Name: Immunoterapia podjęzykowa jako alternatywa dla indukowania ochrony przed ostrymi infekcjami dróg oddechowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 56 s
Description: Poznaj immunoterapię podjęzykową jako bezpieczną metodę wzmacniania odpowiedzi immunologicznej w płucach i ochrony przed zakażeniem Streptococcus pneumoniae u myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Jean-Claude Sirardowi z Centrum Infekcji i Odporności w Lille, Instytutu Pasteura de Lille-Francja, za uprzejme dostarczenie oczyszczonej flageliny oraz dr Teresie Camou, Dyrektorowi Narodowego Laboratorium Referencyjnego, Ministerstwo Zdrowia Urugwaju za uprzejme dostarczenie szczepu pneumokoków. 
Autorzy chcieliby wyrazić swoje podziękowania dla Pana Diego Acosty i Pana Ignacio Turela z BichoFeo Producciones-Urugwaj za ich zaangażowanie i ciężką pracę podczas całej produkcji i edycji filmu. 
Ta praca była wspierana przez granty PR_FCE_2009_1_2783 i BE_POS_2010_1_2544 z Narodowej Agencji Badań i Innowacji, ANII z Urugwaju, Programu Rozwoju Nauk Podstawowych, PEDECIBA Urugwaju oraz Sektorowej Komisji Badań Naukowych, CSIC-Universidad de la República, Urugwaj.

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumococcal+vaccines+WHO+position+paper--2012%5BTitle%5D)+AND+%22Weekly+Epidemiological+Record%22%5BJournal%5D)">Pneumococcal vaccines WHO position paper--2012.</a> Weekly Epidemiological Record. 14, 129-144 (2012).</li>
<li>Pneumonia - Facts Sheet N°331. , WHO. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/en">http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/en</a> (2013).</li>
<li>Appelbaum, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carriage+of+antibiotic-resistant+Streptococcus+pneumoniae+by+children+in+eastern+and+central+Europe-a+multicenter+study+with+use+of+standardized+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Carriage of antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae by children in eastern and central Europe-a multicenter study with use of standardized methods.</a> Clin Infect Dis. 23, 712-717 (1996).</li>
<li>Ramirez, J. A., Anzueto, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+needs+of+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Changing needs of community-acquired pneumonia.</a> J Antimicrob Chemother. 66, 3-9 (2011).</li>
<li>Cuburu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublingual+immunization+induces+broad-based+systemic+and+mucosal+immune+responses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Sublingual immunization induces broad-based systemic and mucosal immune responses in mice.</a> Vaccine. 25, 8598-8610 (2007).</li>
<li>Pedersen, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+sublingual+route+for+administration+of+influenza+H5N1+virosomes+in+combination+with+the+bacterial+second+messenger+c-di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the sublingual route for administration of influenza H5N1 virosomes in combination with the bacterial second messenger c-di-GMP.</a> PLoS One. 25, 1-12 (2011).</li>
<li>Song, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublingual+vaccination+with+influenza+virus+protects+mice+against+lethal+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Sublingual vaccination with influenza virus protects mice against lethal viral infection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 1644-1649 (2008).</li>
<li>Cogo, R., Ramponi, A., Scivoletto, G., Rippoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophylaxis+for+acute+exacerbations+of+chronic+bronchitis+using+an+antibacterial+sublingual+vaccine+obtained+through+mechanical+lysis%3A+a+clinical+and+pharmacoeconomic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomed%22%5BJournal%5D)">Prophylaxis for acute exacerbations of chronic bronchitis using an antibacterial sublingual vaccine obtained through mechanical lysis: a clinical and pharmacoeconomic study.</a> Acta Biomed. 74, 76-87 (2003).</li>
<li>Rosaschino, F., Cattaneo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+optimizing+compliance+of+paediatric+patients+for+seasonal+antibacterial+vaccination+with+sublingually+administered+Polyvalent+Mechanical+Bacterial+Lysates+%28PMBL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomed%22%5BJournal%5D)">Strategies for optimizing compliance of paediatric patients for seasonal antibacterial vaccination with sublingually administered Polyvalent Mechanical Bacterial Lysates (PMBL).</a> Acta Biomed. 75, 171-178 (2004).</li>
<li>Senna, G., Caminati, M., Canonica, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+tolerability+of+sublingual+immunotherapy+in+clinical+trials+and+real+life%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Safety and tolerability of sublingual immunotherapy in clinical trials and real life.</a> Curr Opin Allergy Clin Immunol. 13, 656-662 (2013).</li>
<li>Mascarell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+dendritic+cells+mediate+antigen-specific+tolerance+by+stimulating+TH1+and+regulatory+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Oral dendritic cells mediate antigen-specific tolerance by stimulating TH1 and regulatory CD4+ T cells.</a> J Allergy Clin Immunol. 122, 603-609 (2008).</li>
<li>Mascarell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+lingual+immune+system+reveals+the+presence+of+both+regulatory+and+effector+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Allergy%22%5BJournal%5D)">Mapping of the lingual immune system reveals the presence of both regulatory and effector CD4+ T cells.</a> Clin Exp Allergy. 39, 1910-1919 (2009).</li>
<li>Mascarell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+macrophage-like+cells+play+a+key+role+in+tolerance+induction+following+sublingual+immunotherapy+of+asthmatic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Oral macrophage-like cells play a key role in tolerance induction following sublingual immunotherapy of asthmatic mice.</a> Mucosal Immunology. 4, 638-647 (2011).</li>
<li>Hervouet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-bearing+dendritic+cells+from+the+sublingual+mucosa+recirculate+to+distant+systemic+lymphoid+organs+to+prime+mucosal+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen-bearing dendritic cells from the sublingual mucosa recirculate to distant systemic lymphoid organs to prime mucosal CD8 T cells.</a> Mucosal Immunology. 7, 280-291 (2014).</li>
<li>Munoz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+administration+of+flagellin+protects+mice+from+Streptococcus+pneumoniae+lung+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Mucosal administration of flagellin protects mice from Streptococcus pneumoniae lung infection.</a> Infect Immun. 78, 4226-4233 (2010).</li>
<li>Hayashi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+innate+immune+response+to+bacterial+flagellin+is+mediated+by+Toll-like+receptor+5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5.</a> Nature. 410, 1099-1103 (2001).</li>
<li>Lightfield, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+function+for+Naip5+in+inflammasome+activation+by+a+conserved+carboxy-terminal+domain+of+flagellin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Critical function for Naip5 in inflammasome activation by a conserved carboxy-terminal domain of flagellin.</a> Nature Immunology. 9, 1171-1178 (2008).</li>
<li>Lightfield, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+requirements+for+NAIP5+in+activation+of+the+NLRC4+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Differential requirements for NAIP5 in activation of the NLRC4 inflammasome.</a> Infect Immun. 79, 1606-1614 (2011).</li>
<li>Honko, A. N., Mizel, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+administration+of+flagellin+induces+innate+immunity+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Mucosal administration of flagellin induces innate immunity in the mouse lung.</a> Infect Immun. 72, 6676-6679 (2004).</li>
<li>Janot, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioresistant+cells+expressing+TLR5+control+the+respiratory+epithelium%27s+innate+immune+responses+to+flagellin%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Radioresistant cells expressing TLR5 control the respiratory epithelium's innate immune responses to flagellin.</a> Eur J Immunol. 39 (6), 1587-1596 (2009).</li>
<li>Van Maele, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR5+signaling+stimulates+the+innate+production+of+IL-17+and+IL-22+by+CD3%28neg%29CD127%2B+immune+cells+in+spleen+and+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR5 signaling stimulates the innate production of IL-17 and IL-22 by CD3(neg)CD127+ immune cells in spleen and mucosa.</a> J Immunol. 185, 1177-1185 (2010).</li>
<li>Lee, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurologic+adverse+events+following+influenza+A+%28H1N1%29+vaccinations+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics+international%3A+official+journal+of+the+Japan+Pediatric+Society%22%5BJournal%5D)">Neurologic adverse events following influenza A (H1N1) vaccinations in children.</a> Pediatrics international: official journal of the Japan Pediatric Society. 54, 325-330 (2012).</li>
<li>Lewis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+facial+nerve+paralysis+%28Bell%27s+palsy%29+following+intranasal+delivery+of+a+genetically+detoxified+mutant+of+Escherichia+coli+heat+labile+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transient facial nerve paralysis (Bell's palsy) following intranasal delivery of a genetically detoxified mutant of Escherichia coli heat labile toxin.</a> PLoS One. 4, e6999(2009).</li>
<li>Mutsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+inactivated+intranasal+influenza+vaccine+and+the+risk+of+Bell%27s+palsy+in+Switzerland%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Use of the inactivated intranasal influenza vaccine and the risk of Bell's palsy in Switzerland.</a> N Engl J Med. 350, 896-903 (2004).</li>
<li>Kuo, C. H., Wang, W. L., Chu, Y. T., Lee, M. S., Hung, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublingual+immunotherapy+in+children%3A+an+updated+review%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neonatol%22%5BJournal%5D)">Sublingual immunotherapy in children: an updated review.</a> Pediatr Neonatol. 50, 44-49 (2009).</li>
<li>Nempont, C., Cavet, D., Rumbo, M., Bompard, C., Villeret, V., Sirard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+flagellin%27s+hypervariable+region+abrogates+antibody-mediated+neutralization+and+systemic+activation+of+TLR5-dependent+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Deletion of flagellin's hypervariable region abrogates antibody-mediated neutralization and systemic activation of TLR5-dependent immunity.</a> J. Immunol. 181, 2036-2043 (2008).</li>
<li>
 Pathogen Regulation Directorate, Public Health Agency of Canada
 . Streptococcus pneumoniae: Pathogen Safety Data Sheet - Infectious Substances. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/streptococcus-pneumoniae-eng.php">http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/streptococcus-pneumoniae-eng.php</a> (2011).</li>
<li>Marques, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+Streptococcus+pneumoniae+serotype+1+acute+infection+shows+a+signature+of+Th17-+and+IFN-gamma-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Protection against Streptococcus pneumoniae serotype 1 acute infection shows a signature of Th17- and IFN-gamma-mediated immunity.</a> Immunobiology. 217, 420-429 (2012).</li>
<li>Stewart, C. C., Stewart, S. J., et al. Titering antibodies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStewart%2C+CC+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22">Current Protocols in Cytometry</a>. 4, Unit 4.1(2001).</li>
<li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The real-time polymerase chain reaction.</a> Molecular Aspects of Medicine. 27, 95-125 (2006).</li>
<li>Pedersen, G., Cox, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mucosal+vaccine+quandary%3A+intranasal+vs.+sublingual+immunization+against+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">The mucosal vaccine quandary: intranasal vs. sublingual immunization against influenza.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 8, 689-693 (2012).</li>
<li>Vitaliti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+immunity+and+sublingual+immunotherapy+in+respiratory+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Regulators+and+Homeostatic+Agents%22%5BJournal%5D)">Mucosal immunity and sublingual immunotherapy in respiratory disorders.</a> Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 26, S85-S93 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Udowodniono, że podjęzykowe podawanie środków terapeutycznych jest użytecznym sposobem modulowania odpowiedzi immunologicznej w drogach oddechowych. Główną zaletą SLIT w leczeniu chorób układu oddechowego jest to, że nie wiąże się z bezpośrednim dostarczaniem związków do płuc lub nozdrzy, dzięki czemu jest bezpieczniejszy niż leczenie oparte na podawaniu donosowym31.
Immunoterapia podjęzykowa może być stosowana do modulowania odpowiedzi immunologicznej na różne sposoby, albo w celu indukcji odpowiedzi regulatorowych, które mogą złagodzić objawy alergicznego zapalenia i astmy32 , albo w celu wywołania przejściowej aktywacji wrodzonych mechanizmów odpornościowych w leczeniu ostrych infekcji płuc, jak pokazano tutaj.
Model myszy przedstawiony w tym filmie jest wygodną metodą badań przesiewowych różnych związków jako środków terapeutycznych dla SLIT.
Ten model zwierzęcy stanowi użyteczny sposób określania wpływu SLIT na odpowiedź immunologiczną płuc, a także na inne narządy (np. drenujące węzły chłonne lub dystalne miejsca błony śluzowej), których nie można naśladować za pomocą modeli in vitro . Chociaż istnieje kilka prac, które opisują wyniki uzyskane przy użyciu immunoterapii podjęzykowej, szczegółowe metody postępowania w zakresie podawania podjęzykowego nie zostały jeszcze udostępnione. Ponadto model może być wykorzystany do oceny szczepionek podjęzykowych mających na celu zapewnienie ogólnoustrojowej i miejscowej ochrony dróg oddechowych.
Jak pokazano na załączonym filmie, podjęzykowe podawanie związków jest prostą procedurą, którą można łatwo wykonać bez konieczności intensywnego szkolenia. Zazwyczaj osoba biegła w obchodzeniu się ze zwierzętami będzie potrzebować 1 godziny na wykonanie SLIT w grupie 10 myszy przy użyciu środków znieczulających do wstrzykiwań, jak opisano w tym protokole. Jeśli wykonywana jest również prowokacja pneumokokowa, potrzeba dodatkowych 90 minut na przygotowanie zawiesiny bakteryjnej i przeprowadzenie prowokacji donosowej zwierząt.
Przedstawione tu protokoły FACS pozwalają na wygodną charakterystykę wpływu SLIT na lokalne miejsce podania, drenaż węzłów chłonnych, a także ich wpływ na dynamikę komórek płuc.
Oddzielna analiza treści oskrzelowo-pęcherzykowej i miąższu płuc jest ważna dla odróżnienia typów komórek immunologicznych rezydujących i naciekających drogi oddechowe od tych, które pozostają w tkance. Analiza zawartości BAL pozwala na badanie obrotu makrofagów pęcherzykowych, a także dynamiki rekrutacji komórek do przestrzeni pęcherzykowych indukowanej różnymi zabiegami, np. PMN, eozynofilami, monocytami. BAL może być również stosowany do oceny obecności wydzielanych cytokin i chemokin za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) lub wykrywania wydzielanych przeciwciał IgA wywołanych po szczepieniu podjęzykowym. Badania tkanki płuc pozwolą na scharakteryzowanie innych typów komórek, klasycznie komórek dendrytycznych, limfocytów T i limfocytów B.
Przygotowanie próbek BAL i węzłów chłonnych do analizy FACS jest proste. Po pobraniu próbki zwykle potrzeba 60 minut, aby wypełnić protokół barwienia dla 10-20 próbek. Natomiast izolacja komórek z płuc lub tkanki podjęzykowej będzie wymagała więcej czasu, ponieważ wymagane jest trawienie macierzy zewnątrzkomórkowej. Wchłanianie środka terapeutycznego dostarczanego drogą podjęzykową można rozwiązać poprzez śledzenie cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie lub radioaktywnie za pomocą systemów obrazowania in vivo .
Immunoterapia podjęzykowa jest atrakcyjną metodą skutecznego wywoływania odpowiedzi immunologicznej w drogach oddechowych, a także ogólnoustrojowo, która może być stosowana w leczeniu lub zapobieganiu chorobom układu oddechowego. Wyjaśnienie mechanizmów determinujących aktywację i tolerancję odpowiedzi immunologicznej w drogach oddechowych po SLIT ma kluczowe znaczenie dla racjonalnego projektowania nowych strategii terapeutycznych, które mogłyby być stosowane samodzielnie lub w połączeniu z dostępnymi terapiami przeciwko różnym chorobom układu oddechowego.

Ogólnym celem tej pracy jest zilustrowanie korzyści płynących z immunoterapii podjęzykowej w leczeniu ostrych infekcji dróg oddechowych (ARI) i przedstawienie zalet tej drogi dostarczania w porównaniu z innymi drogami podawania, a mianowicie donosowo.
ARI powoduje miliony zgonów każdego roku, zwłaszcza u dzieci poniżej piątego roku życia. Streptococcus pneumoniae pozostaje jednym z głównych czynników etiologicznych bakteryjnego zapalenia płuc u niemowląt i osób starszych1,2. Obecnie główne dostępne leczenie opiera się na stosowaniu antybiotyków, ale stale pojawiają się oporne szczepy3,4.
SLIT wywołuje szerokie reakcje na poziomie ogólnoustrojowym, a także śluzówkowym, szczególnie na drogach oddechowych5. Ma udowodnioną skuteczność w walce z infekcją grypą, promując długotrwałą ochronę poprzez wytwarzanie odpowiedzi humoralnych i komórkowych6,7. Ponadto wykazano, że profilaktyczne leczenie lizatami bakteryjnymi podawanymi drogą podjęzykową zmniejszało zaostrzenia przewlekłego obturacyjnego zapalenia oskrzeli u osóbstarszych8 i zapobiegało nawrotom infekcji dróg oddechowych u dzieci9. SLIT jest szeroko stosowany w leczeniu alergii i astmy. Badania kliniczne wykazały nie tylko jego skuteczność w modulowaniu odpowiedzi immunologicznej w drogach oddechowych, ale także jego bezpieczeństwo10. Pomimo rosnącego zainteresowania firm farmaceutycznych i badaczy SLIT, mechanizmy zaangażowane w indukcję odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej po podjęzykowym podaniu związków pozostają niejasne. W ostatnim czasie zwrócono uwagę na mechanizmy promujące tolerancję związaną z odczulaniem alergenów. Zaproponowano, że komórki rezydentne i rekrutowane w błonie śluzowej podjęzykowej, takie jak komórki dendrytyczne i makrofagi, mogą promować tolerancję po SLIT11-13. Komórki dendrytyczne błony śluzowej jamy ustnej mogą promować komórki pomocnicze T wytwarzające IFN-gamma i IL-1011, a także recyrkulować do dystalnej błony śluzowej narządów płciowych i promować limfocyty T CD8 + 14. Jednak niewiele wiadomo na temat wpływu SLIT na komórki wrodzone lub jego zdolności do poprawy usuwania patogenów podczas ostrych infekcji dróg oddechowych.
Naturalna kontrola infekcji pneumokokowej w płucach w dużym stopniu zależy od skutecznej i szybkiej aktywacji lokalnych wrodzonych mechanizmów obronnych. Wcześniej wykazaliśmy, że wzmocnienie wrodzonej odporności płuc przez pojedynczą donosową dawkę flageliny (FliC), agonisty TLR5 i NLRC4, chroni 75-100% myszy poddanych śmiertelnej dawce klinicznego izolatu Streptococcus pneumoniae serotyp 1. Wykazano, że ochrona ta jest zależna od lokalnej rekrutacji komórek GR1 + (prawdopodobnie neutrofili wielojądrzastych, PMN) i nie jest zależna od przeciwciał, limfocytów B lub T15. 
Witelina jest strukturalnym składnikiem wici bakteryjnej. W postaci monomerycznej jest rozpoznawany przez dwa receptory rozpoznawania patogenów (PRR), TLR5, który wyczuwa zewnątrzkomórkowy FliC16 i inflamasom NLRC4 / NAIP5, który wykrywa wewnątrzkomórkową flagelinę17,18. Kiedy FliC jest wykrywany przez PRR, wyzwalana jest ważna reakcja zapalna. My i inni wykazaliśmy, że wkroplenie oczyszczonego FliC z Salmonella enterica serowar Typhimurium do płuc napędza szybką produkcję chemokin i cytokin, zwłaszcza gdy są rozpoznawane przez nabłonek płuc, które z kolei koordynują rekrutację komórek odpornościowych do dróg oddechowych, głównie PMN15,19-21. Chociaż przemijające, znaczne naciek neutrofili, który ma miejsce w drogach oddechowych po dostarczeniu FliC do nosa, może stanowić problem w przypadku przejścia na terapie kliniczne do stosowania u ludzi. Nadmierny stan zapalny może być szkodliwy dla funkcji płuc. Ponadto wykazano, że donosowe dostarczanie cząsteczek immunostymulujących może powodować paraliż twarzy i/lub toksyczne działanie na mózg22-24. 
Immunoterapia podjęzykowa oferuje bezpieczniejszą alternatywę dla modulacji odpowiedzi immunologicznej w drogach oddechowych w porównaniu do drogi donosowej. Jest nieinwazyjny, bezbolesny, prosty i dobrze przestrzega zaleceń pacjenta25. Ponadto, jak wspomniano wcześniej, może indukować reakcje ochronne w błonie śluzowej dróg oddechowych bez ryzyka związanego z bezpośrednim podawaniem preparatów donosowo lub dopłucnie. Droga podjęzykowa może być alternatywnie wykorzystana do dostarczania cząsteczek, które mają doskonały wpływ na układ odpornościowy płuc, ale udowodniono, że są toksyczne lub wywołują silny stan zapalny, gdy są podawane donosowo. Oprócz tych zalet, preparaty do immunoterapii podjęzykowej mają niższe koszty produkcji, ponieważ niesterylne produkty mogą być dostarczane tą drogą, a wstrząs endotoksyczny nie stanowi problemu dla SLIT. Z drugiej strony warto zauważyć, że do wywołania odpowiedzi immunologicznej w płucach konieczne są wyższe dawki związków immunostymulujących w porównaniu z tymi stosowanymi drogą donosową lub pozajelitową; również w przypadku korzystania z mysiego modelu SLIT potrzebne są wysoce skoncentrowane roztwory, ponieważ miejsce anatomiczne, w którym osadzane są preparaty, jest małe. 
Na podstawie naszych wcześniej opublikowanych danych, opracowaliśmy model ochrony za pomocą immunoterapii podjęzykowej z flageliną jako modelowym immunostymulantem. Wykazaliśmy, że pojedyncza dawka flageliny indukowała 60% przeżycia przed inwazyjnym pneumokokowym zapaleniem płuc wywołanym przez szczep serotypu 1, podczas gdy wszystkie myszy w grupie kontrolnej zmarły z powodu infekcji w ciągu 5 dni. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że większa liczba PMN jest rekrutowana do dróg oddechowych zwierząt chronionych po podjęzykowym leczeniu flageliną, co sugeruje, że komórki te mogą być zaangażowane w mechanizm ochrony indukowany przez immunoterapię podjęzykową. 
Ten film pokazuje szczegółowo, jak przeprowadzić immunoterapię podjęzykową, a także jak odzyskać odpowiednią tkankę z błony śluzowej podjęzykowej, drenując węzły chłonne, a także płuca i drogi oddechowe w celu przeprowadzenia dalszej analizy. Dodatkowo ilustruje ogólną technikę przygotowania komórek do analizy FACS i pokrótce pokazuje, jak przygotować zawiesiny Streptococcus pneumoniae oraz jak przeprowadzić infekcje donosowe u myszy w celu skonfigurowania modelu ostrej infekcji.

<table><tbody><tr><td>Roztwór ketaminy (50 mg/ml)</td><td>Pharma Service, Urugwaj</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Xilacine (2%)</td><td>Portinco S.A., Urugwaj</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylna strzykawka 1 ml</td><td>Modern, Urugwaj</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylna igła 27 G</td><td>Nowoczesna, Urugwaj</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>General Electric Health Care</td><td>E15885</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>ATCC</td><td>302020</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny/streptomycyny</td><td>SIGMA</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny PBS bez Ca2+/Mg2+</td><td>PAA</td><td>H21002</td><td></td></tr><tr><td>Type-I Collagenase</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I (DNAse-I)</td><td>SIGMA</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>Dispaza</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 sprzężony szczur anty mysz IgG2b anty CD11b</td><td>550993</td><td></td><td>Clone M1/70</td></tr><tr><td>APC sprzężony chomik anty mysz IgG1 anty CD11c</td><td>BD</td><td>550261</td><td>Klon HL3&nbsp;</td></tr><tr><td>APC-Cy7 sprzężony szczur anty mysi IgG2a anty Ly6G</td><td>BD</td><td>560600</td><td>Klon 1A8</td></tr><tr><td>Sterylny roztwór soli</td><td>fizjologicznej Laboratorio Farmaco Urugwaj, Urugwaj</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptyczny agar sojowy</td><td>BD Difco, Francja</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>Defibrynowana krew owcza</td><td>Biokey, Urugwaj</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne szalki Petriego</td><td>Greiner</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>p10 Pipeta</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>p20 Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3120000097</td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipeta</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipeta</td><td>Capp</td><td>C200</td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3120000062</td><td></td></tr><tr><td>sterylne końcówki filtrujące p10</td><td>Greiner</td><td>771288</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne końcówki filtrujące p200</td><td>Greiner</td><td>739288</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne końcówki filtrujące p1000</td><td>Greiner</td><td>750288</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>BIOSAN</td><td>V1-plus</td><td></td></tr><tr><td>Szczypce z cienką końcówką ze stali nierdzewnej&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>Z168785/Z168777</td><td>Zakrzywione i proste</td></tr><tr><td>Kleszczyki do tkanek opatrunkowych</td><td>SIGMA</td><td>F4392</td><td>Długość 8 cali</td></tr><tr><td>Kleszcze do mikropreparacji</td><td>SIGMA</td><td>F4017</td><td>Proste&nbsp;</td></tr><tr><td>Kleszczyki mikropreparacyjne</td><td>SIGMA</td><td>F4142&nbsp;</td><td>zakrzywiony</td></tr><tr><td>Nożyczki majonezowe</td><td>SIGMA</td><td>Z265993&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>SAKIRA MEDICAL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylny dziurkacz do biopsji i Oslash; 3mm</td><td>Stiefel Laboratories Ltd.</td><td>2079D</td><td>Średnica 5 mm może być również używana</td></tr><tr><td>Sterylne probówki 1,5 ml</td><td>Deltalab</td><td>200400P</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne 15 ml Probówki</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne 50 ml Probówki</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pipety serologiczne 5 ml</td><td>Greiner</td><td>606160</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pipety serologiczne 10 ml</td><td>Greiner</td><td>607160</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pipety serologiczne 25 ml</td><td>Greiner</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego, klasa II</td><td>Thermo Scientific</td><td>seria 1300, typ A2</td><td></td></tr><tr><td>Mikroizolator&nbsp; Stojak</td><td>RAIR&nbsp; IsoSystem&nbsp;</td><td>76144W</td><td>Super&nbsp; Mysz&nbsp; 1800 Strefa AllerZone&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrowirówka z chłodzeniem</td><td>Mikrowirówka Eppendorf</td><td>Legend Micro 21R</td><td></td></tr> Wirówka <tr><td></td><td>Heraeus</td><td>Biofuge-pico</td><td></td></tr><tr><td>Termo</td><td>Scientific</td><td>Sorval ST40R</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2&nbsp;</td><td>Model Thermo Scientific</td><td>&nbsp; 3111</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne Pipety Pasteura z cienką końcówką</td><td>Deltalab</td><td>D210022</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pipety Pasteura</td><td>Deltalab</td><td>200007</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna płytka 24-dołkowa</td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek - Countess</td><td>Life Technologies</td><td>C10227&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka komory do liczenia komórek Countess</td> Life <td>Technologies</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do cytometrii przepływowej</td><td>BD</td><td>343675</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy - FACS Canto-II</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrument do PCR w czasie rzeczywistym - Rotor Gene Q lub ABI 7900</td><td>Qiagen / Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>Molekularny Biologia klasy</td></tr><tr><td>DNAse-I</td><td>Life Technologies</td><td>18068-015</td><td>Biologia molekularna klasy</td></tr><tr><td>DNAse-I Bufor 10X</td><td>Life Technologies</td><td>18068015</td><td>Biologia molekularna Klasa</td></tr><tr><td>EDTA 25 mM</td><td>Life Technologies</td><td>18068015</td><td>Biologia molekularna klasy</td></tr><tr><td>Ultra-Pure Water</td> Life <td>Technologies</td><td>10977</td><td>Biologia molekularna klasy</td></tr><tr><td>RNAse Out</td><td>Life Technologies</td><td>100000840</td><td>Biologia molekularna</td></tr><tr><td>Klasyfikacja Losowe startery heksamerowe</td><td>Life Technologies</td><td>N8080127</td><td>Biologia molekularna Klasa</td></tr><tr><td>M-MLV-RT bufor</td><td>Life Technologies</td><td>18057-018</td><td>Biologia molekularna Klasa</td></tr><tr><td>M-MLV-RT enzime</td><td>Life Technologies</td><td>28025-021</td><td>Biologia molekularna Grade</td></tr><tr><td>QuantiTect Syber Green PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>204143</td><td>Podstawy specyficzne dla klasy z biologii molekularnej</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Technologie</td><td></td> życiowe <td>Biologia molekularna Klasa</td></tr></tbody></table>

immunoterapia podjęzykowa jako alternatywa dla indukowania ochrony przed ostrymi infekcjami dróg oddechowych

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Droga podjęzykowa jest szeroko stosowana do dostarczania małych cząsteczek do krwiobiegu i modulowania odpowiedzi immunologicznej w różnych miejscach. Wykazano, że skutecznie indukuje odpowiedzi humoralne i komórkowe w miejscach ogólnoustrojowych i śluzówkowych, a mianowicie w płucach i drogach moczowo-płciowych. Szczepienie podjęzykowe może sprzyjać ochronie przed infekcjami dolnych i górnych dróg oddechowych; Może również promować tolerancję na alergeny i łagodzić objawy astmy. Modulacja odpowiedzi immunologicznej płuc za pomocą immunoterapii podjęzykowej (SLIT) jest bezpieczniejsza niż bezpośrednie podawanie preparatów drogą donosową, ponieważ nie wymaga dostarczania potencjalnie szkodliwych cząsteczek bezpośrednio do dróg oddechowych. W przeciwieństwie do dostarczania donosowego, skutki uboczne obejmujące toksyczność mózgu lub paraliż twarzy nie są promowane przez SLIT. Mechanizmy immunologiczne leżące u podstaw SLIT pozostają nieuchwytne, a jego zastosowanie w leczeniu ostrych infekcji płuc nie zostało jeszcze zbadane. W związku z tym konieczne jest opracowanie odpowiednich modeli zwierzęcych SLIT w celu dalszego zbadania jego potencjalnych zalet. 
Ta praca pokazuje, jak wykonywać podjęzykowe podawanie środków terapeutycznych myszom, aby ocenić ich zdolność do ochrony przed ostrym pneumokokowym zapaleniem płuc. Przedstawiono techniczne aspekty postępowania z myszami podczas inokulacji podjęzykowej, precyzyjną identyfikację błony śluzowej podjęzykowej, drenaż węzłów chłonnych i izolację tkanek, płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i płuc. Szczegółowo opisano protokoły przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki do analizy FACS. Omówiono inne dalsze zastosowania do analizy odpowiedzi immunologicznej. Wyjaśniono również techniczne aspekty przygotowania inokulum Streptococcus pneumoniae i donosowego prowokacji myszy.
SLIT to prosta technika, która pozwala na badanie przesiewowe potencjalnych cząsteczek w celu modulacji odpowiedzi immunologicznej płuc. Parametry wpływające na powodzenie SLIT są związane z wielkością cząsteczki, podatnością na degradację i stabilnością wysoko skoncentrowanych formulacji.

Immunoterapię podjęzykową można z sukcesem wykorzystać do modulowania odpowiedzi immunologicznej płuc. Wykazaliśmy, że pojedyncza dawka flagelliny, agonisty TLR5 i NLRC4, może indukować znaczący wzrost poziomu mRNA kodującego chemokiny CXCL1, CCL20 oraz cytokinę IL-6 w porównaniu z kontrolami traktowanymi solą fizjologiczną. Krotność indukcji poziomów mRNA osiągnęła szczyt 8 h po SLIT i powróciła do poziomów podstawowych po 20 hr (Rycina 1). Jednakże, gdy SLIT przeprowadzono 2 hr przed infekcją donosową S. pneumoniae, poziomy mRNA Cxcl1 i Il6 pozostawały znacząco podwyższone nawet 24 hr po SLIT w porównaniu z zwierzętami nieleczonymi (Rycina 2).
Analiza populacji komórek w BAL i tkance płucnej za pomocą FACS wykazała, że u zwierząt leczonych FliC podawanym drogą podjęzykową zwiększona była liczba neutrofili w drogach oddechowych, ale nie w tkance płuc (Rycina 3).
Na koniec porównano przeżywalność po ekspozycji na pneumokoki u zwierząt, którym wcześniej podano FliC drogą podjęzykową, oraz w grupie kontrolnej otrzymującej sól fizjologiczną. Jak pokazano na Rysunku 4, podjęzykowa immunoterapia swoista (SLIT) z użyciem flagelliny zwiększyła ochronę oraz przeżywalność w przebiegu ostrego pneumokokowego zapalenia płuc.
<img alt="Rycina 1" fo:content-width="6.7in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig1highresV2.jpg" width="680" /> 
Rycina 1.&#160;Kinetyka profilu transkrypcyjnego płuc po podjęzykownej immunoterapii flagelliną. Myszy BALB/c w wieku od 8 do 10 tygodni (n=4) poddano leczeniu 10 µg flagelliny lub solą fizjologiczną drogą podjęzykową w znieczuleniu. Płuca pobrano w różnych punktach czasowych i umieszczono w konserwancie do kwasów nukleinowych. Przeprowadzono ekstrakcję całkowitego RNA i zsyntetyzowano cDNA. Poziomy mRNA oceniono za pomocą RT-PCR z wykorzystaniem specyficznych starterów wymienionych w Tabeli 1. Kwantyfikację względną wykonano metodą ΔCt, wykorzystując poziomy mRNA Actb do normalizacji. Wyniki przedstawiono jako krotność wzrostu w porównaniu z grupą leczoną solą fizjologiczną jako mediana±SEM. Gwiazdki oznaczają różnice statystycznie istotne (p &#60; 0.05) obliczone zgodnie z testem Mann-Whitneya. Wyniki są reprezentatywne dla 2 niezależnych eksperymentów.
<img alt="Rycina 2" fo:content-width="6.2in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig2highresV2.jpg" width="660" /> 
Rycina 2.&#160;Profil transkrypcyjny płuc podczas zapalenia płuc wywołanego przez pneumokoki po podjęzykowej immunoterapii flagelliną. Myszy BALB/c w wieku od 8 do 10 tygodni (n=4 dla grupy kontrolnej i n=7 dla grupy leczonej) otrzymywały 10 µg flagelliny lub soli fizjologicznej drogą podjęzykową w znieczuleniu. 2 hr później myszy zostały poddane ekspozycji drogą donosową na minimalną dawkę śmiertelną (MLD), powodującą 100% śmiertelność, izolat kliniczny S. pneumoniae serotypu 1 E1585, odpowiadający 4x105 CFU/50 µl. Płuca pobrano 24 hr po ekspozycji i przechowywano w konserwancie do kwasów nukleinowych do czasu przeprowadzenia ekstrakcji RNA i syntezy cDNA. Wykonano PCR w czasie rzeczywistym (zob. lista starterów w Tabeli 1), a kwantyfikację względną przeprowadzono zgodnie z metodą ΔCt, wykorzystując poziomy mRNA Actb do normalizacji. Wyniki przedstawiono jako krotność wzrostu w porównaniu z grupą leczoną solą fizjologiczną jako mediana±SEM. Gwiazdki oznaczają różnice istotne statystycznie (p &#60; 0.05) obliczone zgodnie z testem Mann-Whitneya.
<img alt="Rysunek 3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig3highresV2.jpg" width="680" /> 
Rysunek 3.&#160;Analiza rekrutacji neutrofili polimorfojądrowych (PMN) do tkanki płuc i dróg oddechowych po SLIT. Myszy BALB/c w wieku od 8 do 10 tygodni (n=4) poddano podjęzykownej aplikacji 10 µg flagelliny lub soli fizjologicznej w znieczuleniu. Po 2 hr myszy poddano wyzwaniu drogą donosową przy użyciu MLD S. pneumoniae serotypu 1 E1585. 24 hr po wyzwaniu przeprowadzono BAL, a płuca przygotowano do analizy FACS. PMN zidentyfikowano jako komórki Ly6Ghigh/CD11bhigh/CD11cnegative oraz na podstawie profilu FCS-SSC. Wyniki przedstawiono jako procent PMN w stosunku do całkowitej liczby komórek w BAL lub płucach. Słupki reprezentują medianę±SEM. Gwiazdki oznaczają różnice istotne statystycznie (p &#60; 0.05) obliczone zgodnie z jednoczynnikowym testem Manna-Whitneya.
<img alt="Rycina 4" fo:content-width="5.3in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig4highresV2.jpg" width="530" /> 
Rycina 4.&#160;SLIT z użyciem flagelliny chroni myszy przed ostrą pneumokokowym zapaleniem płuc. Myszy BALB/c w wieku od 8 do 10 tygodni (n = 8) poddano leczeniu podjęzykowemu z zastosowaniem 10 µg flagelliny lub soli fizjologicznej w znieczuleniu. Po 2 h myszy zainfekowano donosowo dawką MLD S. pneumoniae serotypu 1 E1585. Przeżywalność oceniano codziennie. Krzywe Kaplana-Meiera porównano za pomocą testu Log-rank (Mantel-Cox). Gwiazdki oznaczają różnice istotne statystycznie (p &#60; 0.05). Wyniki są reprezentatywne dla 2 niezależnych eksperymentów.
<table align="center" border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody align="center">
		<tr>
			<td>Nazwa</td>
			<td>Sekwencja 5’-3’</td>
			<td>Długość produktu PCR (bp)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mB-actin_F</td>
			<td>GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT</td>
			<td rowspan="2">68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mB-actin_R</td>
			<td>CGTCATCCATGGCGAACTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCCL20_F</td>
			<td>TTTTGGGATGGAATTGGACAC</td>
			<td rowspan="2">69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCCL20_R</td>
			<td>TGCAGGTGAAGCCTTCAACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCXCL1_F</td>
			<td>CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA</td>
			<td rowspan="2">84</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCXCL1_R</td>
			<td>ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIL-6_F</td>
			<td>GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA</td>
			<td rowspan="2">78</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIL-6_R</td>
			<td>AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTNFalpha_F</td>
			<td>CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA</td>
			<td rowspan="2">63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTNFalpha_R</td>
			<td>CCTCCACTTGGTGGTTTGCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCxcl2_F</td>
			<td>CCCTCAACGGAAGAACCAAA</td>
			<td rowspan="2">72</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCxcl2_R</td>
			<td>CACATCAGGTACGATCCAGGC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1.&#160;Lista starterów użytych do analizy real-time PCR. Specyficzne sekwencje starterów użyte do analizy qPCR. Startery forward i reverse dla mysich genów actb, Cccl20, Cxcl1, Il6, Tnfa oraz Cxcl1 przedstawiono jako sekwencje 5’-3’, a oczekiwana długość produktu została podana w parach zasad (bp).

Obecna praca ilustruje wygodę stosowania immunoterapii podjęzykowej w celu wzmocnienia wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w płucach i zapewnienia ochrony przed ostrym pneumokokowym zapaleniem płuc u myszy.

Immunoterapia podjęzykowa jako alternatywa dla indukowania ochrony przed ostrymi infekcjami dróg oddechowych

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Ogólnym celem tej procedury jest zastosowanie immunoterapii podjęzykowej w celu wzmocnienia wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w płucach i komfortowej ochrony przed śmiertelnym pneumokokowym zapaleniem płuc. U myszy pierwszym krokiem jest podanie roztworu ze środkiem immunostymulującym flag do błony śluzowej podjęzykowej znieczulonej myszy. Następnie zawiesina zawierająca śmiertelną dawkę genowego szczepu streptococcus pneumonia jest wkraplana przez korzeń donosowy znieczulonym myszom, które wcześniej były leczone flatline lub solą fizjologiczną jako kontrola.Broncho bilar lage wykonuje się w celu analizy subpopulacji naciekającej drogi oddechowe, a tkanka płucna jest przetwarzana w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki w celu fenotypowej charakterystyki populacji komórek. Za pomocą wieloparametrycznej cytometrii przepływowej żuchwy można również przetworzyć dodatkowe węzły chłonne żuchwy, a także tkankę podjęzykową w celu przeprowadzenia cytometrii przepływowej lub innej dalszej analizy. Populacje komórek infiltrujących drogi oddechowe.Płuca lub błonę śluzową podjęzykową można zidentyfikować za pomocą fenotypowania immunologicznego i wieloparametrycznej cytometrii przepływowej Aktywacja immunologiczna w różnych tkankach po immunoterapii podjęzykowej może być również analizowana, badając profil transkrypcji za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Witamy w Laboratorium Badań nad Szczepionkami na Wydziale Biotechnologii, przydzielamy szkołę medyczną Uniwersytetu U.Jednym z głównych zainteresowań naszego laboratorium jest generowanie nowych strategii interwencji immunologicznej przeciwko infekcjom dróg oddechowych. Droga międzynosowa jest z powodzeniem stosowana do dostarczania środków immunostymulujących w leczeniu lub zapobieganiu infekcji płuc lub innej teologii.Wykazaliśmy, że podawanie donosowe, składnik żelu bakteryjnego, może być skutecznie stosowany do przerwania trwającej infekcji płuc wywołanej przez myszy STO. Chociaż korzeń donosowy zwykle wymaga małej dawki środka terapeutycznego i wywołuje silną odpowiedź w drogach oddechowych, ma pewne wady, takie jak możliwość toksyczności ośrodkowego układu nerwowego i paraliżu powięzi związanego z wchłanianiem związków immunostymulujących przez nerwy oratorskie. W związku z tym opracowaliśmy model immunoterapii UAL jako alternatywę dla indukowania odporności ochronnej przed pneumokokowym zapaleniem płuc.Immunoterapia podjęzykowa stanowi bezpieczniejszą alternatywę w porównaniu z instalacją donosową. Jest nieinwazyjny, bezbolesny i prosty. Chociaż może wymagać większych dawek środka terapeutycznego, może być stosowany do dostarczania NA lub produktów farmaceutycznych, aby ostatecznie modulować odpowiedź immunologiczną na długość.Pokażemy Ci teraz, jak wykonać podawanie podjęzykowe u myszy przy użyciu pochlebnego środka terapeutycznego. Immunoterapia subinowa o pochlebnym działaniu może ostatecznie chronić myszy przed śmiertelnym prowokacją donosową z paciorkowcowym zapaleniem płuc poprzez wywołanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w płucach. Zajmiemy się również charakterystyką długości, odpowiedzi wrodzonej podczas infekcji i po immunoterapii podjęzykowej przy użyciu płynnej geometrii i PCR w czasie rzeczywistym.Na koniec pokażemy Ci, jak pobrać miejscowe ziarniste węzły chłonne i tkankę podjęzykową do dalszej analizy. Po przygotowaniu roztworu środka pobudzającego, który ma być badany, należy znieczulić zwierzęta, podając 200 mikrolitrów roztworu Ketaminy OSI metodą wstrzyknięcia międzyotrzewnowego Pet roztworu zawierającego immunostymulator w maksymalnej objętości 10 mikrolitrów. Następnie chwyć mysz lewą ręką i przytrzymaj ją kciukiem i palcem wskazującym wolną ręką.Delikatnie umieść zamknięte kleszcze pod językiem i przytrzymaj go na miejscu. Palcem środkowym i serdecznym weź pipetę i nanieś roztwór na dno jamy ustnej i grzbietową stronę języka. Usuń kleszcze i pozwól ustom odpocząć przez trzy do pięciu minut przed włożeniem go z powrotem do klatki.Kluczowymi cechami tej techniki są całkowita objętość użyta do leczenia zwierząt i znieczulenia. Mały rozmiar myszy w jamie ustnej ogranicza maksymalną objętość, jaką można zastosować do stosunku podjęzykowego do 10 mikrolitrów. Po ustaleniu dawki należy dostosować stężenie próbki do tej maksymalnej objętości.Większe objętości mogą spowodować niepożądane połknięcie lub aspirację roztworu. Znieczulenie ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć połknięcia i umożliwić przenikanie substancji przez nabłonek. Radzimy nie stosować inhalacji do znieczulenia, ponieważ myszy obudzą się zbyt wcześnie.Należy pamiętać, że niektóre środki znieczulające do wstrzykiwań mogą wywoływać ślinotok u myszy. Jeśli tak się stanie, użyj małego kawałka papieru lub papieru, aby wyeliminować nadmierne ślinotok przed nałożeniem roztworu ze środkiem terapeutycznym, dawkę środka terapeutycznego należy dostosować, aby zmaksymalizować jego działanie i zdecydowanie zaleca się przetestowanie kilku dawek. Jeśli wcześniej stosowałeś swój związek donosowo, dawka od pięciu do 10 razy wyższa byłaby dobrym punktem wyjścia do przetestowania.Przetestuj swój środek terapeutyczny za pomocą korzenia podjęzykowego. Należy zauważyć, że wchłanianie przez nabłonek będzie ograniczone przez Wielkość cząsteczki rozmrożenia Podwielokrotność wcześniej przygotowanego materiału roboczego paciorkowca zapalenia płuc znanego bakteryjnego numeru CFU wirować przez pięć minut przy 2, 500 Gs i wyrzucić supernat Zawiesić w jednym mililitrze soli fizjologicznej i wirówkę. Ponownie wyrzuć supernatant, a następnie odpocznij.Zawiesić osad w odpowiedniej objętości sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aby uzyskać zawiesinę cztery razy 10 do pięciu CFU w 50 mikrolitrach, co odpowiada minimalnej dawce bakteryjnej użytego serotypu cząstek, która powoduje 100% śmiertelność w cebulce C. Myszy pobierają 50 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej i ostrożnie wkraplają całkowitą objętość do nozdrzy wcześniej znieczulonej myszy. Trzymaj mysz pionowo przez dwie minuty i pozwól jej spoczywać w pozycji grzbietowej przez kolejne dwie minuty. Po prowokacji potwierdź numery CFU w zawiesinie bakteryjnej, wykonując seryjne dziesięciokrotne rozcieńczenie zawiesiny i naniesiono je na krew.Płytka agarowa Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni z 5% CO2 muco. Kolonie etno można odróżnić po zielonym alo charakterystycznym dla bakterii alfa hemolitycznych. Policz jednostki tworzące kolonie i zarejestruj użycie dawki prowokacyjnej.Po eutanazji zwierzęcia należy otworzyć klatkę piersiową aż do szyi. Wykonaj nacięcie wzdłuż przednich nóg, aby odsłonić tchawicę i obszar podjęzykowy. Zidentyfikuj węzły chłonne żuchwy.Zwykle pojawiają się one jako biało-owalne struktury znajdujące się nad gruczołami ślinowymi. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką delikatnie pociągnij tkankę podjęzykową i odsłoń grzbietową stronę dna jamy ustnej. Weź węzły chłonne żuchwy, delikatnie pociągając do góry cienkimi kleszczami rdzeniowymi, aby uwolnić je z tkanki.Umieść je w probówce zawierającej C-R-P-M-I lub roztwór konserwujący kwas nukleinowy zgodnie z dalszą procedurą. Miało to zostać przeprowadzone później. Teraz zidentyfikuj mniejsze węzły chłonne znajdujące się głębiej po obu stronach gardła i wyjmij je.Są to dodatkowe węzły chłonne żuchwy. Otwórz klatkę piersiową, aby odsłonić płuco i usunąć grasicę. Przeciąć dolną binna CVA i usunąć nadmiar krwi za pomocą tkanki chłonnej, aby wykonać płukanie oskrzeli.Najpierw odsłoń tchawicę. Następnie wykonaj małe nacięcie skalpelem i wprowadź cienką końcówkę. Przenieś peppe uprzednio wypełniony jednym mililitrem PBS bez wapnia i magnezu plus jeden milimolowy EDA Ostrożnie wkraść i odessać całkowitą objętość co najmniej trzy razy.Następnie odessać i przenieść zawiesinę komórkową do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Perfuzja płuc polega na wstrzyknięciu pięciu mililitrów PBS bez wapnia i magnezu oraz jednego milimolowego EDTA do prawej komory serca, aby wyeliminować wszystkie czerwone krwinki i komórki odpornościowe obecne w naczyniach krwionośnych płuc. Jeśli perfuzja została wykonana prawidłowo, kolor płuc zmieni się z różowego na biały.Usuń serce, weź płuca perfuse i umieść je w kompletnym roztworze konserwującym lub roztworze konserwującym kwasy nukleinowe, w zależności od dalszej analizy, która ma być przeprowadzona. Jeśli chcesz przeanalizować populację komórek w błonie śluzowej podjęzykowej, odizoluj głowę zwierzęcia i usuń gruczoły ślinowe i przymocuj tkankę miękką. Wykonaj nacięcie po każdej stronie jamy ustnej, aż dojdziesz do stawu żuchwowego i oddziel dolną szczękę wraz z językiem i dnem jamy ustnej.Używając pary kleszczy do zębów szczura, podciągnij język i wykonaj nacięcie w miejscu, w którym podstawa języka styka się z dnem jamy ustnej. Obszar ten stanowi błonę śluzową podjęzyka. Wytnij i usuń język za pomocą stempla do biopsji, kleszczy i nożyczek.Wytnij tkankę błony śluzowej podjęzykowej i umieść ją w czystej probówce. Przenieś płuca na 24-dołkową płytkę i oznacz je czystymi nożyczkami. Dodać jeden mililitr pożywki wytrawiającej, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół i inkubować w temperaturze 37 stopni i 5% CO2 przez 40 minut po inkubacji.Ponownie pipetuj w górę i w dół, aby upewnić się, że większość komórek została uwolniona z tkanki. Przenieś zawiesinę komórek na sitko o siatce 40 mikro i przemyj pięcioma mililitrami PBA. Pięciomilimolowa wirówka EDTA przy 2 500 GS pięć minut.Reus zawiesił komórki w jednym mililitrowym faksie EDTA złożonym z PBS bez wapnia, magnezu, jednego milimolowego EDTA i 1% płodowej surowicy boinga. Weź QU i wykonaj dwukrotne rozcieńczenie komórek za pomocą trip i blue i policz Reus, zawiesić komórki do stężenia dwa razy 10 do siedmiu komórek na mililitr i dodać 50 mikrolitrów na probówkę. Dodaj 50 mikrolitrów dwukrotnej mieszanki przeciwciał do każdej probówki w celu analizy immunofenotypowej.Inkubować przez 30 minut na lodzie w ciemności po trzykrotnym umyciu faktami. EDTA ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach faktów EDTA i przeanalizować w cytometrze Ta sama procedura może być wykorzystana do analizy populacji komórek w tkance podjęzykowej przy użyciu pożywki trawiącej zawierającej tę przestrzeń. Kolagenaza i DS jedna immunoterapia podjęzykowa przy użyciu oczyszczonej flatline, agonisty TLR 5 i LC 4, indukowały znaczną regulację w górę poziomów mRNA chemokin i cytokin zaangażowanych w rekrutację neutrofili w płucach.Obserwowano to również podczas infekcji. Rekrutację PMN do płuc potwierdzono cytometrią przepływową. Leczenie podjęzykowe pięcioma agonistami receptora TLR korelowało ze zwiększoną przeżywalnością zwierząt i ochroną przed pneumokokowym zapaleniem płuc.Wykazaliśmy, że immunoterapia podjęzykowa jest skutecznym sposobem na wywołanie ochrony w liniach przed inwazyjnym pneumokokowym zapaleniem płuc PNE. Udało się to osiągnąć dzięki podjęzykowej instalacji lain, krawieckiego agonisty, który nie jest wytwarzany przez zapalenie płuc. Podjęzykowa instalacja leżąca indukowała regulację w górę chemokiny C Xcl L w liniach, a także infiltrację neutrofili.Rodzaj komórek, które mają kluczowe znaczenie dla wyeliminowania immunoterapii podjęzykowej pneumokokami z agonistami TLR, może być stosowany w leczeniu zakażeń samodzielnie lub w połączeniu z obecnymi terapiami, takimi jak antybiotykoterapia, w celu zapobiegania rozprzestrzenianiu się bakterii i rozwojowi ciężkich postaci infekcji. Korzeń podjęzykowy może być również używany do dostarczania szczepionki i wykazano, że jest skuteczny w indukowaniu odporności ochronnej błony śluzowej, a także ogólnoustrojowej. Strategia ta jest szczególnie interesująca w przypadku infekcji dróg oddechowych, a zwłaszcza w przypadku bro pneumonias, ponieważ może nie tylko zapobiec podstawowej chorobie, ale także kolonizacji asal blokującej bakterie w momencie wejścia.Ogólnie rzecz biorąc, uważamy, że droga podjęzykowa jest atrakcyjną alternatywą dla opracowania nowych strategii leczenia lub zapobiegania infekcjom dróg oddechowych. Zachęcamy do wypróbowania tej techniki.

sublingual-immunotherapy-as-an-alternative-to-induce-protection

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Profilaktyczne i terapeutyczne szczepienia często nie stymulują silnej odpowiedzi immunologicznej z powodu tygodniowego drenażu szczepionki do węzłów chłonnych, a w konsekwencji słabego zaangażowania komórek odpornościowych. Poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie szczepionki do węzłów chłonnych, tzw. wstrzyknięcie dolimfatyczne, można znacznie poprawić skuteczność szczepionki i zmniejszyć dawki szczepionki.

Immunoterapia dolimfatyczna i szczepienie u myszy

Intubacja-intubacja dotchawicza (IMIT) jest doskonałą, nieinwazyjną metodą badania chorób układu oddechowego, jak również metodą wkraplania odczynników terapeutycznych bezpośrednio do płuc. Jest to szybka i wysoce powtarzalna metoda, która nadaje się do badań przedklinicznych.

Wkraplanie dotchawicze za pośrednictwem intubacji (IMIT): nieinwazyjny, specyficzny dla płuc system dostarczania

Istnieje ogólny brak wiedzy na temat działania szczepionek. W tym miejscu proponujemy połączone zastosowanie genetyki odwrotnej i chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu uzyskania wglądu we wczesną odpowiedź immunologiczną gospodarza na szczepionki, ze szczególnym uwzględnieniem komórek dendrytycznych i odporności limfocytów T.

Donosowe podawanie rekombinowanych szczepionek przeciw grypie w chimerycznych modelach mysich w celu zbadania odporności błony śluzowej

Demonstrujemy procedurę dotchawniczego inokulacji Haemophilus influenzae do dolnych dróg oddechowych myszy. Jest to bardzo przydatne narzędzie do badania szlaków sygnałowych regulujących stan zapalny dróg oddechowych w modelach mysich.

Dotchawicze podawanie Haemophilus influenzae w modelach mysich w celu zbadania zapalenia dróg oddechowych

Szczegółowo opisujemy metodologię stosowaną do porównania skuteczności ochronnej i odpowiedzi immunologicznej płuc indukowanej przez donosowe i podskórne szczepienie z BCG w modelu mysim. Nasze wyniki pokazują korzyści płynące ze szczepienia płuc i sugerują rolę odpowiedzi za pośrednictwem IL17 w ochronie indukowanej szczepionką.

Skuteczność ochronna i odpowiedź immunologiczna płuc po podaniu podskórnym i donosowym BCG myszom

Opisano przygotowanie antygenowych nanocząsteczek liposomalnych i ich zastosowanie w stymulowaniu aktywacji komórek B in vitro i in vivo. Spójne i silne odpowiedzi przeciwciał doprowadziły do opracowania nowego modelu alergii na orzeszki ziemne. Protokół generowania liposomów antygenowych można rozszerzyć na różne antygeny i modele immunizacji.

Liposomy antygenowe do wytwarzania przeciwciał specyficznych dla choroby

Tutaj prezentujemy elegancki protokół do oceny in vivo skuteczności szczepionki i odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Protokół ten można dostosować do modeli szczepionek, które badają patogeny wirusowe, bakteryjne lub pasożytnicze.

Ocena odpowiedzi gospodarz-patogen i skuteczności szczepionki u myszy

Przedstawiona tutaj jest procedura krok po kroku do wywołania ostrego uszkodzenia płuc u myszy poprzez bezpośrednie wkroplenie lipopolisacharydu dotchawiczego i przeprowadzenie analizy FACS próbek krwi, płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i tkanki płucnej. Minimalna inwazyjność, prosta obsługa, dobra odtwarzalność i miareczkowanie ciężkości choroby to zalety tego podejścia.

Wywoływanie ostrego uszkodzenia płuc u myszy przez bezpośrednie wkroplenie lipopolisacharydów dotchawiczych

Ten artykuł opisuje i demonstruje podawanie szczepionek donosowych oraz pobieranie mleka od królików w okresie laktacji (Oryctolagus cuniculus) jako sposób oceny odporności błony śluzowej w translacyjnie odpowiednim modelu immunizacji matki.

Immunizacja donosowa i pobieranie mleka w badaniach immunizacji matek u białych królików nowozelandzkich (Oryctolagus cuniculus)

W tym badaniu wykazano, że nieinwazyjna technika instylacji tchawicy pozwala na rozwój ALI u szczurów za pomocą podstawowego laryngoskopu, aby zapewnić precyzyjne dostarczanie LPS do płuc. LPS jest wprowadzany za pomocą rurki tchawicowej za pomocą laryngoskopu. Skala uszkodzenia płuc jest oceniana w wielu punktach czasowych.

Nieinwazyjne podanie lipopolisacharydu przez endotchawicę w celu wywołania ostrego uszkodzenia płuc u gryzoni

Poznaj immunoterapię podjęzykową jako bezpieczną metodę wzmacniania odpowiedzi immunologicznej w płucach i ochrony przed zakażeniem Streptococcus pneumoniae u myszy.

Immunoterapia podjęzykowa jako alternatywa dla indukowania ochrony przed ostrymi infekcjami dróg oddechowych

Przeglądaj więcej filmów