Name: Slice It Hot: Ostre cięcie mózgu dorosłego w temperaturze fizjologicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj metodę przygotowania ostrych plasterków mózgu w temperaturze fizjologicznej bez skomplikowanych modyfikacji. Technika ta umożliwia prowadzenie wysokiej jakości eksperymentów elektrofizjologicznych in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować za znaczący wkład dr Shiwei Huang (Australian National University) w walidację metody. Ponadto chcielibyśmy podziękować Pani Kasi Pietrajtis za pomocne uwagi dotyczące komórek Golgiego oraz Panu Witalijowi Lernerowi za dane eksperymentalne kory mózgowej. Prace te były wspierane przez PITN-GA-2009-238686 (CEREBNET), FP7-ICT (REALNET), ELSC i ISF.

Wszystkie procedury eksperymentalne opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Hebrajskiego.
1. Przygotowanie rozwiązań i narzędzi do krojenia
<ol>
	<li>Przygotować 1 l wzorcowego roztworu fizjologicznego (SPS) zawierającego jony opisane w Tabeli 1.
	<ol>
		<li>Przygotować wcześniej roztwór podstawowy zawierający sole o stężeniu 10-krotnie wyższym od końcowego w szklanej butelce wypełnionej 1 000 ml wody dejonizowanej (przewodność 0,055 μS/cm). Dodaj sole (NaCl, KCl, KH,2, PO4 iMgSO4) i mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotuj końcowy roztwór SPS w dniu eksperymentu. Dodać 100 ml roztworu podstawowego do 700 ml oczyszczonej wody, rozpuścić glukozę (3,6 g) i NaHCO3 (2,18 g) za pomocą mieszadła magnetycznego, a następnie dodać oczyszczoną wodę do 1 l.</li>
		<li>Wyrównać roztwór, gazując go 95%O2 / 5% CO2 przez ~20 min. Następnie dodać 2 ml 1 M roztworu CaCl2</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Zmontuj następujące narzędzia (Rysunek 1).
	<ol>
		<li>Przygotuj duże nożyczki lub inne narzędzie do dekapitacji, małe nożyczki chirurgiczne do otwierania czaszki, kleszcze z cienką końcówką do podnoszenia czaszki w celu odsłonięcia mózgu, skalpel z ostrzem do wypreparowania żądanej części mózgu do pokrojenia i małą szpatułkę do manipulowania wypreparowanymi częściami mózgu.</li>
		<li>Ponadto przygotuj małe kawałki bibuły filtracyjnej do usunięcia nadmiaru płynu z mózgu, dwie małe szalki Petriego do wypreparowania mózgu w dwóch szklanych zlewkach o pojemności 500 ml do przechowywania podgrzanej oczyszczonej wody i SPS oraz kleju cyjanoakrylowego do sklejenia mózgu do etapu krojenia.</li>
		<li>Przygotuj małą szczoteczkę do obchodzenia się z plastrami podczas krojenia oraz szklaną pipetę Pasteura z szerokim otworem do przenoszenia plastrów z kąpieli krojącej do komory regeneracyjnej. Zdezynfekuj narzędzia, aby zapobiec rozwojowi bakterii w ciepłych kąpielach w plastrach. Ponadto należy używać czystych rękawic laboratoryjnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj zanurzoną komorę odzyskiwania plastrów, taką jak opisana przez Gibba i Edwardsa15. Stale gazuj SPS w nim 95% O2 / 5% CO2 i utrzymuj w temperaturze 36 °C. Upewnij się, że gazowanie nie powoduje uwięzienia w kąpieli małych pęcherzyków, które mogłyby uszkodzić plastry.</li>
	<li>Podgrzać ~300 ml SPS do temperatury 36 °C na grzałce z mieszadłem magnetycznym lub w łaźni wodnej. Jeśli używana jest płyta grzewcza, należy uważać, aby nie dopuścić do przegrzania roztworu, co może spowodować wytrącanie się jonów. W takim przypadku ogrzej świeży SPS zamiast chłodzić stary.</li>
	<li>Doprowadź ~500 ml oczyszczonej wody do wrzenia za pomocą czajnika elektrycznego i w zlewce połącz 300 ml z zimną wodą, aby uzyskać nieco cieplejszą wodę niż temperatura krojenia. Użyj tej podgrzanej, oczyszczonej wody podczas dekapitacji, a pozostałą część przegotowanej wody wykorzystaj później do utrzymania fizjologicznej temperatury kąpieli krojącej.</li>
	<li>Znieczulić mysz, wstrzykując dootrzewnowo 0,1 ml pentobarbitalu (60 mg/ml). Po kilku minutach sprawdź, czy zwierzę nie reaguje na silne szczypanie palca u nogi lub ogona, aby upewnić się, że nie ma czucia.</li>
</ol>
2. Sekcja mózgu
<ol>
	<li>Szybko odetnij głowę myszy, przecinając szyję dużymi nożycami z tyłu czaszki i pozwól, aby głowa wpadła do zlewki z podgrzaną oczyszczoną wodą, aby spłukać nadmiar krwi.</li>
	<li>Odsłoń otwór wielki w czaszce pod mięśniami szyi i skórą, ewentualnie usuwając większą część szyi małymi nożyczkami.</li>
	<li>Pociągnij skórę na szczycie czaszki, aby móc wyraźnie zobaczyć szwy czaszki, aby pokierować otwarciem czaszki.</li>
	<li>Rozetnij czaszkę, wkładając dolną końcówkę małych nożyczek przez otwór wielki i natychmiast obracając je w kierunku bocznej strony. Delikatnie przeciąć wzdłuż bocznej krawędzi kości ciemieniowej do miejsca za oczami i szwem czołowo-ciemieniowym; następnie obróć się w kierunku środka czaszki i przetnij linię środkową na drugą stronę czaszki (patrz zielona przerywana linia na rysunku 2A).</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką podnieś czaszkę z narożnika czołowo-ciemieniowego i pociągnij ją po przekątnej w górę i na boki, aby odsłonić mózg (patrz żółta przerywana strzałka na rycinie 2A). Upewnij się, że czaszka nie jest przymocowana do żadnej kości ani skóry głowy, tak aby mózg pozostał na swoim miejscu, gdy czaszka zostanie podniesiona. W przypadku, gdy mózg porusza się wraz z czaszką, użyj małych nożyczek, aby usunąć tkankę łączną między czaszką a mózgiem.</li>
	<li>Kiedy mózg jest odsłonięty, nie pozwól, aby mózg był suchy. Wykonuj więc kolejne kroki, trzymając czaszkę i mózg na szalce Petriego wypełnionej podgrzanym, zagazowanym SPS.</li>
	<li>Odłącz część mózgu używaną do eksperymentu od reszty mózgu za pomocą skalpela i szpatułki. W przypadku korzystania z móżdżku, należy odłączyć go od przodomózgowia za pomocą pojedynczego nacięcia przez śródmózgowie i most (wzdłuż czerwonych linii na rysunkach 2B-D) i przenieść go na małą szalkę Petriego, która zawiera świeże, zagazowane SPS.</li>
	<li>Usuń pień mózgu, aby utworzyć prostą i szeroką podstawę do przyklejenia mózgu do etapu cięcia podczas krojenia móżdżku w płaszczyźnie poziomej. Na krótko umieść móżdżek na mokrym kawałku bibuły filtracyjnej tak, aby strona odcięta od przodomózgowia była skierowana w dół.
	<ol>
		<li>Przeciąć pień mózgu skalpelem, aby utworzyć podstawę (jak pokazano niebieską linią na rysunku 2B) i przywrócić móżdżek do SPS. Gdy potrzebne są inne płaszczyzny cięcia, należy odpowiednio przyciąć blok móżdżku (niebieskie linie na rysunkach 2C i D).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Cięcie mózgu
<ol>
	<li>Przygotuj etap cięcia, upewniając się, że jest suchy, a następnie nałożyć niewielką kroplę kleju superglue na środek etapu.</li>
	<li>Podnieś blok mózgu z SPS za pomocą szpatułki właściwą stroną do góry i usuń nadmiar płynu z mózgu za pomocą małych kawałków bibuły filtracyjnej. Następnie, jednym ruchem, wsuń mózg ze szpatułki na kroplę kleju na scenie.</li>
	<li>Aby zapobiec wysuszeniu mózgu i spływaniu kleju po bokach tkanki, nałóż kilka kropli SPS za pomocą pipety Pasteura i umieść etap cięcia w komorze krojenia. Ustaw blok mózgowy tak, aby obszary zainteresowania (np. kora móżdżku) były skierowane w stronę ostrza, a zatem były poddawane najmniejszemu naciskowi mechanicznemu przed pocięciem.</li>
	<li>Pokrój każdy plasterek zgodnie z instrukcjami producenta, stale gazując SPS w komorze krojenia, a także utrzymując temperaturę na poziomie 34-37 °C. Utrzymuj temperaturę komory krojenia w tym zakresie, napełniając zewnętrzną komorę krajalnicy podgrzaną, oczyszczoną wodą i wymieniając wodę, gdy temperatura spadnie zbyt nisko. 
UWAGA: Parametry krojenia muszą być eksperymentalnie znalezione dla każdego rodzaju badanej tkanki i neuronów. W przypadku krajalnicy Campden SMZ 700 z ceramicznymi ostrzami i komórkami Golgiego móżdżku należy zastosować amplitudę drgań 0,75 mm przy 65 Hz i prędkość posuwu 0,05 mm/s; w przypadku neuronów jądrowych móżdżku zalecana jest wyższa amplituda i częstotliwość (odpowiednio 1 mm i 90 Hz) oraz wolniejsza prędkość postępu (0,01-0,02 mm/s). Zarówno w przypadku neuronów jądrowych Golgiego, jak i móżdżku, grubość warstwy powinna wynosić 300 μm.</li>
	<li>Podczas krojenia nie pozwól, aby plastry same się złożyły. Zapobiegnij temu, delikatnie podpierając je miękką szczoteczką, najlepiej dotykając plasterka tylko w miejscach, które nie są interesujące dla eksperymentu. Uważaj, aby szczoteczka nie dotykała ostrza wibratomu; Szczególnie w przypadku ostrzy ceramicznych nawet lekki kontakt może uszkodzić ostrze.</li>
	<li>Przenieś każdą kromkę z komory krojenia do komory odzyskiwania/przytrzymywania za pomocą pipety Pasteura z szerokimi otworami, polerowanego ogniowo.</li>
	<li>Pozostaw plastry w komorze na co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu. Pozwala to na degradację uszkodzonych lub umierających tkanek i komórek, a tym samym skutkuje czystszą powierzchnią plastru. Przez pierwszą godzinę utrzymywać temperaturę SPS w komorze w zakresie 34-36 °C; Upewnij się, że plastry nie są dotykane przez pęcherzyki powietrza, które mogą je uszkodzić lub sprawić, że będą unosić się na wodzie.</li>
</ol>
4. Eksperyment
<ol>
	<li>Po upływie 1 godziny odczekać, aż temperatura komory rekuperacji ostygnie do temperatury RT (17-25 °C). 
	UWAGA: Może to wydłużyć okres, w którym plastry mogą być używane, spowalniając wzrost bakterii, a także metabolizm komórkowy. Okres ten zależy od regionu mózgu i typu komórki. Na przykład niektóre typy komórek Golgiego można uznać za zdrowe w plasterkach 8 godzin po pokrojeniu, podczas gdy inne typy trwają tylko 6 godzin.</li>
	<li>Po upływie 1 godziny od krojenia użyj plastrów do różnych eksperymentów elektrofizjologicznych.</li>
</ol>

<ol><li>Skrede, K., Westgaard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transverse+hippocampal+slice%3A+a+well-defined+cortical+structure+maintained+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro.</a> Brain Research. 35, 589-593 (1971).</li>
<li>Aghajanian, G., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li>
<li>Gueritaud, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activity+of+rat+ocular+motoneurons+recorded+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Electrical activity of rat ocular motoneurons recorded in vitro.</a> Neuroscience. 24, 837-852 (1988).</li>
<li>Lipton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+best+of+brain+slices%3A+comparing+preparative+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Making the best of brain slices: comparing preparative methods.</a> Journal of Neuroscience Methods. 59, 151-156 (1995).</li>
<li>Richerson, G., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Experimental Neurology. 131, 133-143 (1995).</li>
<li>Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+inhibits+edema+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Ascorbate inhibits edema in brain slices.</a> Journal of Neurochemistry. 74, 1263-1270 (2000).</li>
<li>Moyer, J. R., Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+techniques+applied+to+brain+slices.+In%3A+Patch-clamp+analysis%3A+advanced+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Springer%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp techniques applied to brain slices. In: Patch-clamp analysis: advanced techniques.</a> Springer. , 135-193 (2002).</li>
<li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices%3A+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> J. Neuroscience Methods. 156, 251-259 (2006).</li>
<li>Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+recording+from+mossy+fiber+terminals+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices.</a> Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type%E2%80%93specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type–specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8, 745-752 (2011).</li>
<li>Huang, S., Uusisaari, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+temperature+during+brain+slicing+enhances+the+quality+of+acute+slice+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations.</a> Front. Cell. Neurosci. 7, (2013).</li>
<li>Ohe, G. C., Darian-Smith, C., Garner, C. C., Heller, H. C. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10590-10598 (2006).</li>
<li>Voets, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+principle+of+temperature-dependent+gating+in+cold-+and+heat-sensitive+TRP+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The principle of temperature-dependent gating in cold- and heat-sensitive TRP channels.</a> Nature. 430, 748-754 (2004).</li>
<li>Coulter, D. A., Huguenard, J. R., Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+currents+in+rat+thalamocortical+relay+neurones%3A+kinetic+properties+of+the+transient%2C+low-threshold+current%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Calcium currents in rat thalamocortical relay neurones: kinetic properties of the transient, low-threshold current.</a> The Journal of Physiology. 414, 587-604 (1998).</li>
<li>Gibb, A. J., Edward, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+recording+from+cells+in+slice+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microelectrode+Techniques%3A+the+Plymouth+workshop+handbook%22%5BJournal%5D)">Patch clamp recording from cells in slice tissues.</a> Microelectrode Techniques: the Plymouth workshop handbook. , 2nd edition, Company of Biologists. Cambridge, UK. (1994).</li>
<li>Lefler, Y., Yarom, Y., Uusisaari, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+Inhibitory+Input+to+the+Inferior+Olive+Decreases+Electrical+Coupling+and+Blocks+Subthreshold+Oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cerebellar Inhibitory Input to the Inferior Olive Decreases Electrical Coupling and Blocks Subthreshold Oscillations.</a> Neuron. 81 (6), 1389-1400 (2014).</li>
<li>Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warmer+preparation+of+hippocampal+slices+prevents+synapse+proliferation+that+might+obscure+LTP-related+structural+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity.</a> Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).</li>
<li>Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slices+have+more+synapses+than+perfusion-fixed+hippocampus+from+both+young+and+mature+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats.</a> J. Neurosci. 19, 2876-2886 (1999).</li>
<li>Kirov, S. A., Petrak, L. J., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines+disappear+with+chilling+but+proliferate+excessively+upon+rewarming+of+mature+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus.</a> Neuroscience. 127, 69-80 (2004).</li>
<li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> J. Neurosci. Methods. 171, 181-125 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Demonstrujemy metodę przygotowywania ostrych wycinków mózgu myszy w temperaturze fizjologicznej, a nie lodowatej.
Wykazano11 , że jakość plastrów uzyskanych w ciepłych warunkach jest lepsza w porównaniu z tymi przygotowanymi w zimnych warunkach, pod warunkiem, że ostrze krajalnicy ma minimalne wibracje pionowe. Krojenie w temperaturze fizjologicznej może zapobiec artefaktom fizjologicznym spowodowanym niską temperaturą, takim jak te związane ze zmianami w procesach metabolicznych<su...

Celem prezentowanej metody jest uzyskanie wysokiej jakości ostrych wycinków mózgu do eksperymentów elektrofizjologicznych in vitro, zwłaszcza przy użyciu dorosłych lub nawet starych zwierząt.
Metoda ostrego cięcia mózgu, opisana przez Skrede i Westgaarda1 w dwóch eleganckich zdaniach, stała się jednym z fundamentów współczesnych badań neurobiologicznych i jest stosowana w niezliczonych odmianach na całym świecie. Jakość wycinków znajduje odzwierciedlenie w liczbie żywych neuronów w wycinku, okresie czasu, w którym komórki zachowują swoje właściwości elektrofizjologiczne i morfologiczne, a także w integralności tkanki. Co więcej, maksymalny czas trwania stabilnych nagrań zależy od jakości plastrów. W związku z tym na przestrzeni dziesięcioleci oryginalna metoda krojenia była dalej rozwijana przez poszczególne grupy badawcze w celu zwiększenia regeneracji plastrów po pokrojeniu2-10, często poprzez złożone modyfikacje składu roztworów do krojenia lub odzyskiwania (takie jak dodanie askorbinianu, tiomocznika, a nawetH2O2), a także wstępną perfuzję wewnątrzsercową zwierzęcia za pomocą schłodzonych roztworów fizjologicznych.
Jak ostatnio wykazano11, temperatura fizjologiczna podczas krojenia wydaje się być bardziej korzystna dla zdrowia neuronów niż chłodzenie; poprawa jest najbardziej uderzająca podczas pracy z dorosłymi (2-8 miesięcy) gryzoniami. Unikanie dramatycznych zmian temperatury zapobiega powstawaniu artefaktów spowodowanych procesami zależnymi od temperatury w komórkach, takimi jak plastyczność13 i kinetyka kanałów jonowych13,14. Takie zmiany mogą wpływać na napięcie błony i wewnątrzkomórkową sygnalizację wapnia, próg kolca i kształt kolca.
Przedstawiona tutaj metoda przygotowania "gorącego" ostrego plastra to ogólna procedura uzyskiwania wysokiej jakości ostrych wycinków mózgu z dowolnego obszaru mózgu, w tym móżdżku, kory mózgowej i hipokampa, jąder pnia mózgu16, jak również opuszki węchowej, zarówno u szczurów, jak i myszy.
Zauważ, procedura krojenia temperatury fizjologicznej wymaga, aby ostrze tnące wibrowało prawie idealnie poziomo i było pozbawione żadnych wad strukturalnych. Taka precyzja może nie być osiągalna w przypadku starszych modeli krajalnicy; W takich przypadkach zalecamy wykonanie preparatu plastra w warunkach mroźno-zimnych, ponieważ niska temperatura wydaje się uodparniać tkankę na uszkodzenia mechaniczne, nawet jeśli odbywa się to kosztem aberracji metabolicznych.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>CTS</td><td>170066</td><td>Stężenie: 60 mg/ml w soli fizjologicznej.</td></tr><tr><td>Duże nożyczki&nbsp;</td><td>FST</td><td>14001-16</td><td>Do dekapitacji można użyć dowolnych dużych nożyczek lub gilotyny o wystarczająco ostrych krawędziach&nbsp;</td></tr><tr><td>Nożyczki do przysłony&nbsp;</td><td>Prestige medical</td><td>48,148</td><td>Można używać dowolnych nożyczek z cienką końcówką, pod warunkiem, że ostrza nożyczek nie są dłuższe niż 1.5&#8211; 2 cm</td></tr><tr><td>Kleszczyki z cienką końcówką&nbsp;</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel&nbsp;</td><td>FST</td><td>91003-12</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela #11</td><td>FST</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Mała szpatułka&nbsp;</td><td>Rybacy&nbsp;</td><td>2350</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła</td><td></td><td></td> filtracyjna <td>Można użyć dowolnej marki laboratoryjnej.</td></tr><tr><td>Szalki</td><td>Petriego Duroplan</td><td>Z231509-1</td><td></td></tr><tr><td>Szklane zlewki&nbsp;</td><td>SCHOT</td><td>10022846</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura&nbsp;</td><td>Marka liścia klonu</td><td>14672-029</td><td></td></tr><tr><td>Super klej&nbsp;</td><td>LOCTITE</td><td>4091361/1</td><td></td></tr><tr><td>Krajalnica</td><td>Campden</td><td>7000-smz</td><td></td></tr><tr><td>Ceramiczne ostrze do krojenia</td><td>Campden</td><td>7550-1-C</td><td></td></tr><tr><td>Grzałka/mieszadło</td><td></td><td></td> magnetyczne <td>Do podgrzewania SPS do zabiegu</td></tr><tr><td>Czajnik</td><td></td><td></td> elektryczny <td>Do podgrzewania wody w celu kontroli temperatury</td></tr><tr><td>Komora odzysku plastrów + jednostka grzewcza</td><td>Warner Instrumenty</td><td>&nbsp; BSC-HT +&nbsp; Można również stosować modele BSC-BUW</td><td>zbudowane w domu.</td></tr><tr><td>Termometr</td><td></td><td></td><td>do monitorowania temperatury SPS podczas rozcinania i krojenia</td></tr></tbody></table>

slice it hot: ostre cięcie mózgu dorosłego w temperaturze fizjologicznej

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania ostrych wycinków mózgu. Procedura ta jest kluczowym elementem w elektrofizjologicznych eksperymentach z zaciskiem krosowym, który w dużej mierze decyduje o jakości wyników. Wykazano, że pominięcie etapu chłodzenia podczas procedury krojenia jest korzystne w uzyskiwaniu zdrowych plastrów i komórek, zwłaszcza w przypadku silnie zmielinizowanych struktur mózgu dojrzałych zwierząt. Chociaż dokładny mechanizm, dzięki któremu podwyższona temperatura wspiera zdrowie neuronów, może być tylko spekulowany, ma się rozumieć, że jeśli to możliwe, temperatura, w której odbywa się krojenie, powinna być zbliżona do warunków fizjologicznych, aby zapobiec artefaktom związanym z temperaturą. Kolejną ważną zaletą tej metody jest prostota zabiegu, a co za tym idzie krótki czas przygotowania. W zademonstrowanej metodzie wykorzystuje się dorosłe myszy, ale tę samą procedurę można zastosować zarówno u młodszych myszy, jak i szczurów. Również poniższy eksperyment z zaciskiem łatkowym jest wykonywany na poziomych wycinkach móżdżku, ale ta sama procedura może być również stosowana w innych płaszczyznach, a także w innych tylnych obszarach mózgu.

Platki przygotowane w opisany sposób mogą być wykorzystane w różnych eksperymentach elektrofizjologicznych i optogenetycznych. Na Rysunku 3A i 3C przedstawiono odpowiednio reprezentatywny przykład poziomego plastra móżdżku oraz coronalnego plastra kory mózgowej, widziane w optyce kontrastu interferencyjnego (DIC). W plastrze móżdżku kilka typów neuronów móżdżkowych można łatwo rozpoznać po ich lokalizacji i kształcie ciała komórkowego, co umożliwia celowane rejestracje elektrofizjologicz...

W tym artykule pokazujemy metodę przygotowania ostrych wycinków mózgu w temperaturze fizjologicznej, przy użyciu konwencjonalnego roztworu fizjologicznego bez specjalnych modyfikacji krojenia (takich jak dodanie sacharozy) i bez wewnątrzsercowej perfuzji zwierzęcia przed przygotowaniem plastrów.

Slice It Hot: Ostre cięcie mózgu dorosłego w temperaturze fizjologicznej

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyprodukowanie wysokiej jakości ostrych wycinków mózgu. Osiąga się to poprzez najpierw wydobycie mózgu ze zwierzęcia. Drugim krokiem jest wypreparowanie interesującego obszaru mózgu i przymocowanie go do etapu krojenia, jednocześnie utrzymując go wilgotnym roztworem do krojenia.Następnie mózg jest zanurzany w roztworze do krojenia temperatury fizjologicznej. Ostatnim krokiem jest pokrojenie mózgu w plastry viome. Ostatecznie plastry mogą być wykorzystywane w różnych eksperymentach elektrofizjologicznych in vitro.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak krojenie na zimno, jest to, że jest prostsza i daje lepsze wyniki. Ogólnie rzecz biorąc, każdy, kto jest nowy w tej metodzie, będzie miał trudności, ponieważ wymaga ona, aby wszystkie kroki były wykonywane płynnie i szybko, bez zbędnych opóźnień. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy potrzebowaliśmy uzyskać wysokiej jakości plastry jądra móżdżku od dorosłych zwierząt.Metoda zostanie zademonstrowana przez Le Anri, studenta w naszym laboratorium przed rozpoczęciem tej procedury. Upewnij się, że narzędzie, narzędzia i rozwiązania są przygotowane wcześniej. Tabela pierwsza przedstawia skład wzorcowego roztworu fizycznego lub SPS, w którym mózg zostanie przecięty po przygotowaniu roztworu roboczego SPS.Zgodnie z pisemnym protokołem, równoważ roztwór z 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla przez 20 minut, podczas gdy SPS Equilibrates organizują narzędzia potrzebne do krojenia. Rysunek ten przedstawia rozmieszczenie narzędzi używanych do krojenia mózgu i może być używany jako wizualne odniesienie podczas ustawiania klucza do identyfikacji każdego elementu zawartego w pisemnym protokole. Po zakończeniu równoważenia roztworu roboczego SPS dodać dwa mililitry jednego molowego chlorku wapnia do SPS, a następnie zdekantować około 300 mililitrów roztworu do zlewki.Umieścić zlewkę zawierającą SPS na płycie grzewczej lub w łaźni wodnej do podgrzania do 36 stopni Celsjusza. Jeśli używana jest grzałka, należy dołączyć mieszadło magnetyczne i upewnić się, że roztwór się nie przegrzewa, ponieważ spowoduje to wytrącanie się żelaza i sprawi, że roztwór stanie się bezużyteczny. Następnie zagotuj około 500 mililitrów oczyszczonej wody w czajniku elektrycznym i dodaj to do zlewki zawierającej 300 mililitrów chłodnej oczyszczonej wody, aby uzyskać wodę nieco cieplejszą niż 36 stopni Celsjusza po znieczuleniu i odcięciu głowy myszy.Zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami, głowę płucze się z nadmiaru krwi w zlewce z podgrzaną wodą. Następnie użyj małych nożyczek, aby odsłonić otwór i magnum czaszki i odciągnij skórę, aby odsłonić czaszkę i lepiej uwidocznić szwy czaszki, aby otworzyć czaszkę. Włóż końcówkę małych nożyczek przez przedramię i magnum.Natychmiast obróć je w stronę boczną i delikatnie przeciąć wzdłuż bocznej półki kości ciemieniowej do miejsca za oczami i szwem czołowym ciemieniowym. Następnie obróć nożyczki w kierunku środka czaszki i przetnij linię środkową na drugą stronę czaszki. Ten diagram pokazuje pełny wzór cięć otwierających czaszkę.Teraz użyj cienkich kleszczy, aby podnieść czaszkę z przedniego kącika ciemieniowego i pociągnij ją w górę po przekątnej, aby odsłonić mózg, przenieś mózg i pozostałą czaszkę na szalkę Petriego zawierającą ciepły gaz. SPS. Następnie użyj skalpela i szpatułki, aby odłączyć obszar zainteresowania od reszty mózgu. W tym przypadku wykonuje się pojedyncze cięcie zarówno przez śródmózgowie, jak i most, aby odłączyć móżdżek.Czerwona linia na tym schemacie ilustruje położenie cięcia. Opłucz móżdżek, umieszczając go na drugiej małej szalce Petriego zawierającej ciepły, nagazowany SPS. Następnie przenieś móżdżek na kawałek mokrej bibuły filtracyjnej.Użyj skalpela, aby przeciąć pień mózgu mózgu, aby utworzyć prostą, szeroką podstawę, którą należy przykleić do etapu cięcia. Niebieska linia na tym schemacie pokazuje obszar, który będzie bliski etapowi cięcia. Na koniec włóż przecięty móżdżek z powrotem na małą szalkę Petriego zawierającą ciepły gaz SPS, a następnie przystąp do krojenia.Najpierw upewnij się, że etap cięcia jest suchy, a następnie nałóż niewielką kroplę kleju cyjanoakrylowego na środek etapu. Następnie użyj suli, aby podnieść blok mózgu z SPS i przetrzyj go małym kawałkiem bibuły filtracyjnej, aby usunąć nadmiar płynu z mózgu. Po usunięciu nadmiaru płynu jednym ruchem wsuń mózg ze szpatułki na kroplę kleju.Następnie użyj makaronu od zwierzaka, aby nałożyć kilka kropli SPS na mózg. Umieść etap cięcia z mózgiem przymocowanym do komory krojenia. Ustaw blok mózgowy tak, aby kora móżdżku była skierowana w stronę ostrza.Gwarantuje to, że obszar zainteresowania jest poddawany najmniejszemu naciskowi mechanicznemu przed pokrojeniem. Teraz rozpocznij cięcie mózgu za pomocą mikrotomu zgodnie z instrukcjami producenta, jednocześnie stale gazując SPS w komorze krojenia przez cały czas trwania procedury krojenia. Utrzymuj temperaturę komory tnącej na poziomie od 34 do 37 stopni Celsjusza, napełniając zewnętrzną komorę podgrzaną oczyszczoną wodą.Podczas krojenia delikatnie podeprzyj każdy plasterek miękką szczotką, aby zapobiec jego składaniu. Staraj się nie dotykać obszaru zainteresowania i nie pozwól, aby szczoteczka dotykała ostrza wibratora, ponieważ spowoduje to uszkodzenie ostrza. Używając pipety do makaronu z polerowanego szkła o szerokich otworach, przenieś każdą kromkę z komory krojenia do komory przechowywania zawierającej stale gazowany SPS i utrzymuj w temperaturze 36 stopni Celsjusza.Upewnij się, że gazowanie nie powoduje uwięzienia małych pęcherzyków w komorze, które mogłyby uszkodzić plastry po całkowitym pokrojeniu mózgu. Pozostaw plastry zanurzone w komorze trzymania w temperaturze od 34 do 37 stopni Celsjusza na co najmniej godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu. Pozwala to na degradację uszkodzonej i umierającej tkanki, co skutkuje czystszą powierzchnią plastru.Po upływie godziny poczekaj, aż temperatura komory odzyskiwania ostygnie do temperatury pokojowej. Wycinki są teraz gotowe do użycia w eksperymentach. Na tym zdjęciu przedstawiono poziomy wycinek móżdżku uzyskany za pomocą zademonstrowanej metody.Wskazane są trzy główne warstwy kory móżdżku. GC to warstwa granulatu. PC wskazuje warstwę komórek bikini i ml.Istota biała w warstwie molekularnej jest oznaczona jako elektroda krosowa WMA jest schematycznie rysowana na ogniwie GOGI, w skrócie GOC. Pasek skali reprezentuje 40 mikronów. To jest przykładowe nagranie z komórki GOGI pokazane wcześniej.Nagranie uzyskano za pomocą elektrody patch clamp. W bieżącym trybie cęgowym. kolor jest reprezentatywnym śladem z sześciu szarych śladów.Pokazano tu koronalny wycinek kory mózgowej uzyskany demonstrowaną metodą. Korowe ogniwa parametaliczne pokazano wraz ze schematycznym rysunkiem elektrody krosowej. To jest przykładowe nagranie z zaciskiem krosowym.W obecnym trybie zacisku z ogniwa parametalicznego pokazanego na poprzednim obrazie, ślad pokazuje typowe zachowanie korowej komórki parametalicznej. Podczas tej procedury należy zwrócić uwagę, aby stale monitorować temperaturę.

slice-it-hot-acute-adult-brain-slicing-in-physiological-temperature

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Tutaj opisujemy adaptację protokołów używanych do indukowania plastyczności homeostatycznej w neuronach do badania plastyczności receptorów sprzężonych z białkiem G astrocytów. Metoda ta, ostatnio wykorzystana do badania zmian w mGluR grupy astrocytarnej I u młodych myszy, może być stosowana do pomiaru skalowania różnych astrocytarnych GPCR w tkance dorosłych myszy in situ i in vivo oraz do lepszego zrozumienia wrażliwości receptorów astrocytarnych na zmiany aktywności neuronalnej.

Indukowanie plastyczności receptorów astrocytarnych poprzez manipulację szybkością odpalania neuronów

Ten protokół demonstruje implementację zoptymalizowanej metody ochronnego odzyskiwania N-metylo-D-glukaminy (NMDG) do przygotowania wycinków mózgu. Pojedynczy preparat podłoża jest używany do niezawodnego uzyskiwania zdrowych wycinków mózgu od zwierząt w każdym wieku i do różnych zastosowań eksperymentalnych.

Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy

Ten protokół opisuje podstawowe kroki proceduralne do wykonywania nagrań z użyciem krosówek dla całej komórki. Technika ta pozwala na badanie zachowania elektrycznego neuronów, a gdy jest wykonywana w wycinkach mózgu, pozwala na ocenę różnych funkcji neuronalnych z neuronów, które są nadal zintegrowane w stosunkowo dobrze zachowanych obwodach mózgowych.

Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

Subcellular patch-clamp recordings dają możliwość zbadania funkcjonalnych właściwości dendrytów. Jednak te drobne struktury nie są łatwo dostępne ze względu na ich małą średnicę. Opisany tutaj protokół ma na celu ułatwienie zbierania stabilnych i wiarygodnych zapisów z dendrytów neuronów dopaminowych w wycinkach in vitro.

Subkomórkowe nagrania patch-clamp z domeny somatodendrycznej neuronów dopaminowych nigralnych

Mikroglej, komórki odpornościowe rezydujące w mózgu, szybko reagują zmianami morfologicznymi na modyfikacje swojego środowiska. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać mikroskopię dwufotonową do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku serotoniny lub ATP w ostrych wycinkach mózgu myszy.

Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu

Wprowadzamy powtarzalną i stabilną metodę zapisu optycznego dla wycinków mózgu przy użyciu barwnika wrażliwego na napięcie. W artykule opisano barwienie barwnikiem wrażliwym na napięcie oraz rejestrację sygnałów optycznych przy użyciu konwencjonalnych preparatów plastrów hipokampa.

Szerokokątny zapis optyczny pojedynczych fotonów w wycinkach mózgu przy użyciu barwnika wrażliwego na napięcie

Przedstawiono protokół przygotowania swobodnie pływających kultur warstwowych z dorosłego ludzkiego mózgu. Protokół jest odmianą szeroko stosowanej metody hodowli plastrowej z wykorzystaniem wkładek membranowych. Jest prosty, opłacalny i zalecany do przeprowadzania krótkoterminowych testów mających na celu rozwikłanie mechanizmów neurodegeneracji stojących za chorobami mózgu związanymi z wiekiem.

Krótkoterminowe, swobodnie unoszące się w powietrzu kultury warstwowe z dorosłego ludzkiego mózgu

To jest protokół do przygotowania ostrych plastrów z dorosłych i starzejących się hipokampów myszy, który wykorzystuje transcardialną perfuzję i cięcie plastrów za pomocą lodowatego NMDG-aCSF w celu zmniejszenia niedotlenienia tkanki. Uzyskane w ten sposób plastry pozostają zdrowe przez wiele godzin i nadają się do długotrwałych nagrań typu patch-clamp i nagrań terenowych.

Minimalizacja niedotlenienia w plastrach hipokampa od dorosłych i starzejących się myszy

Ten protokół opisuje przygotowanie poziomych wycinków kory hipokampowo-śródwęchowej (HEC) od myszy wykazujących spontaniczną aktywność fal ostrych. Plastry są inkubowane w uproszczonej komorze przechowawczej, a nagrania są wykonywane w warunkach zanurzonych z szybko płynącym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby promować dotlenienie tkanek i spontaniczne pojawienie się aktywności na poziomie sieci.

Ostre krojenie mózgu myszy w celu zbadania spontanicznej aktywności sieci hipokampa

Przedstawiamy protokół przygotowania ostrych plastrów z grzbietowo-pośredniego hipokampa myszy. Porównujemy ten preparat poprzeczny z cięciem koronalnym pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Poznaj metodę przygotowania ostrych plasterków mózgu w temperaturze fizjologicznej bez skomplikowanych modyfikacji. Technika ta umożliwia prowadzenie wysokiej jakości eksperymentów elektrofizjologicznych in vitro.

Slice It Hot: Ostre cięcie mózgu dorosłego w temperaturze fizjologicznej

Przeglądaj więcej filmów