Name: Zakażenie retrowirusowe mysich embrionalnych komórek ciała zarodkowego pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do analizy różnicowania układu krwiotwórczego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Poznaj metodę zakażenia retrowirusowego komórek ciała zarodkowego myszy do analizy różnicowania układu krwiotwórczego. Technika umożliwia szybką ekspresję transgenu i badanie hematopoetycznego rozwoju komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Pilotaż i Granty Wykonalności z Indiana University School of Medicine Center (IUSM) dla Doskonałości w Hematologii Molekularnej (NIDDK, 5P30DK090948). Dodatkowe finansowanie pochodziło z grantu Biomedical Enhancement Grant przyznanego przez IUSM. Chcielibyśmy podziękować dr Karen Cowden Dahl za komentarz do manuskryptu.

1. Formacja ciała zarodkowego (EB)
<ol>
	<li>ESC adaptujące żelatynę, które były utrzymywane na mysich fibroblastach zarodkowych (MEF). Przejście ESC 3 razy na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej pokrytej 0,1% żelatyną w celu usunięcia MEF.
	<ol>
		<li>Hoduj komórki w pożywce podtrzymującej ESC z LIF, aby komórki nie były zróżnicowane (Tabela 1). Upewnij się, że komórki nigdy nie przekraczają 80% konfluencji. Do różnicowania należy używać komórek o niskim pasażu (10 lub mniej pasaży po usunięciu z MEF).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu poprzedzającym hodowlę ESC w celu różnicowania EB, należy przepuścić komórki tak, aby następnego dnia były w około 50-70% zlewające się. Kontynuuj hodowlę komórek w pożywce podtrzymującej ESC, aby zachować pluripotencję komórek.</li>
	<li>W dniu różnicowania odessać pożywkę podtrzymującą ESC i przemyć 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl i 11,9 mM buforu fosforanowego, pH 7,4) do dołka na płytce 6-dołkowej.
	<ol>
		<li>Dodać 200 μl 0,25% trypsyny/EDTA do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.</li>
		<li>Dezaktywować trypsynę/EDTA za pomocą 800 μl pożywki różnicującej. Pipetować w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej o pojemności 2 ml z końcówką p200, aby rozbić komórki na pojedynczą zawiesinę komórkową. Upewnij się, że końcówka p200 ściśle przylega do końca, tak aby nośnik nie znalazł się między złączem pipety i końcówki.</li>
		<li>Pigazować w górę i w dół około 5-10 razy. Należy uważać, aby podczas pipetowania nie tworzyć pęcherzyków powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Zwiększyć objętość do 10 ml za pomocą PBS. Wirować przy 315 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant. Przemyć dwukrotnie 5 ml PBS w celu usunięcia pozostałej pożywki zawierającej LIF. Odwirować jak w kroku 1.4 dla każdego prania.
	<ol>
		<li>Zawiesić końcowy osad komórkowy w 2 ml pożywki różnicującej (Tabela 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru lub licznika komórek i płytki 6 000-10 000 komórek/ml na 10-centymetrowej płytce Petriego (hodowla nietkankowa poddana obróbce).
	<ol>
		<li>Określ empirycznie dokładne komórki/ml dla każdej linii ESC. Używaj sterylnych płytek Petriego zwykle używanych do pracy z bakteriami lub płytek o niskiej przyczepności. 
		UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki różnicowania, EB powinny tworzyć kule, które pozostają w zawieszeniu bez przyczepiania się do płytki. Przetestuj kilka marek płyt, aby znaleźć te, które mają najmniejszą przyczepność.</li>
		<li>Inkubować różnicujące się EKM w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>skład</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
			<td>głośność</td>
			<td>firma</td>
			<td>Numer katalogowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (DMEM)</td>
			<td>1x</td>
			<td></td>
			<td>Pojemność 410 ml</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>Zobacz materiał D5796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (ES Screened)</td>
			<td>W 100%</td>
			<td>15%</td>
			<td>Pojemność 75 ml</td>
			<td>Klon</td>
			<td>SH30070.03E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminokwasy endogenne</td>
			<td>100x</td>
			<td>1x</td>
			<td>Pojemność 5 ml</td>
			<td>Technologie życiowe</td>
			<td>Numer katalogowy: 11140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamina</td>
			<td>100x</td>
			<td>1x</td>
			<td>Pojemność 5 ml</td>
			<td>Technologie życiowe</td>
			<td>Numer katalogowy: 35050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penncylina/Streptomycyna</td>
			<td>100x</td>
			<td>1x</td>
			<td>Pojemność 5 ml</td>
			<td>Technologie życiowe</td>
			<td>Numer katalogowy: 15070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>β-merkaptoetanol</td>
			<td>14,3 mln</td>
			<td>114 μM</td>
			<td>4 μl</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>Zobacz materiał M3148</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czynnik hamujący białaczkę (LIF)</td>
			<td>107 jednostek/ml</td>
			<td>1 000 jednostek/ml</td>
			<td>50 μl</td>
			<td>Milipory</td>
			<td>ESG1107</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Nośniki konserwacji ESC.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>skład</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
			<td>głośność</td>
			<td>firma</td>
			<td>Numer katalogowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (DMEM)</td>
			<td>1x</td>
			<td></td>
			<td>Pojemność 410 ml</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>Zobacz materiał D5796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (User Screened for optymalna różnica)</td>
			<td>W 100%</td>
			<td>15%</td>
			<td>Pojemność 75 ml</td>
			<td>Klon</td>
			<td>SH30070.03E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminokwasy endogenne</td>
			<td>100x</td>
			<td>1x</td>
			<td>Pojemność 5 ml</td>
			<td>Technologie życiowe</td>
			<td>Numer katalogowy: 11140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamina</td>
			<td>100x</td>
			<td>1x</td>
			<td>Pojemność 5 ml</td>
			<td>Technologie życiowe</td>
			<td>Numer katalogowy: 35050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penncylina/Streptomycyna</td>
			<td>100x</td>
			<td>1x</td>
			<td>Pojemność 5 ml</td>
			<td>Technologie życiowe</td>
			<td>Numer katalogowy: 15070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>β-merkaptoetanol</td>
			<td>14,3 mln</td>
			<td>114 μM</td>
			<td>4 μl</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>Zobacz materiał M3148</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Nośniki różnicowania.
2. Przygotowanie komórek EB do infekcji wirusowej
<ol>
	<li>Na pożądanym etapie rozwoju (między 2. a 3. dniem) przenieś EB z 10-centymetrowej szalki Petriego do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umyj płytkę 5 ml PBS i dodaj popłucz do stożkowej probówki.</li>
	<li>Granulować komórki EB w temperaturze pokojowej 315 x g przez 5 minut. Umyć komórki EB 5 ml PBS.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu do oddzielania rozmrożonych komórek (zawierającego enzymy proteolityczne i kolagenolityczne) i umieścić probówki w łaźni wodnej (lub inkubatorze) o temperaturze 37 °C na 30 minut, od czasu do czasu mieszając (od migotania lub lekkiego wirowania).</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki różnicującej. Pipetować w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 2 ml z końcówką do pipety p200. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30-60 minut.</li>
	<li>Wirować komórki w temperaturze 315 x g przez 5 minut i umyć komórki PBS.</li>
</ol>
3. Infekcja wirusowa
<ol>
	<li>Zawiesić komórki w 1,5 ml pożywki różnicującej. Przenieś zawiesinę komórkową na 6-dołkową płytkę poddaną działaniu hodowli nietkankowej.</li>
	<li>Przygotuj retrowirusa za pomocą standardowych technik z wyprzedzeniem. Dodać od 5 do 100 μl supernatantu wirusowego do komórek w zależności od miana wirusa. Nie należy dodawać polibrenu w celu nasilenia infekcji, ponieważ hamuje to późniejszą reformację EB.</li>
	<li>Spinokkulować komórki wirusem przez odwirowanie przy 2,120 x g przez 90 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
4. Różnicowanie zakażonych wirusem komórek EB w wiszących kroplach
<ol>
	<li>Dodać 2 ml pożywki różnicującej do każdej studzienki zawiesiny zakażonych komórek EB.</li>
	<li>Odmierzyć pipetą 3,5 ml zawiesiny zakażonych komórek EB do sterylnego zbiornika na odczynniki do multipipetorów. Za pomocą multipipetora odpipetować 15-20 rzędów po osiem kropli o objętości 20 μl na odwróconą pokrywkę 15-centymetrowej płytki Petriego.</li>
	<li>Dodać 10 ml sterylnego PBS lub wody do dolnej połowy płytki Petriego. Następnie odwróć pokrywkę z kroplami i umieść na szalce Petriego. Upewnij się, że krople zwisają do góry nogami z pokrywy z PBS lub wodą poniżej, aby komora była nawilżona.</li>
	<li>Umieścić szalki w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C z 5,0% CO2 .</li>
	<li>Po 2 dniach zebrać EB utworzone w wiszących kroplach, odwracając pokrywkę i przemywając 4,5 ml pożywki różnicującej.
	<ol>
		<li>Przenieś pożywkę i EB na nową, 10-centymetrową płytkę Petriego z kulturą nietkankową. Ponownie umyć pokrywkę 3 ml pożywki różnicującej i przenieść na płytkę o średnicy 10 cm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobrać komórki do analizy za pomocą cytometrii przepływowej po łącznie 8 dniach hodowli, zaczynając od początkowego przeniesienia komórek do pożywki różnicującej (-LIF).</li>
</ol>
5. Przygotowanie komórek do analizy cytometrem przepływowym
<ol>
	<li>Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z pipetą o pojemności 10 ml. Umyć płytkę 5 ml PBS i przenieść do tej samej stożkowej probówki.</li>
	<li>Komórki osadu po 315 x g. Umyj granulki 10 ml PBS.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu do oddzielania rozmrożonych komórek i umieścić probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut, od czasu do czasu mieszając. Do wykrywania niektórych antygenów powierzchniowych komórek można zamiast tego użyć trypsyny.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki różnicującej i pipetować w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 2 ml. Użyj końcówki p200 na końcu pipety, aby pomóc rozbić strawiony EB na zawiesinę jednokomórkową.
	<ol>
		<li>Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C ponownie na 60 minut, aby integralne białka błonowe mogły zostać przetworzone na powierzchnię komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Granulki w ilości 315 x g przez 5 min.</li>
	<li>Przemyć komórki 0,1% albuminą surowicy bydlęcej frakcji V (BSA) przygotowanym w PBS (PBS/BSA) i inkubować komórki ze specyficznymi przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie.</li>
</ol>
6. Analiza cytometrii przepływowej dla komórek progenitorowych układu krwiotwórczego
<ol>
	<li>Umieścić 106 komórek pochodzących z EB w probówce o okrągłym dnie o pojemności 5 ml i wymiarach 12 x 75 mm. Do regulacji ustawień kompensacji cytometru przepływowego należy używać koralików kompensacyjnych zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Komórki osadu o gramaturze 315 g. Odlewać supernatant i ponownie zawiesić osad w resztkowym roztworze PBS/BSA w probówce.</li>
	<li>W celu wykrycia HPC ESC należy inkubować komórki z przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie: anty-mysimi CD41-PE (R-fikoerytherin) i anty-mysimi CD117 (cKit)-APC/CY7 (allofikocyjanina cyjanina 7).
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciała w stosunku 1:100 w PBS/BSA. Dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała do każdej próbki. Określ prawidłowe rozcieńczenie przeciwciała dla każdego dostawcy, klonu i partii lub przeciwciała. Określ optymalne rozcieńczenie do indywidualnego znakowania komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbki należy inkubować na lodzie w ciemności przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać 2 ml PBS/BSA i granulki w proporcji 315 x g przez 5 min.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 300 μl PBS lub innego buforu izotonicznego.</li>
	<li>Przefiltruj zawieszone komórki przez nasadkę sitka komórkowego (0,35 μM) w celu usunięcia dużych agregatów komórkowych.</li>
	<li>Analizuj komórki na cytometrze przepływowym.</li>
</ol>

<ol><li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li>
<li>Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryoid+bodies%3A+an+in+vitro+model+of+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+physiology%22%5BJournal%5D)">Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis.</a> Experimental physiology. 85, 645-651 (2000).</li>
<li>Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies.</a> Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).</li>
<li>Tian, X., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+towards+hematopoietic+cells%3A+progress+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells towards hematopoietic cells: progress and pitfalls.</a> Curr Opin Hematol. 15, 312-318 (2008).</li>
<li>Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+by+gene+targeting+in+mouse+embryo-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells.</a> Cell. 51, 503-512 (1987).</li>
<li>Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+proto-oncogene+int-2+in+mouse+embryo-derived+stem+cells%3A+a+general+strategy+for+targeting+mutations+to+non-selectable+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes.</a> Nature. 336, 348-352 (1988).</li>
<li>Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transmission+of+genes+introduced+into+cultured+pluripotential+cells+by+retroviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector.</a> Nature. 323, 445-448 (1986).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li>
<li>Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+by+lentiviral+vectors%3A+lack+of+gene+silencing+in+mammalian+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 2140-2145 (2002).</li>
<li>Smith-Arica, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+efficiency+of+human+and+mouse+embryonic+stem+cells+using+adenoviral+and+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+stem+cells%22%5BJournal%5D)">Infection efficiency of human and mouse embryonic stem cells using adenoviral and adeno-associated viral vectors.</a> Cloning and stem cells. 5, 51-62 (2003).</li>
<li>Lakshmipathy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+of+embryonic+and+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection of embryonic and adult stem cells.</a> Stem Cells. 22, 531-543 (2004).</li>
<li>Cook, B. D., Liu, S., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad1+signaling+restricts+hematopoietic+potential+after+promoting+hemangioblast+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Smad1 signaling restricts hematopoietic potential after promoting hemangioblast commitment.</a> Blood. 117, 6489-6497 (2011).</li>
<li>Zafonte, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad1+expands+the+hemangioblast+population+within+a+limited+developmental+window%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Smad1 expands the hemangioblast population within a limited developmental window.</a> Blood. 109, 516-523 (2007).</li>
<li>Kyba, M., Perlingeiro, R. C., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HoxB4+confers+definitive+lymphoid-myeloid+engraftment+potential+on+embryonic+stem+cell+and+yolk+sac+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HoxB4 confers definitive lymphoid-myeloid engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic progenitors.</a> Cell. 109, 29-37 (2002).</li>
<li>Galvin, K. E., Travis, E. D., Yee, D., Magnuson, T., Vivian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+signaling+regulates+the+bone+morphogenic+protein+pluripotency+pathway+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nodal signaling regulates the bone morphogenic protein pluripotency pathway in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 285, 19747-19756 (2010).</li>
<li>Ismailoglu, I., Yeamans, G., Daley, G. Q., Perlingeiro, R. C., Kyba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodermal+patterning+activity+of+SCL%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mesodermal patterning activity of SCL.</a> Exp Hematol. 36, 1593-1603 (2008).</li>
<li>Kyba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+hematopoietic+differentiation+of+embryonic+stem+cells+conditionally+expressing+Stat5%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced hematopoietic differentiation of embryonic stem cells conditionally expressing Stat5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11904-11910 (2003).</li>
<li>Cao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-23a+regulates+TGF-beta-induced+epithelial-mesenchymal+transition+by+targeting+E-cadherin+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">MiR-23a regulates TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition by targeting E-cadherin in lung cancer cells.</a> Int J Oncol. 41, 869-875 (2012).</li>
<li>Chan, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+antagonism+between+PDGF+and+the+TGFbeta+family+of+signalling+pathways+by+control+of+miR-24+expression%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for antagonism between PDGF and the TGFbeta family of signalling pathways by control of miR-24 expression.</a> EMBO J. 29, 559-573 (2010).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+miR-23a+approximately+27a+approximately+24+decreases+transforming+growth+factor-beta-induced+tumor-suppressive+activities+in+human+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Upregulation of miR-23a approximately 27a approximately 24 decreases transforming growth factor-beta-induced tumor-suppressive activities in human hepatocellular carcinoma cells.</a> Int J Cancer. 123, (2008).</li>
<li>Min, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-associated+miR-27a+inhibits+dendritic+cell-mediated+differentiation+of+Th1+and+Th17+cells+by+TAB3%2C+p38+MAPK%2C+MAP2K4+and+MAP2K7%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Immun%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-associated miR-27a inhibits dendritic cell-mediated differentiation of Th1 and Th17 cells by TAB3, p38 MAPK, MAP2K4 and MAP2K7.</a> Genes Immun. 13, 621-631 (2012).</li>
<li>Mikkola, H. K., Fujiwara, Y., Schlaeger, T. M., Traver, D., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CD41+marks+the+initiation+of+definitive+hematopoiesis+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Expression of CD41 marks the initiation of definitive hematopoiesis in the mouse embryo.</a> Blood. 101, 508-516 (2003).</li>
<li>Mitjavila-Garcia, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CD41+on+hematopoietic+progenitors+derived+from+embryonic+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of CD41 on hematopoietic progenitors derived from embryonic hematopoietic cells.</a> Development. 129, 2003-2013 (2002).</li>
<li>Warr, M. R., Pietras, E. M., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+controlling+hematopoietic+stem+cell+functions+during+normal+hematopoiesis+and+hematological+malignancies.+Wiley+interdisciplinary+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Systems+biology+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanisms controlling hematopoietic stem cell functions during normal hematopoiesis and hematological malignancies. Wiley interdisciplinary reviews.</a> Systems biology and medicine. 3, 681-701 (2011).</li>
<li>Dahl, R., Ramirez-Bergeron, D. L., Rao, S., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spi-B+can+functionally+replace+PU.1+in+myeloid+but+not+lymphoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Spi-B can functionally replace PU.1 in myeloid but not lymphoid development.</a> Embo J. 21, 2220-2230 (2002).</li>
<li>Dahl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+macrophage+and+neutrophil+cell+fates+by+the+PU.1%3AC%2FEBPalpha+ratio+and+granulocyte+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of macrophage and neutrophil cell fates by the PU.1:C/EBPalpha ratio and granulocyte colony-stimulating factor.</a> Nat Immunol. 4, 1029-1036 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Jak omówiono powyżej, klony ESC, które indukują ekspresję interesującego genu, mogą być generowane przy użyciu systemów doksycyklinowych, jednak generowanie tych linii jest czasochłonne i pracochłonne. W niniejszym protokole opisano metodę ekspresji interesującego genu w zawiesinie pojedynczej komórki przygotowanej z EB pochodzących z ESC. Te zainfekowane komórki są następnie przekształcane w EB przez zawieszenie kropli w celu zbadania późniejszego różnicowania. W przykładzie (ryc. 3) pokazano, że ekspre...

Mysie embrionalne komórki macierzyste (ESC) są pluripotencjalne, pozostają niezróżnicowane i samoodnawiają się w obecności cytokinowego czynnika hamującego białaczkę (LIF)1. Po odstawieniu LIF spontanicznie różnicują się w trójwymiarowe (3D) struktury zwane ciałami embrionalnymi (EBs)2. Architektura 3D pozwala na rozwój trzech listków zarodkowych: ektodermy, endodermy i mezodermy, które następnie dają początek dojrzałym typom tkanek3. ESC są wyjątkowym modelem do wyjaśniania molekularnych mechanizmów różnicowania komórkowego, w szczególności do badania rozwoju wczesnych hematopoetycznych komórek progenitorowych (HPC)4. 
Ekspresja genów w ESC może być manipulowana za pomocą kilku technik, które pozwalają na określenie roli poszczególnych cząsteczek w rozwoju. Jedną z najczęstszych technik jest wykorzystanie rekombinacji homologicznej do wygenerowania linii ESC, które nie mają genu zainteresowania5,6. Istnieje również wiele technik, które zostały wykorzystane do nadekspresji genów. Pierwszą techniką zastosowaną do modyfikacji ekspresji genów w ESC było zakażenie ich rekombinowanymi retrowirusami7,8. Interesujący nas gen jest jednak często wyciszany, ponieważ ESC różnicują się w komórki progenitorowe i dojrzałe. Zastosowanie lentiwirusów okazało się skuteczne w ograniczaniu wyciszania genów ulegających ekspresji wirusa9. Inne wektory wirusowe wykorzystywane do nadekspresji obejmują adenowirusa i wirusa związanego z adenowirusem10. Ponadto standardowe techniki transfekcji w celu stabilnego wprowadzania plazmidów ekspresyjnych są szeroko stosowane do ekspresji transgenu ESC11. Jedną z trudności związanych z tymi systemami jest to, że często ekspresja określonego genu ma różne skutki w zależności od jego czasowej ekspresji. Na przykład białko Smad1 wpływa w różny sposób na rozwój komórek krwiotwórczych na różnych etapach rozwoju EB12,13. 
Ten problem można obejść poprzez generowanie ESC, które indukcyjnie wyrażają interesujący nas gen. Najpowszechniejszy system indukowalnej ekspresji transgenów w ESC wykorzystuje operon oporności na tetracykliny z E. Coli (Escherichia coli). Opracowano kilka różnych systemów tetracyklinowych. Jedna z bardziej popularnych strategii została opracowana przez Kybę i współpracowników14. Stworzyli linię ESC (Ainv15), która ma gen odwrotnej transaktywatora tetracykliny wprowadzony do konstytutywnie aktywnego locus ROSA26. Element odpowiedzi tetracykliny (TRE), dalsze miejsce LoxP (locus X-over P1 z bakteriofaga P1) i kasetę neomycyny bez promotora wprowadzono do locus HPRT (fosforybozylotransferaza hipoksantynowo-guaninowa) na chromosomie X. Stosując podejście rekombinacji CRE, gen będący przedmiotem zainteresowania wraz z promotorem eukariotycznym w celu kierowania ekspresją genu oporności na neomycynę można wprowadzić do miejsca LoxP. Prawidłowo ukierunkowane ESC są izolowane przez selekcję G418. Te ukierunkowane klony muszą następnie zostać przetestowane pod kątem indukowanej doksycykliną (lub tetracykliną) ekspresji transgenu. To podejście z powodzeniem wygenerowało linie ESC, które indukcyjnie wyrażają HoxB4, Stat5, SCL i Smad714-17. Jednak generowanie tych indukowalnych linii komórkowych jest czasochłonne. Opisano tutaj metodę dezagregacji ciał embrionalnych pochodzących z ESC (EB) na zawiesiny pojedynczych komórek, retrowirusowego zakażenia zawiesin komórkowych w różnych dniach rozwoju, a następnie reformowania EB przez zawieszenie kropli. Dalsze różnicowanie jest później oceniane za pomocą cytometrii przepływowej. W artykule przedstawiono przykład, w jaki sposób ekspresja miRNA w komórkach pochodzących z EB wpływa na różnicowanie układu krwiotwórczego. Metoda ta jest przydatna do badania roli genów po wyprowadzeniu określonej tkanki listka rozrodczego.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-merkaptoetanol</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>FBS (ES Screened)</td><td>Hyclon</td><td>SH30070.03E</td><td></td></tr><tr><td>FBS (zdefiniowany)</td><td>Hyklon</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Życie Technologie</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA</td><td>Technologie życia</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>LIF ESGRO</td><td>Milipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>ACCUMAX</td><td>Millipore</td><td>SCR006</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych Falcon 6- studzienka</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Talerze Falcon bez obróbki 6-dołkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-49</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego Sokół 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego Sokół 15 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-148</td><td></td></tr><tr><td>Tubka Sokoła 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-11A Rurka</td><td></td></tr><tr><td>Sokoła 5 ml z nasadką sitka komórkowego</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>Białe sterylne resevoirs</td><td>U.S.A. Scientific</td><td>111-0700</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysi CD41 PE sprzężony z PE</td><td>Biolegend</td><td>133906</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD117 Sprzężony z APC/CY7</td><td>Biolegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>RW4 ESC</td><td>ATCC</td><td>CRL-12418</td><td></td></tr></tbody></table>

zakażenie retrowirusowe mysich embrionalnych komórek ciała zarodkowego pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do analizy różnicowania układu krwiotwórczego

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embrionalne komórki macierzyste (ESC) są znakomitym modelem do wyjaśnienia molekularnych mechanizmów różnicowania komórek. Są one szczególnie przydatne do badania rozwoju wczesnych hematopoetycznych komórek progenitorowych (HPC). Ekspresją genów w ESC można manipulować za pomocą kilku technik, które pozwalają określić rolę poszczególnych cząsteczek w rozwoju. Jedną z trudności jest to, że ekspresja określonych genów często ma różne efekty fenotypowe w zależności od ich czasowej ekspresji. Problem ten można obejść poprzez generowanie ESC, które indukują ekspresję genu będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu technologii takiej jak system transgenowy indukowany doksycykliną. Jednak generowanie tych indukowalnych linii komórkowych jest kosztowne i czasochłonne. Opisano tutaj metodę dezagregacji ciał zarodkowych (EB) pochodzących z ESC na zawiesiny pojedynczych komórek, retrowirusowego zakażenia zawiesin komórkowych, a następnie reformowania EB przez zawieszenie kropli. Dalsze różnicowanie jest następnie oceniane za pomocą cytometrii przepływowej. Korzystając z tego protokołu, wykazano, że egzogenna ekspresja genu mikroRNA na początku różnicowania ESC blokuje wytwarzanie HPC. Jednak w przypadku ekspresji w komórkach pochodzących z EB po wytworzeniu powstającej mezodermy, gen mikroRNA zwiększa różnicowanie układu krwiotwórczego. Metoda ta jest przydatna do badania roli genów po wyprowadzeniu określonej tkanki listka rozrodczego.

W tych badaniach wykorzystano żelatynizowane ESC RW4 (pochodzące z linii myszy 129X1/SvJ). Ciałka zarodkowe (EB) izolowano w 3. dniu różnicowania. Dla uzyskania najlepszych rezultatów EB powinny być sferyczne i nieprzylegające (Rycina 1A, B). Po spinokulacji wirusem koekspresującym fluorescencyjny marker GFP wraz z genem zainteresowania, EB formowano ponownie metodą wiszącej kropli. EB z powodzeniem odtworzono z zawiesin komórkowych przygotowanych z EB w 2,0, 2,5 i 3,0 dniu. Jednakże nie udało się odtwor...

Manipulowanie czasową ekspresją genów w różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych (ESC) można osiągnąć za pomocą indukowalnych systemów genetycznych. Jednak wytwarzanie tych linii komórkowych jest kosztowne i czasochłonne. Protokół ten zapewnia szybką ekspresję transgenu w różnicujących się komórkach pochodzących z ES, a następnie analizę dalszego różnicowania układu krwiotwórczego.

Zakażenie retrowirusowe mysich embrionalnych komórek ciała zarodkowego pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do analizy różnicowania układu krwiotwórczego

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie, w jaki sposób ekspresja genu w różnych momentach różnicowania embrionalnych komórek macierzystych wpływa na różnicowanie układu krwiotwórczego. Po transdukcji ciała zarodka, zawiesina pojedynczych komórek przez wirowanie, ciała zarodków są reformowane przez wiszącą kroplę i hodowane, aby umożliwić dalsze różnicowanie w komórki krwiotwórcze. Następnie przygotowuje się zawiesiny jednokomórkowe zreformowanych ciał zarodkowych, inkubuje się je z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem i analizuje na cytometrze przepływowym pod kątem różnicowania układu krwiotwórczego.Ostatecznie metoda ta pokazuje, czy ekspresja genu podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych wpływa na rozwój układu krwiotwórczego. Jest to szczególnie przydatne do wykazania ról genów, które mogą być aktywne dopiero po utworzeniu wczesnej tkanki embrionalnej. Tak więc powszechne techniki ekspresji genu ryzykownego w różnych momentach różnicowania embrionalnych komórek macierzystych wymagają generowania linii embrionalnych komórek macierzystych i indukowanej ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą induktorów, takich jak doksycyklina.Generow

retroviral-infection-murine-embryonic-stem-cell-derived-embryoid-body

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje proces otrzymywania transplantowalnych hematopoetycznych komórek macierzystych z mysich embrionalnych komórek macierzystych (ESC) oraz ich późniejszą iniekcję do letalnie napromieniowanych myszy biorców. W skrócie, ESC są różnicowane do postaci ciał embroidalnych, które następnie są infekowane retrowirusem HoxB4 i współhodowane z komórkami zrębowymi OP9 oraz cytokinami hematopoetycznymi.

Wytwarzanie komórek macierzystych krwi z mysich embrionalnych komórek macierzystych

Opisano protokół ex vivo służący do generowania dojrzałych ludzkich erytrocytów z hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych. Dodatkowo opisano wydajną metodę dostarczania lentiwirusowego w celu wyciszenia czynnika transkrypcyjnego TAL1 w pierwotnych komórkach erytroidalnych. Wydajność dostarczania genów za pomocą lentiwirusów została zademonstrowana z wykorzystaniem wirusów ekspresyjących GFP.

Lentiwirusowy wyciszanie genów podczas erytropoezy ex vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Ten protokół opisuje metody konstruowania humanizowanego modelu myszy szpiku kostnego/wątroby/grasicy z opartą na komórkach macierzystych odpornością na zakażenie wirusem HIV.

Zmodyfikowana odporność na zakażenie wirusem HIV oparta na komórkach macierzystych w humanizowanym modelu myszy

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje indukcję programu hemogennego w mysich fibroblastach embrionalnych poprzez nadekspresję minimalnego zestawu czynników transkrypcyjnych. Technologia ta może zostać przełożona na system ludzki, aby zapewnić platformy do przyszłych badań nad hematopoezą, chorobami hematologicznymi i przeszczepem krwiotwórczych komórek macierzystych.

Przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy za pomocą czynników transkrypcyjnych w celu wywołania programu hemogennego

Opisujemy technikę wykorzystania mysich embrionalnych komórek macierzystych do generowania dwu- lub trójwymiarowych ciał embrionalnych. Następnie wyjaśniamy, jak indukować różnicowanie neuronalne komórek ciała zarodka za pomocą kwasu retinowego i jak analizować ich stan różnicowania za pomocą immunofluorescencji markerów komórek progenitorowych i immunoblottingu.

Analiza indukowanego kwasem retinowym różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy w dwu- i trójwymiarowych ciałach embrionalnych

Ten protokół zapewnia metodę tworzenia humanizowanych myszy (hu-NSG) poprzez dowątrobowe wstrzykiwanie ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych do kondycjonowanych promieniowaniem noworodków NSG. Mysz hu-NSG jest podatna na zakażenie wirusem HIV i skojarzoną terapię antyretrowirusową (cART) i służy jako odpowiedni model patofizjologiczny do badań replikacji i latencji HIV.

Humanizowany mysi modelNOD/SCID/IL2rγ null (hu-NSG) do badań replikacji i latencji HIV

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Ten protokół demonstruje indukcję programu hemogennego w ludzkich fibroblastach skóry poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych GATA2, GFI1B i FOS w celu wytworzenia hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Hemogenne przeprogramowanie ludzkich fibroblastów poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych

Tutaj opisujemy metodę retrowirusowej nadekspresji i adoptywnego transferu mysich komórek B-1a w celu zbadania in vivo migracji i lokalizacji komórek B-1a. Protokół ten można rozszerzyć o różne dalsze testy funkcjonalne, w tym kwantyfikację lokalizacji komórek B-1a dawcy lub analizę czynników wydzielanych przez komórki dawcy po transferze adopcyjnym.

Retrowirusowa nadekspresja CXCR4 na mysich komórkach B-1A i transfer adoptywny w celu ukierunkowanej migracji komórek B-1A do szpiku kostnego i produkcji IgM

Poznaj metodę zakażenia retrowirusowego komórek ciała zarodkowego myszy do analizy różnicowania układu krwiotwórczego. Technika umożliwia szybką ekspresję transgenu i badanie hematopoetycznego rozwoju komórek macierzystych.

Zakażenie retrowirusowe mysich embrionalnych komórek ciała zarodkowego pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do analizy różnicowania układu krwiotwórczego (Wideo) | JoVE Journal

Zakażenie retrowirusowe mysich embrionalnych komórek ciała zarodkowego pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do analizy różnicowania układu krwiotwórczego

Przeglądaj więcej filmów