Name: Optogenetyczna stymulacja nerwu słuchowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Poznaj metodę optogenetycznej stymulacji nerwu słuchowego u myszy w badaniach słuchu. Technika ta pozwala precyzyjnie kontrolować aktywność neuronów spiralnych, oferując lepszą rozdzielczość częstotliwości niż tradycyjne implanty ślimakowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań (Bernstein Focus for Neurotechnology grant 01GQ0810, dla T. Mosera i MED-EL Niemcy); Niemiecką Fundację Badawczą poprzez Centrum Mikroskopii Nanoskalowej i Fizjologii Molekularnej Mózgu (FZT 103, T. Moser) oraz przez SFB889, dla N. Strenzke i T. Mosera).

Wszystkie eksperymenty przedstawione w tej pracy zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi określonymi przez niemieckie prawo do ochrony zwierząt doświadczalnych. Rada ds. Dobrostanu Zwierząt Uniwersytetu w Getyndze oraz Urząd ds. Dobrostanu Zwierząt Kraju Związkowego Dolna Saksonia zatwierdziły eksperymenty.
1. Przygotowanie stymulatora μLED
<ol>
	<li>W przypadku μLED należy najpierw przygotować stymulator μLED. Używaj niebieskich diod LED o powierzchni czynnej 200 na 200 μm (μLED, patrz tabela materiałów).</li>
	<li>przewody do μLED. Następnie zamknij μLED i połączenia za pomocą kleju epoksydowego. Pozostaw urządzenie na noc, aby żywica epoksydowa mogła się utwardzić.</li>
	<li>Aby zapewnić stabilność mechaniczną i izolację elektryczną, przeprowadź przewody przez cienką szklaną kapilarę, użyj kapilar borokrzemianowych o średnicy zewnętrznej 1 mm i uszczelnij połączenie żywicą epoksydową (rysunek 1D) tak, aby kapilarę można było zamontować na mechanicznym manipulatorze. 
	UWAGA: Istnieje kompromis polegający na tym, że kapsuła jest wystarczająco gruba, aby uzyskać dobrą izolację elektryczną (unikając artefaktów stymulacji), ale wystarczająco cienka, aby umożliwić swobodne poruszanie się diody LED wewnątrz pęcherza i zlokalizowanie jej na ślimaku. Dobrą praktyką jest przygotowanie więcej niż jednej diody LED.</li>
	<li>Aby potwierdzić dobrą izolację elektryczną, najpierw przygotuj szalkę Petriego z 0,9% NaCl i zanurz 3 gołe druty miedziane w cieczy. Służy to do symulacji zwierzęcia za pomocą elektrod ABR. Podłącz przewody do ABR-amplifier, a stamtąd do oscyloskopu.</li>
	<li>Następnie podłącz diodę LED do stymulatora i zanurz ją w roztworze, aż zostanie całkowicie pokryta. Napędzaj diodę LED impulsami (patrz krok 3.1.1) maksymalnym dozwolonym prądem przez ponad 20 minut i sprawdź, czy nie ma artefaktów stymulacji. Jeśli się pojawią, wyrzuć diodę LED i wypróbuj nową.</li>
</ol>
2. Zabieg chirurgiczny
<ol>
	<li>Użyj 4-10 tygodniowych myszy transgenicznych z ekspresją ChR2 pod promotorem Thy1.2 (linia 9 w Wang i wsp.13). Aby manipulować zwierzęciem i przeprowadzić operację, zawsze używaj czystych i dobrze zidentyfikowanych narzędzi chirurgicznych.</li>
	<li>Znieczulić zwierzęta wstrzyknięciem dożylnym mieszaniny uretanu (1,32 mg/kg), ksylazyny (5 mg/kg) i buprenorfiny 0,1 μg/g rozcieńczonej w 0,9% sterylnym roztworze NaCl i umieścić mysz na płytce grzewczej w celu utrzymania temperatury ciała na poziomie 37 °C. Przy tej dawce znieczulenie zwykle trwa przez cały protokół eksperymentalny.
	<ol>
		<li>Rozpoczynając 10 minut po wstępnym znieczuleniu, sprawdź, czy nie ma oznak pobudzenia przez odruch wycofania łapy. W przypadku ruchów należy zastosować dawki podtrzymujące uretanu (0,66 mg/kg) i buprenorfiny (0,05 μg/g) rozcieńczonych w 0,9% sterylnym roztworze NaCl (bez ksylazyny). Ponownie sprawdź odruch wycofania łapy i kontynuuj tylko wtedy, gdy odruch jest nieobecny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie ogolić obszar zauszny w ramach przygotowań do nacięcia. Użyj dostępu zausznego, aby dotrzeć do pęcherza (jama ucha środkowego zawierająca powietrze).
	<ol>
		<li>Za pomocą mikrokleszczy ostrożnie wypreparuj i/lub usuń część mięśni szyi, np. platysma, mostkowo-obojczykowo-sutkowy i połuski.</li>
		<li>Znajdź i odsłoń pęcherz (ryc. 1A). Zidentyfikuj pęcherz jako strukturę kostną o charakterystycznym kulistym kształcie z pierścieniem na powierzchni pęcherza, który wskazuje na wprowadzenie błony bębenkowej (ryc. 1A). Zrób otwór końcówką igły insulinowej tuż pod tym pierścieniem. Zacznij od tego, usuń kość pokrywającą pęcherz za pomocą cienkiego Rongeura (gnawer) lub mikrokleszczy w taki sposób, aby promontorium ślimaka było odsłonięte (ryc. 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku ślimaka delikatnie zgolić torebkę kostną, aby otworzyć małe okienko (ślimak: ~500-800 μm), uważając, aby pozostawić nienaruszony błędnik błoniasty (ryc. 1B). Wykonaj ślimak przy drugim skręcie ślimaka, ponieważ jest on wystarczająco daleko od tętnicy strzemiączkowej i od wierzchołka. Otwarcie wierzchołka może spowodować pęknięcie ślimaka, w tym złamanie modiolus.</li>
	<li>W przypadku wprowadzenia okrągłego okienka światłowodu lub implantu μLED do błony bębenkowej, ostrożnie powiększ okrągłą wnękę okienną, drapiąc kostną niszę czubkiem ostrego skalpela (dobrym rozwiązaniem jest ostrze numer 11). Zawsze używaj nowego ostrza lub skalpela. Bądź bardzo ostrożny, ponieważ tętnica strzemiączkowa biegnie bardzo blisko okrągłego okienka (ryc. 1B).</li>
</ol>
3. Stymulacja optyczna przy użyciu dwóch podejść
<ol>
	<li>Do stymulacji przezślimakowej użyj diod μLED lub lasera sprzężonego ze światłowodem.
	<ol>
		<li>Zamontuj kapilarnę z μLED na mechanicznym manipulatorze i ostrożnie umieść μLED na ślimaku. Użyj oABR, wywołanego przez stymulację o długości 3-10 ms ze źródła prądu (zwykle 5-40 mA przy 2,7 V) przy 1-5 Hz, jako sposób na optymalizację pozycji i orientacji μLED.</li>
		<li>Do stymulacji laserowej użyj lasera o fali ciągłej 473 nm i światłowodu 250 μm (patrz Materiały). Podłącz światłowód do źródła niebieskiego lasera, które idealnie oferuje szybką analogową kontrolę mocy (w przeciwnym razie użyj urządzenia akustyczno-optycznego lub szybkiej migawki, aby zdefiniować bodziec optyczny). Za pomocą mikromanipulatora umieść końcówkę włókna bezpośrednio na ślimaku i przymocuj ją tam za pomocą cementu dentystycznego (stymulacja przezślimakowa).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu stymulacji wewnątrzślimakowej wprowadź włókno przez okrągłe okienko do błony bębenkowej scali. Następnie użyj impulsów laserowych o długości 3-10 ms o mocy 10-30 mW (moc wyjściowa światłowodu) przy 1-5 Hz, aby wywołać oABR. Duża amplituda oABR umożliwia eksperymentatorowi obserwację oABR wywołanego pojedynczymi bodźcami na oscyloskopie w celu optymalizacji położenia i orientacji emitera (μLED lub światłowodu) przy użyciu amplitudy oABR jako odczytu.</li>
	<li>Po osiągnięciu dobrego oABR przymocuj włókno za pomocą kleju cyjanoakrylowego lub cementu dentystycznego i poczekaj, aż klej będzie stały. 
	UWAGA: To normalne, że ze ślimaka wydostaje się jakiś płyn. Jednak, aby uniknąć problemów z polimeryzacją cementu, zaleca się wysuszenie regionu za pomocą drobnych bawełnianych.</li>
</ol>
4. Nagrania oABR
<ol>
	<li>Umieść elektrody igłowe pod małżowiną uszną, na wierzchołku i z tyłu w pobliżu nóg i podłącz je do wzmacniacza.</li>
	<li>Zwiększ potencjał różnicy między igłami podskórnymi wierzchołków i wyrostka sutkowatego. Próbkuj z częstotliwością 50 kHz i filtruj (1-10 000 Hz). Wizualizacja potencjału różnicowego na oscyloskopie idealnie w pobliżu zestawu do nagrywania, aby zoptymalizować położenie stymulatora optycznego. Użyj uśredniania sygnału (50-1,000x) i przechowuj dane na komputerze do analizy w trybie offline.</li>
</ol>
5. Zapisy optycznie wywołanych lokalnych potencjałów pola
<ol>
	<li>Umieść zwierzę w ramce stereotaktycznej. Za pomocą kleszczy centralnie pociągnij skórę nad czaszką i wykonaj środkowe nacięcie nożyczkami, które z grubsza rozciągają się między oczami do punktu, w którym mięśnie szyi przyczepiają się do czaszki.
	<ol>
		<li>Odbijaj skórę na boki. Przeciąć okostną wzdłuż szwu strzałkowego i usunąć ją na bok, delikatnie pocierając odsłoniętą kość czaszki wacikiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść specjalnie wykonaną metalową płytkę na odsłoniętej czaszce, pozostawiając około 1 mm odstępu między ogonowym końcem płytki a lambdą. Wiertłem o średnicy 0,7 mm ostrożnie wywierć otwór w kości ciemieniowej.</li>
	<li>Delikatnie wkręć o średnicy 0,85 mm – która ma służyć jako odniesienie dla potencjałów zarejestrowanych z dolnego wzgórka (IC) – przytrzymując kleszczami tak długo, jak długo śruba nie jest dobrze dokręcona. Zapewnij dobry kontakt między śrubą a oponą twardą bez penetracji mózgu. Przyklej i metalową płytkę do czaszki za pomocą kleju cyjanoakrylowego.</li>
	<li>Delikatnie rozluźnij mięśnie szyi od czaszki. Pociągnij mięśnie szyi doogonowo na około 1-2 mm. Zidentyfikuj przecięcie zatoki strzałkowej górnej (SSS) i zatoki poprzecznej (TS). W razie potrzeby zwiększ przezroczystość czaszki, zwilżając kość fizjologicznym roztworem NaCl.
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj IC u myszy jako leżący bezpośrednio ogonowo do skrzyżowania SSS i TS. Po ustaleniu położenia IC powoli i ostrożnie wykonaj trepanację rozciągającą się na ok. 0,5 mm rostralnie do 1,5 mm doogonowo do TS i około 3 mm na boki.</li>
		<li>Unikaj jakichkolwiek uszkodzeń SSS i TS, ponieważ uniemożliwiłyby one udany eksperyment. Tutaj sprawdź, czy trepanowana kość się poluzowała, delikatnie ją popychając. Za pomocą kleszczy powoli oderwij kość.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą odpowiedniego adaptera przymocuj wielokanałowy układ i stację czołową do mikromanipulatora. Aby zapobiec zniszczeniu wielokanałowej matrycy zapisu podczas wprowadzania do układu scalonego, ostrożnie usuń oponę twardą zgiętą końcówką małej igły podskórnej, zaczynając blisko krawędzi kości.
	<ol>
		<li>Usuń zwierzę z ramki stereotaktycznej. Przymocuj metalową płytkę do pręta, aby zachować fiksację stereotaktyczną. Umieść sondę nagrywającą nad układem scalonym i włóż ją pod mikroskopijną kontrolą tak, aby najbardziej górny kanał był widoczny tylko na powierzchni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzmocnij potencjał różnicowy między poszczególnymi kanałami matrycy zapisu a śrubą odniesienia w kości ciemieniowej, próbkuj z częstotliwością 32 kHz, filtr dolnoprzepustowy (300 Hz) i zapisz na komputerze do analizy offline.</li>
	<li>Wszystkie zwierzęta powinny zostać humanitarnie poddane eutanazji pod koniec zabiegu przed rekonwalescencją anestezjologiczną zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi eutanazji. Odpowiednie metody eutanazji mogą obejmować zwichnięcie szyjki macicy lub wdychanie CO2 .</li>
</ol>

<ol><li>Rubinstein, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paediatric+cochlear+implantation%3A+prosthetic+hearing+and+language+development%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Paediatric cochlear implantation: prosthetic hearing and language development.</a> Lancet. 360 (9331), 483-485 (2002).</li>
<li>Middlebrooks, J. C., Bierer, J. A., Snyder, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+implants%3A+the+view+from+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cochlear implants: the view from the brain.</a> Current opinion in neurobiology. 15 (4), 488-493 (2005).</li>
<li>Clark, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiple-channel+cochlear+implant%3A+the+interface+between+sound+and+the+central+nervous+system+for+hearing%2C+speech%2C+and+language+in+deaf+people-a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+sciences%22%5BJournal%5D)">The multiple-channel cochlear implant: the interface between sound and the central nervous system for hearing, speech, and language in deaf people-a personal perspective.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1469), 791-810 (2006).</li>
<li>Zeng, F. G., Rebscher, S., Harrison, W., Sun, X., Feng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+implants%3A+system+design%2C+integration%2C+and+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+reviews+in+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">Cochlear implants: system design, integration, and evaluation.</a> IEEE reviews in biomedical engineering. 1, 115-142 (2008).</li>
<li>Wilson, B. S., Dorman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+implants%3A+a+remarkable+past+and+a+brilliant+future%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Cochlear implants: a remarkable past and a brilliant future.</a> Hearing research. 242 (1-2), 3-21 (2008).</li>
<li>Moore, D. R., Shannon, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+cochlear+implants%3A+awakening+the+deafened+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Beyond cochlear implants: awakening the deafened brain.</a> Nature neuroscience. 12 (6), 686-691 (2009).</li>
<li>Shannon, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multichannel+electrical+stimulation+of+the+auditory+nerve+in+man.+II.+Channel+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Multichannel electrical stimulation of the auditory nerve in man. II. Channel interaction.</a> Hearing research. 12 (1), 1-16 (1983).</li>
<li>Fishman, K. E., Shannon, R. V., Slattery, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speech+recognition+as+a+function+of+the+number+of+electrodes+used+in+the+SPEAK+cochlear+implant+speech+processor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+speech%2C+language%2C+and+hearing+research%3A+JSLHR%22%5BJournal%5D)">Speech recognition as a function of the number of electrodes used in the SPEAK cochlear implant speech processor.</a> Journal of speech, language, and hearing research: JSLHR. 40 (5), 1201-1215 (1997).</li>
<li>Kral, A., Hartmann, R., Mortazavi, D., Klinke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+resolution+of+cochlear+implants%3A+the+electrical+field+and+excitation+of+auditory+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Spatial resolution of cochlear implants: the electrical field and excitation of auditory afferents.</a> Hearing research. 121 (1-2), 11-28 (1998).</li>
<li>Izzo, A. D., Suh, E., Pathria, J., Walsh, J. T., Whitlon, D. S., Richter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectivity+of+neural+stimulation+in+the+auditory+system%3A+a+comparison+of+optic+and+electric+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical%22%5BJournal%5D)">Selectivity of neural stimulation in the auditory system: a comparison of optic and electric stimuli.</a> Journal of biomedical. 12 (2), 021008(2007).</li>
<li>Richter, C. P., Rajguru, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spread+of+cochlear+excitation+during+stimulation+with+pulsed+infrared+radiation%3A+inferior+colliculus+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neural+engineering%22%5BJournal%5D)">Spread of cochlear excitation during stimulation with pulsed infrared radiation: inferior colliculus measurements.</a> Journal of neural engineering. 8 (5), 056006(2011).</li>
<li>Teudt, I. U., Maier, H., Richter, C. P., Kral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+events+and+%E2%80%9Coptophonic%E2%80%9D+cochlear+responses+induced+by+pulsed+near-infrared+laser%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+transactions+on+bio-medical+engineering%22%5BJournal%5D)">Acoustic events and “optophonic” cochlear responses induced by pulsed near-infrared laser.</a> IEEE transactions on bio-medical engineering. 58 (6), 1648-1655 (2011).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+mapping+of+synaptic+connectivity+using+photostimulation+in+Channelrhodopsin-2+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (19), 8143-8148 (2007).</li>
<li>Kleinlogel, S., Feldbauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+light-sensitive+and+fast+neuronal+activation+with+the+Ca2%2B-permeable+channelrhodopsin+CatCh%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh.</a> Nature neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).</li>
<li>Friesen, L. M., Shannon, R. V., Baskent, D., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speech+recognition+in+noise+as+a+function+of+the+number+of+spectral+channels%3A+comparison+of+acoustic+hearing+and+cochlear+implants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Speech recognition in noise as a function of the number of spectral channels: comparison of acoustic hearing and cochlear implants.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 110 (2), 1150-1163 (2001).</li>
<li>Donaldson, G. S., Kreft, H. A., Litvak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place-pitch+discrimination+of+single-+versus+dual-electrode+stimuli+by+cochlear+implant+users+%28L%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Place-pitch discrimination of single- versus dual-electrode stimuli by cochlear implant users (L).</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 118 (2), 623-626 (2005).</li>
<li>Srinivasan, A. G., Shannon, R. V., Landsberger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+virtual+channel+discrimination+in+a+multi-channel+context%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Improving virtual channel discrimination in a multi-channel context.</a> Hearing research. 286 (1-2), 19-29 (2012).</li>
<li>Zeng, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speech+dynamic+range+and+its+effect+on+cochlear+implant+performance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Speech dynamic range and its effect on cochlear implant performance.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 111 (1 Pt 1), 377-386 (2002).</li>
<li>Matic, A. I., Walsh, J. T., Richter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+extent+of+cochlear+infrared+neural+stimulation+determined+by+tone-on-light+masking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical%22%5BJournal%5D)">Spatial extent of cochlear infrared neural stimulation determined by tone-on-light masking.</a> Journal of biomedical. 16 (11), 118002(2011).</li>
<li>Verma, R., Guex, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+responses+to+electric+and+infrared+neural+stimulation+of+the+rat+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus.</a> Hearing research. 310, 69-75 (2014).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annual review of neuroscience. 34, 389-412 (2011).</li>
<li>Hegemann, P., Nagel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+channelrhodopsins+to+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">From channelrhodopsins to optogenetics.</a> EMBO molecular medicine. 5 (2), 173-176 (2013).</li>
<li>Packer, A. M., Roska, B., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neurons+and+photons+for+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Targeting neurons and photons for optogenetics.</a> Nature neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Nagel, G., Szellas, T., Kateriya, S., Adeishvili, N., Hegemann, P., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsins%3A+directly+light-gated+cation+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsins: directly light-gated cation channels.</a> Biochemical Society transactions. 33 (Pt 4), 863-866 (2005).</li>
<li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Current biology: CB. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Bamann, C., Kirsch, T., Nagel, G., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+characteristics+of+the+photocycle+of+channelrhodopsin-2+and+its+implication+for+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Spectral characteristics of the photocycle of channelrhodopsin-2 and its implication for channel function.</a> Journal of molecular biology. 375 (3), 686-694 (2008).</li>
<li>Ritter, E., Stehfest, K., Berndt, A., Hegemann, P., Bartl, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+light-induced+structural+changes+of+Channelrhodopsin-2+by+UV-visible+and+Fourier+transform+infrared+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Monitoring light-induced structural changes of Channelrhodopsin-2 by UV-visible and Fourier transform infrared spectroscopy.</a> The Journal of biological chemistry. 283 (50), 35033-35041 (2008).</li>
<li>Berndt, A., Prigge, M., Gradmann, D., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+open+states+with+progressive+proton+selectivities+in+the+branched+channelrhodopsin-2+photocycle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Two open states with progressive proton selectivities in the branched channelrhodopsin-2 photocycle.</a> Biophysical journal. 98 (5), 753-761 (2010).</li>
<li>Kato, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+channelrhodopsin+light-gated+cation+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel.</a> Nature. 482 (7385), 369-374 (2012).</li>
<li>Hegemann, P., Möglich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin+engineering+and+exploration+of+new+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin engineering and exploration of new optogenetic tools.</a> Nature methods. 8 (1), 39-42 (2011).</li>
<li>Mattis, J., Tye, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+for+applying+optogenetic+tools+derived+from+direct+comparative+analysis+of+microbial+opsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins.</a> Nature methods. 9 (2), 159-172 (2012).</li>
<li>Arenkiel, B. R., Peca, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Light-Induced+Activation+of+Neural+Circuitry+in+Transgenic+Mice+Expressing+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Transgenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).</li>
<li>Tomita, H., Sugano, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Properties+of+Transgenic+Rats+Harboring+the+Channelrhodopsin-2+Gene+Regulated+by+the+Thy-1.2+Promoter%5BTitle%5D)+AND+%22+PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Visual Properties of Transgenic Rats Harboring the Channelrhodopsin-2 Gene Regulated by the Thy-1.2 Promoter.</a> PLoS ONE. 4 (11), e7679(2009).</li>
<li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li>
<li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nature Neuroscience. 15 (5), 793-802 (2012).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li>
<li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li>
<li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., Berndt, A., Sohal, V. S., Deisseroth, K., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+optogenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ultrafast optogenetic control.</a> Nature neuroscience. 13 (3), 387-392 (2010).</li>
<li>Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisane eksperymenty wykazują optogenetyczną stymulację SGN i w zasadzie mogą być również stosowane do stymulacji wewnętrznych i/lub zewnętrznych komórek rzęsatych, pod warunkiem ekspresji opsyn. Eksperymenty te wymagają dużo cierpliwości i troski. Jak wspomniano wcześniej, najbardziej krytycznymi krokami są dobre wprowadzenie kokleostomii/okrągłego okienka, a także odpowiednia pozycja i orientacja źródła światła.
Istnieją ograniczenia związane ze stymulacją optogenetyczną podczas stosowania C...

Według Światowej Organizacji Zdrowia, 360 milionów ludzi na całym świecie cierpi na ubytek słuchu. U osób niesłyszących bezpośrednia stymulacja elektryczna SGN przez implanty ślimakowe umożliwia otwarte rozumienie mowy u większości z nich1,2,4,5. Mimo że implanty ślimakowe zostały wszczepione ponad 200 000 osób, a zatem są najbardziej udaną neuroprotezą, kodowanie dźwięku napędzane przez obecne implanty ślimakowe jest ograniczone. CI opierają się na stymulacji elektrycznej przez określoną liczbę elektrod, z których każda aktywuje tonotopowy obszar nerwu słuchowego, omijając w ten sposób dysfunkcyjny narząd czuciowy Cortiego w ślimaku. Normalni słyszący słuchacze mogą rozróżniać ponad 2000 częstotliwości, jednak dzisiejsze implanty ślimakowe używają tylko do 12-22kanałów częstotliwości4. Wynika to z szerokiego przepływu prądu z każdej elektrody stymulującej7,9, aktywując dużą liczbę SGN, które reprezentują wiele różnych częstotliwości dźwięku8,15. Ograniczenie to można poprawić za pomocą stymulacji wielobiegunowej, ale kosztem większego zużycia energii16,17. Ich wyjściowy zakres dynamiki dla natężenia dźwięku jest również ograniczony, zwykle poniżej 6-20 dB4,18. Z tych powodów poprawa rozdzielczości częstotliwości i intensywności jest ważnym celem zwiększenia wydajności implantu ślimakowego w celu poprawy rozpoznawania mowy w hałaśliwym otoczeniu, rozumienia prozodii i percepcji muzyki.
Inną opcją stymulacji nerwu słuchowego jest stymulacja optyczna. Światło można wygodnie skupić, aby kierować się na małą populację SGN, obiecując lepsze ograniczenie przestrzenne, zwiększenie rozdzielczości częstotliwości, a także poszerzenie zakresu dynamiki, co skutkuje lepszą rozdzielczością intensywności. Rzeczywiście, stymulacja ślimaka światłem podczerwonym wykazała doskonałą rozdzielczość częstotliwości w modelach zwierzęcych10,11,19. Jedną z wad tego rodzaju stymulacji jest to, że wymaga ona wyższych energii niż stymulacja elektryczna10,11. Ponadto wyrażono obawy co do zdolności metody do bezpośredniej stymulacji neuronów słuchowych12,20.
Jako alternatywę dla stymulacji podczerwonej, stosujemy optogenetykę, aby uczynić SGN wrażliwymi na światło. Optogenetyka to nowatorskie podejście, które łączy techniki genetyczne i optyczne w celu nieinwazyjnej i specyficznej kontroli komórek z wysoką precyzją czasową (recenzje21-23). Obecnie najczęściej stosowana modalność wykorzystuje ekspresję genu mikrobiologicznej rodopsyny kanałowej 2 (ChR2) Chlamydomonas reinhardtii i jego wariantów, kodujących kanał kationowy24 bramkowany światłem. ChR2 jest białkiem 7-transbłonowej helisy, które po transdukcji do neuronów i aktywacji przez niebieskie światło działa jako nieselektywny kanał kationowy, depolaryzując w ten sposób komórki24-27. ChR2 został dobrze scharakteryzowany24,28-31 i opracowano wiele wariantów w celu modyfikacji spektrum działania, bramkowania i przepuszczalności32,33. Celem naszej pracy jest ustalenie optogenetyki ślimaka do aktywacji szlaku słuchowego. Zauważamy, że podejście optogenetyczne do stymulacji nerwu słuchowego wymaga genetycznej manipulacji zwoju spiralnego w celu ekspresji rodopsyny kanałowej. Praca z myszami i szczurami pozwala na wykorzystanie dostępnych zwierząt transgenicznych13,34,35, które zapewniają ekspresję rodopsyny kanałowej z niewielką zmiennością wzdłuż osi tonotopowej i u zwierząt36. Połączenie warunkowych alleli37 z odpowiednimi liniami Cre zapewnia ekspresję specyficzną dla komórki. Transfer genów do spiralnego zwoju innych zwierząt wymaga użycia wirusa, takiego jak wirus związany z adenowirusem, który jest standardowym podejściem w optogenetyce38 i który, jak wykazaliśmy, działa dobrze u myszy36. Manipulacje genetyczne i ekspresja transgenów kodujących obce białka niosą ze sobą ryzyko wystąpienia działań niepożądanych, takich jak reakcje immunologiczne i/lub proliferacja, upośledzony stan, a nawet śmierć genetycznie zmodyfikowanych komórek. Na potrzeby tej demonstracji używamy transgenicznych myszy eksprymujących ChR2 w neuronach spiralnych zwojów pod promotorem Thy-113, aby optycznie stymulować ścieżkę słuchową. Zauważamy, że inne warianty rodopsyny kanałowej mogą być wykorzystywane w tym samym celu, co wykazaliśmy, wykorzystując transfer wariantu CatCh14 do SGN39 za pośrednictwem wirusa.
Chociaż optogenetyka ślimakowa wymaga manipulacji genetycznej, oferuje molekularne dostrojenie do zoptymalizowanej stymulacji SGN i obiecuje lepszą rozdzielczość częstotliwości i intensywności w porównaniu do stymulacji elektrycznej. Optogenetyczna stymulacja drogi słuchowej jest bardzo istotna dla badań nad słuchem. Na przykład, obiecuje postęp w badaniach nad zależnym od aktywności udoskonalaniem tonotopii podczas rozwoju, w analizie wymogu integracji spektralnej w lokalizacji dźwięku oraz zakresu interakcji między specyficznymi dla częstotliwości projekcjami aferentnymi w centralnym układzie słuchowym.

<table><tbody><tr><td>Uretan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U2500-100G</td><td>Znieczulająca</td></tr><tr><td>ksylazyna HCl</td><td>RXV</td><td></td><td>Uspokajająco i przeciwbólowo</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Reckitt Benckiser</td><td></td><td>Kleszcze przeciwbólowe</td></tr><tr><td>Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Służy do przytrzymywania twardych tkanek, np. kości lub materiałów. Nigdy nie używaj ich do trzymania miękkich, delikatnych chusteczek&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont #5 - Cienkie kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Tylko do trzymania tkanek miękkich</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki - Ostre</td><td>narzędzia do nauki</td><td>14060-09</td><td>Aby otworzyć skórę i pomóc w rozwarstwieniu mięśni</td></tr><tr><td>Lempert Rongeurs&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>16004-16</td><td>Są bardzo przydatne do łatwego usuwania kości z lasera bulla</td></tr><tr><td>473 nm&nbsp;</td><td>Changchun New Industries</td><td>MLL-III473</td><td>100 mW półprzewodnikowy laser laserowy 473 nm</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Changchun New Industries</td><td>DPSSL MLL 100 mW</td><td>Sterownik laserowy sterowany TTL</td></tr><tr><td>250 i mikro; m światłowód</td><td>Dowolny komercyjny, np. Thorlabs</td><td>M42L05</td><td></td></tr><tr><td>Modulator akustyczno-optyczny</td><td>Crystal Technology, Inc.</td><td>PCAOM VIS</td><td>Kontroluj ilość światła sprzężonego ze światłowodem z kontrolera lasera</td></tr><tr><td>do modulatora akustyczno-optycznego</td><td>Crystal Technology, Inc.</td><td>160T1-8SAR-24-0.8</td><td>Steruj modulatorem akustyczno-optycznym</td></tr><tr><td>Miernik mocy i energii lasera Solo2</td><td>Gentec-EO</td><td></td><td>Służy do pomiaru natężenia światła diody LED i lasera sprzężonego ze światłowodem</td></tr><tr><td>Niebieski i mikro; LED</td><td>Cree</td><td>C470UT200</td><td>Konieczne jest zbudowanie kilku &mu; Urządzenia LED, ponieważ łatwo ulegają uszkodzeniu lub izolacja nie jest wystarczająco dobra</td></tr><tr><td>System TDT&nbsp;</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td>RZ6-A-P1</td><td>Może być używany dowolny system do generowania bodźców&nbsp; prezentacja i akwizycja danych</td></tr><tr><td>Jednotrzonkowa, 16-kanałowa sonda krzemowa</td><td>Neuronexus</td><td>a1x16-5mm-100-177-CM16LP&nbsp;</td><td>Są to delikatne urządzenia, należy obchodzić się z nimi ostrożnie i czyścić po użyciu</td></tr><tr><td>Omnidrill</td><td>World Precision Instruments</td><td>503598</td><td>Wykonaj kraniotomię do nagrań IC i implantacji referencyjnej</td></tr><tr><td>Micro Drill Steel Burrs</td><td>dowolna reklama; np. Fine Science Tools</td><td>19007-07</td><td></td></tr><tr><td>Samogwintująca śruba do kości</td><td>dowolna reklama; np. Fine Science Tools</td><td>19010-10</td><td>Śruba referencyjna</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>wszelkie komercyjne; np. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4-osiowy</td><td></td><td>Pozycjonowanie sondy rejestrującej</td></tr></tbody></table>

optogenetyczna stymulacja nerwu słuchowego

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Bezpośrednia stymulacja elektryczna neuronów spiralnych (SGN) za pomocą implantów ślimakowych (CI) umożliwia otwarte rozumienie mowy u większości osób z implantami niesłyszącymi1-6. Niemniej jednak, kodowanie dźwięku za pomocą prądowych CI ma słabą rozdzielczość częstotliwości i intensywności ze względu na szeroki rozrzut prądu z każdego kontaktu elektrody, aktywujący dużą liczbę SGN wzdłuż osi tonotopowej ślimaka7-9. Stymulacja optyczna jest proponowana jako alternatywa dla stymulacji elektrycznej, która obiecuje przestrzennie bardziej ograniczoną aktywację SGN, a co za tym idzie, wyższą rozdzielczość częstotliwości kodowania. W ostatnich latach bezpośrednie oświetlenie ślimaka w podczerwieni zostało wykorzystane do wywołania reakcji w nerwie słuchowym10. Niemniej jednak wymaga ona wyższych energii niż stymulacja elektryczna10,11 i pozostaje niepewność co do mechanizmu leżącego u jej podstaw12. Tutaj opisujemy metodę opartą na optogenetyce w celu stymulacji SGN niebieskim światłem o niskiej intensywności, przy użyciu transgenicznych myszy z neuronalną ekspresją rodopsyny kanałowej 2 (ChR2)13 lub ekspresją za pośrednictwem wirusa wariantu ChR2 CatCh14. Użyliśmy diod elektroluminescencyjnych (μLED) i laserów sprzężonych ze światłowodami, aby stymulować SGN wyrażające ChR2 przez mały sztuczny otwór (ślimakomia) lub okrągłe okienko. Oznaczyliśmy odpowiedzi za pomocą nagrań na skórze głowy potencjałów wywołanych światłem (optogenetic auditory brainstem response: oABR) lub na podstawie zapisów mikroelektrod ze ścieżki słuchowej i porównaliśmy je ze stymulacją akustyczną i elektryczną.

Optymalne wykonanie cochleostomii ma krytyczne znaczenie i zwiększa prawdopodobieństwo powodzenia eksperymentu. Oznacza to, że okno jest regularne i niewielkie, a wewnętrzne struktury ślimaka nie zostały uszkodzone. Przykładowo, krwawienie wskazuje na uszkodzenie stria vascularis. Dobry przykład przedstawiono na Rysunku 1B.
W przypadku myszy transgenicznych ChR2, ChR2 jest ekspresyjne w SGN w obrębie ślimaka (Ryc. 1C). Naświetlanie światłem ni...

Implanty ślimakowe (CI) umożliwiają słyszenie poprzez bezpośrednią stymulację elektryczną nerwu słuchowego. Jednak słaba rozdzielczość częstotliwości i intensywności ogranicza jakość słyszenia w przypadku implantów ślimakowych. W tym miejscu opisujemy optogenetyczną stymulację nerwu słuchowego u myszy jako alternatywną strategię badań słuchowych i rozwoju przyszłych implantów ślimakowych.

Optogenetyczna stymulacja nerwu słuchowego

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Ogólnym celem tej procedury jest optyczna stymulacja nerwu słuchowego zwierząt z optogenetycznie zmodyfikowanymi spiralnymi neuronami zwojowymi. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw niebieskiego stymulatora micro LED lub światłowodu sprzężonego z niebieskim laserem. Kolejnym etapem zabiegu jest ocena ślimaka przy użyciu mikrochirurgicznego dostępu zausznego.Trzecim krokiem jest ustawienie stymulatora optycznego w taki sposób, aby rejestrował optycznie wywołane reakcje pnia mózgu. Ostatnim krokiem jest dostęp do dolnego colusa w celu zarejestrowania optycznie wywołanej aktywności. Ostatecznie, wyniki mogą wykazać skuteczną stymulację układu słuchowego poprzez zapisy słuchowych reakcji pnia mózgu i lokalnych potencjałów pola.W wzgórku dolnym Stymulacja optogenetyczna nerwu słuchowego. Jako alternatywa dla elektryczności, implanty ślimakowe obiecują lepszą rozdzielczość częstotliwości i intensywności. Jest to bardzo interesujące dla badań audytorskich, ale implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku poprawy przywracania słuchu u osób niesłyszących.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach słuchowych, takie jak rola aktywności wzorca w udoskonalaniu rozwoju ortopedycznego, wymóg integracji spektralnej w lokalizacji komórek oraz zakres interakcji między projekcjami ramek specyficznych dla częstotliwości. W centralnym układzie słuchowym wizualna demonstracja procedury ma kluczowe znaczenie, ponieważ właściwe ustawienie i orientacja mikrodiody LED lub światłowodu są trudne do nauczenia. Stymulator micro LED wykorzystuje niebieską diodę LED z powierzchnią czynną o powierzchni aktywnej 200 mikronów kwadratowych, najpierw przewody do mikro diody LED.Następnie, za pomocą żywicy epoksydowej, zamknij diodę LED i jej połączenie, pozostaw do wyschnięcia na noc. Po utwardzeniu przeprowadź druty przez średnicę zewnętrzną jednego milimetra. Pożycz kapilarnę ze szkła krzemianowego.Szkło zapewnia stabilność mechaniczną i izolację elektryczną. Uszczelnij połączenie kapilary i diody LED pokrytej żywicą epoksydową za pomocą większej ilości żywicy epoksydowej, ustaw kapilarnę tak, aby można ją było zamontować na manipulatorze. Teraz sprawdź połączenia elektryczne.Najpierw przygotuj trzy druty miedziane. Zanurz jeden koniec każdego z nich w 0,9% kąpieli chlorku sodu. Następnie podłącz ich drugie końce do wzmacniacza A BR.Monitoruj sygnał za pomocą oscyloskopu. Następnie podłącz mikro diodę LED do specjalnie wykonanego stymulatora do testu. Zanurz podłączoną do stymulatora micro LED w wannie i zasilaj diodę LED przez co najmniej 20 minut.Podczas stymulacji diody LED monitoruj oscyloskop pod kątem artefaktów. Wyrzuć wszystkie wadliwe diody LED. Znieczulij mysz w wieku od czterech do 10 tygodni.Ta mysz wyraża opsynę kanału dwa pod udem 1.2 promotor 10 minut. Po wstrzyknięciu środków znieczulających należy sprawdzić odruch odstawienia zwierzęcia, aby potwierdzić chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia. Następnie nałóż maść na oczy i rozpocznij operację.Najpierw ostrożnie ogol obszar uszny w stylu retro, aby zbliżyć się do bullah, wypełnionej powietrzem jamy ucha środkowego. Ustaw mysz na poduszce grzewczej po stronie operacyjnej za pomocą mikrokleszczy. Ostrożnie wypreparuj mięśnie szyi, a mianowicie platysmę, mostkowo-obojczykowo-sutkowy i pochyłe.Teraz odsłoń bullę. Jest to kulista, kostna struktura z pierścieniem na powierzchni, na której znajduje się błona bębenkowa. Za pomocą igły do insuliny zrób otwór tuż pod pierścieniem od otworu.Usuń kość pokrywającą pęcherz. Używaj cienkich Ronów i mikro kleszczyków, odsłaniając przy tym pro audytorium ślimaka. Następnie uruchom ślimak. Stomia.Najpierw zgol torebkę kostną, nie naruszając błędnika błoniastego. Teraz otwórz małe okienko o średnicy od 500 do 800 mikronów przy drugim skręcie ślimaka, z dala od tętnicy stożkowatej i otworu wierzchołkowego. Wierzchołek może spowodować pęknięcie ślimaka i złamanie mięśni moczowych.Przygotuj się do pomiaru optogenetycznych słuchowych odpowiedzi pnia mózgu lub OABR. Najpierw włóż elektrody igłowe w następujących miejscach pod małżowiną uszną, na wierzchołku i z tyłu w pobliżu nóg z elektrodami podłączonymi do wzmacniacza. Zwiększ potencjał różnicowy między igłami podskórnymi wierzchołka i wyrostka sutkowatego.Pobieraj próbki z częstotliwością 50 kiloherców i filtruj odpowiedzi w zakresie od 1 do 10 000 Hz w celu stymulacji ślimaka trans. Zamontuj mikro diodę LED lub światłowód w połączeniu z mikro diodą LED chwytaną przez mechaniczny manipulator. Ostrożnie umieść go na miejscu.Wizualizacja potencjału różnicowego na oscyloskopie. Umieść go w pobliżu zestawu nagrywania, aby łatwo było zoptymalizować położenie stymulatora optycznego. Korzystaj z uśredniania sygnału i przechowuj dane na komputerze do analizy w trybie offline.Teraz zoptymalizuj położenie i orientację mikrodiody LED, reagując na impulsy prądu o długości od trzech do 10 milisekund z częstotliwością od jednego do pięciu herców. Inną opcją jest stymulacja laserowa za pomocą lasera o długości fali ciągłej o długości 473 nanometrów podłączonego do światłowodu o długości 250 mikrometrów. Wymaga to szybkiego, analogowego sterowania mocą lasera lub dowolnego urządzenia optycznego.Za pomocą szybkiej migawki umieść włókno za pomocą mikromanipulatora bezpośrednio na stomii ślimaka i przymocuj je cementem dentystycznym w celu stymulacji wewnątrzślimakowej. Włóż światłowód przez okrągłe okienko do s Scala.Tempe. Zoptymalizuj położenie i orientację światłowodu, wywołując odpowiedzi za pomocą impulsów o długości od trzech do 10 milisekund o mocy od 10 do 30 miliwatów przy częstotliwości od jednego do pięciu herców.Umiejscowienie stymulatora jest najbardziej krytycznym krokiem do protokołu. Mikro ED lub światłowód należy cierpliwie przenosić, aż OABR będzie widoczny. Po uzyskaniu dobrych reakcji optogenetycznych, słuchowych pnia mózgu, przymocuj włókno za pomocą kleju cyjanoakrylowego lub cementu dentystycznego.W przypadku tego protokołu użyj ramki stereotaktycznej i przygotuj mysz, otwierając czaszkę nad dolną colusem. Za pomocą mikroskopu umieść sondę rejestrującą nad dolną colusem i włóż ją tak, aby najwyższy kanał był widoczny tylko na powierzchni. Teraz wzmocnij potencjał różnicowy między poszczególnymi kanałami matrycy nagrywającej a śrubą referencyjną i kością ciemieniową.Użyj częstotliwości próbkowania 32 kiloherców, filtra dolnoprzepustowego 300 Hz i zapisz dane. Optymalna stomia ślimaka ma kluczowe znaczenie i zwiększa prawdopodobieństwo udanego eksperymentu. Oznacza to, że okienko jest regularne, małe i nie dochodzi do uszkodzenia wewnętrznych struktur ślimaka.Na przykład krwawienie wskazuje na uszkodzenie STR ssis przy użyciu kanału Rodin dwóch transgenicznych myszy. Kanał Rodin drugi jest wyrażony w spiralnych neuronach gangowych w ślimaku niebieskie oświetlenie światłem za pomocą mikro diody LED lub lasera wywołuje duże optogenetyczne A BR, które różnią się od akustycznego A BR amplitudą i kształtem fali optogenetycznym. BR ma większe amplitudy niż akustyczny A BR optogenetyczny.BR jest zatem bardziej porównywalny z elektrycznym A BR. Oba mogą rekrutować więcej spiralnych neuronów zwojowych lub wywoływać bardziej zsynchronizowaną aktywację neuronów spiralnych zwojów. Propagację aktywności przez szlak słuchowy zweryfikowano za pomocą zapisów zewnątrzkomórkowych w centralnym układzie słuchowym. Na przykład optogenetyczna stymulacja ślimaka wywołała aktywność neuronalną w słuchowym śródmózgowiu.Stabilność mechaniczna i bezpieczne izolacje elektryczne stymulatorów micro LED, a także unikanie nadmiernego przepływu węgla są kluczowymi czynnikami skutecznego wykorzystania optogenetyki ślimaka. Próbując tego profesjonalisty, ważne jest, aby pamiętać, aby uniknąć uszkodzenia tętnicy dystrybucyjnej w Ebola. Raz zmasterowane nagrania z wzgórka dolnego można wykonać w około trzy godziny, jeśli zostaną wykonane prawidłowo.Zgodnie z tą procedurą można wykonać metody takie jak zapisy pojedynczych jednostek w wzgórku dolnym. Optogenetyczna stymulacja szlaku słuchowego utoruje drogę naukowcom z zakresu neurobiologii słuchowej do zadawania pytań, na które wcześniej nie można było odpowiedzieć za pomocą stymulacji akustycznej lub elektrycznej. Mamy również nadzieję, że technika ta znajdzie zastosowanie w klinicznej rehabilitacji osób z wadami słuchu.

optogenetic-stimulation-of-the-auditory-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano zastosowanie klasycznego behawioralnego paradygmatu warunkowania lękowego w badaniach nad protezami słuchowymi u szczurów. Paradygmat ten umożliwia identyfikację zarówno detekcji, jak i rozróżniania między odmiennymi bodźcami akustycznymi i elektrycznymi, wykorzystując tętno jako miernik wyniku.

Behawioralne określenie dyskryminacji par bodźców słuchowych, akustycznych i elektrycznych z zastosowaniem warunkowania klasycznego i analizy tętna

Źródło: Kozin, E. D., et.al. Bezpośrednia wizualizacja mysiego grzbietowego jądra ślimaka w celu optogenetycznej stymulacji szlaku słuchowego. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje transfer genów za pośrednictwem wirusa do grzbietowego jądra ślimakowego myszy (DCN) w celu umożliwienia stymulacji słuchowej wywołanej światłem. Wektor wirusowy kodujący opsynę, światłoczuły kanał jonowy, jest wstrzykiwany do DCN po kraniotomii i aspiracji móżdżku w celu uzyskania bezpośredniego dostępu. Ekspresja...

Transfer genów za pośrednictwem wirusa do grzbietowego jądra ślimaka myszy w celu stymulacji słuchowej wywołanej światłem

Ten film demonstruje protokół stymulacji korzenia nerwu słuchowego i rejestrowania prądów postsynaptycznych w przyśrodkowych neuronach olivocochlear w wycinkach klina mózgu myszy.

Stymulacja korzeni nerwów słuchowych i nagrania prądu postsynaptycznego w klinie mózgu myszy

Źródło: Badran, B. W., et al. Laboratoryjne podawanie przezskórnej stymulacji nerwu błędnego usznego usznego (taVNS): technika, celowanie i rozważania. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia przezskórną stymulację nerwu błędnego (taVNS), nieinwazyjną metodę modulowania aktywności mózgu. Elektrody umieszcza się na przedniej ścianie zewnętrznego przewodu słuchowego i tragusie, celując w gałąź uszną nerwu błędnego (ABVN). Po stymulacji powstały impuls nerwowy przemieszcza się do pnia mózgu,...

Przezskórna stymulacja nerwu błędnego usznego na uchu ludzkim

Źródło: Akil, O., et al., Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje procedurę dostarczania genu terapeutycznego do ucha wewnętrznego szczeniaka myszy z genetycznie wywołanym ubytkiem słuchu. Za pomocą wektora wirusowego związanego z adenowirusem (AAV), gen jest wstrzykiwany przez okrągłą błonę okienną, umożliwiając cząsteczkom wirusa wniknięcie do komórek rzęsatych, przywrócenie produkcji...

Terapia genowa oparta na wektorach wirusowych w celu przywrócenia słuchu w modelu mysim

Celem tego protokołu jest nakreślenie podejścia chirurgicznego, które zapewni bezpośredni dostęp do grzbietowego jądra ślimaka w modelu mysim.

Bezpośrednia wizualizacja mysiego grzbietowego jądra ślimaka w celu optogenetycznej stymulacji drogi słuchowej

Narząd słuchowy pośredniczy w słyszeniu. W niniejszej pracy przedstawiono zmodyfikowaną metodę mikroelektroporacji in ovo zoptymalizowaną do badania proliferacji i różnicowania słuchowych komórek progenitorowych w rozwijającym się narządzie słuchowym kurcząt.

Transfer genów do narządu słuchowego kurczaka za pomocą mikroelektroporacji in ovo

Prezentujemy technikę miejscowego podawania leków drogą przezbębenkową do ślimaka. Podawanie leków tą drogą nie kolidowałoby ze skutecznością przeciwnowotworową leków stosowanych w chemioterapeutykach, takich jak cisplatyna.

Podawanie leków przezbębenkowych w leczeniu ototoksyczności

Zwierzęce modele implantów ślimakowych mogą poszerzyć wiedzę na temat technologicznych podstaw leczenia trwałego odbiorczego ubytku słuchu za pomocą stymulacji elektrycznej. W badaniu przedstawiono protokół chirurgiczny ogłuszenia i implantacji ślimakowej zestawu elektrod u myszy, a także ocenę funkcjonalną z odpowiedzią słuchową pnia mózgu.

Operacja wszczepienia implantu ślimakowego i elektrycznie wywołane nagrania słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u myszy C57BL/6

Integracja różnych wejść synaptycznych do neuronów jest najlepiej mierzona w preparacie, który zachowuje wszystkie jądra presynaptyczne dla naturalnego wyczucia czasu i plastyczności obwodów, ale wycinki mózgu zazwyczaj zrywają wiele połączeń. Opracowaliśmy zmodyfikowany wycinek mózgu, aby naśladować aktywność obwodów in vivo, zachowując jednocześnie możliwość eksperymentowania in vitro.

Przygotowanie In Vitro Wedge Slice do naśladowania połączeń obwodów neuronalnych in vivo

Elektryczna stymulacja akustyczna (EAS) z dłuższymi elektrodami może oferować szerszy zasięg ślimaka i różne rodzaje map w przypadku utraty słuchu wysokich częstotliwości. Połączenie mniej inwazyjnej chirurgii, elastycznych elektrod o ściankach bocznych i podawania sterydów pozwala na głębsze wprowadzenie przy niewielkim lub żadnym urazie chirurgicznym, co skutkuje dobrym zachowaniem słuchu.

Zwiększony zasięg ślimakowy i zachowanie słuchu w przypadku ubytku słuchu o wysokiej częstotliwości dzięki elektrycznej stymulacji akustycznej za pomocą dłuższej elektrody

Poznaj metodę optogenetycznej stymulacji nerwu słuchowego u myszy w badaniach słuchu. Technika ta pozwala precyzyjnie kontrolować aktywność neuronów spiralnych, oferując lepszą rozdzielczość częstotliwości niż tradycyjne implanty ślimakowe.

Optogenetyczna stymulacja nerwu słuchowego

Przeglądaj więcej filmów