Wykorzystanie spektrometrii mas MALDI-TOF i niestandardowej bazy danych do scharakteryzowania bakterii występujących w unikalnym środowisku jaskiniowym (Kartchner Caverns, AZ, USA)

Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie, zastosowanie i zademonstrowanie szczegółowej procedury identyfikacji bakterii opartej na bibliotece przy użyciu MALDI do spektrometrii mas. Osiąga się to poprzez najpierw uzyskanie widm masowych bakterii za pomocą spektrometru masowego Maloffa. W tym badaniu zbierane są widma masowe 15 bakterii wyizolowanych ze środowiska, w wyniku których powstają piki, charakterystyczne wzory lub odciski palców analizowanych bakterii.

Te widma mas są następnie importowane do oprogramowania i tworzona jest baza danych modeli. Następnie widma mas referencyjnych w bazie danych modelu są przetwarzane i analizowane za pomocą analizy skupień, dopasowania pików i analizy statystycznej. Na koniec widma masowe ślepo zakodowanych bakterii, które są losowo wybierane spośród tych 15 bakterii, są ponownie zbierane i porównywane z widmami referencyjnymi w bazie danych modelu w celu uzyskania wyników identyfikacji, co pokazuje, że bakterie można prawidłowo zidentyfikować na podstawie współczynników podobieństwa lub potencjalnych biomarkerów i klas pików.

Rozpocznij tę procedurę od naniesienia jednego mikrolitra ekstraktu białkowego niezawierającego żywych komórek na płytce docelowej maldi ze stali nierdzewnej i pozostaw do wyschnięcia. Następnie pokryj wysuszony ekstrakt białkowy jednym mikrolitrem roztworu matrycy i pozostaw do wyschnięcia. Następnie nanieść jeden mikrolitr wzorca CBR na tarczę po wyschnięciu, pokryć CBR jednym mikrolitrem roztworu matrycy i pozostawić do wyschnięcia.

Na koniec nanieść dwa mikrolitry roztworu matrycy na płytkę docelową jako kontrolę ujemną. Użyj spektrometru wielomasowego wyposażonego w laser azotowy i obsługiwanego za pomocą oprogramowania sterującego elastycznością firmy Bruker. Zbierz każde widmo masy w dodatnim trybie liniowym, gromadząc 500 strzałów laserowych w przyrostach co 100 strzałów.

Ustaw jedno napięcie źródła jonów na 20, kilowolty źródło jonów, dwa napięcia na 18,15 kilowolta, a napięcie soczewki na 9,05 kilowolta. Parametry te są specyficzne dla danego instrumentu i mogą wymagać optymalizacji. Ustaw zakres masy do ładunku dla automatycznej oceny widma od dwóch do 20 kilodaltonów na ładunek.

Następnie ustaw minimalny próg rozdzielczości na 100. Wybierz algorytm wykrywania piku OID. Ustaw próg stosunku sygnału do szumu na dwa, a minimalny próg intensywności na 100.

Na koniec ustaw akumulację szczytową na 500 na potrzeby projektowania bazy danych. Utwórz nową bazę danych w bio numerics 7.1 za pomocą kreatora nowej bazy danych. Następnie utwórz typ eksperymentu widma, taki jak maldi, używając poleceń w panelu typów eksperymentów.

Następnie utwórz poziomy za pomocą panelu projektowania bazy danych, przejdź do menu bazy danych i dodaj nowe poziomy za pomocą polecenia dodaj nowy poziom tutaj. Utwórz poziom gatunku, poziom repliki biologicznej i poziom techniczny. Aby zaimportować surowe widma masowe.

Najpierw wyeksportuj surowe widma masowe jako pliki tekstowe za pomocą analizy flex, przechodząc do menu pliku i klikając polecenie eksportuj widmo masy. Następnie zaimportuj widma mas surowych do bazy danych na poziomie powtórzeń technicznych. Wstępnie przetworzyć widma mas surowych, importując i ponownie próbkując przy użyciu algorytmu dopasowania kwadratowego.

Następnie wykonaj odejmowanie linii bazowej za pomocą toczącej się tarczy o wielkości 50 punktów, oblicz szum za pomocą ciągłej transformacji falkowej lub CWT. Wygładź widma za pomocą okna Kaisera o rozmiarze okna 20 punktów i becie 10 punktów. Następnie wykonaj drugie odejmowanie linii bazowej za pomocą tarczy tocznej o rozmiarze 200 punktów.

Na koniec wykryj piki za pomocą CWT z minimalnym stosunkiem sygnału do szumu wynoszącym 10 po wstępnym przetworzeniu bezpiecznych wzorców charakterystycznych dla każdego widma masowego, takich jak listy pików, zawierające rozmiary pików, intensywności pików i stosunek sygnału do szumu. W następnym utwórz widma mas złożonych ze wstępnie przetworzonych widm za pomocą polecenia summarized w menu analizy. Jako poziom docelowy należy wybrać replikację biologiczną. Tu.

Połącz widma masowe 10 technicznych powtórzeń tej samej kolonii, aby uzyskać złożone widmo masowe dla tej kolonii, co daje trzy złożone widma masowe dla tego izolatu na poziomie kontrpróby biologicznej. Na koniec podsumuj trzy widma złożone, aby utworzyć jedno widmo złożone dla tego izolatu na poziomie gatunku. Aby przeprowadzić analizę skupień na podstawie podobieństwa i skalowanie wielowymiarowe, utwórz grupy z kolorami.

Najpierw wybierz trzy biologiczne widma mas złożonych i kliknij polecenie utwórz nową grupę z wyboru w menu grupy, aby utworzyć grupę dla odpowiedniego izolatu. Następnie zaprojektuj kolor automatycznie używany dla tych trzech widm masowych. Analizę skupień można przeprowadzić, przechodząc do menu klastrowania i klikając polecenie oblicz analizę skupień.

W ustawieniach porównania, na stronie pierwszej, wybierz korelację Pearsona i pozostaw inne parametry jako domyślne. Na drugiej stronie wybierz metodę grupowania par nieważonych ze średnią arytmetyczną. Następnie kliknij przycisk Zakończ.

Uzyskaj wielowymiarowy wykres skalowania za pomocą polecenia skalowania wielowymiarowego w menu statystyk, aby wykonać dopasowywanie szczytów. Kliknij na typ widma maldi w panelu eksperymentów. Następnie wybierz układ.

Pokaż obraz, pokazane są poszczególne piki widm. Następnie wykonaj dopasowywanie pików za pomocą polecenia do peak matching w menu spectra, aby zidentyfikować klasy pików, wykonaj dwukierunkowe grupowanie, klikając macierz statystyczna. Górnictwo. Intensywność pików dopasowanych do klas pików jest reprezentowana jako mapa cieplna w celu identyfikacji bakterii za pomocą metody opartej na współczynniku podobieństwa, utworzenia porównania i wygenerowania rogramu na podstawie widm masowych na poziomie technicznej replikacji, jak to ma miejsce w przypadku analizy skupień, zachowaj rogram do porównania podobieństwa.

Wybierz nieznane widmo mas i kliknij analizę. Zidentyfikuj wybrane wpisy. Pojawi się okno dialogowe identyfikacji.

Wybierz typ klasyfikatora opartego na porównaniu i kliknij przycisk Dalej. Na następnej stronie wybierz zapisany gram jako porównanie referencyjne, a następnie kliknij przycisk Dalej. Wybierz podstawowe podobieństwo jako metodę identyfikacji i ponownie kliknij Dalej, wybierz maksymalne podobieństwo jako metodę punktacji.

Wpisz odpowiednie wartości progowe i minimalne wartości różnicy dla każdego parametru, a następnie kliknij przycisk Dalej. Po zakończeniu obliczeń w panelu wyników pojawi się okno identyfikacji. Zostaną wyświetlone elementy członkowskie bazy danych, które najlepiej pasują do nieznanego.

Rogram oparty na analizie klastrów pokazuje podobieństwo między każdym izolatem w bazie danych. Zestaw danych zawiera widma 15 różnych gatunków z trzema widmami złożonymi dla każdego gatunku. Dwukierunkowa analiza skupień może pomóc naukowcom w identyfikacji potencjalnych biomarkerów dla danego gatunku lub szczepów w obrębie gatunku.

Tutaj szczytowa intensywność jest reprezentowana przez kolory, zielony oznacza niską intensywność, a czerwony oznacza wysoką intensywność. Wreszcie, w oparciu o tę analizę, widmo masowe niewiadomej można porównać z gramem i uzyskać identyfikację opartą na współczynniku podobieństwa.