Procedura perfuzji żył odpiszczelowych człowieka ex vivo i wzmocnienia zewnętrznego
October 1st, 2014
Mechanizmy prowadzące do rozwoju przerostu błony wewnętrznej (IH) i niewydolności przeszczepów żył są nadal słabo poznane. Badanie to opisuje system ex vivo do perfuzji ludzkich żył pod kontrolowanym przepływem i ciśnieniem. Ponadto oceniono skuteczność zbrojenia siatką zewnętrzną w celu ograniczenia rozwoju IH.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena wpływu nacisku, zwykłego stresu i zewnętrznego wzmocnienia na przerost błony wewnętrznej człowieka. Osiąga się to poprzez jednoczesną perfuzję pod wysokim ciśnieniem dwóch segmentów z tej samej żyły. Podczas gdy jeden segment jest wzmocniony zewnętrzną siatką, segmenty żył są następnie cięte na odcinki do analizy histologicznej i molekularnej.
Analizy te służą do oceny wpływu wzmocnienia zewnętrznego na przerost błony wewnętrznej. Wyniki pokazują, że zewnętrzne wzmocnienie może zmniejszyć przerost błony wewnętrznej, który zwykle obserwuje się po siedmiu dniach perfuzji. Pomostowanie abordażowe Seno van jest jednym z leków z wyboru u pacjentów cierpiących na chorobę tętnic obwodowych.
Jednak rozwój przerostu t, który prowadzi do niepowodzenia przeszczepu, jest głównym czynnikiem ograniczającym w takich rzemiosłach. Ta przebudowa wynika z adaptacji furgonetki do środowiska tętniczego w celu opracowania nowych terapii. Zrozumienie mechanizmów molekularnych związanych z tym zjawiskiem ma zasadnicze znaczenie.
W związku z tym opracowaliśmy model perfuzji ex vivo. Jedną z głównych zalet naszego systemu jest to, że pozwala on na badanie parametrów hemodynamicznych bez żadnych innych zakłócających czynników immunologicznych lub endokrynologicznych. Doktorant medycyny z naszego laboratorium zademonstruje tę technikę.
Próbki żył ludzkich pobiera się od pacjentów poddawanych operacji pomostowania kończyn dolnych. Żyła jest pobierana i przenoszona do laboratorium w sterylnych warunkach i umieszczana pod kapturem z przepływem laminarnym. Minimalny rozmiar takich żył to dziewięć centymetrów długości.
Średnica wewnętrzna wynosi powyżej 2,5 milimetra, a średnica zewnętrzna powyżej czterech milimetrów. Żyła jest podzielona na trzy. Nawet segmenty pobranych żył są przechowywane w lodowatym podłożu RPMI 1640 glut max uzupełnionym 12,5% FBS, płukać jeden segment w PBS.
Jest to sterowanie ponownie podzielone na trzy części. Napraw jedną część w Forminie dla morpho i zamroź pozostałe dwie części do analizy molekularnej. EVPS musi być wykonany z wodoodpornego materiału, który nie wypłukuje chemikaliów, takich jak polimetyloakryl, polioksyetylen metylowy i stal.
Komora perfuzyjna musi mieć głębokość co najmniej 2,5 centymetra, aby zminimalizować zginanie i rozszerzanie naczynia oraz łatwą wymianę mediów. Podpora żyłowa to stalowy pręt połączony z nasadkami w kształcie litery L od góry do dołu. Kanały łączące na kolumnie ciśnieniowej umożliwiają regulację ciśnienia do i odpływu do żyły oraz zmianę mediów w celu określenia normalnego kierunku przepływu.
Dwa pozostałe segmenty do perfuzji delikatnie wstrzykuje się pożywką. Jeśli segment ma zawory, przepływ będzie wolniejszy. Żyła musi być odwrócona w EVPS, aby zastawki nie utrudniały przepływu.
Podłącz żyłę do dwóch metalowych cylindrów. Jeden koniec na raz. Zabezpiecz cylindry za pomocą Vicryl trzy oh wokół wgłębień za pomocą ciasnego węzła.
Następnie przenieś żyłę do komory perfuzyjnej załadowanej mediami. W przypadku trzeciego odcinka żyły przymocuj jeden koniec żyły do cylindra, jak pokazano wcześniej. Następnie delikatnie nasuń siatkę na żyłę.
Następnie zabezpiecz siatkę i żyłę na cylindrze za pomocą szwów. Na koniec dostosuj długość siatki i przymocuj drugi koniec żyły i siatkę do cylindra. Przenieś zespół do drugiej komory perfuzyjnej.
EVPS jest zmontowany w zamkniętej pętli z silikonowymi rurkami. Podłącz każdy cylinder odpływowy do rozdzielacza Y za pomocą segmentu rurki silikonowej poddanej działaniu nadtlenku. Zrób to samo dla każdego metalowego cylindra dopływowego.
Następnie podłącz rozdzielacz odpływowy do drugiego rozdzielacza Y. Z tego rozdzielacza Y. Podłącz jeden odpływ do rurki podłączonej do przetwornika ciśnienia, a aby podłączyć drugi odpływ do kolumny ciśnieniowej, użyj rurki o długości jednego metra, aby podłączyć kolumnę ciśnieniową do pompy.
Zakończ konfigurację, podłączając pompę do rozdzielacza dopływu y. Za pomocą kolejnego metra rurki podłącz pozostałe rurki do kolumny ciśnieniowej. Najniższy kanał służy do wymiany mediów.
Po zmontowaniu EVPS należy napełnić kolumnę medium do momentu tuż poniżej kanału odpływowego żył. Teraz przenieś system do inkubatora, który jest ustawiony na 37 stopni Celsjusza za pomocą dwutlenku węgla. Utrzymywać pH na stałym poziomie 7,4 poza inkubatorem.
Przymocuj głowice przekładni pompy do napędu zębatego, aby monitorować ciśnienie. Podłącz wyjście ciśnienia EVPS do przetwornika ciśnienia. Sprawdź, czy probówka jest całkowicie wypełniona i nie ma pęcherzyków.
Impulsowy sygnał cardio o częstotliwości 60 impulsów na minutę o stałej amplitudzie jest ustawiany za pomocą oprogramowania komputerowego, które niezależnie steruje pompą zębatą. Wynikowy przepływ wynosi około 160 mililitrów na minutę. Ciśnienie jest ustawiane i regulowane niezależnie przez pompę odśrodkową połączoną szeregowo z regulowanym regulatorem ciśnienia sterowanym przez komputer.
Po trzech do siedmiu dniach zakończ perfuzję dla każdego perfundowanego segmentu. Usuń pięć milimetrów z każdego końca, aby odrzucić podwiązaną część żył. Następnie wytnij pięciomilimetrowy pierścień do mocowania od środkowej części żyły.
Zamroź pozostałe fragmenty do analizy molekularnej. Osadź trzeci segment w forminie do histologii i analizy molekularnej. Po siedmiu dniach perfuzji wysokociśnieniowej przygotowano odcinki żył do analizy histologicznej.
We wszystkich warunkach barwienie h i e ujawniło jądra komórek śródbłonka wyściełających światło i jądra SMC w warstwie pożywki. Gdy tkanka została zabarwiona żelem V w celu wyświetlenia elastyny, perfundowane żyły wykazywały pogrubienie błony wewnętrznej, patologiczną przebudowę na zewnątrz i widoczne było ścieńczenie podłoża. Barwienie trichomów Massona pokazuje, że tylko jedna z trzech warstw mięśniowych przetrwała komórki mięśni gładkich nagromadzone w warstwie wewnętrznej.
W przeciwieństwie do tego, zewnętrzne wzmocnienie żyły zachowało dystrybucję SMC i strukturę pożywki Ta technika wymaga pracy w rygorystycznej sepsie. Po opanowaniu można to wykonać w mniej niż dwie godziny przy użyciu tego systemu. Inne warunki, takie jak przepływ turbulentny, można przetestować, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak skuteczność zbrojenia siatkowego w przepływie nieliniowym.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsze badanie bada mechanizmy leżące u podstaw hiperplazji śródbłonka (IH) i niepowodzenia przeszczepów żył przy użyciu systemu perfuzyjnego ex vivo. Badania oceniają skuteczność zewnętrznego wzmocnienia siatki w zmniejszaniu rozwoju IH w ludzkich żyłach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia naczyń
- Medycyna regeneracyjna
Tło
- Hiperplazja śródbłonka jest istotnym czynnikiem niepowodzenia przeszczepów żył.
- Mechanizmy prowadzące do IH nie są dobrze zrozumiane.
- Zewnątrzne wzmocnienie może odgrywać rolę w łagodzeniu IH.
- Do badania wykorzystywane są ludzkie żyły, aby zapewnić odpowiedniość do wyników klinicznych.
Cel badania
- Ocenić wpływ ciśnienia i stresu ścinającego na IH.
- Ocenić skuteczność zewnętrznego wzmocnienia siatki.
- Analizę histologiczną i molekularną segmentów żył.
Zastosowane metody
- Ex vivo perfuzja segmentów ludzkich żył w kontrolowanych warunkach.
- Porównanie segmentów żył wzmocnionych i niewzmocnionych.
- Analiza histologiczna przekrojów żył po perfuzji.
- Analiza molekularna do oceny rozwoju IH.
Główne wyniki
- Zewnątrzne wzmocnienie znacząco zmniejszyło IH po siedmiu dniach perfuzji.
- Analiza histologiczna potwierdziła niższe poziomy IH w segmentach wzmocnionych.
- Ciśnienie i stres ścinający były krytycznymi czynnikami wpływającymi na IH.
- Badanie dostarcza wglądu w potencjalne terapie dla obwodowej choroby tętnic.
Wnioski
- Zewnątrzne wzmocnienie siatki jest skuteczne w ograniczeniu rozwoju IH.
- Rozumienie mechanizmów IH może poprawić wyniki przeszczepów żył.
- Potrzebne są dalsze badania, aby zbadać długoterminowe skutki wzmocnienia.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This ex vivo perfusion system enables mechanistic de-risking of vascular graft failure by isolating hemodynamic drivers of intimal hyperplasia. The model supports target validation and predictive confidence in preclinical development of vascular therapies. It provides a disease-relevant system for evaluating reinforcement strategies under controlled arterial conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the therapeutic hypothesis that pressure and shear stress drive intimal hyperplasia in human veins.
- Operational Value: Enables functional target validation by comparing reinforced and non-reinforced segments from the same donor.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying the impact of external reinforcement on pathological remodeling.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated human vein segments for downstream compound or device screening under arterial hemodynamics.
- Operational Value: Standardizes perfusion conditions (pressure, flow, pulse) to ensure reproducible quantitative outputs across experiments.
- Scalability: Supports platform reuse for testing multiple reinforcement geometries or flow conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses human saphenous veins to ensure disease relevance and translational biomarker alignment for peripheral arterial disease models.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation by maintaining human tissue integrity ex vivo.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables mechanistic de-risking of graft failure pathways before in vivo testing.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, supporting hypothesis testing and assay readiness for vascular interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of hemodynamic factors in intimal hyperplasia development.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, reproducible perfusion of human vein segments.
- Analytics: Enables quantitative histological and molecular readouts to compare conditions and reinforce target confidence.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using human tissue to model arterial graft environments.
- Enterprise Reuse: Frames the perfusion system as a reusable platform for evaluating vascular grafts, devices, or biologics under controlled hemodynamics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in graft failure pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of human tissue-based hemodynamic assays.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in vascular programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement of reinforcement strategies based on IH suppression data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in vascular tissue handling, ex vivo perfusion, and histological analysis.
- Dependent on perfusion chambers, pressure regulators, pumps, and sterile tubing systems.
- Necessitates cross-team standardization of perfusion parameters and tissue preparation protocols.
- Adaptation considerations include valve handling, mesh integration, and non-laminar flow testing.
- Practical limitations include tissue viability duration and the need for immediate processing post-harvest.
