Techniki eksperymentalne i obrazowe do badania struktur skrzepów fibryny w stanach prawidłowych i chorobowych

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie różnic morfologicznych w nieprawidłowych strukturach skrzepu, które występują w cukrzycy i niedokrwistości sierpowatokrwinkowej, stanach chorobowych symulowanych zakrzepów cukrzycowych. Osiąga się to poprzez obrazowanie glikowanych struktur skrzepu za pomocą mikroskopii konfokalnej próbek krwi od pacjentów z niedokrwistością sierpowatokrwinkową. Skrzepy fibryny zawierające czerwone krwinki są obrazowane w czasie rzeczywistym w systemie konfokalnym.

Następnie można przeprowadzić analizę mikroskopową w celu oceny szybkości fibrynolizy w normalnych i glikowanych strukturach skrzepów. Ostatecznie ta analiza w czasie rzeczywistym może być wykorzystana do oceny różnic morfologicznych, które występują w nieprawidłowych strukturach skrzepów w odpowiedzi na stany chorobowe, w których powstają. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zakrzepicy i hemostazy, takie jak: Czym różnią się struktury skrzepów fibryny u pacjentów z cukrzycą lub niedokrwistością sierpowatokrwinkową.

Aby ocenić symulowane skrzepy cukrzycowe za pomocą mikroskopii konfokalnej, najpierw rozmrozić ludzki fibrynogen i 10% fluorescencyjnie znakowany koniugat ludzkiego fibrynogenu w temperaturze 37 stopni Celsjusza, gdy roztwory podgrzane zmieszane z ludzkim fibrynogenem i koniugatem fibrynogenu w roztworze chlorku sodu z trikami glukozy i inkubować roztwór chroniony przed światłem w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Zbliżając się do końca inkubacji, użyj kleju na bazie płynu, aby przymocować cienki klej po dwóch stronach szklanego szkiełka mikroskopowego, aby utworzyć komorę, a następnie wymieszaj roztwór fibrynogenu z czynnikiem temperatury pokojowej 13 i trombiną do końcowej objętości 50 mikrolitrów i natychmiast przenieś 30 mikrolitrów roztworu fibryny do komory szkiełka mikroskopowego. Teraz umieść szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 22 milimetry o grubości 15 milimetrów na wierzchu kleju i uszczelnij otwarte boki komory przezroczystym klejem, uważając, aby klej nie wchodził w interakcję ze skrzepem.

Pozwól skrzepom fibryny polimeryzować w temperaturze od 21 do 23 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie uzyskaj obrazy skrzepów za pomocą mikroskopii konfokalnej za pomocą obiektywu 40 x i lasera argonowego 488 nanometrów, aby ocenić skrzepy u pacjentów z niedokrwistością sierpowatokrwinkową. Najpierw rozcieńczyć próbkę czerwonych krwinek w ilości 1 miliona komórek na mililitr w pożywce do hodowli komórek wolnych od surowicy i wymieszać komórki z pięcioma mikrolitrami odpowiedniego roztworu do znakowania komórek przez delikatne pipetowanie.

Po 20 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza umyj komórki trzykrotnie w pożywce o temperaturze 37 stopni Celsjusza, podczas gdy komórki znajdują się w wirówce, wymieszaj świeżo przygotowany roztwór fibrynogenu, czynnik 13 i trombinę, jak właśnie pokazano. Następnie przenieś 10 mikrolitrów znakowanych czerwonych krwinek do roztworu fibryny i natychmiast dozuj 30 mikrolitrów roztworu komórkowego do komory klejącej. Na szkiełku mikroskopowym pozwól fibrynie polimeryzować w temperaturze od 21 do 23 stopni Celsjusza po dwóch godzinach, uzyskaj konfokalne obrazy skrzepów za pomocą laserów wzbudzających o długości fal 488 nanometrów i 633 nanometrów, aby wzbudzić odpowiednio fluorescencyjnie znakowaną fibrynę i czerwone krwinki.

Aby ocenić tempo fibrynolizy i struktury skrzepów glikowanych, najpierw przygotuj skrzepy glikowane, jak pokazano tym razem. Jednak po dozowaniu roztworu skrzepu fibryny do komory kleju nie należy uszczelniać końców komory. Zamiast tego pozwól skrzepom polimeryzować w temperaturze od 21 do 23 stopni Celsjusza w szczelnej komorze zawierającej 250 mililitrów wody, aby zapobiec odwodnieniu.

Po półtorej godziny uzyskaj obrazy skrzepów za pomocą mikroskopii konfokalnej, jak właśnie pokazano. Następnie odpipetować 25 mikrolitrów plazminy do otwartego końca komory i pozwolić plazminie rozproszyć się w skrzepie poprzez działanie kapilarne. Na koniec otwórz funkcje szeregów czasowych w oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego, kliknij tryb akwizycji i wybierz szeregi czasowe.

Następnie wybierz liczbę cykli i przedział czasu nagrywania, aby uchwycić w czasie rzeczywistym materiał wideo z lizy skrzepów wywołanych plazminą Analiza skrzepów normalnych i glikowanych ujawnia, że skrzepy glikowane są gęstsze i mają mniejsze pory niż normalne skrzepy, zarówno z dodatkiem czynnika 13, jak i bez niego podczas polimeryzacji skrzepów. Rzeczywiście, w skrzepach glikowanych ONZ występuje niższe stężenie fibryny, co tworzy mniej gęstą strukturę niż ta obserwowana w skrzepach glikowanych, które zawierają wyższe stężenie fibryny. Skrzepy fibryny od pacjentów z niedokrwistością sierpowatokrwinkową zawierają czerwone krwinki i wykazują gęstszą strukturę niż zdrowe skrzepy fibryny ze względu na zwiększone stężenie fibrynogenu u tych osób.

Co więcej, naturalna tendencja czerwonych krwinek od pacjentów z niedokrwistością sierpowatokrwinkową do tworzenia agregatów i płci, skupisk czerwonych krwinek, które przeplatają się z siecią fibryny, co powoduje powstawanie nieprawidłowych struktur skrzepowych, które znacznie różnią się morfologią od tych obserwowanych u zdrowych pacjentów. Wreszcie, analiza szybkości fibrynolizy skrzepów normalnych w porównaniu z skrzepami glikowanymi wykazuje znacznie upośledzoną zdolność symulowanych skrzepów cukrzycowych do lizyjania fibryny przy braku wystarczającej ilości plazminy. Badania te pomogą utorować drogę naukowcom zajmującym się zakrzepicą i hemostazą, zwłaszcza pacjentom, u których rozwijają się współistniejące patologie w wyniku niedokrwistości sierpowatokrwinkowej i cukrzycy.