Name: Test tworzenia kolonii miękkiego agaru (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj metodę testu tworzenia kolonii w miękkim agarze do badania transformacji nowotworowej komórek in vitro. Ta technika pozwala ilościowo ocenić wzrost niezależny od podłoża i potencjał tumorygenny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Merit Award od U.S. Department of Veterans Affairs oraz grant NIH R01CA1385282522717 dla RW.

1. Przygotowanie materiałów i odczynników
<ol>
	<li>Oznaczyć każdą studzienkę na 6-dołkowej płytce poddanej działaniu hodowli tkankowej odpowiednio dla każdej badanej linii komórkowej lub stanu.</li>
	<li>Przygotuj 2x pożywkę do hodowli komórkowych, rozpuszczając 1 g pożywki w proszku i 0,2 g wodorowęglanu sodu w wodzie dejonizowanej do końcowej objętości 50 ml.</li>
	<li>Przepuść to medium przez filtr 0,2 μm w celu sterylizacji.</li>
	<li>Dodaj dodatkowe składniki potrzebne do normalnej hodowli interesującej nas linii komórkowej. Na przykład hoduj linię komórkową CMT 167 w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS i 1% roztworem penicyliny/streptomycyny. Przed użyciem podgrzać podłoże do 37 °C w gorącej kąpieli wodnej.</li>
	<li>Przygotuj 1x pożywkę do hodowli komórkowych oddzielnie, tak jak w przypadku normalnej hodowli komórkowej interesującej Cię linii komórkowej.</li>
	<li>Przygotuj 1% szlachetnego agaru, dodając 1 g szlachetnego agaru do 100 ml wody dejonizowanej. 
	UWAGA: Szlachetny agar nie rozpuści się całkowicie przy samym mieszaniu.</li>
	<li>Przygotuj agar szlachetny 0,6%, dodając 0,6 g szlachetnego agaru do 100 ml wody dejonizowanej. Oba roztwory agaru można przygotować w szklanych butelkach o pojemności 100 ml z zamykanymi pokrywkami do długotrwałego przechowywania.</li>
	<li>Autoklaw szlachetnych mieszanin agarowych w celu sterylizacji. Mieszaniny te mogą być przygotowane z wyprzedzeniem i przechowywane w temperaturze 4 °C, ale powinny być ponownie podgrzane w czasie eksperymentu, aż do całkowitego rozpuszczenia się agaru.</li>
	<li>Przygotować roztwór chlorku tetrazolu nitroniebieskiego, sporządzając roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml w 1x PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 i 0,24 g KH2PO4 w H2O do końcowej objętości 1 000 ml). Zostanie to wykorzystane pod koniec eksperymentu do zabarwienia kolonii.</li>
</ol>
2. Poszycie dolnej warstwy agaru
<ol>
	<li>Poluzuj nakrętkę na butelce z 1% szlachetnym agarem i wstaw do kuchenki mikrofalowej na około 1-2 minuty. Podczas podgrzewania w kuchence mikrofalowej uważnie monitoruj roztwór, aby uniknąć wykipienia. Kontynuuj podgrzewanie, mieszając z przerwami, aż agar całkowicie się rozpuści, a roztwór będzie klarowny. 
	UWAGA: Do obsługi kolby po podgrzaniu należy używać rękawic żaroodpornych. Niezastosowanie się do tego może spowodować oparzenia lub poważne obrażenia.</li>
	<li>Umieść stopiony roztwór agaru i wstępnie podgrzaną pożywkę 2x w wiadrze z lodem wypełnionym gorącą wodą z kranu (42 °C). Umieść również stożkową probówkę o pojemności 50 ml w uchwycie na probówkę w wiaderku z gorącą wodą. Przenieś wiadro do okapu do hodowli komórkowej w celu wykonania kolejnych kroków.</li>
	<li>Do dolnej warstwy agaru potrzebne będzie 1,5 ml mieszanki agaru i pożywki na dołek płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Aby zapewnić odpowiednią ilość mieszanki, należy przygotować łącznie 12 ml na każdą płytkę 6-dołkową.</li>
	<li>Rozpocząć od dodania 6 ml pożywki hodowlanej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, a następnie 6 ml 1% szlachetnego roztworu agaru.</li>
	<li>Odwróć stożkową rurkę kilka razy, aby wymieszać. Praca w szybkim tempie zapobiegnie przedwczesnemu stwardnieniu miękkiego agaru.</li>
	<li>Pobrać około 5,5 ml mieszaniny do pipety serologicznej o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Pozwolić, aby pęcherzyki powietrza uniosły się do górnej części kolumny pipety przed wlaniem 1,5 ml tej mieszaniny do każdej studzienki. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć osadzania się pęcherzyków powietrza w dołkach płytowych.</li>
	<li>Przykryj płytki i pozwól mieszaninie agaru zestalić się w temperaturze pokojowej, w kapturze do hodowli komórkowych, przez 30 minut.</li>
</ol>
3. Posiewanie górnej warstwy komórek zawierających agar
<ol>
	<li>Gdy dolna warstwa agaru zastygnie, rozpocznij przygotowanie górnej warstwy.</li>
	<li>Najpierw należy zebrać komórki przez trypsynizację i rozcieńczyć je w stosunku 1:5 w pożywce hodowlanej (np. na 1 ml trypsyny dodać 4 ml pożywki) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Policz komórki i oblicz liczbę komórek potrzebnych na studzienkę, aby przygotować ostateczną zawiesinę komórek w tym czasie. Liczba ta będzie się różnić w zależności od typu komórki. Użyj 5,000 komórek / studnię jako punktu wyjścia i dostosuj w razie potrzeby. Dla tej liczby komórek należy przygotować zawiesinę komórek o stężeniu 6,667 komórek/ml (tj. każda studzienka otrzyma 0,75 ml tej zawiesiny i 0,75 ml agaru na całkowitą objętość 1,5 ml; stężenie komórek zostanie również rozcieńczone w stosunku 1:2, aby uzyskać końcową całkowitą liczbę komórek wynoszącą 5,000).</li>
	<li>Objętość zawiesiny komórek potrzebna na studzienkę płytki 6-dołkowej ponownie wyniesie 1,5 ml. Przygotować dodatkową zawiesinę komórek w łącznej objętości 12 ml na płytkę 6-dołkową.</li>
	<li>Rozpuść 0,6% roztwór agaru w kuchence mikrofalowej, jak powyżej, i umieść w pojemniku na lód zawierającym gorącą wodę wraz z 50 ml stożkową probówką w uchwycie na probówkę i końcową zawiesiną komórek z kroku 3.3.</li>
	<li>Przenieś wiadro z lodem ze stopionym 0,6% agarem do okapu do hodowli komórkowych w celu wykonania kolejnych czynności.</li>
	<li>Wymieszać 0,6% agaru i zawiesinę komórek w stosunku 1:1, przygotowując łączną objętość 12 ml na płytkę 6-dołkową. Wymagane będzie 1,5 ml na studzienkę, ale należy zrobić więcej, jak powyżej.</li>
	<li>Odpipetować 6 ml zawiesiny komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Następnie dodaj 6 ml 0,6% agaru do probówki. 
	UWAGA: Temperatura tej mieszaniny musi być utrzymywana na poziomie około 42 °C, aby uniknąć przedwczesnego twardnienia i zmaksymalizować przeżywalność komórek.</li>
	<li>Pracując szybko, odpipetuj tę mieszaninę 2-3 razy, aby rozprowadzić komórki, a następnie nabierz 5,5 ml mieszaniny do pipety serologicznej o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Pozwól, aby pęcherzyki powietrza uniosły się do górnej części kolumny pipety przed wlaniem 1,5 ml tej mieszaniny do każdej studzienki. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć osadzania się pęcherzyków powietrza w dołkach płytowych.</li>
	<li>Pozostawić mieszaninę komórek/agarów do zestalenia się w temperaturze pokojowej, w kapturze do hodowli komórkowych, przez 30 minut przed umieszczeniem w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Czas potrzebny do odpowiedniego utworzenia kolonii różni się dla każdej linii komórkowej, zwykle około 21 dni.</li>
	<li>Na górnej warstwie agaru należy utrzymać warstwę pożywki wzrostowej, aby zapobiec wysuszeniu. W tym celu wystarczy 100 μl pożywki dodawanej dwa razy w tygodniu.</li>
</ol>
4. Barwienie płytek i liczenie kolonii
<ol>
	<li>Wybarwić komórki, dodając 200 μl roztworu chlorku tetrazolu nitroniebieskiego do studzienki i inkubując płytki przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po zabarwieniu kolonii zrób zdjęcia studni za pomocą imagera i policz kolonie za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.</li>
</ol>

<ol><li>Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+growth+of+mammalian+cells+in+vitro%3B+growth+characteristics+of+colonies+from+single+HeLa+cells+with+and+without+a+feeder+layer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer.</a> J Exp Med. 103, 273-283 (1956).</li>
<li>Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoikis%3A+an+emerging+hallmark+in+health+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Anoikis: an emerging hallmark in health and diseases.</a> The Journal of pathology. 226, 380-393 (2012).</li>
<li>Wend, P., Holland, J. D., Ziebold, U., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+stem+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in stem and cancer stem cells.</a> Semin Cell Dev Biol. 21, 855-863 (2010).</li>
<li>Reya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Wnt+signalling+in+self-renewal+of+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells.</a> Nature. 423, 409-414 (2003).</li>
<li>Klaus, A., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+and+its+impact+on+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling and its impact on development and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.</a> Cell. 127, 469-480 (2006).</li>
<li>Takahashi-Yanaga, F., Kahn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Wnt+signaling%3A+can+we+safely+eradicate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting Wnt signaling: can we safely eradicate cancer stem cells.</a> Clin Cancer Res. 16, 3153-3162 (2010).</li>
<li>De, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2FCa2%2B+signaling+pathway%3A+a+brief+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Wnt/Ca2+ signaling pathway: a brief overview.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 43, 745-756 (2011).</li>
<li>Tennis, M. A., Vanscoyk, M. M., Wilson, L. A., Kelley, N., Winn, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+Wnt7a+is+modulated+by+DNMT1+and+cigarette+smoke+condensate+in+non-small+cell+lung+cancer%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Methylation of Wnt7a is modulated by DNMT1 and cigarette smoke condensate in non-small cell lung cancer).</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Winn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+Wnt-7a+expression+reverses+non-small+cell+lung+cancer+cellular+transformation+through+frizzled-9-mediated+growth+inhibition+and+promotion+of+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Restoration of Wnt-7a expression reverses non-small cell lung cancer cellular transformation through frizzled-9-mediated growth inhibition and promotion of cell differentiation.</a> J Biol Chem. 280, 19625-19634 (2005).</li>
<li>Winn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumorigenic+effect+of+Wnt+7a+and+Fzd+9+in+non-small+cell+lung+cancer+cells+is+mediated+through+ERK-5-dependent+activation+of+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Antitumorigenic effect of Wnt 7a and Fzd 9 in non-small cell lung cancer cells is mediated through ERK-5-dependent activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma.</a> J Biol Chem. 281, 26943-26950 (2006).</li>
<li>Tennis, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sprouty-4+inhibits+transformed+cell+growth%2C+migration+and+invasion%2C+and+epithelial-mesenchymal+transition%2C+and+is+regulated+by+Wnt7A+through+PPARgamma+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Sprouty-4 inhibits transformed cell growth, migration and invasion, and epithelial-mesenchymal transition, and is regulated by Wnt7A through PPARgamma in non-small cell lung cancer.</a> Mol Cancer Res. 8, 833-843 (2010).</li>
<li>Steele, J. G., Rowlatt, C., Sandall, J. K., Franks, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+properties+of+high-+and+low-metastatic+cell+lines+selected+from+a+spontaneous+mouse+lung+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell surface properties of high- and low-metastatic cell lines selected from a spontaneous mouse lung carcinoma.</a> Int J Cancer. 32, 769-779 (1983).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Potwierdzenie in vitro supresyjnej funkcji białek sygnałowych jest trudne. Jednym z najbardziej rygorystycznych testów dostępnych do zbadania tej właściwości jest test tworzenia miękkich kolonii agaru. Tutaj zilustrowaliśmy test tworzenia miękkiej kolonii agaru przy użyciu mysiej linii komórkowej raka płuc stabilnie wykazującej nadekspresję Wnt7a i Fzd9 w porównaniu z jej rodzicielską linią komórkową CMT167.
Istnieje kilka ważnych punktów, które należy wziąć pod uwagę w odniesieniu do...

Test tworzenia kolonii miękkiego agaru jest techniką powszechnie używaną do oceny transformacji komórkowej in vitro. Historycznie rzecz biorąc, inny test, test klonogenny, opisany przez Pucka i wsp. w 1956 roku, został wykorzystany do oceny zdolności komórek do tworzenia kolonii1. W tej technice komórki zostały rozproszone na płytce hodowlanej i hodowane w obecności komórek "karmiących" lub kondycjonowanej pożywki w celu dostarczenia niezbędnych czynników wzrostu. Ograniczeniem tej techniki było to, że dostarczała ona tylko informacji dotyczących tworzenia kolonii. Normalne komórki nie mogą rosnąć niezależnie od zakotwiczenia, ze względu na szczególny rodzaj śmierci apoptotycznej, zwany anoikis2. Jednak przekształcone komórki mają zdolność wzrostu i podziału bez wiązania się z substratem. Aby wykorzystać tę koncepcję, naukowcy opracowali test tworzenia miękkich kolonii agaru. Od tego czasu test tworzenia miękkich kolonii agarów został zmodyfikowany w ostatnich latach w celu zaspokojenia konkretnych potrzeb. Jedna z odmian polega na włączeniu barwnika fluorometrycznego, aby umożliwić wysokoprzepustowe zliczanie kolonii. Inna odmiana polega na użyciu specjalistycznego roztworu agaru, aby umożliwić pobranie żywych komórek po utworzeniu kolonii, gdy potrzebne są próbki białek lub DNA.
W tradycyjnym teście tworzenia kolonii miękkiego agaru, komórki są hodowane w warstwie miękkiego agaru zmieszanego z podłożem do hodowli komórkowych, które spoczywa na innej warstwie miękkiego agaru, również zmieszanego z podłożem do hodowli komórkowych, ale zawierającego wyższe stężenie agaru. Zapobiega to przyleganiu komórek do płytki hodowlanej, a jednocześnie umożliwia przekształconym komórkom tworzenie widocznych kolonii. Uzasadnieniem tej techniki jest to, że normalne komórki są zależne od kontaktu komórki z macierzą zewnątrzkomórkową, aby móc rosnąć i dzielić się. I odwrotnie, przekształcone komórki mają zdolność wzrostu i podziału niezależnie od otaczającego środowiska. W związku z tym komórki zdolne do tworzenia kolonii w sposób niezależny od zakotwiczenia uznano za przekształcone i rakotwórcze. Ogólnym celem tej metody jest zmierzenie tej zdolności w komórkach w sposób półilościowy i rygorystyczny.
Szlak sygnałowy Wnt jest krytyczny w embriogenezie i często ulega deregulacji w nowotworzeniu3-6. Istnieje wiele ścieżek związanych z sygnalizacją Wnt. Szlak kanoniczny obejmuje sygnalizację Wnt i regulację transkrypcji genów w dalszej części strumienia poprzez jego wpływ na koaktywator transkrypcji beta-kateninę. Wnt sygnalizują również przez kilka niekanonicznych szlaków, na przykład szlak polaryzacji komórek płaskich, który reguluje elementy zaangażowane w strukturę cytoszkieletu7, oraz szlak Wnt-wapń, który reguluje uwalnianie wapnia z retikulum endoplazmatycznego8. Ligandy Wnt wywierają swoją aktywność poprzez wiązanie receptorów Frizzled. Chociaż wykazano, że kilka Wnt jest regulowanych w górę w raku płuc, wykazano, że Wnt7a jest regulowany w dół w niedrobnokomórkowym raku płuc poprzez metylację promotora9. Wnt7a wiąże Fzd9 i działa jako supresor guza poprzez szlak niekanoniczny. Przywrócenie Wnt-7a i Fzd-9 hamuje wzrost komórek niedrobnokomórkowego raka płuc10. Działanie Wnt7a/Fzd9 odbywa się poprzez aktywację ERK-5, który z kolei aktywuje receptor γ aktywowany przez proliferatory peroksysomów (PPARγ)11,12. Tutaj pokazujemy, że nadekspresja Wnt7a i Fzd9 powoduje zahamowanie niezależnego od zakotwiczenia wzrostu linii komórkowej mysiego raka płuca. Mysie komórki CMT167 pochodziły z raka płuc u myszy C57BL / lcrf13 i były stabilnie transfekowane Wnt7A i Fzd9. Nadekspresję Wnt7A i Fzd9 potwierdzono ilościowo PCR (Q-PCR), a funkcjonalność nadekspresji Wnt7A i Fzd9 potwierdzono poprzez dalszą aktywację PPARγ.

<table><tbody><tr><td>Interesująca linia komórek rakowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10032302</td><td>CMT-167</td></tr><tr><td>Sproszkowane RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>31800-089</td><td>Służy do przygotowania 2x pożywki do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Liquid RPMI 1650 Medium</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>Określany jako 1x pożywka do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Hyklon płodowej surowicy bydlęcej</td><td></td><td>SH30910.03</td><td>Służy do uzupełniania pożywki do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>CellGro</td><td>30-002-Cl</td><td>Stosowany w pożywce do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Difco Noble Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214230</td><td>Służy do przygotowania agaru 1,0% i 0,6%.</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Fisher</td><td>BP-328-1</td><td>Stosowany w 2x pożywce do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Cellgro</td><td>25-050-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne filtry butelkowe</td><td>Fisher</td><td>09-761-126</td><td>Służy do sterylnego filtrowania 2x pożywka.</td></tr><tr><td>Odczynnik lipofekctaminy</td><td>Invitrogen</td><td>18324-020</td><td>Stosowany w teście lucyferazy PPAR-RE.</td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe poddane działaniu</td><td></td><td></td><td></td>hodowli tkankowej</tr><tr><td>37 &#176; C/5% CO2 Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemi-Doc Imager</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Służy do fotografowania kolonii.</td></tr><tr><td>Ilość Jedna Oprogramowanie</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Służy do liczenia kolonii komórek.</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml Probówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>stożkowe 50 ml Termosy Erlenmeyera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipety</td><td></td><td></td><td></td>serologiczne</tr><tr><td>Pipety pomocnicze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr z pokrywą </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poślizgowe końcówki</td><td></td><td></td><td></td>do pipet</tr><tr><td>Mikroskop z odwróconym światłem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rękawice</td><td></td><td></td><td></td>żaroodporne</tr><tr><td>Saran Wrap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wiadro na</td><td></td><td></td><td></td> lód</tr></tbody></table>

test tworzenia kolonii miękkiego agaru

The Soft Agar Colony Formation Assay

Wzrost niezależny od zakotwiczenia to zdolność przekształconych komórek do wzrostu niezależnie od stałej powierzchni i jest cechą charakterystyczną kancerogenezy. Test tworzenia miękkich kolonii agaru jest dobrze ugruntowaną metodą charakteryzowania tej zdolności in vitro i jest uważany za jeden z najbardziej rygorystycznych testów na złośliwą transformację w komórkach. Test ten pozwala również na półilościową ocenę tej zdolności w odpowiedzi na różne warunki leczenia. Tutaj zademonstrujemy test tworzenia miękkiego kolonii agaru przy użyciu mysiej linii komórkowej raka płuc, CMT167, aby zademonstrować supresyjne działanie guza dwóch członków szlaku sygnałowego Wnt, Wnt7A i Frizzled-9 (Fzd-9). Jednoczesna nadekspresja Wnt7a i Fzd-9 spowodowała zahamowanie tworzenia kolonii w komórkach CMT167. Pokazuje to, że ekspresja liganda Wnt7a i jego receptora Frizzled-9 jest wystarczająca do zahamowania wzrostu guza w mysim modelu raka płuca.

Ekspresja Wnt7A i Fzd9 w komórkach CMT167 jest skuteczna w supresji nowotworu, co wykazano w naszym teście tworzenia kolonii w miękkim agarze. Wstępnie wykorzystano Q-PCR, aby wykazać, że mRNA Wnt7A i Fzd9 wykazują niski poziom ekspresji w komórkach CMT167. Komórki CMT167 wykazywały niski poziom endogennego Wnt7A i Fzd9 w porównaniu z komórkami MLE-12, linią epitelialną płuc myszy przekształconą przez SV40 (Rycina 1). Następnie przeprowadzono transfekcję komórek CMT167 dwoma retrowirusowymi wektorami nad...

Test tworzenia miękkiego kolonii agaru jest metodą używaną do potwierdzania wzrostu in vitro niezależnego od zakotwiczenia komórkowego. Celem tego protokołu jest zilustrowanie rygorystycznej metody wykrywania potencjału rakotwórczego transformowanych komórek oraz supresyjnego wpływu białek na transformowane komórki.

Test tworzenia kolonii miękkiego agaru

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft ...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie wzrostu niezależnego od zakotwiczenia komórkowego. Osiąga się to poprzez uprzednie posiew warstwy agaru na płytce do hodowli komórkowej i pozostawienie jej do stwardnienia. Drugim krokiem jest umieszczenie mieszaniny komórek w agarze na wierzchu poprzedniej warstwy agaru.Następnie komórki mogą tworzyć kolonie przez okres kilku tygodni. Ostatnim krokiem jest barwienie kolonii w celu wizualizacji i kwantyfikacji. Ostatecznie test tworzenia miękkiej kolonii agaru służy do wykazania niezależnego wzrostu Anchorage jako wskaźnika transformacji komórkowej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak test genowy Clon, jest to, że test tworzenia miękkich kolonii agaru wymaga, aby komórki tworzyły kolonie w sposób niezależny od zakotwiczenia. Rozpocznij procedurę od oznaczenia każdego dołka w poddanej zabiegu kulturze tkankowej. Płytka z sześcioma dołkami odpowiednio do każdej badanej linii komórkowej lub stanu.Następnie przygotuj dwie pożywki hodowlane Xcel, rozpuszczając jeden gram pożywki w proszku i 0,2 grama wodorowęglanu sodu w wodzie dejonizowanej do końcowej objętości 50 mililitrów. Przepuść to medium przez filtr 0,2 mikrona. Dodaj dodatkowe składniki potrzebne do normalnej hodowli interesującej nas linii komórkowej.Na przykład hoduj linię komórkową CMT 1 67 w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% roztworem streptomycyny FBS i 1% penicyliny. Przed użyciem podgrzać medium do 37 stopni Celsjusza w gorącej kąpieli wodnej. Teraz przygotuj jedną pożywkę hodowlaną Xcel.Następnie przygotuj 1% szlachetny agar, dodając jeden gram szlachetnego agaru do 100 mililitrów wody dejonizowanej. Następnie przygotuj 0,6% szlachetnego agaru, dodając 0,6 grama szlachetnego agaru do 100 mililitrów wody dejonizowanej. Następnie autoklaw szlachetnych mieszanek agarowych.Następnie należy przygotować jeden miligram na mililitr roztworu podstawowego chlorku tetra oleum nitro blue w jednym XPBS w celu zabarwienia kolonii. W tej procedurze butelkę z 1% szlachetnym agarem należy podgrzewać w kuchence mikrofalowej przez około jedną do dwóch minut, podgrzewając w kuchence mikrofalowej. Uważnie monitorować roztwór, aby uniknąć wykipienia.Następnie kontynuuj podgrzewanie i mieszanie z przerwami, aż agar całkowicie się rozpuści, a roztwór będzie klarowny. Następnie umieść stopiony roztwór agaru i podgrzej dwa x pożywki hodowlanej w wiadrze z lodem wypełnionym temperaturą 42 stopni Celsjusza. Kranówka.Ponadto umieść stożkową rurkę o pojemności 50 mililitrów w uchwycie na probówkę w pojemniku na lód z gorącą wodą. Następnie przenieś wiadro do okapu do hodowli komórkowej. Następnie dodaj sześć mililitrów pożywki hodowlanej i sześć mililitrów 1% szlachetnego roztworu agaru do 50-mililitrowej stożkowej probówki.Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. Praca w szybkim tempie zapobiegnie przedwczesnemu stwardnieniu miękkiego agaru. Następnie pobrać około 5,5 mililitra mieszaniny za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej.Pozwól, aby pęcherzyki powietrza uniosły się do górnej części kolumny pipety. Następnie wlej 1,5 mililitra mieszaniny do każdej studzienki i unikaj osadzania się pęcherzyków powietrza. Przykryj płytkę i pozwól mieszaninie agaru zestalić się w kapturze do hodowli komórkowych w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Najpierw zbierz komórki za pomocą trypsyny i rozcieńcz je od jednego do pięciu w hodowli, pożywce do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Policz komórki i oblicz liczbę komórek potrzebnych na studzienkę, aby przygotować ostateczną zawiesinę komórek w tym czasie. Następnie rozpuść 0,6% roztwór agaru w kuchence mikrofalowej.Umieść go w wiaderku z lodem zawierającym gorącą wodę wraz z 50-mililitrową stożkową rurką w uchwycie na probówkę i końcową zawiesinę komórek. Następnie przenieś wiadro z lodem ze stopionym 0,6% agarem do okapu do hodowli komórkowych w celu wykonania kolejnych czynności. Aby przygotować całkowitą objętość 12 mililitrów zawiesiny komórek na płytkę sześciodołkową, najpierw pipetuj sześć mililitrów zawiesiny komórek do 50-mililitrowej stożkowej probówki.Następnie dodaj sześć mililitrów 0,6% agaru do probówki. Utrzymuj mieszaninę w temperaturze 42 stopni Celsjusza, aby uniknąć przedwczesnego stwardnienia i zmaksymalizować przeżycie komórek. Następnie szybko odpipetuj mieszaninę, dwa do trzech razy, aby rozprowadzić komórki.Pobrać 5,5 mililitra mieszaniny za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej i pozwolić, aby pęcherzyki powietrza uniosły się do górnej części kolumny pipety. Następnie włóż 1,5 mililitra mieszaniny do każdego. Dobrze, pozwól mieszaninie agaru komórkowego zestalić się w temperaturze pokojowej w okapie do hodowli komórkowych przez 30 minut przed umieszczeniem jej w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Dodaj 100 mikrolitrów pożywki wzrostowej na górną warstwę agaru dwa razy w tygodniu, aby zapobiec wysuszeniu i odczekaj około 21 dni na odpowiednie utworzenie kolonii. Aby zabarwić komórki, dodaj 200 mikrolitrów roztworu chlorku tetra oleum nitro blue do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po zabarwieniu kolonii zrób zdjęcia studni za pomocą imagera i policz kolonie za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.Pokazano tutaj test tworzenia miękkiej kolonii agaru z ekspresją wektora wyrażającego CMT 1 67 LNCX LPC X komórki i CMT 1 67 LL przeszedł siedem kędzierzawych dziewięciu nad komórkami eksprymującymi. Wektor wyrażający komórki CMT 1 67 L i CXL PC X oraz CMT 1 67 LL poszedł w siódme miejsce. Dziewięć komórek z nadekspresją zostało posianych w teście tworzenia kolonii miękkiego agaru CMT 1 67 LL poszło siedem kędzierzawych dziewięciu komórek wykazało wyraźny spadek tworzenia kolonii Po jego opracowaniu.Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad rakiem do zbadania transformacji komórkowej in vitro. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oceniać komórki pod kątem niezależnego wzrostu Anchorage.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zastosowanie testu kolonogennego do oceny żywotności reprodukcyjnej jest uznane od ponad 50 lat. W niniejszym materiale przedstawiamy ogólną procedurę przeprowadzania testu kolonogennego z wykorzystaniem komórek adherentnych.

Test klonogenny: komórki adherentne

Podczas pracy z pożywkami i odczynnikami używanymi do hodowli mikroorganizmów, należy stosować technikę aseptyczną, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Do izolacji, namnażania lub oznaczania liczby bakterii i fagów rutynowo stosuje się różne metody posiewu, z których wszystkie obejmują procedury utrzymujące sterylność materiałów eksperymentalnych.

Aseptyczne techniki laboratoryjne: metody galwanizacji

Ten film opisuje test tworzenia miękkiego kolonii agaru w celu sprawdzenia wpływu inhibitora enzymu PADI i BB-Cl-amidyny na rak piersi in vitro. Test ten umożliwia również ilościową ocenę potencjału transformacji komórek w kontekście zaburzeń genetycznych.

Test tworzenia kolonii miękkiego agaru: metoda testowania wpływu nowych związków na proliferację komórek rakowych

Ten film opisuje test tworzenia kolonii, który pomaga określić zdolność komórek raka płuc do rozmnażania się w nieskończoność i tworzenia indywidualnych kolonii. Możemy przeanalizować wpływ środka przeciwnowotworowego na komórki tworzące kolonie, analizując zmiany w liczbie i/lub wielkości powstałych kolonii.

Test tworzenia kolonii: ocena skuteczności środków przeciwnowotworowych na komórkach raka płuc tworzących kolonie

Źródło: Cayron, J. i Lesterlin, C. Wieloskalowa analiza wzrostu bakterii w warunkach leczenia stresem. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę oceny filamentacji E. coli i replikacji DNA w przypadku antybiotykoterapii hamującej podziały komórek przy użyciu posiewu do pomiaru żywotności i cytometrii przepływowej do analizy wielkości komórki i zawartości DNA.

Ocena filamentacji indukowanej antybiotykiem w E. coli za pomocą testu posiewu i cytometrii przepływowej

Źródło: Temkin, M. I. i in. Wysokoprzepustowe testy kokultury do badania interakcji mikroorganizmów. J. Vis. Exp. (2019)Ten film prezentuje test in vitro do badania interakcji mikroorganizmów między Corynebacterium propinquum a Staphylococcus w współkulturze.

Test in vitro do badania interakcji mikroorganizmów w kokulturze

Białka oddziałują na siebie nawzajem i te interakcje determinują w dużej mierze ich funkcje. Partnerzy interakcji białkowych można zidentyfikować przy wysokiej przepustowości in vivo za pomocą testu sprawności drożdży opartego na teście komplementacji fragmentów białka reduktazy dihydrofolianu (DHFR-PCA).

Badania przesiewowe interakcji białko-białko w całym genomie za pomocą testu komplementacji fragmentów białka (PCA) w żywych komórkach

Tutaj dokumentujemy użycie testu tworzenia kolonii miękkiego agaru do testowania wpływu inhibitora enzymu deiminazy peptydyloargininowej (PADI), BB-Cl-amidyny, na rak piersi rak piersi w badaniach in vitro.

Wykorzystanie testu tworzenia kolonii miękkiego agaru do identyfikacji inhibitorów rakotwórczości w komórkach raka piersi

Fenotypy wzrostu drożdży są precyzyjnie mierzone za pomocą wysoce równoległego obrazowania poklatkowego unieruchomionych komórek rosnących w mikrokolonie. Jednocześnie można monitorować tolerancję na stres, ekspresję białek i lokalizację białek, generując zintegrowane zestawy danych w celu zbadania, w jaki sposób różnice środowiskowe i genetyczne, a także niejednorodność ekspresji genów wśród komórek izogenicznych, modulują wzrost.

Wysokoprzepustowe obrazowanie mikrokolonii na żywo w celu pomiaru niejednorodności wzrostu i ekspresji genów

Ta metoda określa ilościowo obfitość mikroorganizmów za pomocą formatu 96-dołkowej płytki do płytek tworzących kolonie (CFU) i jest stosowana do mikrobiomu Drosophila w próbkach homogenatu całych much. Jednostki CFU są zliczane za pomocą oprogramowania do automatycznej analizy obrazu, które jest dostępne tutaj.

Szybkie zliczanie jednostek tworzących kolonie w formacie 96-dołkowej płytki zastosowane do mikrobiomu Drosophila

Opisano protokół przygotowania prostego modelu ekosystemu, który odtwarza gradient przeciwstawny metanowo-tlenowy występujący w naturalnym środowisku tlenowych bakterii utleniających metan, umożliwiając badanie ich fizjologii w przestrzennie rozwiązanym kontekście. Opisano również modyfikacje popularnych testów biochemicznych do stosowania z ekosystemem modelowym opartym na agarozie.

Modelowy ekosystem oparty na agarozie do hodowli metanotrofów w przeciwgradieniu metanowo-tlenowym

Poznaj metodę testu tworzenia kolonii w miękkim agarze do badania transformacji nowotworowej komórek in vitro. Ta technika pozwala ilościowo ocenić wzrost niezależny od podłoża i potencjał tumorygenny.

Test tworzenia kolonii miękkiego agaru

Przeglądaj więcej filmów