Test tworzenia kolonii miękkiego agaru

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie wzrostu niezależnego od zakotwiczenia komórkowego. Osiąga się to poprzez uprzednie posiew warstwy agaru na płytce do hodowli komórkowej i pozostawienie jej do stwardnienia. Drugim krokiem jest umieszczenie mieszaniny komórek w agarze na wierzchu poprzedniej warstwy agaru.

Następnie komórki mogą tworzyć kolonie przez okres kilku tygodni. Ostatnim krokiem jest barwienie kolonii w celu wizualizacji i kwantyfikacji. Ostatecznie test tworzenia miękkiej kolonii agaru służy do wykazania niezależnego wzrostu Anchorage jako wskaźnika transformacji komórkowej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak test genowy Clon, jest to, że test tworzenia miękkich kolonii agaru wymaga, aby komórki tworzyły kolonie w sposób niezależny od zakotwiczenia. Rozpocznij procedurę od oznaczenia każdego dołka w poddanej zabiegu kulturze tkankowej. Płytka z sześcioma dołkami odpowiednio do każdej badanej linii komórkowej lub stanu.

Następnie przygotuj dwie pożywki hodowlane Xcel, rozpuszczając jeden gram pożywki w proszku i 0,2 grama wodorowęglanu sodu w wodzie dejonizowanej do końcowej objętości 50 mililitrów. Przepuść to medium przez filtr 0,2 mikrona. Dodaj dodatkowe składniki potrzebne do normalnej hodowli interesującej nas linii komórkowej.

Na przykład hoduj linię komórkową CMT 1 67 w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% roztworem streptomycyny FBS i 1% penicyliny. Przed użyciem podgrzać medium do 37 stopni Celsjusza w gorącej kąpieli wodnej. Teraz przygotuj jedną pożywkę hodowlaną Xcel.

Następnie przygotuj 1% szlachetny agar, dodając jeden gram szlachetnego agaru do 100 mililitrów wody dejonizowanej. Następnie przygotuj 0,6% szlachetnego agaru, dodając 0,6 grama szlachetnego agaru do 100 mililitrów wody dejonizowanej. Następnie autoklaw szlachetnych mieszanek agarowych.

Następnie należy przygotować jeden miligram na mililitr roztworu podstawowego chlorku tetra oleum nitro blue w jednym XPBS w celu zabarwienia kolonii. W tej procedurze butelkę z 1% szlachetnym agarem należy podgrzewać w kuchence mikrofalowej przez około jedną do dwóch minut, podgrzewając w kuchence mikrofalowej. Uważnie monitorować roztwór, aby uniknąć wykipienia.

Następnie kontynuuj podgrzewanie i mieszanie z przerwami, aż agar całkowicie się rozpuści, a roztwór będzie klarowny. Następnie umieść stopiony roztwór agaru i podgrzej dwa x pożywki hodowlanej w wiadrze z lodem wypełnionym temperaturą 42 stopni Celsjusza. Kranówka.

Ponadto umieść stożkową rurkę o pojemności 50 mililitrów w uchwycie na probówkę w pojemniku na lód z gorącą wodą. Następnie przenieś wiadro do okapu do hodowli komórkowej. Następnie dodaj sześć mililitrów pożywki hodowlanej i sześć mililitrów 1% szlachetnego roztworu agaru do 50-mililitrowej stożkowej probówki.

Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. Praca w szybkim tempie zapobiegnie przedwczesnemu stwardnieniu miękkiego agaru. Następnie pobrać około 5,5 mililitra mieszaniny za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej.

Pozwól, aby pęcherzyki powietrza uniosły się do górnej części kolumny pipety. Następnie wlej 1,5 mililitra mieszaniny do każdej studzienki i unikaj osadzania się pęcherzyków powietrza. Przykryj płytkę i pozwól mieszaninie agaru zestalić się w kapturze do hodowli komórkowych w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Najpierw zbierz komórki za pomocą trypsyny i rozcieńcz je od jednego do pięciu w hodowli, pożywce do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Policz komórki i oblicz liczbę komórek potrzebnych na studzienkę, aby przygotować ostateczną zawiesinę komórek w tym czasie. Następnie rozpuść 0,6% roztwór agaru w kuchence mikrofalowej.

Umieść go w wiaderku z lodem zawierającym gorącą wodę wraz z 50-mililitrową stożkową rurką w uchwycie na probówkę i końcową zawiesinę komórek. Następnie przenieś wiadro z lodem ze stopionym 0,6% agarem do okapu do hodowli komórkowych w celu wykonania kolejnych czynności. Aby przygotować całkowitą objętość 12 mililitrów zawiesiny komórek na płytkę sześciodołkową, najpierw pipetuj sześć mililitrów zawiesiny komórek do 50-mililitrowej stożkowej probówki.

Następnie dodaj sześć mililitrów 0,6% agaru do probówki. Utrzymuj mieszaninę w temperaturze 42 stopni Celsjusza, aby uniknąć przedwczesnego stwardnienia i zmaksymalizować przeżycie komórek. Następnie szybko odpipetuj mieszaninę, dwa do trzech razy, aby rozprowadzić komórki.

Pobrać 5,5 mililitra mieszaniny za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej i pozwolić, aby pęcherzyki powietrza uniosły się do górnej części kolumny pipety. Następnie włóż 1,5 mililitra mieszaniny do każdego. Dobrze, pozwól mieszaninie agaru komórkowego zestalić się w temperaturze pokojowej w okapie do hodowli komórkowych przez 30 minut przed umieszczeniem jej w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Dodaj 100 mikrolitrów pożywki wzrostowej na górną warstwę agaru dwa razy w tygodniu, aby zapobiec wysuszeniu i odczekaj około 21 dni na odpowiednie utworzenie kolonii. Aby zabarwić komórki, dodaj 200 mikrolitrów roztworu chlorku tetra oleum nitro blue do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po zabarwieniu kolonii zrób zdjęcia studni za pomocą imagera i policz kolonie za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Pokazano tutaj test tworzenia miękkiej kolonii agaru z ekspresją wektora wyrażającego CMT 1 67 LNCX LPC X komórki i CMT 1 67 LL przeszedł siedem kędzierzawych dziewięciu nad komórkami eksprymującymi. Wektor wyrażający komórki CMT 1 67 L i CXL PC X oraz CMT 1 67 LL poszedł w siódme miejsce. Dziewięć komórek z nadekspresją zostało posianych w teście tworzenia kolonii miękkiego agaru CMT 1 67 LL poszło siedem kędzierzawych dziewięciu komórek wykazało wyraźny spadek tworzenia kolonii Po jego opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad rakiem do zbadania transformacji komórkowej in vitro. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oceniać komórki pod kątem niezależnego wzrostu Anchorage.