Izolacja i hodowla zdysocjowanych neuronów czuciowych z zarodków piskląt

Ogólnym celem tej procedury jest wyhodowanie wzbogaconej populacji zdysocjowanych pierwotnych neuronów czuciowych z zarodków kurczaków. Osiąga się to poprzez zebranie nienaruszonych zwojów korzenia grzbietowego z dnia embrionalnego, od siedmiu do 10 zarodków kurczaka do stożkowej rurki, a następnie rozbicie ich na zdysocjowaną zawiesinę komórkową. W drugim etapie dysocjacji komórki DRG są umieszczane na szalce hodowlanej w celu inkubacji.

Następnie naczynie hodowlane jest delikatnie płukane, aby preferencyjnie usunąć neurony. Ostatnim etapem jest posiew zdysocjowanych neuronów czuciowych na dobrze zdefiniowanych podłożach, takich jak myte kwasem i wypalane szkiełka nakrywkowe wstępnie zakodowane wysokimi lub niskimi stężeniami lamininy. Jedna chemia immunocytochemiczna służy do wykazania obecności NCA i aktywowanych integryn beta one w ciałach komórkowych, neurytach i stożkach wzrostu zdysocjowanych, hodowanych embrionalnych neuronów czuciowych piskląt.

Metoda ta jest potężnym narzędziem do wyjaśnienia wielu aspektów neurobiologii, w tym mechanizmów kierowania aksonami, stożków wzrostu, dynamiki cytoszkieletu, a także składu i regulacji powierzchni komórki. Technika ta pozwala naukowcom szybko uzyskać kultury znacznie wzbogacone o zdysocjowane neurony czuciowe, które zawierają bardzo mało komórek glejowych. Różni się to od nienaruszonych kultur korzeni grzbietowych, które zawierają zarówno neurony, jak i komórki nieneuronalne.

Co więcej, niewielkie zmiany tego protokołu powinny pozwolić na uzyskanie wysokiej wydajności kultur neuronalnych ze źródeł innych niż zwoje korzenia grzbietowego, w tym embrionalne przodomózgowie. W kapturze z przepływem laminarnym rozbij zainscenizowane, płodne jajo piskląt z białym rogiem i umieść jego zawartość na 100-milimetrowej szalce Petriego. Następnie przenieś zarodek na inną 100-milimetrową szalkę Petriego.

Dodaj podgrzany XPBS do szalki Petriego, aby tkanka była mokra. Zarodek zostaje pozbawiony głowy, a ciało przenoszone jest na inną czystą szalkę Petriego. Do tkanki dodaje się rozgrzany F 12 HS 10.

Umieścić szalkę Petriego z tkanką embrionalną pod mikroskopem preparacyjnym w kapturze z przepływem laminarnym. Następnie wykonaj pionowe nacięcie w linii środkowej od ogona do szyi, ściskając rozwijającą się skórę właściwą, aby odsłonić serce, płuca i inne narządy. Cienkimi kleszczami delikatnie chwyć szyję i aortę lub inną tkankę znajdującą się bezpośrednio nad sercem i pociągnij w kierunku ogona, aby wypatroszyć zwierzę.

Następnie nanieść ciepły F 12 HS 10 na tkankę, aby jeszcze bardziej oczyścić preparat i utrzymać wilgotną tkankę, a w razie potrzeby powtórzyć aplikacje F 12 HS 10 podczas sekcji. Następnie usuń wszelkie pozostałe narządy sercowo-naczyniowe, oddechowe lub trawienne, aby odsłonić rozwijający się kręgosłup żeber i DRG, aby zebrać DRG po obu stronach kręgosłupa lędźwiowego, poniżej żeber, wyrwij DRG z zarodka. Odbywa się to poprzez ściskanie i odcinanie korzeni, które sięgają od Dr.G w kierunku rdzenia kręgowego i uchwycenie rozwijającego się nerwu od DRG w kierunku obwodu lub odwrotnie.

Następnie umieść nienaruszone DRG w 35-milimetrowym naczyniu hodowlanym wypełnionym ciepłym F 12 HS 10. Usuń nadmiar tkanki, takiej jak korzenie grzbietowe lub brzuszne, które mogą przylegać do DRG. Aby uzyskać DRG lepsze niż odcinek lędźwiowy, należy usunąć brzuszną połowę kręgosłupa piersiowego i szyjnego.

Odbywa się to poprzez wykonanie nacięcia w rozwijającym się kręgosłupie prostopadłym do osi rdzenia kręgowego w górnym odcinku lędźwiowym oraz kolejnego cięcia w górnej części odcinka szyjnego. Następnie wykonaj nacięcia wzdłuż prawej i lewej strony kręgosłupa. Łącznie nacięcia te odłączają brzuszną połowę kręgosłupa od zarodka, a kolumna jest następnie usuwana z zarodka, aby umożliwić łatwy dostęp do DRG.

Usuń rdzeń kręgowy klatki piersiowej i szyjnej, chwytając rdzeń kręgowy cienkimi kleszczami. Następnie zbierz nienaruszone DRG klatki piersiowej i szyjki macicy, tak jak to zrobiono wcześniej, i umieść je w ciepłym F 12 HS 10 z innymi DRG. Usuń nadmiar tkanki, która może przylegać do DRG.

Następnie przepłucz wnętrze nowej szklanej pipety do pasty za pomocą F 12 HS 10, aby zapobiec przywieraniu DRG do ścianki pipety. Za pomocą przepłukanej pipety przenieś wszystkie DRG i F 12 HS 10 z małej szalki Petriego do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów, można wyciąć dodatkowe zarodki, aby zwiększyć liczbę DRG w tej procedurze. Umieść stożkową probówkę z nienaruszonymi DRG w wirówce i delikatnie wiruj 200 razy G przez dwie do trzech minut.

Upewnij się, że DRG opadły na dno rury. Następnie delikatnie usuń F 12 HS 10, pozostawiając granulat DRG w nienaruszonym stanie. Następnie dodaj dwa mililitry jednego X-C-M-F-P-B-S, aby usunąć osad DRG.

Ponownie zakręć i wyjmij C-M-F-P-B-S, zachowując DRG. Powtórz ten krok prania, w sumie trzy prania. Po zakończeniu mycia i usunięciu C-M-F-P-B-S dodaj dwa mililitry podgrzanej trypsyny do 15-mililitrowej probówki i delikatnie usuń DRG.

Następnie umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 do 15 minut, aby strawić DRG do zdysocjowanych komórek. Delikatnie zanurzyć DRG w roztworze trypsyny i wizualnie sprawdzić, czy nie ma nienaruszonych DRG. Kontynuuj tację, aż nienaruszone DRG nie będą już widoczne gołym okiem i/lub pozwól na dłuższe podróże inkubacji w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż nienaruszone DRG zostaną rozdzielone.

Następnie odwiruj zdysocjowane DRG i trypsynę w ilości 200 razy G przez trzy do pięciu minut, aby utworzyć osad. W razie potrzeby wiruj dłużej, aż uformuje się granulka. Następnie ostrożnie odessaj trypsynę, nie naruszając osadu.

Dodaj dwa mililitry F 12 hs 10 do granulki i delikatnie wytrzyj DRG. Następnie przenieś całą zawartość ze stożkowej rurki do 100-milimetrowej naczynia hodowlanego. Przepłukać probówkę ośmioma mililitrami F 12 HS 10 i przenieść ją do naczynia hodowlanego po dwa mililitry na raz, co daje w sumie 10 mililitrów.

Następnie umieść naczynie hodowlane w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy godziny. Teraz dodaj 400 mikrolitrów przygotowanej lamininy, po jednym do każdego mytego kwasem i upieczonego szkiełka nakrywkowego i rozprowadź go końcówką pipety, aby zapewnić pełne pokrycie. Napięcie powierzchniowe pozwoli lamininie pozostać na szkiełku nakrywkowym i nie rozprzestrzeniać się na dnie naczynia hodowlanego.

Umieść pokrywkę na naczyniu i pozwól Laminowi inkubować przez dwie do trzech godzin w temperaturze pokojowej. Następnie trzykrotnie przepłucz szkiełka nakrywkowe pokryte lamininą sterylnym PBS w okapie z przepływem laminarnym. Pozostaw PBS na szkiełkach okrywkowych po ostatnim płukaniu.

Nie tracić napięcia powierzchniowego podczas etapów płukania. Po inkubacji użyj sterylnej pipety o pojemności 10 mililitrów, aby delikatnie przepłukać dno naczynia zawierającego zdysocjowane komórki DRG. Trzymaj naczynie pod kątem 45 stopni.

Pobrać około siedmiu mililitrów F 12 HS 10. Następnie delikatnie wyrzuć go na jedną trzecią naczynia, aby usunąć neurony. Powtórz to jeszcze pięć razy.

Następnie obróć naczynie o około 120 stopni i powtórz procedurę płukania przez kolejne sześć płukań. Następnie powtórz procedurę ponownie dla pozostałej jednej trzeciej naczynia. Teraz za pomocą tej samej pipety przenieś F 12 HS 10 zawierające neurony z naczynia do stożkowej rurki.

Wirować przez pięć do 10 minut przy 200 G do osadzania. Komórki następnie usuwają F 12 HS 10, pozostawiając osad w nienaruszonym stanie. Następnie ponownie zamieszaj granulat z dwoma mililitrami podgrzanego F 12 H plus suplementy.

Następnie określ gęstość komórek za pomocą hemocytometru, rozcieńczyć komórki w razie potrzeby za pomocą F 12 H plus suplementy, aby uzyskać pożądane stężenie posiewu. Następnie natychmiast usuń PBS z szkiełek okładkowych pokrytych lamininą. Umieść na nich 400 mikrolitrów komórek.

Ostrożnie przenieś naczynie do inkubatora do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozostaw do inkubacji na dwie do trzech godzin w sterylnych warunkach. Delikatnie zalej 35-milimetrowe szalki zawierające neurony 1,6 mililitra F 12 H plus suplementy. Następnie należy zwrócić komórki do inkubatora i inkubować je przez noc.

Rysunek ten przedstawia hodowane, zdysocjowane pierwotne neurony czuciowe znakowane immunologicznie dla NCA i aktywowane integryny beta one. Embrionalne neurony piskląt rosną solidnie na wysokich stężeniach lamininy w jednym z ciał komórek neuronalnych. Neuryty i stożki wzrostu są immunododatnie dla NCA i aktywowanej integryny beta one.

Połączony obraz dwóch barwników ujawnia, że większość komórek jest dodatnia zarówno dla N cam, jak i aktywowanej integryny beta one. Zgodnie z oczekiwaniami w przypadku embrionalnych neuronów czuciowych piskląt, mniej niż 5% komórek pobranych tą techniką jest nieneuronalnych. Na tym obrazie znajduje się komórka o morfologii podobnej do gleju, która jest NCA M ujemna i beta jedna integryna dodatnia.

Zgodne z komórką nieneuronalną. Większe powiększenie hodowanego neuronu czuciowego wyraźnie pokazuje neuryty rozciągające się z ciała komórki, a ta wstawka pokazuje większe powiększenie stożka wzrostu na końcu neurytu. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o starannej i pełnej dysocjacji nienaruszonych zwojów korzenia grzbietowego oraz płytkach neuronów i odpowiedniej gęstości na określonych podłożach, takich jak myte kwasem i wypalane pokryte zrazy oznaczone znanymi stężeniami laminatu jeden Zgodnie z procedurą hodowli.

Metody obrazowania na żywo, takie jak mikroskopia poklatkowa, mogą być wykonywane w celu oceny stożka wzrostu, filologii ruchliwości, dynamiki POAL i innych zachowań stożków wzrostu na określonych podłożach oraz w odpowiedzi na cząsteczki zastosowane do pożywki hodowlanej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć solidną wiedzę na temat tego, jak wyprodukować solidnie rosnącą kulturę, która jest wysoce wzbogacona o pierwotne zdysocjowane neurony z embrionalnych zwojów korzenia grzbietowego piskląt.