Name: Analiza przebudowy nerwowo-naczyniowej w organotypowych kulturach entorhino-hipokampowych plastrów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Poznaj metodę analizy przebudowy nerwowo-naczyniowej w organotypowych kulturach entorhino-hippokampowych. Technika umożliwia jednoczesne badanie zmian neuronów i naczyń krwionośnych po uszkodzeniu niedokrwiennym mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Uniwersytet w Bazylei, Wydział Biomedycyny oraz Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (31003A_141007). Wsparcia technicznego udzielił Markus Saxer.

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich z 22 września 2010 roku (2010/63/UE) i zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez władze szwajcarskie.
1. Konfiguracja organotypowych kultur entorhino-hipokampowych plastrów
<ol>
	<li>Przygotować organotypowe kultury warstwowe entorhino-hipokampa (EHOSC) od młodych myszy w 4. dniu po urodzeniu (P4) przy użyciu metody inkubacji statycznej4,11. Tutaj użyj myszy C57Bl6 i CB6F1.
	<ol>
		<li>Poświęć około 30 minut na młode myszy na przygotowanie kultur plastrowych, tj. 3 godziny na miot 6 młodych myszy. Wszystkie kroki należy wykonywać w sterylnych warunkach na stole warsztatowym z przepływem laminarnym ze sterylizowanymi narzędziami chirurgicznymi.</li>
		<li>Aby uniknąć możliwej ingerencji w położenie plasterka wzdłuż osi przegrodowo-skroniowej, należy używać wyłącznie wycinków hipokampa w połowie przegrody. Jeśli nie zaznaczono inaczej, wykonaj wszystkie czynności w RT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odetnij głowę szczeniaka myszy P4 nożyczkami chirurgicznymi. Na tym etapie nie jest wymagane znieczulenie.
	<ol>
		<li>Usuń czaszkę wokół mózgu i zidentyfikuj szczelinę między ogonowym końcem półkul mózgowych a śródmózgowiem. Ostrożnie usuń część mózgu od śródmózgowia do śródmózgowia z czaszki i umieść ją w lodowatym pożywce składającej się z MEM uzupełnionego stabilizowaną formą L-glutaminy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj sekcję pod mikroskopem stereoskopowym z mózgiem zanurzonym w lodowatym pożywce przygotowawczej. Usuń pozostałe opony mózgowe z półkul korowych. Zidentyfikuj hipokamp na przyśrodkowej powierzchni ogonowej półkuli i oddziel go wraz z sąsiednią korą śródwęchową od pozostałej części mózgu.
	<ol>
		<li>Przenieś tkankę do rozdrabniacza tkanek i pokrój plastry o grubości 400 μm w warunkach aseptycznych, poprzecznie do osi przegrodowo-skroniowej hipokampa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić plastry na wkładkach do hodowli komórkowych (około 6 plastrów na wkładkę) i inkubować je na płytkach 6-dołkowych z 1 ml pożywki inkubacyjnej na dołek (47 ml MEM, 25 ml Eagle Medium, 25 ml surowicy końskiej, 1 ml glutamax I, 1 ml sterylnego 10% roztworu glukozy, pH 7,3) w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Zmienić pożywkę następnego dnia, a następnie co drugi dzień do 1 tygodnia.</li>
</ol>
2. Niedotlenienie in vitro i deprywacja tlenu i glukozy z reperfuzją
<ol>
	<li>Dokładny harmonogram zabiegu znajduje się w Tabeli 1. Hodowla EHOSC przez 5 dni (DIV5) przed ekspozycją na niedotlenienie lub OGD. W tym momencie należy zmienić pożywkę z pożywki inkubacyjnej zawierającej 25% surowicy końskiej na pożywkę wolną od surowicy o następującym składzie: Pożywka neurobazalna z 2% suplementem B27, 1% glutamax i dodatkowym 0,1% glukozy.</li>
	<li>Przygotować pożywkę OGD zgodnie z opisem w Bibliografii 7 . Końcowe stężenia składników będą następujące: 0,3 mM CaCl2, 70 mM NaCl, 5,25 mM NaHCO3, 70 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 2 mMMgSO4 i 10 mM sacharozy przy pH 6,8. Dodać 1 ml pożywki OGD do każdego dołka z dwóch 6-dołkowych płytek do hodowli tkankowych.
	<ol>
		<li>Perfundować pożywkę OGD zN2 przez 1 godzinę w komorze do hipoksji, a następnie uszczelnić i przechowywać O/N w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Użyj pasków beztlenowych jako wskaźników niedotlenienia. Uznaj, że podłoże jest beztlenowe, gdy kolor pasków zmienił się z różowego na biały.</li>
		<li>Do indukcji hipoksji należy użyć pożywki wolnej od surowicy z glukozą zamiast pożywki OGD. Przed użyciem należy perfaktorować pożywkę zN2 w komorze hipoksji, jak opisano powyżej dla pożywki OGD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanim plastry zostaną wystawione na działanie OGD, należy ponownie przetoczyć pożywkę OGD zN2 przez 30 minut. Dodać 2 μl roztworu jodku propidyny (PI) o stężeniu 1 mg/ml na studzienkę (dla końcowego stężenia 2 μg/ml) do plasterków przez 30 minut i wybierać tylko zdrowe plastry do eksperymentów, na co wskazuje mała liczba komórek PI dodatnich.</li>
	<li>Należy postępować zgodnie z harmonogramem ekspozycji na OGD i reperfuzji wskazanym na rysunku 1. Pozbawić plastry samego tlenu (hipoksja) lub tlenu i glukozy (OGD) przez 15 minut.
	<ol>
		<li>W celu indukcji hipoksji lub OGD przenieś plastry do pożywki OGD i trzymaj przez 15 minut w komorze hipoksji. Upewnij się, że wszystkie płyny, które pozostały po bokach wkładki, zostały odessane po przełączeniu kultur ze zwykłej pożywki na pożywkę OGD i z powrotem.</li>
		<li>Po niedotlenieniu lub OGD zastąpić pożywkę OGD natlenioną pożywką wolną od surowicy i pozostawić hodowle do regeneracji przez 3, 24 lub 48 godzin w pożywce wolnej od surowicy w zwykłym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 . Dodaj PI ponownie przed utrwaleniem w celu określenia śmierci komórki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Leczenie farmakologiczne organotypowych kultur warstwowych entorhino-hipokampa
<ol>
	<li>Hodowla EHOSC przez 5 dni (DIV5) w pożywce inkubacyjnej przed ekspozycją na leczenie farmakologiczne. Leczenie farmakologiczne należy rozpocząć w trakcie OGD lub bezpośrednio po OGD, gdy plastry są przenoszone do pożywki wolnej od surowicy.</li>
	<li>Zabiegi chroniące przed OGD.
	<ol>
		<li>Dodać 100 μM 6-cyjano-7-nitrochinoksalino-2,3-dionu (CNQX) lub 1 μM tetrodotoksyny (TTX) do pożywki podczas indukcji OGD (przez 15 min) lub bezpośrednio po indukcji OGD przez 30 min. Następnie inkubować w pożywce wolnej od surowicy normoksycznej przez 48 godzin przed utrwaleniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie indukcji śmierci ekscytotoksycznej.
	<ol>
		<li>Po 5 dniach w pożywce inkubacyjnej zmienić kultury na pożywkę wolną od surowicy zawierającą 100 μM (RS)-α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowego kwasu (AMPA) na 30 min.</li>
		<li>Usunąć pożywkę hodowlaną zawierającą AMPA przez aspirację (należy uważać, aby usunąć wszelkie pozostałości pożywki z wkładek), a następnie przenieść plastry na świeże płytki z normalną pożywką wolną od surowicy i przechowywać je przez 48 godzin do utrwalenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Utrwalenie i barwienie immunologiczne organotypowych kultur warstwowych entorhino-hipokampa
<ol>
	<li>Barwienie jodkiem propidyny (PI).
	<ol>
		<li>Dodawać PI przez 30 minut do pożywki z żywych wycinków o stężeniu 2 μg/ml. Oglądaj żywe kultury za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w optykę fluorescencyjną i wybierz wycinki do dalszych zabiegów. W przypadku barwienia PI w połączeniu z immunohistochemią, należy dodać roztwór PI 30 minut przed utrwaleniem kultur.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalenie plastrów.
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki 6-dołkowej i dodać 3 ml świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu (PFA) do każdej studzienki. Następnie umieścić płytkę 6-dołkową w lodówce i ustabilizować O/N w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Następnego dnia usuń roztwór PFA i umyj plastry 3-4 razy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunięcie wycinków z wkładki do hodowli komórkowej i procedura blokowania immunohistochemii swobodnie pływających skrawków.
	<ol>
		<li>Ostrożnie oderwij i usuń plastry z wkładek kulturowych za pomocą pędzla artystycznego o rozmiarze 0 lub mniejszym. Przenieś każdą pojedynczą cząstkę do dołka na 96-dołkowej płytce wypełnionej buforem blokującym (PBS z 3% normalną surowicą kozią (NGS) i 2% Triton-X100). Przechowywać plastry w buforze blokującym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej pod stałym mieszaniem za pomocą wytrząsarki orbitalnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunologiczne kultur plastrów
	<ol>
		<li>Do znakowania naczyń krwionośnych należy użyć poliklonalnej antylamininy w rozcieńczeniu 1:200 w PBS zawierającym 1% NGS i 0,5% Triton-X100.</li>
		<li>Do znakowania neuronów należy użyć białka związanego z antymikrotubulami 2 (MAP2) w rozcieńczeniu 1:500 w PBS zawierającym 1% NGS i 0,5% Triton-X100.</li>
		<li>Inkubować plastry z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez 48 godzin w temperaturze 4 °C przy stałym mieszaniu. Po okresie inkubacji umyj je w PBS z 0,5% Triton-X100 3-4 razy.</li>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w stosunku 1:500 w PBS zawierającym 1% NGS i 0,5% Triton-X100. Inkubuj plastry przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem Alexa. Użyj odpowiedniego koziego przeciwciała anty-królika lub kozy anty-myszy sprzężonego z Alexa 350 lub 488.</li>
		<li>Usunąć roztwór przeciwciała drugorzędowego i przemyć plastry trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną Tris (TBS); zamontować je na szkiełkach podstawowych i nakryć szkiełka preparatami Mowiol.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroskopia barwionych plastrów</li>
	<li>Zobacz wybarwione plastry albo pod standardowym mikroskopem ze sprzętem do epifluorescencji, albo za pomocą mikroskopu konfokalnego. Rób zdjęcia odpowiednim aparatem. W przypadku niektórych obrazów należy odwrócić kontrast fluorescencji, aby uzyskać ciemne zabarwione naczynia na jasnym tle (ryc. 5 i 6).</li>
</ol>
5. Określanie regionalnego zagęszczenia naczyń w kulturach
<ol>
	<li>Określić ilościowo gęstość statku na podstawie przekroczeń statku, jak opisano w pozycji referencyjnej 8.</li>
	<li>Do tych pomiarów użyj plastrów barwionych na lamininę. Na nagrane obrazy o 10-krotnym powiększeniu nałożyć siatkę 6 x 6, gdzie każda siatka jest równa 100 x 100 μm na kwadrat, całkowite pole 0,25 mm2.</li>
	<li>Nałóż na siebie trzy takie siatki w regionie CA1, CA3, DG i EC (Rysunek 2). Policz statki przecinające linie siatki.</li>
	<li>Aby uzyskać wyniki o dobrej istotności statystycznej, wykonaj pomiary w co najmniej 3 niezależnych eksperymentach, z których każdy zawiera dane z 3 szczeniąt myszy z 3 plasterkami na szczeniak myszy.</li>
	<li>Określić średnią wartość przekroczeń statków z sieci dla każdego regionu i przeprowadzić analizę statystyczną za pomocą ANOVA z poprawką Bonferroniego jako test post hoc (p<0,05 zdefiniowany jako istotny) przy użyciu odpowiedniego oprogramowania statystycznego.</li>
</ol>

<ol><li>Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+of+cerebral+ischemia+and+the+quest+for+neuroprotection%3A+navigating+past+failure+to+future+success%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success.</a> J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).</li>
<li>Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemic+stroke.+Part+two%3A+modeling+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Neurol+J%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia.</a> Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).</li>
<li>Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+entorhino-dentate+projections+in+organotypic+slice+cultures%3A+mode+of+axonal+regrowth+and+effects+of+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors.</a> Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).</li>
<li>Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+entorhinal+fibers+in+mouse+slice+cultures+is+age+dependent+and+can+be+stimulated+by+NT-4%2C+GDNF%2C+and+modulators+of+G-proteins+and+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase.</a> C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).</li>
<li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).</li>
<li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).</li>
<li>Rytter, A., Cronberg, T., Asztély, F., Nemali, S., Wieloch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+hippocampal+organotypic+tissue+cultures+exposed+to+in+vitro+%E2%80%98ischemia%E2%80%99+show+selective+and+delayed+CA1+damage+that+is+aggravated+by+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro ‘ischemia’ show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).</li>
<li>Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+modulates+density+of+blood+vessels+and+preserves+tight+junctions+in+organotypic+cortical+cultures+of+mice%3A+a+new+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier.</a> J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).</li>
<li>Camenzind, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+transendothelial+glucose+transporter+1+and+P-glycoprotein+transporters+in+a+cortical+slice+culture+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier.</a> Neuroscience. 170, 361-371 (2010).</li>
<li>De Jong, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+hypoperfusion+yields+capillary+damage+in+the+hippocampal+CA1+area+that+correlates+with+spatial+memory+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment.</a> Neuroscience. 91, 203-210 (1999).</li>
<li>Cavaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+variation+in+brain+capillary+density+and+vascular+response+to+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia.</a> Brain Res. 910, 81-93 (2001).</li>
<li>Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subfield-specific+neurovascular+remodeling+in+the+entorhino-hippocampal-organotypic+slice+culture+as+a+response+to+oxygen-glucose+deprivation+and+excitotoxic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich z dnia 24 listopada 1986 r. (86/609/EWG) i zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez władze szwajcarskie. Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dzięki przedstawionym tu metodom, organotypowe kultury plastrów hipokampa mogą być wykorzystywane jako wszechstronne narzędzie do badania zmian plastycznych w tkance nerwowej po urazie. Podczas gdy organotypowe kultury warstw były wykorzystywane w przeszłości do badania reakcji neuronalnych po niedokrwieniu6, 7 , nowy aspekt jednoczesnego badania zmian naczyniowych znacznie zwiększa potencjalne zastosowania tej metody. Sama indukcja OGD lub hipoksja może być zastosowana dość prostymi środkami w organotypowych ...

Ośrodkowy układ nerwowy jest szczególnie wrażliwy na utratę lub zmniejszenie dopływu tlenu i glukozy przez układ naczyniowy. Nawet dość krótka przerwa w dopływie krwi do mózgu może wywołać trwałą utratę funkcji odpowiednich obszarów mózgu, prowadząc do typowych zespołów udaru. Oprócz utraty neuronów w pierwotnych obszarach dotkniętych chorobą, zazwyczaj występuje dodatkowa opóźniona utrata neuronów poprzez wtórne uszkodzenie. Niestety, do tej pory nie było dostępnego leczenia neuroprotekcyjnego w celu zmniejszenia wtórnej śmierci neuronów1. Wysiłki badawcze mające na celu zbadanie mechanizmów wtórnego uszkodzenia opierają się na wykorzystaniu zwierzęcych modeli niedokrwienia mózgu, takich jak niedrożność tętnicy środkowej mózgu i różne techniki zakrzepowej niedrożności (niedawny przegląd patrz2). Równolegle, również ze względu na ograniczenia i obawy etyczne związane z wykorzystaniem modeli zwierzęcych, zastosowano organotypową hodowlę plastrów różnych tkanek OUN, które umożliwiają badanie reakcji neuronalnych na różnego rodzaju urazy3-5.
Do badania reakcji neuronalnej w warunkach naśladujących niedokrwienne uszkodzenie mózgu, opracowano modelowy system deprywacji tlenu glukozy (OGD). W tym modelu kultury warstwowe są tymczasowo wystawione na działanie pożywki, która nie zawiera glukozy i została zrównoważona z gazowym azotem przy braku tlenu. Dzięki takiemu leczeniu możliwe jest wywołanie uszkodzenia i utraty neuronów, które są raczej podobne do obserwowanych po uszkodzeniu niedokrwiennym in vivo6, 7. W hipokampie takie leczenie indukuje utratę neuronów specyficznie w CA1, ale nie w obszarze CA3 lub zakręcie zębatym hipokampa. W przeciwieństwie do tego, badania nad reakcjami naczyniowymi w kulturach plastrów nie były do tej pory szeroko prowadzone. Oczywistym powodem jest brak krążenia i perfuzji naczyń krwionośnych w modelu hodowli plastrów. Jednak wykazaliśmy wcześniej, że możliwe jest utrzymanie naczyń krwionośnych w kulturach warstwowych OUN przez kilka dni8, 9.
Ogólnym celem tej metody jest nie tylko monitorowanie losu neuronów po OGD, ale także rozszerzenie badania na los i przebudowę układu krwionośnego, co jest ważną częścią reakcji na uraz. Do tej pory takie badania wymagały stosowania doświadczeń na zwierzętach (De Jong i in., 1999; Cavaglia i wsp., 2001). W przedstawionym tutaj protokole szczegółowo opiszemy, w jaki sposób takie badania można przeprowadzić w organotypowych kulturach warstw entorhino-hipokampa, którym poddawano się niedotlenieniu lub zmianom ekscytotoksycznym, a następnie analizie zarówno przeżycia neuronów, jak i reakcji naczyń krwionośnych. Protokół ten opiera się na wcześniej opublikowanym badaniu na ten temat10 i może być przydatny dla każdego laboratorium zainteresowanego interakcjami nerwowo-naczyniowymi w OUN.

<table><tbody><tr><td>Minimum Essential Medium MEM</td><td>Gibco</td><td>11012-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>stabilizowana forma L-glutaminy</td></tr><tr><td>Wkłady do hodowli komórkowych Millicell</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże bazowe Eagle&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla koni</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka neuropodstawowa</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Paski anaerobowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59886</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór jodku propidyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>AMPA</td><td>R& Systemy D</td><td>0169-10</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>R& Systemy D</td><td>0190/10</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>R& Systemy D</td><td>1078/1</td><td></td></tr><tr><td>poliklonalna antylaminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anty-MAP2</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anty-mysie 350</td><td>Sondy molekularne</td><td>A11045</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anty-mysie 488</td><td>Sondy molekularne</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anty-króliki 350</td><td>Sondy molekularne</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anty-królik 488</td><td>Sondy molekularne</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie statystyczne</td><td>Oprogramowanie GraphPad</td> Rozdrabniacz tkanek <td>GraphPad Prism</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain</td><td>Ted Pella</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>Komora hipoksji</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza przebudowy nerwowo-naczyniowej w organotypowych kulturach entorhino-hipokampowych plastrów

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Niedokrwienne uszkodzenie mózgu jest jednym z najczęstszych i najbardziej wyniszczających stanów zagrażających prawidłowemu funkcjonowaniu mózgu i często prowadzi do utrzymujących się deficytów funkcjonalnych u dotkniętych nim pacjentów. Pomimo intensywnych wysiłków badawczych nadal nie ma skutecznej opcji leczenia, która zmniejszałaby uszkodzenie neuronów i chroniła neurony w obszarach niedokrwionych przed opóźnioną wtórną śmiercią. Badania w tej dziedzinie zazwyczaj obejmują wykorzystanie skomplikowanych i problematycznych modeli zwierzęcych. Organotypowe hodowle warstwowe entorhino-hipokampa z deprywacją tlenu i glukozy (OGD) są tworzone in vitro, które naśladują niedokrwienie mózgu. Nowatorskim aspektem tego badania jest to, że oprócz zmian neuronalnych badane są zmiany naczyń krwionośnych mózgu, a reakcja zarówno przedziału neuronalnego, jak i przedziału naczyniowego może być porównywana i korelowana. Metody przedstawione w niniejszym protokole znacznie poszerzają potencjalne zastosowania podejścia opartego na organotypowej hodowli plastrów. Sama indukcja OGD lub hipoksja może być zastosowana dość prostymi środkami w organotypowych kulturach plastrów i prowadzi do wiarygodnych i powtarzalnych uszkodzeń tkanki nerwowej. Stoi to w jaskrawym kontraście ze skomplikowanymi i problematycznymi eksperymentami na zwierzętach wywołującymi udar i niedokrwienie in vivo. Poszerzenie analizy o badanie reakcji układu krwionośnego może dostarczyć nowych sposobów na zachowanie i przywrócenie funkcji mózgu. Przedstawione tutaj podejście oparte na hodowli warstw może stać się atrakcyjnym i ważnym narzędziem do badania niedokrwiennego uszkodzenia mózgu i może być przydatne do testowania potencjalnych środków terapeutycznych mających na celu neuroprotekcję.

Pozbawienie tlenu i glukozy oraz hipoksja indukują śmierć neuronów i redukcję naczyń krwionośnych specyficznie w obszarze CA1 hipokampa. 
OGD lub samo pozbawienie tlenu przez 15 min wywołało silną indukcję śmierci komórek, co widoczne było w barwieniu jodkiem propidium specyficznie w obszarze CA1 hipokampa (Rycina 3), podobnie jak opisano poprzednio7. Przy zastosowaniu markerów do wizualizacji sieci naczyń krwionośnych stwierdzono, że gęstość i organizacja naczyń krwionośnych w wię...

Przedstawiono protokół dla organotypowych kultur entorhino-hipokampowych, który pozwala na odtworzenie wielu aspektów niedokrwiennego uszkodzenia mózgu. Badając zmiany układu nerwowo-naczyniowego oprócz zmian w neuronach, protokół ten jest wszechstronnym narzędziem do badania zmian plastycznych w tkance nerwowej po urazie.

Analiza przebudowy nerwowo-naczyniowej w organotypowych kulturach entorhino-hipokampowych plastrów

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesne badanie zmian neuronów i naczyń krwionośnych w modelu hodowli tkankowej niedokrwiennego uszkodzenia mózgu. Osiąga się to poprzez uprzednie ustawienie kultur plastrów hipokampa nosorożca. Drugim krokiem jest naśladowanie niedokrwiennego uszkodzenia mózgu poprzez wystawienie kultur na warunki niedotlenienia.Ostatnim krokiem jest analiza i skorelowanie przeżycia neuronów ze zmianami naczyniowymi. Ostatecznie stosuje się podejście in vitro oparte na organicznych kulturach warstw hipokampa, aby pokazać złożone interakcje między neuronami a układem naczyniowym w warunkach niedokrwiennych. Główną zaletą tej techniki jest to, że po prowokacji hipoksyjnej przeżycie neuronów i zmiany w naczyniach krwionośnych mogą być badane jednocześnie w systemie modelu hodowli warstwowej.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuroniedokrwienia, takie jak ujawnienie złożonych interakcji między neuronami a naczyniami krwionośnymi oraz stanów niedokrwiennych. Na początek przygotuj się, wprowadź organotypowe organotypowe kultury plasterków hipokampa nosorożca z dnia poporodowego z myszy pops. Po usunięciu czaszki zidentyfikuj szczelinę między końcem rdzenia półkul mózgowych a śródmózgowiem.Ostrożnie usuń części mózgu rostralne do śródmózgowia i umieść je w lodowato zimnym pożywce składającej się z suplementowanego MEM. Kontynuuj sekcję pod mikroskopem stereoskopowym, utrzymując mózg zanurzony w lodowatym pożywce przygotowawczej. Usuń pozostałe opony mózgowe z półkul korowych.Następnie zidentyfikuj hipokamp na przyśrodkowej powierzchni rdzenia półkuli i oddziel go wraz z sąsiednią korą wewnętrzną RH od reszty mózgu. Przenieś tkankę do rozdrabniacza tkanek i pokrój plastry o grubości 400 mikronów poprzecznie do osi skroniowej przegrody hipokampa. Umieść plastry na wkładkach do hodowli komórkowych i inkubuj je na sześciodołkowych płytkach z jednym mililitrem pożywki inkubacyjnej w wilgotnej atmosferze.Zmień pożywkę następnego dnia, a następnie co drugi dzień do jednego tygodnia Następnie przygotuj pożywkę OGD. Dodaj jeden mililitr pożywki OGD do każdej studzienki z dwoma sześcioma. Cóż, płytki do hodowli tkankowych perfundują pożywkę OGG z azotem przez godzinę w komorze hipoksji, a przed zamknięciem i przechowywaniem przez noc W inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza użyj pasków beztlenowych jako wskaźników niedotlenienia.Uznaj, że podłoże jest beztlenowe, gdy kolor pasków zmienia się z różowego na biały. Gdy będziesz gotowy, wybierz zdrowe komórki za pomocą barwienia jodkiem propidyny lub PI. Dodawać liczbę pi przez 30 minut do pożywki hodowlanej w stężeniu dwóch mikrogramów na mililitr.Oglądaj żywe kultury za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego wyłącznie w optykę fluorescencyjną. Wycinki z kilkoma oznaczonymi komórkami, jak pokazano tutaj, powinny zostać wybrane do dalszych badań wycinków z wieloma oznaczonymi komórkami, jak pokazano tutaj. Nie powinien być stosowany do indukcji OGD.Przenieś plastry do pożywki OGD i trzymaj przez 15 minut w komorze hipoksji, upewnij się, że wszystkie płyny, które pozostały po bokach wkładki, zostały odessane na kulturach przełącznika. Ze zwykłej pożywki na pożywkę OGD i z powrotem po OGD, zastąp pożywkę OGD natlenioną pożywką wolną od surowicy i pozwól kulturom odzyskać sprawność przez 3, 24 lub 48 godzin. W pożywce wolnej od surowicy ponownie dodać liczbę pi przed utrwaleniem w celu określenia śmierci komórki.Jeśli badanie wymaga leczenia farmakologicznego, należy je rozpocząć w trakcie OGD lub bezpośrednio po przeniesieniu wycinków do surowicy wolnej od surowicy. Podłoże do barwienia PI. W połączeniu z immunohistochemią dodać roztwór PI 30 minut przed utrwaleniem kultur.Po utrwaleniu komórek przez noc usuń roztwór PFA i umyj plastry trzy do czterech razy. W przypadku PBS procedurę blokowania należy rozpocząć od ostrożnego odłączenia wycinków od wkładek hodowlanych i przeniesienia ich do studzienki na 96-dołkowej płytce wypełnionej buforem blokującym. Przechowywać plastry w buforze blokującym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej pod ciągłym mieszaniem za pomocą wytrząsarki orbitalnej.Po dodaniu wybranych przeciwciał pierwotnych inkubować przez 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza ze stałym mieszaniem po okresie inkubacji. Umyj je w PBS z 0,5%Triton X 103 do czterech razy. Następnie postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami w całym przeciwciałie wtórnym przed zamontowaniem odcinków barwnika na szkiełkach podstawowych z szkiełkami nakrywkowymi.Obejrzyj wybarwione plastry pod standardowym mikroskopem ze sprzętem do fluorescencji epi lub pod mikroskopem konfokalnym. W przypadku niektórych obrazów odwróć kontrast fluorescencji, aby uzyskać ciemno zabarwione naczynia na jasnym tle za pomocą plastrów barwionych na lamininę. Nałożone na siebie zarejestrowane obrazy o powiększeniu 10x z siatką sześć na sześć nakładają się na trzy takie siatki w obszarze ca jeden, CA trzy DG i DC.I policz statki przecinające linie siatki, aby uzyskać wyniki o dobrej istotności statystycznej. Wykonaj pomiary z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów, z których każdy zawiera dane z trzech zaciągnięć myszy z trzema plasterkami na młode myszy. Porównanie kultur kontrolnych z leczonymi ujawnia, że niedotlenienie indukuje śmierć neuronów i utratę naczyń krwionośnych w regionie hipokampa.W tych przykładach barwienie PI jest pokazane na czerwono i połączone z barwieniem lamininą na zielono po trzech godzinach od leczenia hipoksją, nie ma widocznego barwienia PI i nie są widoczne żadne zmiany naczyniowe. Po 24 godzinach pojawia się przebarwienie PI i widoczny jest również ubytek naczyń krwionośnych. Zarówno zabarwienie PI, jak i utrata naczyń krwionośnych stają się bardziej widoczne po 48 godzinach.Sam OGD indukuje zarówno utratę neuronów, jak i utratę naczyń krwionośnych. W około jednym zastosowaniu TTX lub CN QX zapobiegło zarówno utracie neuronów, jak i utracie naczyń krwionośnych ujawnionej przez barwienie lamininą za pomocą 100 mikromolów A MPA przez 30 minut, co spowodowało rozległą utratę neuronów w większości obszarów hipokampa, ale utrata naczyń krwionośnych pozostała ograniczona do obszaru CA pierwszego. Kwantyfikacja naczyń krwionośnych potwierdza selektywną utratę w obszarze CA one.Po tej procedurze można przeprowadzić leczenie farmakologiczne lub modyfikacje genetyczne w celu zidentyfikowania skutecznych środków neuroprotekcyjnych i lepszego zrozumienia mechanizmów przebudowy naczyń krwionośnych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować interwencyjne kultury podobne do hipokampa i indukować OGD, a następnie analizować zarówno przeżycie neuronów, jak i zmiany naczyniowe.

the-analysis-neurovascular-remodeling-entorhino-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Organoptypowy model hodowli plastrów hipokampa jest modelem in vitro stosowanym do badania uszkodzeń neuronalnych w różnych paradygmatach. W niniejszym artykule opisujemy metody przygotowania hodowli plastrów oraz ilościowego oznaczania uszkodzeń neuronalnych.

Model organotypowej hodowli skrawków hipokampa do badania uszkodzeń neuronów

Opisujemy metodę przygotowania organotypowych skrawków hipokampa, którą można łatwo dostosować do innych obszarów mózgu. Skrawki mózgu umieszcza się na porowatych membranach, pozwalając na utworzenie interfejsu z pożywką hodowlaną. Metoda ta pozwala zachować ogólną architekturę hipokampa przez okres do 2 tygodni hodowli.

Organotypowe hodowle przekrojów hipokampa

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

Opisano technikę badania komórek NG2 i oligodendrocytów za pomocą systemu hodowli plasterkowej w przodomózgowiu i móżdżku.  Metoda ta pozwala na badanie dynamiki proliferacji i różnicowania komórek w obrębie linii oligodendrocytów, w której można łatwo manipulować środowiskiem zewnątrzkomórkowym przy zachowaniu cytoarchitektury tkanek.

Organotypowe kultury warstwowe do badania dynamiki oligodendrocytów i mielinizacji

Tutaj opisujemy technikę badania neurogenezy poporodowej hipokampa za pomocą techniki organotypowej hodowli plastrów. Metoda ta pozwala na manipulację neurogenezą dorosłych w warunkach in vitro i pozwala na bezpośrednie zastosowanie środków farmakologicznych do hodowanego hipokampa.

Organotypowe kultury warstwowe do badań neurogenezy poporodowej

Organotypowe kultury plastrów hipokampa (OHSC) reprezentują model in vitro, który bardzo dobrze symuluje sytuację in vivo. W tym miejscu opisujemy ulepszony protokół krojenia oparty na wibratomie w celu uzyskania wysokiej jakości plastrów do wykorzystania w ocenie potencjału neuroprotekcyjnego nowych substancji lub biologicznego zachowania komórek nowotworowych.

Organotypowe kultury warstwowe hipokampa jako model do badania neuroprotekcji i inwazyjności komórek nowotworowych

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Przedstawiono protokół przygotowania swobodnie pływających kultur warstwowych z dorosłego ludzkiego mózgu. Protokół jest odmianą szeroko stosowanej metody hodowli plastrowej z wykorzystaniem wkładek membranowych. Jest prosty, opłacalny i zalecany do przeprowadzania krótkoterminowych testów mających na celu rozwikłanie mechanizmów neurodegeneracji stojących za chorobami mózgu związanymi z wiekiem.

Krótkoterminowe, swobodnie unoszące się w powietrzu kultury warstwowe z dorosłego ludzkiego mózgu

Opisujemy protokół specyficznej dla typu komórki ekspresji genetycznie kodowanego czujnika opartego na FRET ATeam1.03YEMK w organotypowych kulturach warstwowych przodomózgowia myszy. Ponadto pokazujemy, jak wykorzystać ten czujnik do dynamicznego obrazowania komórkowych poziomów ATP w neuronach i astrocytach.

Obrazowanie wewnątrzkomórkowego ATP w organotypowych wycinkach tkanki mózgu myszy przy użyciu czujnika ATeam1.03YEMK opartego na FRET

Tutaj opisujemy przygotowanie organicznych plastrów kory nosa i hipokampa. Przy stopniowym i kontrolowanym pozbawianiu surowicy, plastry te przedstawiają ewoluujące zdarzenia podobne do padaczki i mogą być uważane za model epileptogenezy ex vivo. System ten stanowi doskonałe narzędzie do monitorowania dynamiki spontanicznej aktywności, a także do oceny progresji cech neurozapalnych w całym przebiegu epileptogenezy.

Model epileptogenezy w organotypowych kulturach warstwowych kory nosa i hipokampa

W tym artykule przedstawiamy powtarzalną metodę generowania i utrzymywania długoterminowych wycinków organotypowych rdzenia kręgowego przeszczepionych z nerwowymi komórkami macierzystymi jako model ex vivo do testowania komórkowych terapii zastępczych.

Długoterminowa organotypowa hodowla warstw rdzenia kręgowego myszy jako platforma do walidacji przeszczepu komórek w urazie rdzenia kręgowego

Poznaj metodę analizy przebudowy nerwowo-naczyniowej w organotypowych kulturach entorhino-hippokampowych. Technika umożliwia jednoczesne badanie zmian neuronów i naczyń krwionośnych po uszkodzeniu niedokrwiennym mózgu.

Analiza przebudowy nerwowo-naczyniowej w organotypowych kulturach entorhino-hipokampowych plastrów

Przeglądaj więcej filmów