórki nieneuronalne) i/lub mieszanymi kulturami zawierającymi zarówno zdysocjowane neurony, jak i komórki nieneuronalne. Po trzecie, opisana tutaj procedura jest prosta, niedroga i przystępna dla studentów. Dlatego technika ta może być wykorzystywana zarówno do celów badawczych, jak i dydaktycznych. Co więcej, niewielkie zmiany tego protokołu powinny pozwolić na szybkie, wysokowydajne oczyszczanie neuronów ze źródeł innych niż DRG. Na przykład procedura ta może zostać zmodyfikowana w celu zapewnienia wzbogaconych neuronów kultur z innych tkanek, takich jak embrionalne przodomózgowie lub rdzeń kręgowy.
Protokoły immunocytochemiczne zostały zoptymalizowane dla tych zdysocjowanych kultur neuronalnych i są szczegółowo opisane tutaj. Przedstawiono procedurę podwójnej immunocytochemii przeciwko cząsteczce adhezji komórek nerwowych (NCAM) i integrynom β1. Dane uzyskane za pomocą tych metod immunocytochemicznych wykorzystano do zbadania wzorca przestrzennego i intensywności kilku cząsteczek w hodowanych neuronach8,16.

<table><tbody><tr><td>Sterylne małe szalki do hodowli (35 mm)</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne duże szalki do hodowli (100 mm)</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne duże szalki Petriego (100 mm)</td><td>VWR</td><td>89000-302</td><td></td></tr><tr><td>Szklana szalka Petriego (100 mm)</td><td>VWR</td><td>D108962</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do drobnych</td> materiałów <td>Narzędzia do nauki</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze standardowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>1100-12</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe (22 x 22 mm)</td><td>Fisher</td><td>12 518 105K</td><td>Grubość 0,13-0,17 mm jest optymalna do mikroskopii</td></tr><tr><td>Porcelanowy uchwyt na szkiełko nakrywkowe</td><td>Thomas scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>17502-048</td><td>użyj 50 ml porcji na 500 ml podłoża Ham's F12</td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>VW3204-1</td><td>stosować w 2 M, można użyć dwa razy przed wyrzuceniem</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>użyć 5 M roztworu NaCl dla lamininy-1 roztworu podstawowego</td></tr><tr><td>Laminin-1</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>Dodać 72 &mikro; l sterylnego 5 M NaCl i podwielokrotność na 50 &mikro; l</td></tr><tr><td>15 ml Stożkowa probówka</td><td>potraktowana komórkowo</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>PBS CMF 10x</td><td>Gibco</td><td>14200</td><td>stosowany przy 1x, rozcieńczony sterylną wodą filtrowaną Millipore</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Gibco</td><td>14080</td><td>używany przy 1x, rozcieńczony sterylną wodą filtrowaną Millipore</td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Lonza</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej płodu (BSA)</td><td>Gibco</td><td>10438</td><td>stosować w F12HS20 przy 10%</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>przygotować sterylny roztwór 1 M w wodzie destylowanej, rozcieńczyć w pożywce F12 do uzyskania końcowego stężenia 10 mM</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomiocin</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>użyć 5 ml w 500 ml pożywki F12</td></tr><tr><td>NT3</td><td>Milipore</td><td>GF031</td><td>Dodać 1 ml sterylnej wody Millipore, podwielokrotność w sterylnych warunkach, przechowywać w temperaturze -20 °; C, stosować w końcowym stężeniu 10 ng/ml w pożywce F12H, utrzymywać w -20 & stopniach; C zamrażarka bez rozmrażania</td></tr><tr><td>NGF</td><td>RnD systemy</td><td>256-GF</td><td>Dodać 1 ml sterylnego 1x PBS z 0,1% BSA, podwielokrotność w sterylnych warunkach, przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, stosowany w końcowym stężeniu 10 ng/ml w pożywce F12H</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>podwielokrotność w sterylnych warunkach, przechowywać w temperaturze -20 &deg; C, stosować przy końcowym stężeniu 200 mM w pożywce F12H</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>podwielokrotność w sterylnych warunkach, przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Gibco</td><td>15260</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Inne potrzebne przedmioty: ogólne narzędzia do preparacji, w tym szklane pipety Pasteura, płodne białe jaja kurze leghorn, inkubator do jaj kontrolnych (nawilżany, 37 &deg; C), komora inkubacji komórek (nawilżona, 37 &; C), kaptur z przepływem laminarnym, lornetka stereowizyjna luneta preparacyjna</td></tr><td colspan="4"><silny>Tabela odczynników immunocytochemicznychsacharoza Sigma S9378 stosowany w roztworze utrwalającym (4% paraformaldehye, 30% sacharozy, 2x PBS)Triton-X 100 Sigma T-8787 Paraformaldehyd Sigma P6148 stosowany w roztworze utrwalającym (4% paraformaldehye, 30%<tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> sacharoza, 2x PBS)</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Normalna kozia surowica</td><td>Technologie życia</td><td>PCN500</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>16004-430</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela przeciwciał pierwotnych</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko NCAM</td><td>Millipore</td><td>AB5032</td><td>poliklonalne</td></tr><tr><td>przeciwciało przeciwko aktywowany & beta; 1 połknięcie</td><td>Millipore</td><td>MAB19294</td><td>monoklonalne</td></tr><tr><td colspan="4"><silna>Tabela przeciwciał wtórnych</td></tr><tr><td>Goat anty-mysie IgG Alexa 488</td><td>Life technologies</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG Alexa 548</td><td>Technologie życiowe</td><td>A11036</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla zdysocjowanych neuronów czuciowych z zarodków piskląt

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurony to wielopłaszczyznowe komórki, które przenoszą informacje niezbędne do różnych funkcji, w tym czucia, ruchu motorycznego, uczenia się i pamięci. Badanie neuronów in vivo może być trudne ze względu na ich złożoność, zróżnicowane i dynamiczne środowisko oraz ograniczenia techniczne. Z tych powodów badanie neuronów in vitro może okazać się korzystne dla rozwikłania złożonych tajemnic neuronów. Dobrze zdefiniowany charakter modeli hodowli komórkowych zapewnia szczegółową kontrolę nad warunkami środowiskowymi i zmiennymi. Tutaj opisujemy, jak izolować, dysocjować i hodować neurony pierwotne z zarodków piskląt. Ta technika jest szybka, niedroga i generuje solidnie rosnące neurony czuciowe. Procedura konsekwentnie wytwarza kultury, które są wysoce wzbogacone o neurony i mają bardzo mało komórek nieneuronalnych (mniej niż 5%). Neurony pierwotne nie przylegają dobrze do nieobrobionego szkła lub plastiku z kultur tkankowych, dlatego opisano szczegółowe procedury tworzenia dwóch odrębnych, dobrze zdefiniowanych substratów zawierających lamininę do posiewu neuronów. Hodowane neurony są wysoce podatne na wiele technik komórkowych i molekularnych, w tym koimmunoprecypitację, obrazowanie żywych komórek, RNAi i immunocytochemię. Procedury podwójnej immunocytochemii na tych hodowanych neuronach zostały zoptymalizowane i opisane tutaj.

Opisany tutaj protokół umożliwia badaczom hodowlę wzbogaconej populacji dysocjowanych embrionalnych neuronów sensorycznych z bardzo niewielką ilością (np. &lt;5%) komórek nie neuronalnych7,8,10,16. Liczne zwoje korzeni grzbietowych (DRG) można pozyskać z obszarów lędźwiowo-krzyżowych, piersiowych i szyjnych. W zależności od potrzeb badacza, DRG z tych odrębnych regionów anatomicznych można łatwo wyizolować. Na przykład Rycina 1 przedstawia obrazy zarodka kury na różnych etapach sekcji...

Modele hodowli komórkowych zapewniają szczegółową kontrolę nad warunkami środowiskowymi, a tym samym stanowią potężną platformę do wyjaśnienia wielu aspektów biologii komórek neuronalnych. Opisujemy szybką, niedrogą i niezawodną metodę izolacji, dysocjacji i hodowli neuronów czuciowych z zarodków piskląt. Podano również szczegółowe informacje na temat przygotowania podłoża i immunocytochemii.

Izolacja i hodowla zdysocjowanych neuronów czuciowych z zarodków piskląt

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyhodowanie wzbogaconej populacji zdysocjowanych pierwotnych neuronów czuciowych z zarodków kurczaków. Osiąga się to poprzez zebranie nienaruszonych zwojów korzenia grzbietowego z dnia embrionalnego, od siedmiu do 10 zarodków kurczaka do stożkowej rurki, a następnie rozbicie ich na zdysocjowaną zawiesinę komórkową. W drugim etapie dysocjacji komórki DRG są umieszczane na szalce hodowlanej w celu inkubacji.Następnie naczynie hodowlane jest delikatnie płukane, aby preferencyjnie usunąć neurony. Ostatnim etapem jest posiew zdysocjowanych neuronów czuciowych na dobrze zdefiniowanych podłożach, takich jak myte kwasem i wypalane szkiełka nakrywkowe wstępnie zakodowane wysokimi lub niskimi stężeniami lamininy. Jedna chemia immunocytochemiczna służy do wykazania obecności NCA i aktywowanych integryn beta one w ciałach komórkowych, neurytach i stożkach wzrostu zdysocjowanych, hodowanych embrionalnych neuronów czuciowych piskląt.Metoda ta jest potężnym narzędziem do wyjaśnienia wielu aspektów neurobiologii, w tym mechanizmów kierowania aksonami, stożków wzrostu, dynamiki cytoszkieletu, a także składu i regulacji powierzchni komórki. Technika ta pozwala naukowcom szybko uzyskać kultury znacznie wzbogacone o zdysocjowane neurony czuciowe, które zawierają bardzo mało komórek glejowych. Różni się to od nienaruszonych kultur korzeni grzbietowych, które zawierają zarówno neurony, jak i komórki nieneuronalne.Co więcej, niewielkie zmiany tego protokołu powinny pozwolić na uzyskanie wysokiej wydajności kultur neuronalnych ze źródeł innych niż zwoje korzenia grzbietowego, w tym embrionalne przodomózgowie. W kapturze z przepływem laminarnym rozbij zainscenizowane, płodne jajo piskląt z białym rogiem i umieść jego zawartość na 100-milimetrowej szalce Petriego. Następnie przenieś zarodek na inną 100-milimetrową szalkę Petriego.Dodaj podgrzany XPBS do szalki Petriego, aby tkanka była mokra. Zarodek zostaje pozbawiony głowy, a ciało przenoszone jest na inną czystą szalkę Petriego. Do tkanki dodaje się rozgrzany F 12 HS 10.Umieścić szalkę Petriego z tkanką embrionalną pod mikroskopem preparacyjnym w kapturze z przepływem laminarnym. Następnie wykonaj pionowe nacięcie w linii środkowej od ogona do szyi, ściskając rozwijającą się skórę właściwą, aby odsłonić serce, płuca i inne narządy. Cienkimi kleszczami delikatnie chwyć szyję i aortę lub inną tkankę znajdującą się bezpośrednio nad sercem i pociągnij w kierunku ogona, aby wypatroszyć zwierzę.Następnie nanieść ciepły F 12 HS 10 na tkankę, aby jeszcze bardziej oczyścić preparat i utrzymać wilgotną tkankę, a w razie potrzeby powtórzyć aplikacje F 12 HS 10 podczas sekcji. Następnie usuń wszelkie pozostałe narządy sercowo-naczyniowe, oddechowe lub trawienne, aby odsłonić rozwijający się kręgosłup żeber i DRG, aby zebrać DRG po obu stronach kręgosłupa lędźwiowego, poniżej żeber, wyrwij DRG z zarodka. Odbywa się to poprzez ściskanie i odcinanie korzeni, które sięgają od Dr.G w kierunku rdzenia kręgowego i uchwycenie rozwijającego się nerwu od DRG w kierunku obwodu lub odwrotnie.Następnie umieść nienaruszone DRG w 35-milimetrowym naczyniu hodowlanym wypełnionym ciepłym F 12 HS 10. Usuń nadmiar tkanki, takiej jak korzenie grzbietowe lub brzuszne, które mogą przylegać do DRG. Aby uzyskać DRG lepsze niż odcinek lędźwiowy, należy usunąć brzuszną połowę kręgosłupa piersiowego i szyjnego.Odbywa się to poprzez wykonanie nacięcia w rozwijającym się kręgosłupie prostopadłym do osi rdzenia kręgowego w górnym odcinku lędźwiowym oraz kolejnego cięcia w górnej części odcinka szyjnego. Następnie wykonaj nacięcia wzdłuż prawej i lewej strony kręgosłupa. Łącznie nacięcia te odłączają brzuszną połowę kręgosłupa od zarodka, a kolumna jest następnie usuwana z zarodka, aby umożliwić łatwy dostęp do DRG.Usuń rdzeń kręgowy klatki piersiowej i szyjnej, chwytając rdzeń kręgowy cienkimi kleszczami. Następnie zbierz nienaruszone DRG klatki piersiowej i szyjki macicy, tak jak to zrobiono wcześniej, i umieść je w ciepłym F 12 HS 10 z innymi DRG. Usuń nadmiar tkanki, która może przylegać do DRG.Następnie przepłucz wnętrze nowej szklanej pipety do pasty za pomocą F 12 HS 10, aby zapobiec przywieraniu DRG do ścianki pipety. Za pomocą przepłukanej pipety przenieś wszystkie DRG i F 12 HS 10 z małej szalki Petriego do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów, można wyciąć dodatkowe zarodki, aby zwiększyć liczbę DRG w tej procedurze. Umieść stożkową probówkę z nienaruszonymi DRG w wirówce i delikatnie wiruj 200 razy G przez dwie do trzech minut.Upewnij się, że DRG opadły na dno rury. Następnie delikatnie usuń F 12 HS 10, pozostawiając granulat DRG w nienaruszonym stanie. Następnie dodaj dwa mililitry jednego X-C-M-F-P-B-S, aby usunąć osad DRG.Ponownie zakręć i wyjmij C-M-F-P-B-S, zachowując DRG. Powtórz ten krok prania, w sumie trzy prania. Po zakończeniu mycia i usunięciu C-M-F-P-B-S dodaj dwa mililitry podgrzanej trypsyny do 15-mililitrowej probówki i delikatnie usuń DRG.Następnie umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 do 15 minut, aby strawić DRG do zdysocjowanych komórek. Delikatnie zanurzyć DRG w roztworze trypsyny i wizualnie sprawdzić, czy nie ma nienaruszonych DRG. Kontynuuj tację, aż nienaruszone DRG nie będą już widoczne gołym okiem i/lub pozwól na dłuższe podróże inkubacji w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż nienaruszone DRG zostaną rozdzielone.Następnie odwiruj zdysocjowane DRG i trypsynę w ilości 200 razy G przez trzy do pięciu minut, aby utworzyć osad. W razie potrzeby wiruj dłużej, aż uformuje się granulka. Następnie ostrożnie odessaj trypsynę, nie naruszając osadu.Dodaj dwa mililitry F 12 hs 10 do granulki i delikatnie wytrzyj DRG. Następnie przenieś całą zawartość ze stożkowej rurki do 100-milimetrowej naczynia hodowlanego. Przepłukać probówkę ośmioma mililitrami F 12 HS 10 i przenieść ją do naczynia hodowlanego po dwa mililitry na raz, co daje w sumie 10 mililitrów.Następnie umieść naczynie hodowlane w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy godziny. Teraz dodaj 400 mikrolitrów przygotowanej lamininy, po jednym do każdego mytego kwasem i upieczonego szkiełka nakrywkowego i rozprowadź go końcówką pipety, aby zapewnić pełne pokrycie. Napięcie powierzchniowe pozwoli lamininie pozostać na szkiełku nakrywkowym i nie rozprzestrzeniać się na dnie naczynia hodowlanego.Umieść pokrywkę na naczyniu i pozwól Laminowi inkubować przez dwie do trzech godzin w temperaturze pokojowej. Następnie trzykrotnie przepłucz szkiełka nakrywkowe pokryte lamininą sterylnym PBS w okapie z przepływem laminarnym. Pozostaw PBS na szkiełkach okrywkowych po ostatnim płukaniu.Nie tracić napięcia powierzchniowego podczas etapów płukania. Po inkubacji użyj sterylnej pipety o pojemności 10 mililitrów, aby delikatnie przepłukać dno naczynia zawierającego zdysocjowane komórki DRG. Trzymaj naczynie pod kątem 45 stopni.Pobrać około siedmiu mililitrów F 12 HS 10. Następnie delikatnie wyrzuć go na jedną trzecią naczynia, aby usunąć neurony. Powtórz to jeszcze pięć razy.Następnie obróć naczynie o około 120 stopni i powtórz procedurę płukania przez kolejne sześć płukań. Następnie powtórz procedurę ponownie dla pozostałej jednej trzeciej naczynia. Teraz za pomocą tej samej pipety przenieś F 12 HS 10 zawierające neurony z naczynia do stożkowej rurki.Wirować przez pięć do 10 minut przy 200 G do osadzania. Komórki następnie usuwają F 12 HS 10, pozostawiając osad w nienaruszonym stanie. Następnie ponownie zamieszaj granulat z dwoma mililitrami podgrzanego F 12 H plus suplementy.Następnie określ gęstość komórek za pomocą hemocytometru, rozcieńczyć komórki w razie potrzeby za pomocą F 12 H plus suplementy, aby uzyskać pożądane stężenie posiewu. Następnie natychmiast usuń PBS z szkiełek okładkowych pokrytych lamininą. Umieść na nich 400 mikrolitrów komórek.Ostrożnie przenieś naczynie do inkubatora do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozostaw do inkubacji na dwie do trzech godzin w sterylnych warunkach. Delikatnie zalej 35-milimetrowe szalki zawierające neurony 1,6 mililitra F 12 H plus suplementy. Następnie należy zwrócić komórki do inkubatora i inkubować je przez noc.Rysunek ten przedstawia hodowane, zdysocjowane pierwotne neurony czuciowe znakowane immunologicznie dla NCA i aktywowane integryny beta one. Embrionalne neurony piskląt rosną solidnie na wysokich stężeniach lamininy w jednym z ciał komórek neuronalnych. Neuryty i stożki wzrostu są immunododatnie dla NCA i aktywowanej integryny beta one.Połączony obraz dwóch barwników ujawnia, że większość komórek jest dodatnia zarówno dla N cam, jak i aktywowanej integryny beta one. Zgodnie z oczekiwaniami w przypadku embrionalnych neuronów czuciowych piskląt, mniej niż 5% komórek pobranych tą techniką jest nieneuronalnych. Na tym obrazie znajduje się komórka o morfologii podobnej do gleju, która jest NCA M ujemna i beta jedna integryna dodatnia.Zgodne z komórką nieneuronalną. Większe powiększenie hodowanego neuronu czuciowego wyraźnie pokazuje neuryty rozciągające się z ciała komórki, a ta wstawka pokazuje większe powiększenie stożka wzrostu na końcu neurytu. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o starannej i pełnej dysocjacji nienaruszonych zwojów korzenia grzbietowego oraz płytkach neuronów i odpowiedniej gęstości na określonych podłożach, takich jak myte kwasem i wypalane pokryte zrazy oznaczone znanymi stężeniami laminatu jeden Zgodnie z procedurą hodowli.Metody obrazowania na żywo, takie jak mikroskopia poklatkowa, mogą być wykonywane w celu oceny stożka wzrostu, filologii ruchliwości, dynamiki POAL i innych zachowań stożków wzrostu na określonych podłożach oraz w odpowiedzi na cząsteczki zastosowane do pożywki hodowlanej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć solidną wiedzę na temat tego, jak wyprodukować solidnie rosnącą kulturę, która jest wysoce wzbogacona o pierwotne zdysocjowane neurony z embrionalnych zwojów korzenia grzbietowego piskląt.

isolation-culture-dissociated-sensory-neurons-from-chick

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób wizualizacji szlaków aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w embrionalnym rdzeniu kręgowym kurczaka, z wykorzystaniem elektroporacji in ovo genów reporterowych pod kontrolą specyficznych elementów enhancera.

Rozszyfrowanie dróg aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w cewie nerwowej kurczaka z wykorzystaniem elektroporacji in ovo

Demonstrujemy sposób wycinania i hodowli eksplantów zwoju statoakustycznego w dniu E4 oraz rdzenia kręgowego w dniu E6 zarodka kurczaka. Eksplanty są hodowane w warunkach bezsurowiczych w trójwymiarowych żelach kolagenowych przez 24 godziny. Reaktywność neurytów jest badana przy użyciu pożywki uzupełnionej o czynniki wzrostu oraz koralików pokrytych białkiem.

Disekcja i hodowla eksplantów zrazustatoakustycznego i rdzenia kręgowego kurczaka w żelach kolagenowych do testów wzrostu neurytów

Opisujemy szybką metodologię izolacji i hodowli neuronów hipokampa i kory mózgowej z embrionów gryzoni. Protokół ten umożliwia przeprowadzanie eksperymentów wymagających niemal czystych kultur neuronalnych.

Izolacja i hodowla embrionalnych komórek neuronalnych szczura: szybki protokół

Ten film ilustruje technikę izolowania fałdów nerwowych czaszki od śródmózgowia zarodków piskląt. Przedstawiono szczegółowy proces rozwarstwiania fałdów nerwowych, ich rozmieszczenia i mocowania na szkiełkach nakrywkowych pokrytych fibronektyną, a następnie obserwację migracji komórek grzebienia nerwowego z fałdów nerwowych.

Izolowanie fałdów nerwowych czaszki od zarodka kurcząt w celu hodowli komórek grzebienia nerwowego

Film pokazuje izolację neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych od transgenicznego zarodka myszy. Zarodek wykazuje ekspresję neuronów ruchowych znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w celu łatwej wizualizacji i identyfikacji. Neurony ruchowe są chirurgicznie izolowane pod mikroskopem fluorescencyjnym i utrzymywane w pożywce hodowlanej.

Izolacja i hodowla neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych z zarodka myszy

Ten film demonstruje metodę izolowania neuronów z przodomózgowia zarodka pisklęcia we wczesnym stadium i hodowli ich na matrycy mikroelektrod w celu utworzenia sieci neuronalnej.

Izolowanie i hodowla neuronów embrionalnych piskląt na matrycy wieloelektrodowej

Kultury Slice ułatwiają manipulowanie rozwojem zarodka za pomocą zaburzeń genowych i farmakologicznych. Jednakże warunki hodowli muszą zapewniać, że normalny rozwój może przebiegać w ograniczonym środowisku wycinka. Ilustrujemy protokół, który ułatwia prawidłowy rozwój rdzenia kręgowego, aby przebiegał przez co najmniej 24 godziny.

Protokół hodowli plastrów rdzenia kręgowego zarodków kurczaka

Opisujemy sekcję układu nerwowego zająca morskiego Aplysia po znieczuleniu, izolację neuronów do krótkotrwałej hodowli tkanek oraz zapisy prądów jonowych pojedynczej komórki za pomocą techniki patch clamp.

Izolacja neuronów czuciowych Aplysia californica w celu nagrań prądów glutaminergicznego za pomocą zacisków krosowych

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

Ta praca przedstawia protokół do uzyskania jednorodnych kultur komórkowych pierwotnych neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych. Kultury te można wykorzystać do analiz porównawczych cech morfologicznych, komórkowych, molekularnych i elektrofizjologicznych neuronów ruchowych oka i rdzenia.

Izolacja i hodowla neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych myszy transgenicznych z grupy prenatalnej mn:GFP

Zwoje rzęskowe piskląt (CG) są częścią przywspółczulnego układu nerwowego. Wykazano, że hodowle neuronów CG piskląt są skutecznymi modelami komórkowymi w badaniu interakcji między mięśniami nerwowymi. Opisujemy szczegółowy protokół sekcji, dysocjacji i hodowli in vitro neuronów CG z zarodków piskląt.

Izolacja i hodowla neuronów zwojowych rzęsek piskląt

Naucz się izolować i hodować neurony czuciowe z zarodków piskląt, wykorzystując metodę zdysocjowanych komórek z ganglionów korzeniowych. Ta technika umożliwia badanie biologii komórkowej neuronów w kontrolowanych warunkach.

Izolacja i hodowla zdysocjowanych neuronów czuciowych z zarodków piskląt

Przeglądaj więcej filmów