Name: Wykorzystanie spektrometrii mas MALDI-TOF i niestandardowej bazy danych do scharakteryzowania bakterii występujących w unikalnym środowisku jaskiniowym (Kartchner Caverns, AZ, USA) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Poznaj identyfikację bakterii metodą MALDI-TOF MS z wykorzystaniem niestandardowej bazy danych. Technika ta umożliwia szybką i niezawodną analizę mikrobiologiczną w ekstremalnych środowiskach jaskiniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez New College of Interdisciplinary Arts and Sciences na Uniwersytecie Stanowym Arizony, Applied Maths NV, oraz przez National Science Foundation (ROA Supplement to Award No. MCB0604300). Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autora (autorów) i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation.

Uwaga: Niezidentyfikowane bakterie z dowolnego środowiska mogą być chorobotwórcze i muszą być traktowane ostrożnie, stosując odpowiednie protokoły bezpieczeństwa biologicznego. Praca z żywymi kulturami musi być wykonywana w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II przy użyciu procedur poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Więcej informacji na temat procedur BSL-2 można znaleźć w podręczniku CDC/NIH zatytułowanym "Bezpieczeństwo biologiczne w laboratoriach mikrobiologicznych i biomedycznych", strony 33-38. Dokument jest dostępny online pod adresem <a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf</a>. Należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), w tym fartuchy laboratoryjne, okulary ochronne oraz rękawice nitrylowe lub lateksowe. Należy przestrzegać standardowych praktyk mikrobiologicznych i środków ostrożności, a odpady niebezpieczne biologicznie muszą być odpowiednio usuwane.
Bakterie użyte w tej demonstracji zostały wyizolowane z Kartchner Caverns, AZ, USA, z czterech środowisk, w tym suchego nacieku, kamienia przepływowego, wilgotnego nacieku i kroplówki stalaktytowej (Tabela 1). Wszystkie izolaty zidentyfikowano za pomocą sekwencjonowania 16S rDNA i utrzymywano w temperaturze -80 °C w 25% pożywce glicerolu-R2 B. Wszystkie eksperymenty zostały zakończone w RT.
Uwaga: Zalecamy użycie tej samej metody przygotowania próbki do uzyskania widm masowych do budowy bazy danych i widm masowych niewiadomych. Wykazano wcześniej, że metoda przygotowania próbki wpływa na jakość widma i odtwarzalność3. Zastosowanie innej metody przygotowania próbki może spowodować nieprawidłową identyfikację niewiadomych, zwłaszcza gdy pożądana jest wyższa rozdzielczość taksonomiczna (np. na poziomie odkształcenia).
1. Osadzanie na tarczy MALDI
Uwaga: Kilka protokołów do uzyskania ekstraktów białkowych wymaga użycia kwasów i rozpuszczalników organicznych, które muszą być używane zgodnie z wytycznymi i informacjami zawartymi w ich odpowiednich Kartach Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej (MSDS). Należy nosić odpowiednie środki ochrony indywidualnej, które będą się różnić w zależności od rodzaju i ilości użytych chemikaliów (np. fartuchy laboratoryjne, rękawice, okulary ochronne i środki ochrony dróg oddechowych muszą być używane podczas pracy ze znacznymi ilościami toksycznych, łatwopalnych rozpuszczalników, takich jak acetonitryl, oraz kwasów, takich jak kwas mrówkowy i trifluorooctowy).
<ol>
	<li>Umieść 1 μl ekstraktu białkowego niezawierającego żadnych żywotnych komórek (uzyskanego przy użyciu odpowiednich, wcześniej opisanych protokołów11-13) na płytce tarczowej MALDI ze stali nierdzewnej i pozostaw do wyschnięcia. Nałożyć wysuszony ekstrakt białkowy na 1 μl roztworu matrycowego (roztwór kwasu α-cyjano-4-hydroksy-cynamonowego) i pozostawić do wyschnięcia.</li>
	<li>Dla każdej kontrpróby biologicznej należy zauważyć odpowiednią liczbę kontrprób technicznych (od 5 do 20 kontrprób technicznych). W tym przypadku przygotowano 10 powtórzeń technicznych dla każdej kontrpróby biologicznej i przygotowano 3 powtórzenia biologiczne. 
	Uwaga: Zalecamy użycie tarczy tarczowej z polerowanej stali MALDI podczas korzystania z metody przygotowania próbki do ekstrakcji białka. Użycie szlifowanych stalowych płyt docelowych może spowodować rozprowadzenie i niezamierzone wymieszanie różnych próbek poza poszczególnymi dołkami na próbki.</li>
	<li>Nałóż 1 μl wzorca kalibru na tarczę celowniczą i pozostaw do wyschnięcia. Nałożyć 1 μl roztworu matrycowego i pozostawić do wyschnięcia.</li>
	<li>Umieścić 2 μl roztworu matrycowego na płytce docelowej jako kontrolę ujemną.</li>
</ol>
2. Akwizycja widm masowych
<ol>
	<li>Użyć spektrometru mas MALDI-TOF wyposażonego w laser azotowy (λ = 337 nm) i obsługiwanego za pomocą oprogramowania Bruker FlexControl.</li>
	<li>Zbierz każde widmo masy w dodatnim trybie liniowym, gromadząc 500 strzałów laserowych w przyrostach co 100 strzałów. Ustaw napięcie źródła jonów 1 na 20 kV; napięcie źródła jonów 2 do 18,15 kV; i napięcie soczewki do 9,05 kV. Należy pamiętać, że te parametry są specyficzne dla danego instrumentu i mogą wymagać regulacji na innych instrumentach w celu uzyskania optymalnych wyników.</li>
	<li>Ustaw zakres masy do ładunku dla automatycznej oceny widma od 2 do 20 kDa na ładowanie. Użyj algorytmu wykrywania pików środka ciężkości. Ustaw minimalny próg rozdzielczości na 100 Da. Ustaw próg stosunku sygnału do szumu (S:N) na 2. Ustaw minimalny próg intensywności na 100.</li>
</ol>
3. Budowa bazy danych
<ol>
	<li>Projektowanie baz danych
	<ol>
		<li>Utwórz nową bazę danych w BioNumerics 7.1 za pomocą "Kreatora nowej bazy danych".</li>
		<li>Utwórz typ eksperymentu widma, np. Maldi, za pomocą poleceń w panelu "Typy eksperymentów".</li>
		<li>Utwórz poziomy za pomocą "Panelu projektu bazy danych". Dodaj nowe poziomy za pomocą polecenia "Poziom > Dodaj nowy poziom..." w menu "Baza danych". W tym miejscu utwórz odpowiednio poziom "Gatunek", poziom "Duplikat biologiczny" i poziom "Duplikat techniczny".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Importowanie i wstępne przetwarzanie widm masy surowej
	<ol>
		<li>Eksportuj surowe widma masowe jako pliki .txt za pomocą FlexAnalysis, klikając polecenie "Eksportuj widmo masy" > menu "Plik".</li>
		<li>Zaimportuj surowe widma masowe (pliki .txt) do bazy danych na poziomie kontrprób technicznych.</li>
		<li>Wstępnie przetworzyć surowe widma masowe.
		<ol>
			<li>Importowanie i ponowne próbkowanie (przy użyciu algorytmu dopasowania kwadratowego).</li>
			<li>Wykonaj odejmowanie linii bazowej (za pomocą tarczy tocznej o rozmiarze 50 punktów).</li>
			<li>Oblicz szum [Continuous Wavelet Transformation (CWT)], gładki (okno Kaisera o rozmiarze okna 20 punktów i beta 10 punktów) i wykonaj drugie odejmowanie linii bazowej (tocząca się tarcza o rozmiarze 200 punktów).</li>
			<li>Wykrywanie pików [CWT przy minimalnym stosunku sygnału do szumu (S:N) wynoszącym 10].</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po wstępnym przetworzeniu zapisz w bazie danych charakterystyczne wzorce każdego widma masowego, takie jak listy pików zawierające rozmiary pików, intensywności pików, S:N itp.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie widm mas kompozytowych
	<ol>
		<li>Utwórz widma kompozytowe ze wstępnie przetworzonych widm za pomocą polecenia "Podsumowaj..." w menu "Analiza". Jako poziom docelowy należy wybrać "Replika biologiczna".</li>
		<li>W tym miejscu połącz widma masowe 10 technicznych powtórzeń tej samej kolonii, aby uzyskać złożone widmo masowe dla tej kolonii, co daje trzy złożone widma masowe dla tego izolatu na poziomie "kontrpróby biologicznej".</li>
		<li>W tym miejscu podsumuj trzy widma złożone, aby utworzyć jedno widmo złożone dla tego izolatu na poziomie "Gatunek". 
		Uwaga: Widmo złożone jest średnią punkt po punkcie z kontrprób technicznych. Powtórzenia o podobieństwie (korelacja Pearsona) do średniej mniejszej niż 95% (ustawienie domyślne) są wykluczane z kompozytu. Piki w widmach złożonych są wywoływane tylko wtedy, gdy są obecne w 75% (ustawienie domyślne) uwzględnionych powtórzeń. W przypadku kontrprób biologicznych ustawienia te wynosiły odpowiednio 90 i 60%.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych widma masowego
<ol>
	<li>Zaznacz wpisy w bazie danych i utwórz porównanie, klikając polecenie "Utwórz nowe porównanie" w panelu "Porównania".</li>
	<li>W tym miejscu należy użyć widm mas na poziomie "kontrpróby technicznej" i/lub "kontrpróby biologicznej", aby pokazać porównania i analizy.</li>
	<li>Analiza skupień oparta na podobieństwie i skalowanie wielowymiarowe (MDS)
	<ol>
		<li>Twórz grupy z kolorami. Wybierz trzy biologiczne widma mas złożonych i kliknij polecenie "Utwórz nową grupę z wyboru" w menu "Grupy", aby utworzyć grupę dla odpowiedniego izolatu. Wyznacz kolor automatycznie używany dla tych trzech widm masowych.</li>
		<li>Alternatywnie można zdefiniować stany pól z odpowiadającymi im kolorami za pomocą poleceń w panelu "Wpisy bazy danych" w taki sposób, aby każde grupowanie oparte na tym zdefiniowanym polu używało tego samego koloru zdefiniowanego dla tej grupy.</li>
		<li>Wykonaj analizę skupień. Kliknij polecenie "Oblicz analizę skupień" w menu "Grupowanie". Na stronie 1 Ustawienia porównania wybierz opcję "Korelacja Pearsona" i pozostaw inne parametry jako domyślne. Na stronie 2 wybierz "UPGMA". Następnie kliknij "Zakończ".</li>
		<li>Uzyskaj wykres MDS za pomocą polecenia "Skalowanie wielowymiarowe..." w menu "Statystyki".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dopasowanie szczytowe
	<ol>
		<li>Kliknij typ widma "Maldi" w panelu "Eksperymenty". Następnie wybierz "Układ > Pokaż obraz". Widma są pokazane jako opaski żelowe.</li>
		<li>Wykonaj dopasowywanie pików za pomocą polecenia "Do peak matching" w menu "Spectra".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja klas szczytów
	<ol>
		<li>Wykonaj analizę głównych składowych (PCA). Zaznacz typ eksperymentu "Maldi" w panelu "Eksperymentalny" i użyj polecenia "Analiza głównych składowych..." w menu "Statystyczny", aby wykonać PCA.</li>
		<li>Wykonaj klastrowanie dwukierunkowe. Kliknij przycisk "Statystyki > Eksploracja macierzowa"... w oknie "Porównanie". Intensywność szczytów dopasowanych do klas pików jest reprezentowana za pomocą różnych kolorów (mapa cieplna).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Identyfikacja bakterii za pomocą niestandardowej bazy danych
<ol>
	<li>Metoda oparta na współczynniku podobieństwa
	<ol>
		<li>Utwórz porównanie i wygeneruj dendrogram na podstawie widm masowych na poziomie "Repliki technicznej", jak opisano w kroku 4.3.3. Zachowaj dendrogram do porównania podobieństwa.</li>
		<li>Wybierz nieznane widmo mas i kliknij przycisk "Analiza > Zidentyfikuj wybrane wpisy". Pojawi się okno dialogowe identyfikacji.</li>
		<li>Wybierz typ klasyfikatora "Oparty na porównaniu" (lub zapisany klasyfikator) i kliknij "dalej". Na następnej stronie wybierz zapisany dendrogram jako porównanie referencyjne, a następnie kliknij "dalej".</li>
		<li>Wybierz "Podstawowe podobieństwo" jako metodę identyfikacji, a następnie kliknij "dalej".</li>
		<li>Wybierz "Maksymalne podobieństwo" jako metodę oceniania. Wpisz odpowiednie wartości progowe i minimalne wartości różnicy dla każdego parametru, a następnie kliknij "dalej".</li>
		<li>Po zakończeniu obliczeń pojawi się okno identyfikacji. W panelu "Wyniki" znajdują się członkowie bazy danych, którzy najlepiej pasują do nieznanego.</li>
		<li>Zapisz projekt identyfikacji i zweryfikuj identyfikację za pomocą polecenia "analiza krzyżowej walidacji" w panelu "Projekt identyfikacyjny".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potencjalna metoda oparta na biomarkerach
	<ol>
		<li>Definiowanie klas szczytowych. W oknie "Matrix Mining" wybierz zestawy pików o wspólnych cechach i zdefiniuj te piki jako określone klasy pików (potencjalne biomarkery) za pomocą opcji "Spectra > Manage peak class types..." w oknie "Porównanie".</li>
		<li>W tym miejscu zdefiniuj klasy pików specyficzne dla każdego izolatu dla wszystkich 15 izolatów.</li>
		<li>Wybierz widma masowe niewiadomych i dopasuj piki tych widm do zdefiniowanych klas pików, jak opisano wcześniej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review.</a> Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).</li>
<li>Siegrist, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+and+characterization+of+environmental+strains+of+Escherichia+coli+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry+%28MALDI-TOF-MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Meth%22%5BJournal%5D)">Discrimination and characterization of environmental strains of Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS).</a> J Microbiol Meth. 68 (3), 554-562 (2007).</li>
<li>Goldstein, J. E., Zhang, L., Borror, C. M., Rago, J. V., Sandrin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+and+sample+preparation+methods+affect+spectrum+quality+and+reproducibility+during+profiling+of+Staphylococcus+aureus+with+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Culture conditions and sample preparation methods affect spectrum quality and reproducibility during profiling of Staphylococcus aureus with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Lett Appl Microbiol. 57 (2), 144-150 (2013).</li>
<li>Benagli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+MALDI-TOF+MS+identification+database+at+genospecies+level+for+clinical+and+environmental+Aeromonas+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains.</a> Plos One. 7 (10), (2012).</li>
<li>Sauer, S., Kliem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+tools+for+the+classification+and+identification+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (1), 74-82 (2010).</li>
<li>Bohme, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpectraBank%3A+An+open+access+tool+for+rapid+microbial+identification+by+MALDI-TOF+MS+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">SpectraBank: An open access tool for rapid microbial identification by MALDI-TOF MS fingerprinting.</a> Electrophoresis. 33 (14), 2138-2142 (2012).</li>
<li>Walker, J., Fox, A. J., Edwards-Jones, V., Gordon, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+cell+mass+spectrometry+%28ICMS%29+used+to+type+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%3A+media+effects+and+inter-laboratory+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Meth%22%5BJournal%5D)">Intact cell mass spectrometry (ICMS) used to type methicillin-resistant Staphylococcus aureus: media effects and inter-laboratory reproducibility.</a> J Microbiol Meth. 48 (2-3), 117-126 (2002).</li>
<li>Ruelle, V., El Moualij, B., Zorzi, W., Ledent, P., De Pauw, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+environmental+bacterial+strains+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Sp. 18 (18), 2013-2019 (2004).</li>
<li>Sedo, O., Sedlacek, I., Zdrahal, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+Methods+for+Maldi-MS+Profiling+of+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation Methods for Maldi-MS Profiling of Bacteria.</a> Mass Spectrom Rev. 30 (3), 417-434 (2011).</li>
<li>Swatkoski, S., Russell, S., Edwards, N., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+model+virus+using+residue-specific+chemical+cleavage+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of a model virus using residue-specific chemical cleavage and MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Anal Chem. 79 (2), 654-658 (2007).</li>
<li>Freiwald, A., Sauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+classification+and+identification+of+bacteria+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 4 (5), 732-742 (2009).</li>
<li>Drevinek, M., Dresler, J., Klimentova, J., Pisa, L., Hubalek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+MALDI-TOF+MS+identification+of+highly+dangerous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria.</a> Lett Appl Microbiol. 55 (1), 40-46 (2012).</li>
<li>Lasch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+mass+spectrometry+compatible+inactivation+method+for+highly+pathogenic+microbial+cells+and+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF mass spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores.</a> Anal Chem. 80 (6), 2026-2034 (2008).</li>
<li>Usbeck, J. C., Kern, C. C., Vogel, R. F., Behr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+experimental+and+modelling+parameters+for+the+differentiation+of+beverage+spoiling+yeasts+by+Matrix-Assisted-Laser-Desorption%2FIonization+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry+%28MALDI-TOF+MS%29+in+response+to+varying+growth+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of experimental and modelling parameters for the differentiation of beverage spoiling yeasts by Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) in response to varying growth conditions.</a> Food Microbiol. 36 (2), 379-387 (2013).</li>
<li>Del Chierico, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+MS+proteomic+phenotyping+of+filamentous+and+other+fungi+from+clinical+origin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin.</a> J Proteomics. 75 (11), 3314-3330 (2012).</li>
<li>Vitale, R., Roine, E., Bamford, D. H., Corcelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+fingerprints+of+intact+viruses+by+MALDI-TOF%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bba-Mol+Cell+Biol+L%22%5BJournal%5D)">Lipid fingerprints of intact viruses by MALDI-TOF/mass spectrometry.</a> Bba-Mol Cell Biol L. 1831 (4), 872-879 (2013).</li>
<li>Zhang, L., Borror, C. M., Sandrin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+designed+experiments+approach+to+optimization+of+automated+data+acquisition+during+characterization+of+bacteria+with+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A designed experiments approach to optimization of automated data acquisition during characterization of bacteria with MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Plos One. 9 (3), (2014).</li>
<li>Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+bacteria+from+positive+blood+culture+bottles+by+use+of+matrix-assisted+laser+desorption-ionization+time+of+flight+mass+spectrometry+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22J+ClinMicrobiol%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting.</a> J ClinMicrobiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).</li>
</ol>

Autorzy, Vranckx i Janssens, są pracownikami firmy Applied Maths NV, producenta oprogramowania do analizy danych użytego w tym filmie. Firma Applied Maths NV dostarczyła wybrane moduły oprogramowania wyróżnione w tym filmie, a także część kosztów publikacji związanych z tym filmem.

Demonstracja ta pokazała szczegółowe procedury charakterystyki i identyfikacji bakterii przy użyciu MALDI-TOF MS i niestandardowej bazy danych. W porównaniu z tradycyjnymi metodami molekularnymi, na przykład sekwencjonowaniem 16S rDNA, metody odcisków palców oparte na MS MALDI-TOF ułatwiają szybszą identyfikację różnych bakterii. Ze względu na swoją wytrzymałość, technika ta jest szeroko stosowana do charakteryzowania bakterii, wirusów, grzybów i drożdży w środowisku i w warunkach klinicznych1,14-16. Ponadto d...

Spektrometria mas (MS) wspomagana laserową desorpcją/jonizacją (MALDI-TOF) wspomagana matrycą okazała się szybkim i niezawodnym narzędziem do identyfikacji bakterii na poziomie rodzaju, gatunku, a w niektórych przypadkach szczepu1-4. MALDI-TOF MS jonizuje cząsteczki biologiczne (zwykle białka), które pochodzą z powierzchni komórek, błon wewnątrzkomórkowych i rybosomów z całych komórek bakteryjnych lub ekstraktów białkowych1,5. Powstałe piki tworzą charakterystyczne wzory lub "odciski palców" analizowanych bakterii1. Identyfikacja bakterii opiera się na tych "odciskach palców" od masy do ładunku. 
Dwie z najczęściej używanych strategii identyfikacji to strategie oparte na bibliotece i bioinformatyce:1. Podejścia oparte na bibliotekach polegają na porównywaniu widm masowych niewiadomych z wcześniej zebranymi widmami masowymi znanych bakterii w bazach danych/bibliotekach w celu identyfikacji. Dostępne na rynku oprogramowanie, takie jak pakiety oprogramowania BioNumerics, Biotyper i SARAMIS, a także narzędzia oprogramowania typu open source, takie jak SpectraBank6, ułatwiają porównywanie i kwantyfikację podobieństwa między widmami masowymi nieznanych i bakterii referencyjnych. Podejścia oparte na bioinformatyce zwykle opierają się na w pełni zsekwencjonowanych genomach bakterii w celu identyfikacji. W przeciwieństwie do podejść bibliotecznych, które nie obejmują identyfikacji biologicznej natury poszczególnych pików, podejścia oparte na bioinformatyce obejmują identyfikację białek1. 
Większość ostatnich badań MALDI opartych na odciskach palców wykorzystywała metody oparte na bibliotece do identyfikacji bakterii1. Podejścia oparte na bibliotekach wymagają budowy baz danych i porównywania podobieństwa między widmami masowymi. Badania pokazują, że wiele procedur eksperymentalnych, takich jak podłoże3,7, czashodowli8, metoda przygotowaniapróbki3 i zastosowanamatryca9, wpływa na uzyskane widma masowe. Co więcej, niektóre blisko spokrewnione gatunki i szczepy generują widma z jedynie subtelnymi różnicami. W związku z tym podejścia oparte na bibliotekach wymagają rygorystycznie ustandaryzowanych procedur w celu generowania wysoce powtarzalnych widm masowych między powtórzeniami. Niewielkie różnice w protokołach mogą zagrozić skuteczności identyfikacji, zwłaszcza na poziomie podgatunku i szczepu1,3,10. Jednak ani referencyjne bazy danych dostarczone przez producenta, ani raportowane niestandardowe bazy danych nie zawierają wizualnie udokumentowanych procedur budowy bazy danych i/lub zastosowania potoku analizy danych. Z tego powodu celem niniejszej pracy było opracowanie, zastosowanie i zademonstrowanie kompleksowej i szczegółowej procedury identyfikacji bakterii w oparciu o bibliotekę za pomocą MALDI-TOF MS. 
W tej demonstracji, widma masowe 15 bakterii wyizolowanych ze środowiska krasowego (Kartchner Cavern, AZ, USA) zostały zebrane i zaimportowane do oprogramowania w celu skonstruowania modelowej bazy danych. Przetwarzanie danych i potok analizy zostały szczegółowo opisane przy użyciu bazy danych modelu. Na koniec ponownie zebrano widma masowe ślepo zakodowanych bakterii, które zostały losowo wybrane z tych 15 bakterii, i porównano je z widmami referencyjnymi w bazie danych modelu w celu identyfikacji. Wyniki pokazują, że bakterie można prawidłowo identyfikować na podstawie współczynników podobieństwa lub potencjalnych biomarkerów/klas pików.

<table><tbody><tr><td>Kwas &alfa;-cyjano-4-hydroksy-cynamonowy</td><td>ACROS Organics</td><td>163440050</td><td>&ge; 97%, CAS 28168-41-8</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Bruker</td><td>FlexControl Bruker Daltonics</td><td></td><td>wersja 3.0</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Bruker FlexAnalysis</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>wersja 3.0</td></tr><tr><td>Oprogramowanie bionumeryczne</td><td>Matematyka</td><td></td> stosowana <td>wersja 7.1</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie spektrometrii mas maldi-tof i niestandardowej bazy danych do scharakteryzowania bakterii występujących w unikalnym środowisku jaskiniowym (kartchner caverns, az, usa)

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA)

Okazało się, że spektrometria mas Spektrometria mas MALDI-TOF jest szybkim i niezawodnym narzędziem do identyfikacji bakterii na poziomie rodzaju i gatunku, a w niektórych przypadkach także szczepu. W celu ułatwienia identyfikacji opracowano dostępne na rynku narzędzia programowe typu open source; W literaturze nie opisano jednak uniwersalnego/ustandaryzowanego potoku analizy danych. W tym miejscu zapewniamy kompleksową i szczegółową demonstrację procedur identyfikacji bakterii przy użyciu spektrometru mas MALDI-TOF. Widma masowe pobrano od 15 różnych bakterii wyizolowanych z Kartchner Caverns, AZ, USA i zidentyfikowano za pomocą sekwencjonowania 16S rDNA. Bazy danych zostały skonstruowane w BioNumerics 7.1. Przeprowadzono dalsze analizy widm masowych, w tym analizy skupień, dopasowanie pików i analizy statystyczne. Identyfikację przeprowadzono przy użyciu ślepo zakodowanych próbek losowo wybranych z tych 15 bakterii. Przedstawiono dwie metody identyfikacji: oparte na współczynniku podobieństwa i metody oparte na biomarkerach. Wyniki pokazują, że obie metody identyfikacji mogą identyfikować bakterie na poziomie gatunku.

Bazy danych utworzone w tej demonstracji składały się z czterech poziomów, od najwyższego do najniższego: odpowiednio „Wszystkie poziomy”, „Gatunek”, „Powtórzenie biologiczne” i „Powtórzenie techniczne” (Rysunek 1A). Poziom „Powtórzenie techniczne” zawierał wszystkie wstępnie przetworzone widma powtórzeń technicznych. Poziomy „Powtórzenie biologiczne” i „Gatunek” zawierały widma złożone (podsumowujące). Poziom „Wszystkie poziomy” zawierał wszystkie widma powtórzeń technicznych, jak i wszystkie widma złoż...

Ta praca szczegółowo opisuje procedury szybkiej identyfikacji bakterii za pomocą MALDI-TOF MS. Procedury identyfikacji obejmują akwizycję widma, budowę bazy danych i analizy następcze. Przedstawiono dwie metody identyfikacji: opartą na współczynniku podobieństwa i metodę opartą na biomarkerach.

Wykorzystanie spektrometrii mas MALDI-TOF i niestandardowej bazy danych do scharakteryzowania bakterii występujących w unikalnym środowisku jaskiniowym (Kartchner Caverns, AZ, USA)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, ...

Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie, zastosowanie i zademonstrowanie szczegółowej procedury identyfikacji bakterii opartej na bibliotece przy użyciu MALDI do spektrometrii mas. Osiąga się to poprzez najpierw uzyskanie widm masowych bakterii za pomocą spektrometru masowego Maloffa. W tym badaniu zbierane są widma masowe 15 bakterii wyizolowanych ze środowiska, w wyniku których powstają piki, charakterystyczne wzory lub odciski palców analizowanych bakterii.Te widma mas są następnie importowane do oprogramowania i tworzona jest baza danych modeli. Następnie widma mas referencyjnych w bazie danych modelu są przetwarzane i analizowane za pomocą analizy skupień, dopasowania pików i analizy statystycznej. Na koniec widma masowe ślepo zakodowanych bakterii, które są losowo wybierane spośród tych 15 bakterii, są ponownie zbierane i porównywane z widmami referencyjnymi w bazie danych modelu w celu uzyskania wyników identyfikacji, co pokazuje, że bakterie można prawidłowo zidentyfikować na podstawie współczynników podobieństwa lub potencjalnych biomarkerów i klas pików.Rozpocznij tę procedurę od naniesienia jednego mikrolitra ekstraktu białkowego niezawierającego żywych komórek na płytce docelowej maldi ze stali nierdzewnej i pozostaw do wyschnięcia. Następnie pokryj wysuszony ekstrakt białkowy jednym mikrolitrem roztworu matrycy i pozostaw do wyschnięcia. Następnie nanieść jeden mikrolitr wzorca CBR na tarczę po wyschnięciu, pokryć CBR jednym mikrolitrem roztworu matrycy i pozostawić do wyschnięcia.Na koniec nanieść dwa mikrolitry roztworu matrycy na płytkę docelową jako kontrolę ujemną. Użyj spektrometru wielomasowego wyposażonego w laser azotowy i obsługiwanego za pomocą oprogramowania sterującego elastycznością firmy Bruker. Zbierz każde widmo masy w dodatnim trybie liniowym, gromadząc 500 strzałów laserowych w przyrostach co 100 strzałów.Ustaw jedno napięcie źródła jonów na 20, kilowolty źródło jonów, dwa napięcia na 18,15 kilowolta, a napięcie soczewki na 9,05 kilowolta. Parametry te są specyficzne dla danego instrumentu i mogą wymagać optymalizacji. Ustaw zakres masy do ładunku dla automatycznej oceny widma od dwóch do 20 kilodaltonów na ładunek.Następnie ustaw minimalny próg rozdzielczości na 100. Wybierz algorytm wykrywania piku OID. Ustaw próg stosunku sygnału do szumu na dwa, a minimalny próg intensywności na 100.Na koniec ustaw akumulację szczytową na 500 na potrzeby projektowania bazy danych. Utwórz nową bazę danych w bio numerics 7.1 za pomocą kreatora nowej bazy danych. Następnie utwórz typ eksperymentu widma, taki jak maldi, używając poleceń w panelu typów eksperymentów.Następnie utwórz poziomy za pomocą panelu projektowania bazy danych, przejdź do menu bazy danych i dodaj nowe poziomy za pomocą polecenia dodaj nowy poziom tutaj. Utwórz poziom gatunku, poziom repliki biologicznej i poziom techniczny. Aby zaimportować surowe widma masowe.Najpierw wyeksportuj surowe widma masowe jako pliki tekstowe za pomocą analizy flex, przechodząc do menu pliku i klikając polecenie eksportuj widmo masy. Następnie zaimportuj widma mas surowych do bazy danych na poziomie powtórzeń technicznych. Wstępnie przetworzyć widma mas surowych, importując i ponownie próbkując przy użyciu algorytmu dopasowania kwadratowego.Następnie wykonaj odejmowanie linii bazowej za pomocą toczącej się tarczy o wielkości 50 punktów, oblicz szum za pomocą ciągłej transformacji falkowej lub CWT. Wygładź widma za pomocą okna Kaisera o rozmiarze okna 20 punktów i becie 10 punktów. Następnie wykonaj drugie odejmowanie linii bazowej za pomocą tarczy tocznej o rozmiarze 200 punktów.Na koniec wykryj piki za pomocą CWT z minimalnym stosunkiem sygnału do szumu wynoszącym 10 po wstępnym przetworzeniu bezpiecznych wzorców charakterystycznych dla każdego widma masowego, takich jak listy pików, zawierające rozmiary pików, intensywności pików i stosunek sygnału do szumu. W następnym utwórz widma mas złożonych ze wstępnie przetworzonych widm za pomocą polecenia summarized w menu analizy. Jako poziom docelowy należy wybrać replikację biologiczną. Tu.Połącz widma masowe 10 technicznych powtórzeń tej samej kolonii, aby uzyskać złożone widmo masowe dla tej kolonii, co daje trzy złożone widma masowe dla tego izolatu na poziomie kontrpróby biologicznej. Na koniec podsumuj trzy widma złożone, aby utworzyć jedno widmo złożone dla tego izolatu na poziomie gatunku. Aby przeprowadzić analizę skupień na podstawie podobieństwa i skalowanie wielowymiarowe, utwórz grupy z kolorami.Najpierw wybierz trzy biologiczne widma mas złożonych i kliknij polecenie utwórz nową grupę z wyboru w menu grupy, aby utworzyć grupę dla odpowiedniego izolatu. Następnie zaprojektuj kolor automatycznie używany dla tych trzech widm masowych. Analizę skupień można przeprowadzić, przechodząc do menu klastrowania i klikając polecenie oblicz analizę skupień.W ustawieniach porównania, na stronie pierwszej, wybierz korelację Pearsona i pozostaw inne parametry jako domyślne. Na drugiej stronie wybierz metodę grupowania par nieważonych ze średnią arytmetyczną. Następnie kliknij przycisk Zakończ.Uzyskaj wielowymiarowy wykres skalowania za pomocą polecenia skalowania wielowymiarowego w menu statystyk, aby wykonać dopasowywanie szczytów. Kliknij na typ widma maldi w panelu eksperymentów. Następnie wybierz układ.Pokaż obraz, pokazane są poszczególne piki widm. Następnie wykonaj dopasowywanie pików za pomocą polecenia do peak matching w menu spectra, aby zidentyfikować klasy pików, wykonaj dwukierunkowe grupowanie, klikając macierz statystyczna. Górnictwo. Intensywność pików dopasowanych do klas pików jest reprezentowana jako mapa cieplna w celu identyfikacji bakterii za pomocą metody opartej na współczynniku podobieństwa, utworzenia porównania i wygenerowania rogramu na podstawie widm masowych na poziomie technicznej replikacji, jak to ma miejsce w przypadku analizy skupień, zachowaj rogram do porównania podobieństwa.Wybierz nieznane widmo mas i kliknij analizę. Zidentyfikuj wybrane wpisy. Pojawi się okno dialogowe identyfikacji.Wybierz typ klasyfikatora opartego na porównaniu i kliknij przycisk Dalej. Na następnej stronie wybierz zapisany gram jako porównanie referencyjne, a następnie kliknij przycisk Dalej. Wybierz podstawowe podobieństwo jako metodę identyfikacji i ponownie kliknij Dalej, wybierz maksymalne podobieństwo jako metodę punktacji.Wpisz odpowiednie wartości progowe i minimalne wartości różnicy dla każdego parametru, a następnie kliknij przycisk Dalej. Po zakończeniu obliczeń w panelu wyników pojawi się okno identyfikacji. Zostaną wyświetlone elementy członkowskie bazy danych, które najlepiej pasują do nieznanego.Rogram oparty na analizie klastrów pokazuje podobieństwo między każdym izolatem w bazie danych. Zestaw danych zawiera widma 15 różnych gatunków z trzema widmami złożonymi dla każdego gatunku. Dwukierunkowa analiza skupień może pomóc naukowcom w identyfikacji potencjalnych biomarkerów dla danego gatunku lub szczepów w obrębie gatunku.Tutaj szczytowa intensywność jest reprezentowana przez kolory, zielony oznacza niską intensywność, a czerwony oznacza wysoką intensywność. Wreszcie, w oparciu o tę analizę, widmo masowe niewiadomej można porównać z gramem i uzyskać identyfikację opartą na współczynniku podobieństwa.

use-maldi-tof-mass-spectrometry-custom-database-to-characterize

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zastosowanie spektrometrii mas (MS) z laserową desorpcją/jonizacją (MALDI-TOF) bezpośrednio do bulionu z hodowli krwi przyspiesza identyfikację bakterii. Przedstawiona metoda jest szybką i wiarygodną metodą identyfikacji bakterii Gram-ujemnych bezpośrednio z bulionu z posiewów krwi.

Szybka identyfikacja bakterii Gram-ujemnych w bulionie z posiewu krwi przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF

Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą spektrometria mas lotu (MALDI-TOF MS) oraz techniki molekularne (sekwencjonowanie genów 16S rRNA) pozwalają na identyfikację rzadkich patogenów bakteryjnych w rutynowej diagnostyce. Celem tego protokołu jest połączenie obu technik, co prowadzi do dokładniejszych i bardziej wiarygodnych danych.

Identyfikacja rzadkich patogenów bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA i MALDI-TOF MS

IDBac to open-source'owy potok bioinformatyczny oparty na spektrometrii mas, który integruje dane zarówno z nienaruszonych białek, jak i wyspecjalizowanych widm metabolitów, zebrane na materiale komórkowym zeskrobanym z kolonii bakteryjnych. Procedura ta pozwala naukowcom szybko zorganizować setki lub tysiące kolonii bakteryjnych w przypuszczalne grupy taksonomiczne i dalej je różnicować w oparciu o wyspecjalizowaną produkcję metabolitów.

Wykorzystanie potoku IDBac MALDI TOF-MS o otwartym kodzie źródłowym do analizy białek mikrobiologicznych i specjalistycznych danych metabolitowych

Protokół eksploracji genomu sterowany spektrometrią mas jest ustanowiony i opisany tutaj. Opiera się na informacjach o sekwencjach genomu i analizie LC-MS/MS i ma na celu ułatwienie identyfikacji cząsteczek ze złożonych ekstraktów mikrobiologicznych i roślinnych.

Eksploracja genomu pod kontrolą spektrometrii mas jako narzędzie do odkrywania nowych produktów naturalnych

Tutaj prezentujemy protokół szybkiej identyfikacji białek wytwarzanych przez genomowo sekwencjonowane bakterie chorobotwórcze za pomocą tandemowej spektrometrii mas MALDI-TOF-TOF i odgórnej analizy proteomicznej za pomocą oprogramowania opracowanego przez nas. Metastabilne jony białkowe fragmentują się ze względu na działanie kwasu asparaginowego i ta specyficzność jest wykorzystywana do identyfikacji białek.

Identyfikacja białek odporności przeciwbakteryjnej w Escherichia coli za pomocą MALDI-TOF-TOF-MS/MS i odgórnej analizy proteomicznej

Nowatorska metoda przygotowania próbek została zademonstrowana do analizy makrokolonii bakteryjnych na bazie agaru za pomocą matrycowej desorpcji/jonizacji laserowej spektrometrii mas.

Badanie współpracy mikrobiologicznej poprzez obrazową analizę spektrometrii mas kolonii bakteryjnych hodowanych na agarze i w tkance podczas infekcji

Protokół ten umożliwia szybką i opłacalną ocenę składu mikroorganizmów w produktach mlecznych poprzez połączenie kulturologii z MALDI-TOF MS. Dostarcza wyniki taksonomiczne porównywalne z sekwencjonowaniem 16S rRNA, z krótszym czasem realizacji niż tradycyjne metody hodowla.

Ocena bezpieczeństwa mikroorganizmów w mleczarstwach za pomocą profilowania bakteryjnego proteomicznego za pomocą podejścia MALDI

Niniejszy film prezentuje przygotowanie ultrascienistej warstwy matrycy/analitu do analizy peptydów i białek za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-MS).

Przygotowanie próbek do analizy MALDI: metoda ultracienkiej warstwy

Zredukowana lub brakująca ekspresja Pms2 i/lub ERCC1 w całych kryptach jest częstym zjawiskiem w obszarze 10 cm po każdej stronie gruczolaków okrężnicy, co prawdopodobnie stanowi podstawę defektu pola o wysokiej zmienności i progresji do nowotworu. Niedobór Ku86 lub CcOI jest znacznie rzadszy w tych defektach pola.

Niedobory Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI w defektach polowych podczas progresji do raka jelita grubego

Metoda SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies) łączy wzbogacanie peptydów metodą powinowactwa z masową spektrometrią z rozcieńczeniem izotopem stabilnym (MRM-MS), aby zapewnić ilościowe pomiary peptydów jako substytutów odpowiadających im białek. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół z wykorzystaniem cząstek magnetycznych w formacie częściowo zautomatyzowanym.

Ilościowe oznaczanie białek z wykorzystaniem immunoafinityjnego wzbogacania peptydów sprzężonego ze spektrometrią mas

Poznaj identyfikację bakterii metodą MALDI-TOF MS z wykorzystaniem niestandardowej bazy danych. Technika ta umożliwia szybką i niezawodną analizę mikrobiologiczną w ekstremalnych środowiskach jaskiniowych.

Wykorzystanie spektrometrii mas MALDI-TOF i niestandardowej bazy danych do scharakteryzowania bakterii występujących w unikalnym środowisku jaskiniowym (Kartchner Caverns, AZ, USA) (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie spektrometrii mas MALDI-TOF i niestandardowej bazy danych do scharakteryzowania bakterii występujących w unikalnym środowisku jaskiniowym (Kartchner Caverns, AZ, USA)

Przeglądaj więcej filmów