1.5: Chirurgia stereotaktyczna gryzoni

Chirurgia stereotaktyczna to potężna technika wykorzystywana do manipulowania mózgiem u żywych zwierząt. Celowanie w obszary głęboko w nienaruszonym mózgu stanowi wyjątkowy problem, ponieważ zwykle celu chirurgicznego nie można zlokalizować wizualnie. Stereotaksja lub chirurgia stereotaktyczna została opracowana w celu celowania w dyskretne obszary mózgu poprzez poznanie ich relacji przestrzennych z widocznymi punktami orientacyjnymi. Korzystając z trójwymiarowego układu współrzędnych, narzędzia mogą być kierowane w określone miejsca w celu zmierzenia aktywności mózgu, dokonania zmiany chorobowej lub wykonania manipulacji genetycznych. Ten film omówi zasady chirurgii stereotaktycznej, zademonstruje podstawowe etapy procedury i omówi różne zastosowania tej techniki.

Zanim omówimy szczegóły proceduralne, przyjrzyjmy się podstawowym zasadom i narzędziom tej techniki. Zacznijmy od tego, że stereotaksja polega na zlokalizowaniu docelowego obszaru mózgu na osi trójwymiarowej. W tym celu wykorzystuje się atlas stereotaktyczny. Dokument ten jest rekonstrukcją 3D mózgu uzyskaną z seryjnych wycinków barwionych mózgów.

W tym układzie odniesienia relacje przestrzenne są wyrażane za pomocą zestawu 3 osi: przednio-tylnej, przyśrodkowo-bocznej i grzbietowo-brzusznej. Aby określić lokalizację obszaru zainteresowania, znajdź odpowiedni region mózgu w atlasie i użyj siatki do obliczenia odpowiednich współrzędnych przyśrodkowo-bocznych i grzbietowo-brzusznych. Współrzędna przednio-tylna jest uzyskiwana na dole lub na górze strony. Współrzędna ta jest mierzona od punktów orientacyjnych na czaszce utworzonych przez przecięcia płytek kostnych, które są znane jako szwy. Najbardziej widoczny punkt orientacyjny, bregma, definiuje się jako punkt przecięcia szwu strzałkowego ze szwem koronalnym. Punkt znany jako lambda jest bardziej tylny; gdzie szew strzałkowy przecina szew lambdoidalny.

Aby dokładnie ustawić się w obliczonej lokalizacji podczas operacji, stosuje się urządzenie znane jako ramka stereotaktyczna . Rama składa się z ramy głównej, mikromanipulatora i uchwytu sondy, który jest przymocowany do zacisku montażowego. Siekacz i nauszniki stykają się ze zwierzęciem, aby utrzymać głowę w ustalonej pozycji. Mikromanipulator służy do precyzyjnego przemieszczania sond chirurgicznych do określonych współrzędnych w mózgu i jest wyposażony w przesuwane skale noniusza do dokładnych pomiarów odległości we wszystkich trzech wymiarach.

Aby odczytać skalę noniusza, najpierw określ położenie linii 0 w stosunku do znaczników po prawej stronie skali. Ta strona skali jest oznaczona w odstępach co 10 milimetrów, tak że 1 to 10, a 2 to 20. Położenie znaku 0 w tym miejscu pokazuje, że odczyt mieści się w zakresie od 10 do 11 mm. Aby określić pierwszą liczbę po prawej stronie przecinka dziesiętnego, znajdź linię na lewej skali, która najlepiej pokrywa się ze znakiem po prawej stronie. Użyj lewej skali, aby określić wartość tego znaku, która w tym przypadku wynosi 9, co daje końcowy odczyt 10,9 mm.

Jesteś już zaznajomiony z podstawowymi zasadami stereotaksji, więc przyjrzyjmy się, jak przeprowadzany jest zabieg chirurgiczny. Przed zabiegiem skóra głowy znieczulonego zwierzęcia jest golona i dezynfekowana. Aby utrzymać zwierzę na miejscu na ramie stereotaktycznej, nauszniki są delikatnie umieszczane w uszach, a przednie zęby są umieszczane w siekaczach. Maść do oczu stosuje się, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu.

Aby odsłonić czaszkę, wykonaj małe nacięcie skalpelem. Delikatnie oddziel tkankę mięśniową i oczyść powierzchnię czaszki. Następnie użyj mikromanipulatora, aby opuścić sondę do bregmy i zwróć uwagę na jej współrzędną grzbietowo-brzuszną. Następnie podnieś sondę i powtórz tę procedurę przy lambdzie. Jeśli pomiar lambda jest mniejszy niż 0,1 mm od współrzędnej grzbietowo-brzusznej w bregmie, czaszka jest uważana za wypoziomowaną i jesteś gotowy do kontynuowania. Jeśli nie, podnieś lub opuść siekacz i powtórz pomiary.

Teraz, gdy mózg jest wypoziomowany, wróć do bregmy i zapisz współrzędne środkowo-boczne i przednio-tylne. Na podstawie współrzędnych celu z atlasu mózgu oblicz ruchy wymagane do dotarcia do tego miejsca i przesuń sondę do pozycji docelowej. Zaznacz tę pozycję na czaszce i za pomocą wiertła ostrożnie zrób otwór w kości.

Tuż pod czaszką znajduje się opona twarda, gruba, wytrzymała membrana, którą można delikatnie przeciąć czubkiem małej igły.

Następnie ramię mikromanipulatora umieszcza się w pozycji, w której można opuścić sondę do docelowej współrzędnej grzbietowo-brzusznej, w którym to momencie można wykonać żądaną manipulację.

Teraz, gdy rozumiesz podstawowe kroki procedury, przyjrzyjmy się niektórym z wielu sposobów, w jakie neuronaukowcy wykorzystują chirurgię stereotaktyczną, aby odpowiedzieć na pytania w laboratorium.

Zacznijmy od tego, że stereotaksja jest niezwykle przydatna w dostarczaniu środków eksperymentalnych do precyzyjnych obszarów mózgu. Czynniki te mogą obejmować barwniki znacznikowe używane do wizualizacji projekcji neuronalnych i połączeń, związki chemiczne lub odczynniki do genetycznej manipulacji neuronów. Na przykład wstrzyknięcie genetycznie zmodyfikowanych wirusów spowoduje dostarczenie gena, który jest przedmiotem zainteresowania, do zakażonych komórek. W tym przypadku wirus został wstrzyknięty do hipokampa, co spowodowało ekspresję GFP w niewielkiej populacji neuronów.

Z drugiej strony, wirusowe dostarczanie małych interferujących RNA może uniemożliwić ekspresję pożądanych białek. W tym przykładzie ekspresja białka SOD1 została stłumiona w różnych regionach mózgu po stereotaktycznym wstrzyknięciu do komory bocznej.

Alternatywnie, chirurgia stereotaktyczna może być wykorzystana do umieszczenia elektrod w mózgu w celu rejestrowania sygnałów elektrycznych, które towarzyszą aktywności neuronalnej. Po tym, jak zwierzę dojdzie do siebie po zabiegu chirurgicznym, elektrody można podłączyć do elektrofizjologicznych systemów rejestrujących, aby obserwować odpalanie neuronów, podczas gdy mysz zachowuje się swobodnie.

Oprócz pomiaru aktywności neuronalnej, chirurgia stereotaktyczna odgrywa zasadniczą rolę w mikrodializie. Technika ta pozwala na ciągłe monitorowanie stężeń leków, neuroprzekaźników lub metabolitów w tkance mózgowej obudzonych zwierząt. Aby to zrobić, mała, wypełniona płynem sonda z półprzepuszczalną membraną na końcu jest wszczepiana do określonego obszaru mózgu. Małe substancje rozpuszczone, w tym neuroprzekaźniki, hormony i leki, dyfundują do sondy, gdzie można je zebrać do analizy. W tym eksperymencie stężenie glukozy w hipokampie mierzono jako odczyt lokalnej aktywności neuronalnej, podczas gdy szczury wykonywały zadanie wymagające użycia przestrzennej pamięci roboczej.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat chirurgii stereotaktycznej. W tym filmie omówiliśmy zasady i metody procedury, a także jej wiele zastosowań w laboratoriach neurobiologicznych.

Dzięki za oglądanie!