Name: Wyprowadzenie komórek progenitorowych serca z embrionalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj metodę wyprowadzania komórek progenitorowych serca z mysich i ludzkich komórek macierzystych embrionalnych przy użyciu cytometrii przepływowej. Protokół ten umożliwia badania w zakresie biologii serca i medycyny regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy dr Leonidowi Gnatovskiy'emu za uważną i krytyczną lekturę artykułu. Prace te były częściowo wspierane przez granty z National Institutes of Health (HL109054) oraz Samuel and Jean Frankel Cardiovascular Center, University of Michigan (Inaugural Fund) dla WZ oraz z Leon H Charney Division of Cardiology, New York University School of Medicine dla BL.

1. Pochodzenie embrionalnych CPC myszy z mysich ESC
<ol>
	<li>Przygotuj warstwę zasilającą mysie fibroblasty embrionalne (MEF).
	<ol>
		<li>Ciepłe podłoże MEF (10% FBS w DMEM) do 37 °C.</li>
		<li>Przygotuj talerze pokryte żelatyną.
		<ol>
			<li>Dodać 1 ml 0,1% żelatyny w wodzie do studzienki na 6-dołkowej płytce lub 5 ml do naczynia o średnicy 10 cm.</li>
			<li>Pozostaw talerze lub naczynia w temperaturze 37 °C lub pokojowej na co najmniej 30 minut. Zasysanie żelatyny przed użyciem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Napromieniowane MEF-y należy szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając.</li>
		<li>Delikatnie przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml lub 50 ml. Dodać 5 ml wstępnie podgrzanego podłoża MEF. Powoli obracaj komórki i odwiruj przy 200 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Zawieś komórki w pożywce MEF i policz żywe komórki. Stosować następujące objętości pożywki MEF: 2 ml dla komórek na basenik z płytki 6-dołkowej i 10 ml dla komórek z naczynia o średnicy 10 cm.</li>
		<li>Umieść komórki w 6-dołkowych płytkach lub 10-centymetrowych szalkach w proporcjach 1-2 x 10:6 na talerz/naczynie.</li>
		<li>Inkubować płytki/szalki MEF w temperaturze 37 °C, 5% CO2 co najmniej 24 godziny przed użyciem. 
		UWAGA: Wyrzuć talerze/naczynia MEF starsze niż tydzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj ESC myszy
	<ol>
		<li>Kultura Isl1-cre; Rosa26YFP/ Mef2c-cre; ESC myszy Rosa26YFP na MEF-ach do 90% zlewa. Użyj pożywki z komórek ES składającej się z 410 ml DMEM, 75 ml FBS, 0,1 mM MEM NEAA, 2 mM L-glutaminy, 0,1 mM pirogronianu, 100 U Pen/Strep i 0,1 mM β-merkaptoetanolu.</li>
		<li>Przygotować 6-dołkowe płytki pokryte żelatyną, jak opisano w ppkt 1.1.2.</li>
		<li>Odessać pożywkę z płytek i przepłukać komórki DPBS.
		<ol>
			<li>Odessać DPBS i dodać 0,4 ml 0,25% trypsyny do jednego dołka na 6-dołkowej płytce. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 5 min. Dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki ES, aby zatrzymać reakcję trypsyny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zebrać komórki i odwirować komórki przy 200 x g i odessać pożywkę. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki ES i policzyć komórki.</li>
		<li>Płytki ESC na płytkach pokrytych żelatyną o gęstości 3 x 104/cm2. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez około 2 dni, gdy ESC osiągną około 90% konfluencji. Zmieniaj medium codziennie.</li>
		<li>Gdy ESC zlewają się w 90%, powtórz kroki 1.2.2-1.2.5, aby całkowicie usunąć podajniki MEF.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukuj różnicowanie CPC poprzez tworzenie EB
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę różnicującą w następujący sposób: 36 ml IMDM, 12 ml F12 Ham's, 2 mM L-glutaminy, 0,34 ml BSA (7,5%), 0,25 ml N2, 0,5 ml B27, 50 μg/ml AA i 0,45 mM 1-tioglicerolu.</li>
		<li>Odessać pożywkę z komórek i spłukać DPBS. Odessać DPBS i dodać 0,4 ml 0,25% trypsyny do jednego dołka na 6-dołkowej płytce. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Dodać 1 ml pożywki różnicującej, aby zatrzymać reakcję i pipetować w górę i w dół, aby rozproszyć skupiska komórek na pojedyncze komórki.</li>
		<li>Odwirować ESC przy 200 x g przez 5 minut i wyrzucić pożywkę.
		<ol>
			<li>Zawiesić 1 x 106 ESC w 1 ml pożywki różnicującej. Policz komórki i pohoduj komórki na płytce Petriego o niskim odłączeniu o stężeniu 1 x 105 komórek/ml w pożywce różnicującej w temperaturze 37 °C do pierwszej agregacji EB.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dwa dni po utworzeniu EB przenieś EB z szalek do probówek o pojemności 50 ml. Wirować z prędkością 200 x g przez 1 min. Usunąć pożywkę i przepłukać EB 10 ml DPBS bez Ca2+ i Mg2+.</li>
		<li>Odessać DPBS i dodać 1 ml 0,25% trypsyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodać 4,5 ml pożywki różnicującej, aby zatrzymać reakcję. Pigazuj w górę iw dół, aby rozdzielić EB na pojedyncze komórki.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki różnicującej.</li>
		<li>Policz komórki i rozcieńcz 2 x 106 komórek do 1 x 105 komórek/ml w pożywce różnicowej. Dodać VEGF, Bmp4 i aktywinę A do pożywki w końcowym stężeniu odpowiednio 5 ng/ml, 0,8 ng/ml i 5 ng/ml. Wyhodować komórki na szalce Petriego w celu wytworzenia drugiej EB w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>40 godzin po drugim utworzeniu EB przenieś EB do probówek o pojemności 50 ml. Raz spłukać DPBS, dysocjować EB za pomocą 1 ml 0,25% trypsyny w temperaturze 37 °C przez 5 min. Pigazuj w górę iw dół, aby rozdzielić EB na pojedyncze komórki.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w pożywce Stempro-34 z 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml bFGF i 12,5 ng/ml FGF10. Umieść komórki w proporcjach 2 x 105/cm2 na płytkach pokrytych żelatyną. Hodowla w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez około 32 godziny przed izolacją CPC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolowanie mCPC
	<ol>
		<li>Odessać podłoże i spłukać DPBS. Dodać 0,5 ml 0,25% trypsyny do płytek hodowlanych w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodać 4,5 ml pożywki różnicującej, aby zatrzymać reakcję. Pigazuj w górę iw dół, aby rozdzielić EB na pojedyncze komórki. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić komórki w 2% FBS/PBS w celu oczyszczenia FACS.</li>
		<li>Uruchomić niezróżnicowane ESC na sortowniku jako kontrolę ujemną. Zmień napięcie, aby dostosować rozproszenie do przodu (FSC) i rozproszenie boczne (SSC), aby wybrać żądaną populację. Użyj rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego oraz wysokości i szerokości rozproszenia do przodu, aby wykluczyć gruz i dublet. W wybranej subpopulacji, zgodnie z rozkładem kontroli ESC, narysuj bramkę YFP dodatnią na histogramie, aby wyeliminować autofluorescencję komórek. Zbieraj CPC YFP+ z bramkowania YFP+.</li>
		<li>Umieszczenie oczyszczonych komórek CPC (YFP+) na płytkach 6-dołkowych z pożywką różnicującą (1.3.1). Hodowla przez dodatkowe 3-5 dni w temperaturze 37 °C w celu różnicowania CPC na kardiomiocyty i SMC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pochodzenie ludzkich embrionalnych CPC z ludzkich ESC
<ol>
	<li>Przygotuj karmniki
	<ol>
		<li>Przygotować warstwę zasilającą mysie fibroblasty embrionalne (MEF), jak opisano powyżej, o gęstości 2 x 104 / cm2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymanie ludzkich EKW
	<ol>
		<li>Utrzymanie ludzkiego ISL1:cre; ESC pCAG-flox-STOP-flox-GFP lub RFP rutynowo na MEF przy użyciu zwykłej pożywki hESC (Knockout DMEM/F-12 385 ml, Knockout SR 100 ml, 2 mM L-glutamina, 0,1 mM NEAA, 0,1 mM β-merkaptoetanol, 10 ng/ml zasadowego FGF). Przed różnicowaniem serca należy przenieść ludzkie ESC w stanie wolnym od karmienia przez co najmniej 2 przejścia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie ludzkich komórek macierzystych w stanie wolnym od karmnika
	<ol>
		<li>Przygotować powlekane płytki do hodowli ludzkich NK.
		<ol>
			<li>Rozmrozić matrigel w temperaturze 4 °C przez noc. Umieść probówkę o pojemności 50 ml na lodzie i dodaj do niej 30 ml zimnej pożywki DMEM/F12.</li>
			<li>Dodaj 1 ml matrigelu do zimnego podłoża i dobrze wymieszaj. Dodać 1 ml zimnego podłoża matrigel-DMEM/12 do dołka na płytce 6-dołkowej lub 5 ml do naczynia o średnicy 10 cm.</li>
			<li>Pozostawić talerze/naczynia w temperaturze 4 °C na noc lub w temperaturze pokojowej na 2 godziny. Przed użyciem należy odessać pożywkę.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Rozdrobnij ludzkie ESC na płytki: Odessać pożywkę z płytki MEF i przepłukać ludzkie ESC DPBS. Następnie dodać 1 ml dypazy (1 mg/ml) do dołka z płytką 6-dołkową. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, aż brzegi kolonii zaczną się odłączać.</li>
		<li>Usunąć roztwór do usuwania pazy. Dwukrotnie przepłukać DPBS, a następnie dodać do płytki 2,5 ml/dołek pożywki mTeSR lub pożywki kondycjonowanej MEF.</li>
		<li>Zeskrob komórki za pomocą skrobaka do komórek i ostrożnie pipetuj w górę iw dół, aby rozbić ludzkie kolonie ESC na małe grudki.</li>
		<li>Przenieść grudki ESC i rozcieńczyć w stosunku 1:3 do powlekanych płytek.</li>
		<li>Dodać 2 ml/dołek pożywki mTeSR lub pożywki kondycjonowanej MEF i codziennie zmieniać pożywkę.</li>
		<li>Hodowla ludzkich komórek macierzystych w pożywce mTeSR lub pożywce kondycjonowanej MEF na powlekanych płytkach przez co najmniej 2 pasaże.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukuj różnicowanie CPC od ludzkich EKM
	<ol>
		<li>Gdy komórki są zlewające się w ~90%, odessać pożywkę i spłukać DPBS. Następnie inkubować hESC w 0,5 mg/ml Dypazę w temperaturze 37 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Przepłukać hESC dwukrotnie DPBS, usunąć komórki z płytek za pomocą podnośnika komórek, a następnie ponownie zawiesić klamry komórkowe w pożywce różnicującej (DMEM/F12 zawierającej 18% FBS, 0,1 mM NEAA, 2 mM L-glutaminy, 0,1 mM β-merkaptoetanolu i 50 μg/ml kwasu askorbinowego).</li>
		<li>Przenieś komórki do 6-dołkowych płytek o bardzo niskim nakładzie w celu utworzenia EB.</li>
		<li>Zmień medium różnicujące następnego dnia.</li>
		<li>Wymieniaj pożywkę co 3 dni i utrzymuj EB w kulturze zawiesiny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolowanie hCPC
	<ol>
		<li>Zebrać EB nie później niż 9 dnia od różnicowania w celu izolacji CPC u ludzi.</li>
		<li>Odessać pożywkę i dwukrotnie przepłukać EB DPBS. Dodać 0,5 ml 0,25% trypsyny do każdego dołka 6-dołkowych płytek hodowlanych w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Dodać równą objętość pożywki różnicującej, aby zatrzymać reakcję. Pigazuj w górę iw dół, aby rozdzielić EB na pojedyncze komórki. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić komórki w 2% FBS/DPBS. Komórki filtracyjne z sitkiem komórkowym 40 μm i oczyszczonymi FACS ogniwami CPC RFP+, jak opisano w 1.4.3.</li>
		<li>Płytki posortowane hCPC na płytkach pokrytych żelyną. Hodowla hCPC w pożywce różnicowej przez 7-9 dni w celu różnicowania się w komórki kardiomiocytów i mięśni gładkich. 7 dni po posiewie, hoduj zróżnicowane komórki z 5% Knockout SR w pożywce DMEM/F12.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li>
<li>Passier, R., van Laake, L. W., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based+therapy+and+lessons+from+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based therapy and lessons from the heart.</a> Nature. 453 (7193), 322-329 (2008).</li>
<li>Bondue, A., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesp1%3A+a+key+regulator+of+cardiovascular+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Mesp1: a key regulator of cardiovascular lineage commitment.</a> Circulation Research. 107 (12), 1414-1427 (2010).</li>
<li>Bondue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesp1+acts+as+a+master+regulator+of+multipotent+cardiovascular+progenitor+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesp1 acts as a master regulator of multipotent cardiovascular progenitor specification.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 69-84 (2008).</li>
<li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ISL1+heart+progenitors+generate+diverse+multipotent+cardiovascular+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages.</a> Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).</li>
<li>Lei, I., Gao, X., Sham, M. H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+protein+component+BAF250a+regulates+cardiac+progenitor+cell+differentiation+by+modulating+chromatin+accessibility+during+second+heart+field+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF protein component BAF250a regulates cardiac progenitor cell differentiation by modulating chromatin accessibility during second heart field development.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (29), 24255-24262 (2012).</li>
<li>Lei, I., Liu, L., Sham, M. H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+in+cardiac+progenitor+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF in cardiac progenitor cell differentiation.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2437-2445 (2013).</li>
<li>Wu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origin+of+a+bipotential+myocardial+and+smooth+muscle+cell+precursor+in+the+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart.</a> Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).</li>
<li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+HCN4%2B+cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li>
<li>Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+right+ventricle%2C+outflow+tract%2C+and+ventricular+septum+comprise+a+restricted+expression+domain+within+the+secondary%2Fanterior+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field.</a> Developmental Biology. 287 (1), 134-145 (2005).</li>
<li>Boheler, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+into+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).</li>
<li>Wada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+cardiomyocyte-like+cells+from+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12667-12672 (2013).</li>
<li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+enhances+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes.</a> Circulation. 107 (14), 1912-1916 (2003).</li>
<li>Wamstad, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+coordinated+epigenetic+regulation+of+developmental+transitions+in+the+cardiac+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage.</a> Cell. 151 (1), 206-220 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. S. 3rd, Barbas, T. A. L. E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li>
<li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALENs%3A+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature. biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PloS One. 6 (4), e18293(2011).</li>
<li>Kouskoff, V., Lacaud, G., Schwantz, S., Fehling, H. J., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+development+of+hematopoietic+and+cardiac+mesoderm+during+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sequential development of hematopoietic and cardiac mesoderm during embryonic stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13170-13175 (2005).</li>
<li>Xu, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+medium+supporting+cardiomyocyte+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3A+Research+in+Biological+Diversity%22%5BJournal%5D)">Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells.</a> Differentiation: Research in Biological Diversity. 76 (9), 958-970 (2008).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-1857 (2012).</li>
<li>Bizy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+light+chain+2-based+selection+of+human+iPSC-derived+early+ventricular+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Myosin light chain 2-based selection of human iPSC-derived early ventricular cardiac myocytes.</a> Stem Cell Research. 11 (3), 1335-1347 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Protokół ten łączy w sobie metodę wykorzystującą czynniki wzrostu do kierowania różnicowaniem mESC i spontanicznym różnicowaniem ludzkich ESC w CPC. Linia CPC oznaczona fluorescencyjnym reporterem służy do skutecznej identyfikacji i izolacji CPC za pomocą FACS. Oczyszczone przez FACS CPC zachowują zdolność różnicowania się w kardiomiocyty, mięśnie gładkie i komórki śródbłonka oraz mają porównywalny profil ekspresji do komórek in vivo. Tak więc te CPC mogą służyć jako doskonałe źródło w terapii serca opartej na komórkach ...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/52047/derivation-of-cardiac-progenitor-cells-from-embryonic-stem-cells">Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells</a>.
The following author is now listed as a co-corresponding author:
Lei Bu

A correction to the author list was made to: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells.

Erratum: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Choroby serca pozostają główną przyczyną na świecie, a wskaźniki śmiertelności pozostały praktycznie niezmienione w ciągu ostatnich dwóch dekad (American Heart Association). Istnieje pilna potrzeba opracowania nowych strategii terapeutycznych, aby skutecznie zapobiegać lub odwracać niewydolność serca. Jedną z obiecujących strategii jest terapia komórkowa wynikająca z szybkiego rozwoju biologii komórek macierzystych1. W związku z tym multipotencjalne CPC mogą być doskonałym źródłem komórek w terapii ze względu na ich zdolność do proliferacji, ale zaangażowane tylko w różnicowanie linii serca. Dlatego wydajna i solidna metoda generowania i izolowania CPC ma ogromne znaczenie dla badań nad terapią komórkami serca.
Ten protokół skupia się na embrionalnych CPC zidentyfikowanych podczas wczesnej embriogenezy i sposobie ich powstawania z ESC. Różne CPC zostały wyizolowane z serca embrionalnego i dorosłego, a nawet ze szpiku kostnego2. Podczas rozwoju zarodka białka morfogenetyczne kości (BMP), bezskrzydłi członkowie rodziny miejsc integracji MMTV (Wnts) i sygnały węzłowe indukują zaangażowanie multipotencjalnej mezodermy Mesp1 + 3. Komórki Mesp1+ następnie różnicują się w embrionalne CPC4. Te CPC są zwykle oznaczone przez HCN4, NK2 homeobox 5 (Nkx2-5), Isl LIM homeobox 1 (Isl1), T-box 5 (Tbx5) i czynnik wzmacniający miocyty 2C (Mef2c), tworzą pierwotne i drugie pole serca i przyczyniają się do głównych części serca podczas kardiogenezy5-10. Zarówno CPC Nkx2-5+, jak i Isl1+/Mef2c+ są zdolne do różnicowania się w kardiomiocyty, komórki mięśni gładkich (SMC) i komórki śródbłonka5-8. W ten sposób te CPC spowodują powstanie układu naczyniowego serca, a także tkanek serca i są idealnym źródłem komórek do terapii serca opartej na komórkach. W związku z tym wytwarzanie CPC in vitro było głównym przedmiotem badań w badaniach sercowo-naczyniowych. Ponieważ EKM mają nieograniczoną zdolność ekspansji i reprezentują komórki ICM na etapie blastocysty, różnicowanie ESC w embrionalne CPC po naturalnej embriogenezie jest uważane za logiczne i skuteczne podejście do uzyskania CPC.
Jednym z powszechnie stosowanych podejść do uzyskiwania CPC z ESC jest agregacja ESC do EBs11. W celu poprawy efektywności różnicowania wykorzystano zdefiniowane czynniki chemiczne i wzrostowe w oparciu o wiedzę o rozwoju serca12-14. Nie ma jednak ostatecznych markerów CPC, w szczególności markerów powierzchni komórek, które są powszechnie akceptowane w tej dziedzinie. Aby rozwiązać ten problem, ESC zostały zaprojektowane do oznaczania CPC Isl1+ lub Mef2c+ i ich pochodnych za pomocą reporterów fluorescencyjnych przy użyciu systemu Cre/loxP. Rekombinaza cre jest wbijana pod kontrolą promotora/wzmacniacza Isl1 / Mef2c. Zmodyfikowany gen białka fluorescencyjnego RFP lub YFP napędzany przez konstytutywny promotor może być aktywowany przez wycięcie kodonu stop flox z rekombinazą cre (ISL1:cre; pCAG-flox-STOP-flox-GFP lub RFP/ISL1-cre; Rosa26YFP/Mef2c-cre; Rosa26YFP)5,6. Gdy ESC zostaną zróżnicowane w CPC drugiego pola serca, cre napędzane promotorem/wzmacniaczem Isl1 / Mef2c aktywuje reportery fluorescencyjne, a CPC można wzbogacić przez oczyszczanie FACS. Krótko mówiąc, metoda agregacji EB służy do inicjowania różnicowania ESC. Aby zwiększyć efektywność różnicowania, zróżnicowane komórki są traktowane kwasem askorbinowym (AA) i czynnikami wzrostu, takimi jak Bmp4, Activin A i Vegf13,15. Protokół ten umożliwia solidne i wydajne różnicowanie CPC przy użyciu zarówno mysich, jak i ludzkich ESC.

<table><tbody><tr><td>FBS</td><td>Thermo scentific</td><td>SH30070.03E</td><td></td></tr><tr><td>Technologia Knockout SR</td><td>Life</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Technologia Knockout DMEM</td><td>Life</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr>Technologia<td>DMEM</td><td>Life</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr>technologia<td>NEAA</td><td>Life</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr>technologia<td>GlutaMAX</td><td>Life</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Technologia N2</td><td>Life</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr>Technologia<td>B27</td><td>Life</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Ham' Technologia s F12</td><td>Life</td><td>11765062</td><td></td></tr><tr>Technologia<td>IMDM</td><td>Life</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Technologia Pen/Strep</td><td>Life</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Technologia Pyrprecious</td><td>Life</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr>Technologia<td>Dispase</td><td>Life</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Technologia Stempro-34</td><td>Life</td><td>10639011</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/ Technologia F12</td><td>Life</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>Technologia życia</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna&nbsp;</td><td>Technologia życia</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askobowy&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>1-Tioglicerol</td><td>Sigma</td><td>M1753</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>R& D</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Bmp4</td><td>R& D</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>ActivinA</td><td>R& D</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>bFgf</td><td>R& D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>Fgf10</td><td>R& D</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr></tbody></table>

wyprowadzenie komórek progenitorowych serca z embrionalnych komórek macierzystych

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Komórki progenitorowe serca (CPC) mają zdolność różnicowania się w kardiomiocyty, komórki mięśni gładkich (SMC) i komórki śródbłonka i są bardzo obiecujące w terapii komórkowej przeciwko chorobom serca. Wśród różnych metod izolacji CPC, różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych (ESC) w CPC przyciąga dużą uwagę w tej dziedzinie, ponieważ EKM mogą stanowić nieograniczone źródło komórek. W związku z tym opracowano liczne strategie mające na celu wyprowadzenie CPC z ESC. W niniejszym protokole opisano różnicowanie i oczyszczanie embrionalnych CPC zarówno z mysich, jak i ludzkich EKM. Ze względu na trudności w wykorzystaniu markerów powierzchniowych komórek do izolowania embrionalnych CPC, ESC są modyfikowane z fluorescencyjnymi reporterami aktywowanymi przez ekspresję rekombinazy cre specyficznej dla CPC. W ten sposób CPC mogą być wzbogacane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Protokół ten ilustruje procedury tworzenia ciał zarodkowych (EB) z ESC w celu specyfikacji CPC i wzbogacenia. Wyizolowane CPC mogą być następnie hodowane w celu różnicowania linii serca i innych testów biologicznych. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem solidnego i wydajnego wyprowadzania CPC zarówno z mysich, jak i ludzkich ESC.

Protokół przedstawia sposób otrzymywania CPC z kilku linii komórek ES. Komórki ESC są agregowane w celu utworzenia ciałek EB, które następnie różnicują się w CPC. Komórki ESC są rutynowo hodowane na warstwie pokarmowej MEF (Rysunek 1A, F), a warstwa ta jest usuwana przed rozpoczęciem różnicowania. Po agregacji komórek ESC w ciałka EB w medium do różnicowania (Rysunek 1B, G), powstałe ciałka EB są traktowane Bmp4 oraz Aktywiną A w celu nasilenia różnicowania w mezodermę w liniach komórkow...

W tym protokole zostanie zilustrowane pochodzenie komórek progenitorowych serca zarówno z mysich, jak i ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Główną strategią w tym protokole jest wzbogacenie komórek progenitorowych serca za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu fluorescencyjnych reporterów zmodyfikowanych w embrionalnych liniach komórek macierzystych.

Wyprowadzenie komórek progenitorowych serca z embrionalnych komórek macierzystych

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie ludzkich lub mysich komórek progenitorowych serca z embrionalnych komórek macierzystych. Osiąga się to poprzez pierwszą hodowlę w wysokiej jakości embrionalnych komórkach macierzystych lub e-aktywnych komórkach macierzystych lub mysich embrionalnych komórkach żywicielskich lub mitach. W drugim etapie komórki są przenoszone na pokryte żelatyną szalki Petriego, aby ułatwić tworzenie pierwszych ciał zarodka.Następnie komórki są łączone, a czynniki wzrostu są dodawane do kultur w celu indukowania drugiej formy ciał zarodkowych. W ostatnim etapie ciała zarodków są ponownie dysocjowane, a powstałe komórki są traktowane dodatkowymi czynnikami wzrostu. Ostatecznie komórki potomne serca mogą być dalej hodowane w celu różnicowania komórek kardiomiocytów i mięśni gładkich.Podejmując próbę wykonania tej procedury, ważne jest, aby przetestować wydajność różnicowania każdej linii komórkowej, aby umożliwić selekcję komórek o najlepszym potencjale kardiogennym. Teraz dr Inland Lamb, doktor habilitowany w laboratorium, zademonstruje procedurę indukowania różnicowania komórek progenitorowych serca z ciał zarodków myszy Zacznij od hodowli mysich e ESC lu

derivation-of-cardiac-progenitor-cells-from-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje proces otrzymywania transplantowalnych hematopoetycznych komórek macierzystych z mysich embrionalnych komórek macierzystych (ESC) oraz ich późniejszą iniekcję do letalnie napromieniowanych myszy biorców. W skrócie, ESC są różnicowane do postaci ciał embroidalnych, które następnie są infekowane retrowirusem HoxB4 i współhodowane z komórkami zrębowymi OP9 oraz cytokinami hematopoetycznymi.

Wytwarzanie komórek macierzystych krwi z mysich embrionalnych komórek macierzystych

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Artykuł opisuje szczegółową metodologię skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty poprzez selektywne modulowanie szlaku Wnt, a następnie analizę markerów referencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny jednorodności i tożsamości populacji.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy metodę efektywnego wykorzystania potencjału różnicowania serca młodych źródeł ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu generowania funkcjonalnych, kurczących się, kardiomiocytów komórek in vitro.

In vitro Różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów

Tutaj opisujemy skalowalną metodę, wykorzystującą prostą kombinację Activiny A i nadekspresji Id1 za pośrednictwem lentiwirusa, do generowania pierwszych komórek progenitorowych serca podobnych do pola serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Generacja pierwszych sercopodobnych progenitorów serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje technikę różnicowania śródbłonka dla komórek progenitorowych serca. W szczególności koncentruje się na tym, jak stężenie surowicy i gęstość wysiewu komórek wpływają na potencjał różnicowania śródbłonka.

Indukcja różnicowania śródbłonka w komórkach progenitorowych serca w warunkach niskiej surowicy

Ogólnym celem tego artykułu jest ujednolicenie protokołu izolacji, charakterystyki i różnicowania komórek macierzystych serca (CSC) od serca dorosłej myszy. W tym miejscu opisujemy metodę wirowania w gradimencie gęstości w celu wyizolowania mysich CSC oraz opracowane metody hodowli CSC, proliferacji i różnicowania do kardiomiocytów.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie sercowych komórek macierzystych z serca dorosłej myszy

Tutaj podajemy szczegółowy opis eksperymentalnego zestawu do analizy oceny integralności DNA w komórkach macierzystych przed przeszczepem komórki.

Ocena integralności DNA komórek macierzystych w terapii komórek serca

Celem tej metody jest generowanie in vitro komórek progenitorowych serca specyficznych dla pola serca w celu zbadania specyfikacji komórek progenitorowych i właściwości funkcjonalnych, a także generowanie komórek serca specyficznych dla komory do modelowania chorób serca.

Wytwarzanie in vitro komórek progenitorowych serca specyficznych dla pola serca

Poznaj metodę wyprowadzania komórek progenitorowych serca z mysich i ludzkich komórek macierzystych embrionalnych przy użyciu cytometrii przepływowej. Protokół ten umożliwia badania w zakresie biologii serca i medycyny regeneracyjnej.

Wyprowadzenie komórek progenitorowych serca z embrionalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów