Name: Techniki eksperymentalne i obrazowe do badania struktur skrzepów fibryny w stanach prawidłowych i chorobowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Poznaj techniki mikroskopii konfokalnej do badania struktur skrzepów fibryny w cukrzycy i anemii sierpowatej. Ta metoda pozwala analizować morfologię skrzepów i szybkość fibrynolizy w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Lam Lab w Georgia Tech za wiele pomocnych dyskusji przy opracowywaniu eksperymentalnych testów. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody numer K01HL115486 oraz przez New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 z Biura Dyrektora Narodowych Instytutów Zdrowia. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

UWAGA: Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi określonymi przez Institutional Review Board (IRB) w Georgia Tech.
1. Procedura pobierania krwi i izolacji erytrocytów
<ol>
	<li>Pobrać od 40-120 ml krwi od dawców do 10 ml heparynowanych probówek typu vacutainer. Rozpocząć izolację PBMC (mononuklearnych komórek krwi obwodowej) w ciągu 4 h od pobrania. W tym czasie przechowywać krew w RT. 
	UWAGA: Przechowywanie krwi przez noc w RT lub w 4 °C NIE JEST zalecane, ponieważ spowoduje to niższą wydajność PBMC.</li>
	<li>Rozcieńczyć krew pełną w stosunku 1:1 w lodowatym (4 °C) sterylnym PBS.</li>
	<li>Pipetować 10 ml lodowatego polisacharydu hydrofilowego do pustej, sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Delikatnie przenieść rozcieńczoną krew pełną na powierzchnię polisacharydu hydrofilowego.</li>
	<li>Używając pipety 25 ml z ustawionym powolnym tempem, pipetować krew bardzo powoli wzdłuż ścianki probówki. Należy upewnić się, że krew nie zmiesza się z sacharydem przed wirowaniem, ponieważ polisacharyd hydrofilowy jest toksyczny dla komórek, co w przeciwnym razie obniży wydajność PBMC.</li>
	<li>Wirować próbki krwi przez 30 min przy 400 x g w temperaturze 4 °C. Jeśli to możliwe, zmniejszyć prędkość hamowania wirówki do połowy wartości maksymalnej, aby uzyskać lepszą separację po wirowaniu.</li>
	<li>Odessać frakcję osocza/płytek krwi z wirowanej próbki krwi. Ostrożnie odessać warstwę polisacharydu hydrofilowego znajdującą się bezpośrednio nad warstwą upakowanych RBC.</li>
	<li>Zebrać 8-10 ml upakowanych RBC i rozcieńczyć w stosunku 1:1 niesterylną solą fizjologiczną 0,9% NaCl.</li>
</ol>
2. Ocena struktur skrzyżowanych skrzepów glikowanych (symulowane skrzepy w cukrzycy) za pomocą mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Rozmrozić ludzki fibrynogen oraz koniugat ludzkiego fibrynogenu znakowanego fluorescencyjnie w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Do mikroprobówki graduowanej o pojemności 0,5 ml pipetować następujące składniki:
	<ol>
		<li>W przypadku zdrowych, prawidłowych skrzepów fibrynowych, zmieszać ludzki fibrynogen z 10% koniugatem ludzkiego fibrynogenu znakowanego fluorescencyjnie w buforze 50 mM Tris/100 mM NaCl do uzyskania stężenia 5 mg/ml.</li>
		<li>W przypadku sztucznie glikowanego fibrynogenu (do symulacji skrzepów cukrzycowych), inkubować ludzki fibrynogen i 10% koniugat fibrynogenu znakowanego fluorescencyjnie w 5 mM roztworze glukozy rozpuszczonej w 50 mM Tris/100 mM NaCl do uzyskania stężenia końcowego 6,8 mg/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakryć mikroprobówki nieprzezroczystym materiałem, aby uniknąć ekspozycji na światło. Inkubować probówki w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 48 h.</li>
	<li>Przygotować komorę na szklanym szkiełku przedmiotowym, mocując cienką taśmę klejącą po 2 stronach szkiełka.</li>
	<li>Po 48-godzinnym okresie inkubacji przygotować odczynniki do tworzenia fibryny poprzez rozmrożenie FXIIIa i ludzkiej trombiny alfa w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Rozcieńczyć FXIIIa do stężenia 80 U/ml w buforze 5 mM CaCl2.</li>
	<li>Rozcieńczyć trombinę do stężenia 4 U/ml w buforze 5 mM CaCl2.
	<ol>
		<li>Dla skrzepów prawidłowych zapewnić, aby końcowe stężenia fibrynogenu, FXIIIa i trombiny wynosiły odpowiednio 2,5 mg/ml, 20 U/ml i 1 U/ml przy objętości 50 μl.</li>
		<li>Dla skrzepów glikowanych zapewnić, aby końcowe stężenia fibrynogenu, FXIIIa i trombiny wynosiły odpowiednio 3,4 mg/ml, 20 U/ml i 1 U/ml przy objętości 50 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Natychmiast pipetować 30 μl roztworu fibryny do komory utworzonej przez taśmę klejącą.</li>
	<li>Położyć szklane szkiełko zakrywywe o wymiarach 22 mm x 22 mm i grubości 0,15 mm na dwóch warstwach taśmy klejącej. Uszczelnić otwarte boki przezroczystym klejem, aby zapobiec wysychaniu skrzepu fibrynowego. Upewnić się, że klej nie wchodzi w interakcję ze skrzepem fibrynowym.</li>
	<li>Pozostawić skrzepy fibrynowe do polimeryzacji w temperaturze 21-23 °C przez 2 h przed obrazowaniem konfokalnym.</li>
	<li>Wykonać obrazy konfokalne skrzepów przy użyciu mikroskopu konfokalnego z obiektywem 40X/1.30 Oil M27 oraz laserem argonowym o długości fali 488 nm.</li>
</ol>
3. Ocena mikroskopowa konfokalna skrzepów fibryny zawierających RBC od pacjentów z anemią sierpowatą
<ol>
	<li>Rozmrozić ludzki fibrynogen oraz koniugat ludzkiego fibrynogenu znakowanego fluorescencyjnie w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Pipetować następujące składniki do mikroprobówki z podziałką o pojemności 0,5 ml.
	<ol>
		<li>W przypadku zdrowego, prawidłowego skrzepu fibrynowego, zmieszać ludzki fibrynogen z 10% koniugatem ludzkiego fibrynogenu znakowanego fluorescencyjnie w buforze 50 mM Tris/100 mM NaCl do uzyskania stężenia 5 mg/ml.</li>
		<li>W przypadku skrzepów zawierających RBC z SCD, zmieszać ludzki fibrynogen i 10% koniugat ludzkiego fibrynogenu znakowanego fluorescencyjnie w 50 mM Tris/100 mM NaCl tak, aby wynikowe stężenie fibrynogenu wynosiło 10 mg/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znakować wyizolowane RBC (zarówno prawidłowe, jak i pochodzące od pacjentów z niedokrwistością sierpowatą, uzyskane zgodnie z protokołem izolacji RBC), używając roztworu do znakowania komórek.
	<ol>
		<li>Zawiesić komórki w wybranym bezserowym medium hodowlanym przy gęstości 1 x 106 na ml.</li>
		<li>Dodać 5 μl/ml zawiesiny komórkowej do roztworu do znakowania komórek. Dobrze wymieszać, delikatnie pipetując.</li>
		<li>Inkubować przez 20 min w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wirować probówki z oznakowaną zawiesiną z prędkością 1 500 rpm przez 5 min w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Usunąć supernatant i delikatnie resuspendować komórki w medium o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Powtórzyć procedurę przemywania (3.3.4 i 3.3.5) jeszcze dwa razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć FXIIIa do stężenia 80 U/ml w buforze 5 mM CaCl2.</li>
	<li>Rozcieńczyć trombinę do stężenia 4 U/ml w buforze 5 mM CaCl2.
	<ol>
		<li>W przypadku prawidłowych skrzepów upewnić się, że końcowe stężenia fibrynogenu, FXIIIa i trombiny wynoszą odpowiednio 2,5 mg/ml, 20 U/ml i 1 U/ml przy objętości 50 μl.</li>
		<li>W przypadku skrzepów zawierających RBC z SCD upewnić się, że końcowe stężenia fibrynogenu, FXIIIa i trombiny wynoszą odpowiednio 5 mg/ml, 20 U/ml i 1 U/ml przy objętości 50 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pipetować 10 μl oznakowanych RBC do roztworu fibryny. Pipetować 30 μl fibryny z RBC na szkiełko mikroskopowe (patrz: przygotowanie preparatów dla skrzepów glikowanych).</li>
	<li>Pozostawić fibrynę do polimeryzacji w temperaturze 21-23 °C przez 2 h przed obrazowaniem konfokalnym.</li>
	<li>Wykonać obrazy konfokalne skrzepów za pomocą mikroskopu konfokalnego, wykorzystując lasery wzbudzające o długościach fal 488 nm i 633 nm w celu wzbudzenia znakowanej fluorescencyjnie fibryny oraz RBC.</li>
</ol>
4. Ocena szybkości fibrynolizy w glikowanych strukturach skrzepu za pomocą mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Powtórz protokół mikroskopii konfokalnej dla skrzepów glikowanych (Krok 2 protokołu), aby ocenić szybkość fibrynolizy w skrzepach glikowanych.</li>
	<li>Nie uszczelniaj końców komory przezroczystym klejem. Pozostaw skrzepy fibrynowe do polimeryzacji na 1,5 hr w temperaturze 21-23 °C w szczelnej obudowie zawierającej 250 ml wody, aby zapobiec odwodnieniu.</li>
	<li>Po polimeryzacji wykonaj obrazy skrzepów przy użyciu mikroskopu konfokalnego.</li>
	<li>Pipetuj plazminę do otwartego końca komory i rozprowadź ją w skrzepie poprzez działanie kapilarne.
	<ol>
		<li>W przypadku eksperymentów nad fibrynolizą prawidłową i glikowaną przy normalnych stężeniach, nanieś do otworu komory 25 μl plazminy o stężeniu 200 μg/ml.</li>
		<li>W przypadku skrzepów glikowanych przy obniżonych stężeniach, nanieś do otworu komory 25 μl o stężeniu 50 μg/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj funkcji serii czasowej (patrz Rycina 1) w oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego, aby zarejestrować w czasie rzeczywistym wideo z procesu lizy skrzepu przez plazminę.
	<ol>
		<li>Kliknij tryb akwizycji, a następnie wybierz „Time Series”. Wybierz liczbę cykli oraz odstęp czasu rejestracji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Obliczanie szybkości fibrynolizy
<ol>
	<li>Wyznacz szybkość lizy poprzez określenie obszaru (2,500 µm2) i obliczenie czasu wymaganego do rozpuszczenia stałego obszaru skrzepu. Oblicz szybkość lizy, korzystając z następującego równania (Rysunek 2): 
	<img alt="Równanie szybkości lizy plazminy; obszar skrzepu/czas lizy; formuła analizy rozpuszczania skrzepu." fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52019/52019eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"></li>
</ol>
6. Analiza statystyczna szybkości fibrynolizy
<ol>
	<li>Przeanalizuj dane dotyczące lizy przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej. Przeprowadź jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) oraz test post hoc Tukeya-Kramera44,45.</li>
</ol>

<ol><li>Averett, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+Fibrinogen+Model+that+Captures+the+Stress-Strain+Behavior+of+Fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers.</a> Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).</li>
<li>Carlisle, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+properties+of+individual%2C+electrospun+fibrinogen+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers.</a> Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).</li>
<li>Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+origins+of+the+mechanical+properties+of+fibrin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The molecular origins of the mechanical properties of fibrin.</a> Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).</li>
<li>Guthold, M., Cho, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+Unfolding+Mechanisms+Are+Not+Too+Much+of+a+Stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch.</a> Structure. 19, 1536-1538 (2011).</li>
<li>Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+fibrin+clots+II%3A+Linear+viscoelastic+behavior+in+shear+creep%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep.</a> Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).</li>
<li>Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+fibrin+clots.+v.+shear+modulus%2C+creep%2C+and+creep+recovery+of+fine+unligated+clots%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots.</a> Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).</li>
<li>Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+fibrin+clots.+I.%3A+Dynamic+viscoelastic+properties+and+fluid+permeation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation.</a> Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).</li>
<li>Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Origins+of+Fibrin+Clot+Rheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural Origins of Fibrin Clot Rheology.</a> Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).</li>
<li>Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+assembly.+Lateral+aggregation+and+the+role+of+the+two+pairs+of+fibrinopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides.</a> Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).</li>
<li>Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+properties+of+fibrin+for+basic+scientists+and+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians.</a> Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).</li>
<li>Wolberg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+generation+and+fibrin+clot+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Reviews%22%5BJournal%5D)">Thrombin generation and fibrin clot structure.</a> Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).</li>
<li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+generation%2C+fibrin+clot+formation+and+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+and+Apheresis+Science%22%5BJournal%5D)">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).</li>
<li>Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructure+of+the+Fibrin+Clot%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nanostructure of the Fibrin Clot.</a> Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).</li>
<li>Dunn, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+fibrin+clot+structure+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Herz%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes.</a> Herz. 29, 470-479 (2004).</li>
<li>Gladwin, M. T., Sachdev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+abnormalities+in+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).</li>
<li>Collet, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Fibrin+Architecture+Is+Associated+With+Hypofibrinolysis+and+Premature+Coronary+Atherothrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).</li>
<li>Carr, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus%3A+a+hypercoagulable+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+and+its+Complications%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus: a hypercoagulable state.</a> Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).</li>
<li>Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+disease+and+heritability+of+the+prothrombotic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state.</a> Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).</li>
<li>Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+physiology+and+pathology+of+fibrin+structure%2Ffunction%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Reviews%22%5BJournal%5D)">The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function.</a> Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).</li>
<li>American Diabetes Association. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.diabetes.org/">http://www.diabetes.org/</a> (2014).</li>
<li>Alzahrani, S., Ajjan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+article%3A+Coagulation+and+fibrinolysis+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+and+Vascular+Disease+Research%22%5BJournal%5D)">Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes.</a> Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).</li>
<li>Sickle Cell Disease Association of America, Inc. , 
 Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.sicklecelldisease.org/">http://www.sicklecelldisease.org/</a> (2014).</li>
<li>Stuart, M. J., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle-cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Sickle-cell disease.</a> The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).</li>
<li>Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+type+2+diabetes+on+fibrin+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function.</a> Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).</li>
<li>Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+involved+in+the+resistance+of+fibrin+to+clot+lysis+by+plasmin+in+subjects+with+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).</li>
<li>Famodu, A., Reid, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+fibrinogen+levels+in+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+and+geographical+medicine%22%5BJournal%5D)">Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease.</a> Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).</li>
<li>Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Changes+in+Coagulation+and+Viscosity+during+Sickle-Cell+Crisis%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+haematology%22%5BJournal%5D)">Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis.</a> British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).</li>
<li>Ataga, K. I., Orringer, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercoagulability+in+sickle+cell+disease%3A+a+curious+paradox%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox.</a> The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).</li>
<li>Collet, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+fibrin+architecture+is+associated+with+hypofibrinolysis+and+premature+coronary+atherothrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).</li>
<li>Barazzoni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Fibrinogen+Production+in+Type+2+Diabetic+Patients+without+Detectable+Vascular+Complications%3A+Correlation+with+Plasma+Glucagon+Concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).</li>
<li>Ceriello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+activation+in+diabetes+mellitus%3A+the+role+of+hyperglycaemia+and+therapeutic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects.</a> Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).</li>
<li>Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+adhesiveness%2C+plasma+fibrinogen+and+factor+VIII+levels+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 6, 436-440 (1970).</li>
<li>Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+fibrin%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+protein+chemistry%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and fibrin.</a> Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).</li>
<li>Collet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Fibrin+Network+Conformation+and+Fibrin+Fiber+Diameter+on+Fibrinolysis+Speed+Dynamic+and+Structural+Approaches+by+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).</li>
<li>Jörneskog, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+properties+of+the+fibrin+gel+structure+in+patients+with+IDDM%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM.</a> Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).</li>
<li>Svensson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+and+glycation+of+fibrinogen+in+vitro+occur+at+specific+lysine+residues+in+a+concentration+dependent+manner%3A+A+mass+spectrometric+and+isotope+labeling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).</li>
<li>Pieters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycation+of+fibrinogen+in+uncontrolled+diabetic+patients+and+the+effects+of+glycaemic+control+on+fibrinogen+glycation%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation.</a> Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).</li>
<li>Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+fibrin+clot+networks+from+stereoscopic+intermediate+voltage+electron+microscope+images+and+analysis+of+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching.</a> Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).</li>
<li>Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+extravascular+and+intravascular+cells+to+fibrin+network+formation%2C+structure%2C+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability.</a> Blood. 114, 4886-4896 (2009).</li>
<li>Curtis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+microstructural+templating+in+fibrin-thrombin+gel+networks+by+spectral+and+viscoelastic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis.</a> Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).</li>
<li>Kim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+fibrin+network+structure+and+mechanical+properties%3A+an+experimental+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis.</a> Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).</li>
<li>Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+cell+disease+activates+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+induce+cathepsins+k+and+v+activity+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anemia%22%5BJournal%5D)">Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells.</a> Anemia. 2012, 201781(2012).</li>
<li>Allison, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+sickle-cell+haemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Properties of sickle-cell haemoglobin.</a> Biochemical Journal. 65, 212(1957).</li>
<li>Kuehl, R. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuehl%2C+RO+%22Design+of+experiments+%3A+statistical+principles+of+research+design+and+analysis%22">Design of experiments : statistical principles of research design and analysis</a>. , 2nd ed, Cengage Learning. Pacific Grove, CA. (2000).</li>
<li>Lindman, H. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLindman%2C+HR+%22Analysis+of+variance+in+experimental+designs%22">Analysis of variance in experimental designs</a>. , Springer-Verlag Publishing. New York, N.Y., USA. (1992).</li>
<li>Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastable+Mesoscopic+Clusters+in+Solutions+of+Sickle-Cell+Hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin.</a> Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).</li>
<li>Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+theoretical+study+on+the+dissolution+of+mural+fibrin+clots+by+tissue-type+plasminogen+activator%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator.</a> Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).</li>
<li>Sazonova, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((127+Mathematic+model+of+fibrin+clot+lysis+by+plasmin%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrinolysis+and+Proteolysis%22%5BJournal%5D)">127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin.</a> Fibrinolysis and Proteolysis. 12, Suppl 1. 45(1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby uzyskać istotne dane na temat struktury mechanizmów krzepnięcia w stanach chorobowych, ważne jest wyizolowanie czynników uczestniczących w krzepnięciu w celu określenia wpływu białek i komórek w tych warunkach. Niniejszy protokół został opracowany w celu zbadania struktury skrzepu fibrynowego w stanach cukrzycy i SCD in vitro.
Konieczne jest zrozumienie mechanizmów zaangażowanych w tworzenie fibryny i fibrynolizę w stanach chorobowych, ponieważ zaburzenia tych procesów prowadzą do...

Uszkodzenie śródbłonka naczynia krwionośnego jest naprawiane poprzez reakcję hemostatyczną, czyli tworzenie się skrzepu krwi. Kiedy krew przenika do macierzy zewnątrzkomórkowej, czynniki tkankowe aktywują płytki krwi w krwiobiegu, co ułatwia zainicjowanie kaskady krzepnięcia. Kluczowym elementem mechanicznym tego procesu gojenia jest matryca fibrynowa, składająca się z włókien fibryny, które są bardzo elastyczne i mogą wytrzymać duże siły 1-4. Wielu badaczy intensywnie badało powstawanie, strukturę i funkcję fibryny w ciągu ostatnich dziesięcioleci 5-13.
Pacjenci z chorobami takimi jak cukrzyca i niedokrwistość sierpowatokrwinkowa mają zwiększone ryzyko wystąpienia powikłań zakrzepowych, takich jak zawały mięśnia sercowego, choroba niedokrwienna serca i udary 14-19. Każdego roku w Stanach Zjednoczonych u ponad 2 milionów osób diagnozuje się cukrzycę. Istnieją dwa rodzaje cukrzycy: typ I, w którym organizm nie jest w stanie wytworzyć odpowiedniej ilości insuliny, oraz typ II, w którym organizm staje się oporny na insulinę. Wśród pacjentów z cukrzycą choroby sercowo-naczyniowe (CVD) są przyczyną 80% zachorowalności i śmiertelności związanej z tą chorobą 20,21.
Niedokrwistość sierpowatokrwinkowa (SCD) to genetyczna choroba krwi, która dotyka ponad 100 000 osób w Stanach Zjednoczonych22. SCD jest chorobą z mutacją punktową, która powoduje, że czerwone krwinki stają się w kształcie półksiężyca, co utrudnia komórkom przejście przez naczynia krwionośne23. Oba te stany chorobowe zwiększają szanse na rozwój stanów miażdżycowych w organizmie. Jedną z przyczyn takiego stanu rzeczy jest zmieniona struktura i funkcja fibryny w stanach chorobowych14,24-26.
Zarówno w cukrzycy, jak i niedokrwistości sierpowatokrwinkowej, występuje aktywność nadkrzepliwości i hipofibrynolizy, która indukuje miażdżycę i choroby sercowo-naczyniowe (CVD) w porównaniu do zdrowych pacjentów 17,27,28. Wiadomo, że hipofibrynoliza sprzyja progresji miażdżycy i powoduje nawracające incydenty niedokrwienne u pacjentów z przedwczesną chorobą wieńcową29. W niniejszym manuskrypcie badaliśmy rolę właściwości fizycznych fibryny w tym konkretnym otoczeniu. Struktury skrzepów fibryny u pacjentów zdrowych składają się z cienkich włókien, większych porów i ogólnie mniej gęstych14,24. Stwierdzono, że zwiększona porowatość i mniej gęste skrzepy fibryny u zdrowych pacjentów ułatwiają fibrynolizę16. W stanach hiperzakrzepowych, takich jak cukrzyca i niedokrwistość sierpowatokrwinkowa, następuje wzrost produkcji fibrynogenu, co powoduje wzrost stężenia fibrynogenu z normalnego poziomu 2,5 mg / ml u zdrowych pacjentów w wieku 30-33 lat. Stwierdzono, że skrzepy fibrynowe powstające u pacjentów z cukrzycą są mniej porowate, sztywniejsze, mają więcej punktów rozgałęzień i są gęstsze w porównaniu ze zdrowymi pacjentami bez cukrzycy14,24,33-35. Zmieniona struktura fibryny jest wynikiem mechanizmów glikacji, które zachodzą w białkach biorących udział w tworzeniu skrzepów. Nieenzymatyczna (nieodwracalna) glikacja zachodzi, gdy cząsteczki glukozy wiążą się z resztą lizyny na cząsteczce fibrynogenu, która hamuje ludzki czynnik XIIIa (FXIIIa) przed prawidłowym sieciowaniem reszt glutaminy i lizyny33,36,37.
Analiza strukturalna sieci fibrynowych była ostatnio intensywnie badana. W szczególności naukowcy wykorzystali mikroskopię elektronową i rekonstrukcję 3D sieci fibrynowych38, zbadali, w jaki sposób zarówno komórki wewnątrznaczyniowe (śródbłonkowe), jak i pozanaczyniowe (fibroblasty i mięśnie gładkie) wpływają na strukturę fibryny39, wykorzystali analizę wiskoelastyczną i spektralną do analizy struktur fibryny40 oraz opracowali korelacje między strukturą fibryny a właściwościami mechanicznymi przy użyciu podejść eksperymentalnych i obliczeniowych41. Celem obecnego badania było sformułowanie struktur skrzepów w symulowanych warunkach zakrzepicy sierpowatokrwinkowej i niedokrwistości sierpowatokrwinkowej oraz zastosowanie mikroskopii konfokalnej do zbadania struktury i funkcji skrzepów w stanach chorobowych. Skrzepy fibryny powstały z ludzkiego fibrynogenu, ludzkiej trombiny i FXIIIa. Skrzepy poddano lizie za pomocą plazminy. Aby symulować stany cukrzycowe, zwiększone stężenie fibrynogenu inkubowano w roztworze glukozy w celu wywołania glikacji fibrynogenu in vitro. Aby symulować warunki krzepnięcia niedokrwistości sierpowatokrwinkowej, zwiększone stężenia fibrynogenu zmieszano z hematokrytem sierpowatokrwinkowym pobranym od pacjentów, jak to wcześniej zrobiła nasza grupa42. Metody te wykorzystano do zbadania struktury i funkcji związanych z tworzeniem skrzepów fibryny i fibrynolizą w warunkach chorobowych, a także mechanizmów indukujących CVD. Opierając się na aktualnych informacjach na temat tych chorób, struktury skrzepów glikowanej fibryny były gęstsze z mniejszą liczbą i mniejszymi porami. Skrzepy fibryny z czerwonymi krwinkami od pacjentów z niedokrwistością sierpowatokrwinkową (RBC) były również gęstsze i wykazywały agregację krwinek czerwonych i aglomerowanych klastrów fibryny. Jest to dobrze ugruntowane zjawisko, które zostało określone wcześniej43. Postawiono również hipotezę, że szybkość fibrynolizy będzie znacznie niższa w skrzepach fibryny glikowanej ze zredukowanym plazminą i bez niej w porównaniu ze zdrową, normalną fibryną. Wyniki wykazały, że w przypadku skrzepów fibryny glikowanej zaobserwowano istotnie różne wyniki szybkości lizy tylko w warunkach zmniejszonego stężenia plazminy. Ta eksperymentalna technika wykorzystująca mikroskopię konfokalną oferuje znaczące korzyści w porównaniu z innymi metodami obrazowania, ponieważ komórki i białka pozostają w swoim naturalnym stanie, co umożliwia rejestrowanie w czasie rzeczywistym aktywności krzepnięcia. Ta metoda syntetycznego wywoływania krzepnięcia jest również tańsza i bardziej efektywna czasowo niż pobieranie próbek od pacjentów i filtrowanie pojedynczych białek i enzymów. Ponadto, dzięki zastosowaniu oddzielonych białek i enzymów do syntezy skrzepów, skrzepy zostały znormalizowane tak, aby nie było zmienności między próbkami w wyniku innych białek w osoczu.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque (hydrofilowy polisacharyd)</td><td>GE Healthcare</td><td>45-001-749</td><td></td></tr><tr><td>10 ml heparynizowane probówki próżniowe</td><td>BD Biosciences</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoria Badawcze</td><td>Ludzkich Enzymów Fibrynogenu</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ludzkie koniugaty fibrynogenu</td><td>Sondy molekularne</td><td>F13191</td><td></td></tr><tr><td>Probówka mikrowirówkowa z podziałką 0,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza w proszku</td><td>Life Technologies</td><td>15023-02</td><td></td></tr><tr><td>FXIIIa</td><td>Laboratoria Badań Enzymatycznych</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>VIS Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss LSM 510</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris</td><td>Lonza</td><td>S50-642</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiD roztwór do znakowania komórek</td><td>Life Technologies</td><td>L7781</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoria Badań Enzymów</td><td>Plazminowych</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (5 M NaCl)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do modelowania statystycznego</td><td>IBM</td><td>SPSS Statistics 22</td><td></td></tr></tbody></table>

techniki eksperymentalne i obrazowe do badania struktur skrzepów fibryny w stanach prawidłowych i chorobowych

Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States

Fibryna to białko macierzy zewnątrzkomórkowej, które jest odpowiedzialne za utrzymanie integralności strukturalnej skrzepów krwi. W ostatnich latach przeprowadzono wiele badań nad fibryną, w tym badanie syntezy, struktury-funkcji i lizy skrzepów. Jednak nadal nie ma wielu niewiadomych na temat morfologicznych i strukturalnych cech skrzepów, które powstają u pacjentów z chorobą. W niniejszej pracy przedstawiono techniki eksperymentalne, które pozwalają na zbadanie różnic morfologicznych nieprawidłowych struktur skrzepu spowodowanych stanami chorobowymi, takimi jak cukrzyca i niedokrwistość sierpowatokrwinkowa. Nasze badanie koncentruje się na przygotowaniu i ocenie skrzepów fibrynowych w celu oceny różnic morfologicznych za pomocą różnych testów eksperymentalnych i mikroskopii konfokalnej. Ponadto opisano również metodę, która pozwala na ciągłe obliczanie szybkości lizy w czasie rzeczywistym w skrzepach fibryny. Techniki opisane w niniejszym dokumencie są ważne dla badaczy i klinicystów dążących do wyjaśnienia współistniejących patologii zakrzepowych, takich jak zawały mięśnia sercowego, choroba niedokrwienna serca i udary u pacjentów z cukrzycą lub niedokrwistością sierpowatokrwinkową.

Analiza struktur glikowanych skrzepów fibryny za pomocą mikroskopii konfokalnej
Obrazy z mikroskopii konfokalnej skrzepów prawidłowych i glikowanych przedstawiono na Rysunku 3. Analiza mikroskopii konfokalnej skrzepów prawidłowych i glikowanych wykazuje, że skrzepy glikowane są gęstsze i mają mniejsze pory niż skrzepy prawidłowe, zarówno z dodatkiem FXIIIa, jak i bez niego podczas polimeryzacji skrzepu. Na Rysunkach 3A i 3B widoczne jest niższ...

W tym manuskrypcie przedstawiono techniki eksperymentalne, w tym przygotowanie krwi, mikroskopię konfokalną i analizę szybkości lizy, w celu zbadania różnic morfologicznych między normalnymi i nieprawidłowymi strukturami skrzepu spowodowanymi stanami chorobowymi.

Techniki eksperymentalne i obrazowe do badania struktur skrzepów fibryny w stanach prawidłowych i chorobowych

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie różnic morfologicznych w nieprawidłowych strukturach skrzepu, które występują w cukrzycy i niedokrwistości sierpowatokrwinkowej, stanach chorobowych symulowanych zakrzepów cukrzycowych. Osiąga się to poprzez obrazowanie glikowanych struktur skrzepu za pomocą mikroskopii konfokalnej próbek krwi od pacjentów z niedokrwistością sierpowatokrwinkową. Skrzepy fibryny zawierające czerwone krwinki są obrazowane w czasie rzeczywistym w systemie konfokalnym.Następnie można przeprowadzić analizę mikroskopową w celu oceny szybkości fibrynolizy w normalnych i glikowanych strukturach skrzepów. Ostatecznie ta analiza w czasie rzeczywistym może być wykorzystana do oceny różnic morfologicznych, które występują w nieprawidłowych strukturach skrzepów w odpowiedzi na stany chorobowe, w których powstają. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zakrzepicy i hemostazy, takie jak: Czym różnią się struktury skrzepów fibryny u pacjentów z cukrzycą lub niedokrwistością sierpowatokrwinkową.Aby ocenić symulowane skrzepy cukrzycowe za pomocą mikroskopii konfokalnej, najpierw rozmrozić ludzki fibrynogen i 10% fluorescencyjnie znakowany koniugat ludzkiego fibrynogenu w temperaturze 37 stopni Celsjusza, gdy roztwory podgrzane zmieszane z ludzkim fibrynogenem i koniugatem fibrynogenu w roztworze chlorku sodu z trikami glukozy i inkubować roztwór chroniony przed światłem w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Zbliżając się do końca inkubacji, użyj kleju na bazie płynu, aby przymocować cienki klej po dwóch stronach szklanego szkiełka mikroskopowego, aby utworzyć komorę, a następnie wymieszaj roztwór fibrynogenu z czynnikiem temperatury pokojowej 13 i trombiną do końcowej objętości 50 mikrolitrów i natychmiast przenieś 30 mikrolitrów roztworu fibryny do komory szkiełka mikroskopowego. Teraz umieść szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 22 milimetry o grubości 15 milimetrów na wierzchu kleju i uszczelnij otwarte boki komory przezroczystym klejem, uważając, aby klej nie wchodził w interakcję ze skrzepem.Pozwól skrzepom fibryny polimeryzować w temperaturze od 21 do 23 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie uzyskaj obrazy skrzepów za pomocą mikroskopii konfokalnej za pomocą obiektywu 40 x i lasera argonowego 488 nanometrów, aby ocenić skrzepy u pacjentów z niedokrwistością sierpowatokrwinkową. Najpierw rozcieńczyć próbkę czerwonych krwinek w ilości 1 miliona komórek na mililitr w pożywce do hodowli komórek wolnych od surowicy i wymieszać komórki z pięcioma mikrolitrami odpowiedniego roztworu do znakowania komórek przez delikatne pipetowanie.Po 20 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza umyj komórki trzykrotnie w pożywce o temperaturze 37 stopni Celsjusza, podczas gdy komórki znajdują się w wirówce, wymieszaj świeżo przygotowany roztwór fibrynogenu, czynnik 13 i trombinę, jak właśnie pokazano. Następnie przenieś 10 mikrolitrów znakowanych czerwonych krwinek do roztworu fibryny i natychmiast dozuj 30 mikrolitrów roztworu komórkowego do komory klejącej. Na szkiełku mikroskopowym pozwól fibrynie polimeryzować w temperaturze od 21 do 23 stopni Celsjusza po dwóch godzinach, uzyskaj konfokalne obrazy skrzepów za pomocą laserów wzbudzających o długości fal 488 nanometrów i 633 nanometrów, aby wzbudzić odpowiednio fluorescencyjnie znakowaną fibrynę i czerwone krwinki.Aby ocenić tempo fibrynolizy i struktury skrzepów glikowanych, najpierw przygotuj skrzepy glikowane, jak pokazano tym razem. Jednak po dozowaniu roztworu skrzepu fibryny do komory kleju nie należy uszczelniać końców komory. Zamiast tego pozwól skrzepom polimeryzować w temperaturze od 21 do 23 stopni Celsjusza w szczelnej komorze zawierającej 250 mililitrów wody, aby zapobiec odwodnieniu.Po półtorej godziny uzyskaj obrazy skrzepów za pomocą mikroskopii konfokalnej, jak właśnie pokazano. Następnie odpipetować 25 mikrolitrów plazminy do otwartego końca komory i pozwolić plazminie rozproszyć się w skrzepie poprzez działanie kapilarne. Na koniec otwórz funkcje szeregów czasowych w oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego, kliknij tryb akwizycji i wybierz szeregi czasowe.Następnie wybierz liczbę cykli i przedział czasu nagrywania, aby uchwycić w czasie rzeczywistym materiał wideo z lizy skrzepów wywołanych plazminą Analiza skrzepów normalnych i glikowanych ujawnia, że skrzepy glikowane są gęstsze i mają mniejsze pory niż normalne skrzepy, zarówno z dodatkiem czynnika 13, jak i bez niego podczas polimeryzacji skrzepów. Rzeczywiście, w skrzepach glikowanych ONZ występuje niższe stężenie fibryny, co tworzy mniej gęstą strukturę niż ta obserwowana w skrzepach glikowanych, które zawierają wyższe stężenie fibryny. Skrzepy fibryny od pacjentów z niedokrwistością sierpowatokrwinkową zawierają czerwone krwinki i wykazują gęstszą strukturę niż zdrowe skrzepy fibryny ze względu na zwiększone stężenie fibrynogenu u tych osób.Co więcej, naturalna tendencja czerwonych krwinek od pacjentów z niedokrwistością sierpowatokrwinkową do tworzenia agregatów i płci, skupisk czerwonych krwinek, które przeplatają się z siecią fibryny, co powoduje powstawanie nieprawidłowych struktur skrzepowych, które znacznie różnią się morfologią od tych obserwowanych u zdrowych pacjentów. Wreszcie, analiza szybkości fibrynolizy skrzepów normalnych w porównaniu z skrzepami glikowanymi wykazuje znacznie upośledzoną zdolność symulowanych skrzepów cukrzycowych do lizyjania fibryny przy braku wystarczającej ilości plazminy. Badania te pomogą utorować drogę naukowcom zajmującym się zakrzepicą i hemostazą, zwłaszcza pacjentom, u których rozwijają się współistniejące patologie w wyniku niedokrwistości sierpowatokrwinkowej i cukrzycy.

experimental-imaging-techniques-for-examining-fibrin-clot-structures

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Źródło: Kim, D., et. al. Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i mikrotomografia komputerowa do bezpośredniej wizualizacji zakrzepowej choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia wizualizację skrzepliny mózgowej u myszy za pomocą obrazowania mikrotomografii komputerowej (mikro-CT). Mysi model zakrzepliny mózgowej jest wstrzykiwany z nanocząstkami złota ukierunkowanymi na fibrynę, działającymi jako środek kontrastujący. Mysz jest...

Wizualizacja skrzepliny mózgowej u myszy za pomocą obrazowania metodą mikrotomografii komputerowej

Techniki mikroskopii poklatkowej i przetwarzania obrazów zostały użyte do obserwacji i analizy zagęszczenia żelu za pośrednictwem fibroblastów i wyrównania włókien fibryny w bioreaktorze kontrolowanym przez środowisko przez okres 48 godzin.

Obserwacja i ilościowe określanie zagęszczenia fibryny w żelu za pośrednictwem fibroblastów

Ten protokół opisuje zastosowanie połączonego obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni (NIRF) i mikrotomografii komputerowej (microCT) do wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. Technika ta pozwala na ilościowe określenie obciążenia skrzepliną i ewolucji. Technika obrazowania NIRF wizualizuje znakowaną fluorescencyjnie skrzeplinę w wyciętym mózgu, podczas gdy technika mikroCT wizualizuje skrzeplinę wewnątrz żywych zwierząt za pomocą nanocząstek złota.

Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i tomografia mikrokomputerowa do bezpośredniej wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu

Ta praca opisuje metodę opartą na mikroskopii fluorescencyjnej do badania adhezji, rozprzestrzeniania się i wydzielania płytek krwi pod przepływem. Ta wszechstronna platforma umożliwia badanie funkcji płytek krwi w badaniach mechanistycznych nad zakrzepicą i hemostazą.

Obrazowanie żywych komórek degranulacji i wydzielania płytek krwi pod wpływem przepływu

Przedstawione tutaj są dwie metody, które mogą być używane indywidualnie lub w połączeniu do analizy wpływu beta-amyloidu na strukturę skrzepu fibryny. W zestawie znajduje się protokół tworzenia skrzepu fibrynowego in vitro, a następnie metody zmętnienia skrzepu i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Analiza nieprawidłowości w strukturze skrzepu fibryny wywołanych przez β-amyloid za pomocą spektroskopii i skaningowej mikroskopii elektronowej

Prezentujemy model choroby naczyniowej in vitro do zbadania interakcji krwi pełnej ze śródbłonkiem pochodzącym od pacjenta. System ten pozwala na badanie właściwości trombogennych pierwotnych komórek śródbłonka w różnych okolicznościach. Metoda ta jest szczególnie przydatna do oceny trombogenności in situ i terapii przeciwzakrzepowej w różnych fazach krzepnięcia.

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

Fibryna jest odpowiedzialna za tworzenie skrzepów podczas hemostazy i zakrzepicy. Testy zmętnienia i małozakrzepowości (TEG) mogą być wykorzystywane jako narzędzia synergiczne, które zapewniają komplementarną ocenę skrzepu. Te dwie techniki razem mogą dać lepszy wgląd w to, jak warunki krzepnięcia wpływają na tworzenie skrzepów fibryny.

Wykorzystanie zmętnienia i tromboelastografii do charakterystyki skrzepów komplementarnych

Obecny protokół opisuje, jak wykorzystać uraz za pośrednictwemFeCl 3 do wywołania zakrzepicy tętniczej, oraz jak zbierać i przygotowywać próbki uszkodzeń tętnic na różnych etapach zakrzepicy do analizy mikroskopowej elektronowej.

Zakrzepica tętnicza wywołana chlorkiem żelaza i pobieranie próbek do analizy pod mikroskopem elektronowym 3D

To badanie opisuje szybką i skuteczną metodę analizy składników komórkowych skrzepów krwi w mózgu poprzez rozpuszczanie skrzepów, barwienie komórek i rutynowe badanie krwi.

Kompleksowe podejście do analizy składników komórkowych zakrzepów krwi w mózgu

Testy trombolizy in vitro często miały trudności z odtworzeniem warunków in vivo, czy to w trawionej skrzeplinie, czy w środowisku, w którym tromboliza zachodzi. W tym artykule badamy, w jaki sposób sprzężenie pętli Chandlera i testu fluorometrycznej fibrynolizy przepływowej w czasie rzeczywistym (RT-FluFF) jest wykorzystywane do monitorowania lizy skrzepów ex vivo o wysokiej wierności.

Śledzenie fibrynolizy skrzepów krwi pełnej uformowanych w pętli Chandlera pod wpływem przepływu ścinającego w modelu trombolizy in vitro

Praca ta opisuje test mikrofluidyczny, który wykorzystuje naprężenie ścinające do wywołania powstawania zakrzepów we krwi i charakteryzuje zakrzep za pomocą wielu wymiarów odczytu. Test pozwala mierzyć tendencję protrombotyczną próbek krwi, dzięki czemu jest przydatny w diagnozowaniu chorób, odkrywaniu leków oraz podstawowych badaniach mechanistycznych związanych z zakrzepicą.

Testy profilowania zakrzepów: platforma oparta na mikrofluidyce do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej

Poznaj techniki mikroskopii konfokalnej do badania struktur skrzepów fibryny w cukrzycy i anemii sierpowatej. Ta metoda pozwala analizować morfologię skrzepów i szybkość fibrynolizy w czasie rzeczywistym.

Techniki eksperymentalne i obrazowe do badania struktur skrzepów fibryny w stanach prawidłowych i chorobowych

Przeglądaj więcej filmów