Name: Izolacja, kriokonserwacja i hodowla ludzkich komórek nabłonka owodni do zastosowań klinicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Poznaj metodę izolacji ludzkich komórek nabłonka owodni bez użycia produktów pochodzenia zwierzęcego, zgodną z wytycznymi cGMP. Technika ta umożliwia uzyskanie czystej populacji komórek hAECs do zastosowań klinicznych i badań nad medycyną regeneracyjną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe z Programu Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej Rządu Wiktorii.

UWAGA: Łożyska powinny być pobierane z pojedynczych zdrowych ciąż, z preferencją dla planowych cięć cesarskich. Należy wyrazić pisemną, świadomą zgodę na pobranie łożyska. Właściwa komisja etyczna ds. badań klinicznych z udziałem ludzi powinna zatwierdzać pobieranie i wykorzystywanie tkanek ludzkich.
1. Izolacja komórek nabłonka owodni
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Umieścić łożysko na sterylnej powierzchni w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.</li>
	<li>Używając sterylnego roztworu soli zbilansowanej motków (HBSS), wypłucz jak najwięcej krwi z powierzchni łożyska i błon</li>.
	<li>Z łożyskiem umieszczonym pępowiną skierowaną do góry, mechanicznie oddziel zewnętrzną krawędź błony owodniowej i kosmówkowej.</li>
	<li>Po oddzieleniu ręcznie zdejmij błonę owodniową z błony kosmówkowej łożyska, pracując wokół krawędzi błony, w kierunku pępowiny. 
	UWAGA: Należy uważać, aby usunąć wszelkie kawałki zanieczyszczającej błony kosmówkowej z owodni.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych nożyczek odciąć błonę owodniową w odległości około 2 cm od podstawy pępowiny i umieścić w szczelnie zamkniętym pojemniku o pojemności 500 ml zawierającym 250 ml HBSS.</li>
	<li>Dokładnie umyć, potrząsając szczelnie zamkniętą butelką zawierającą błonę owodniową.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy usunąć błonę owodniową z pojemnika zbiorczego i umieścić na szalce Petriego o średnicy 15 cm.</li>
	<li>Pokrój błonę owodniową na kawałki o długości około 5 cm (gdy trzymasz pionowo kleszcze), odrzucając zakrwawione lub podarte kawałki.</li>
	<li>Umieścić w szczelnie zamkniętym pojemniku o pojemności 500 ml i przemyć 250 ml HBSS około 3-5 razy lub do momentu, gdy błona owodniowa stanie się przezroczysta bez zanieczyszczającej krwi. 
	UWAGA: Obecność krwi może zmniejszać wydajność enzymatycznego roztworu trawiącego.</li>
	<li>Przenieść wszystkie kawałki błony owodniowej do pojemnika zawierającego 50 ml enzymatycznego roztworu trawiącego, zwracając uwagę na zminimalizowanie przenoszenia HBSS.</li>
	<li>Inkubować kawałki owodni w enzymatycznym roztworze trawiącym w łaźni wodnej lub ciepłym pomieszczeniu w temperaturze 37 °C przez 15 minut, delikatnie mieszając w celu usunięcia pozostałej krwi.</li>
	<li>Usunąć kawałki błony owodniowej z enzymatycznego roztworu trawiącego i umieścić w nowym sterylnym pojemniku.</li>
	<li>Dodać 100 ml świeżego roztworu enzymatycznego do trawienia błony owodniowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut w łaźni wodnej lub ciepłym pomieszczeniu, delikatnie wstrząsając (pierwsze trawienie).</li>
	<li>Usuń kawałki błony owodniowej i umieść je w nowym pojemniku, uważając, aby enzymatyczny roztwór trawiący spłynął z każdego kawałka błony. 
	UWAGA: Można to osiągnąć, przeciągając kawałki owodni wzdłuż wewnętrznej krawędzi pojemnika.</li>
	<li>Dodać 100 ml świeżego roztworu enzymatycznego do kawałków błony owodniowej i inkubować przez 60 minut w łaźni wodnej lub ciepłym pomieszczeniu w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając (drugie trawienie).</li>
	<li>Przepuścić zawiesinę komórek z kroku 1.14 przez filtr 70 μm i odwirować przy 1 000 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Usunąć i odrzucić supernatant oraz ponownie zawiesić osad komórkowy w 4 ml HBSS zawierającym 1 mg/ml inhibitora enzymów na bazie soi. Delikatnie odpipetować kilkakrotnie pipetą o pojemności 1 ml, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. 
	UWAGA: Na tym etapie komórki można pozostawić na lodzie, dopóki komórki z drugiego trawienia nie znajdą się na tym samym etapie przetwarzania.</li>
	<li>Usuń kawałki błony owodniowej i umieść je w nowym pojemniku, uważając, aby enzymatyczny roztwór trawiący spłynął z każdego kawałka błony. 
	UWAGA: Można to osiągnąć, przeciągając kawałki owodni wzdłuż wewnętrznej krawędzi pojemnika.</li>
	<li>Przepuścić zawiesinę komórek z kroku 1.18 przez filtr 70 μm i odwirować przy 1 000 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Usunąć i odrzucić supernatant oraz ponownie zawiesić osad komórkowy w 4 ml HBSS zawierającym 1 mg/ml inhibitora enzymów na bazie soi. Delikatnie odpipetować kilkakrotnie pipetą o pojemności 1 ml, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.</li>
	<li>Połącz komórki z dwóch wytrawionych lub alternatywnie utrzymuj trawy komórek oddzielnie, dopóki komórki nie zostaną zliczone. 
	UWAGA: Zapobiega to mieszaniu się komórek o potencjalnie niskiej żywotności z komórkami o wysokiej żywotności.</li>
	<li>Dodać HBSS do końcowej objętości 10-20 ml i przeprowadzić liczenie komórek za pomocą błękitu trypanowego w celu zmierzenia żywotności.</li>
	<li>Potwierdź fenotyp komórek nabłonka za pomocą cytometrii przepływowej. Przygotować odpowiednie koktajle przeciwciał za pomocą anty-EpCAM-PE (rozcieńczenie 1:2), anty-CD90-PeCy5 (1:250) i anty-CD105-APC (1:100) w HBSS.</li>
	<li>Zawiesić podzbiór komórek z jednego lub obu procesów trawienia w koktajlu przeciwciał o stężeniu 25 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>W przypadku cytometrii przepływowej wybarwić 1 x 106 komórek koktajlami przeciwciał zawierającymi kontrole izotypów (np. Kontrola izotypu IgG1-PE + anty-CD90-PeCy5 + anty-CD105-APC). Utrzymuj ~ 1 x 106 komórek niezabarwionych w celu ustawienia cytometru przepływowego.</li>
	<li>Inkubować komórki w koktajlach przeciwciał w temperaturze 4 °C przez 60 minut.</li>
	<li>Umyj komórki 3x w HBSS i ponownie zawieś w ilości od 5 do 10 milionów komórek na ml do cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Wykonaj cytometrię przepływową i zanotuj wyniki. Oczekuje się, że czystość izolatu komórkowego (odsetek komórek EpCAM dodatnich i CD90/CD105 ujemnych) wyniesie odpowiednio 90-95% i <1%.</li>
	<li>Odłożyć odpowiednią liczbę komórek do badania pod kątem właściwych kryteriów kontroli jakości lub uwalniania, określonych w końcowym zastosowaniu. 
	UWAGA: Może to obejmować badania przesiewowe w kierunku choroby/wirusa lub inne kryteria bezpieczeństwa lub kryteria biologiczne.</li>
	<li>W przypadku pozostałych komórek należy postępować zgodnie z protokołem kriokonserwacji lub alternatywnie umieścić bezpośrednio w hodowli (krok 3.6 bezpośrednio do hodowli).</li>
</ol>
2. Kriokonserwacja hAEC
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Określ liczbę komórek i żywotność za pomocą danych z cytometrii przepływowej lub ręcznego liczenia z wykluczeniem błękitu trypanowego.</li>
	<li>Wirować przy 700 x g przez 5 min.</li>
	<li>Zawieś komórki w zakresie od 1 do 10 milionów komórek na ml w pożywkach do kriokonserwacji bez produktów zwierzęcych.</li>
	<li>Odpipetować odpowiednią objętość komórek do fiolek do kriokonserwacji z pierścieniem O-ringowym i umieścić w aparacie do zamrażania z kontrolowaną szybkością, w którym chłodzenie następuje w temperaturze około 1°C/min, aż do osiągnięcia -80°C.</li>
	<li>Przenieść fiolki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
3. Rozmrażanie i kultura cyrokonserwowanych hAEC
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Wyjąć fiolki do krioprezerwacji z ciekłego azotu i umieścić na lodzie. 
	UWAGA: Tylko do przelewu - przejdź szybko do następnego kroku.</li>
	<li>Szybko rozmrozić fiolki do krioprezerwacji w temperaturze 37 °C, aż pozostanie tylko mały kawałek (~5 mm x 5 mm) lodu. 
	UWAGA: Ważne jest, aby roztwór komórkowy nie nagrzewał się, aby zmniejszyć toksyczne działanie DMSO w pożywkach krioprezerwacyjnych.</li>
	<li>Rozcieńczyć pożywkę do kriokonserwacji 10-krotnie zimną (~4 °C) pożywką bez surowicy, dodawaną kroplami do probówki lub pojemnika o odpowiedniej wielkości.</li>
	<li>Wirować przy 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zawiesić ponownie w podłożu bez surowicy do przybliżonego stężenia 1 miliona komórek na ml. Określić liczbę komórek i żywotność za pomocą automatycznego lub ręcznego liczenia z wykluczeniem błękitu trypanowego. Oczekiwana żywotność po rozmrożeniu będzie o 5-10% mniejsza niż żywotność przed krioprezerwacją.</li>
	<li>Umieść komórki na standardowych wyrobach z tworzywa sztucznego poddanych hodowli komórkowej lub alternatywnie użyj kolagenu typu I do pokrycia powierzchni hodowli.</li>
	<li>W przypadku powłoki kolagenowej typu I postępuj zgodnie z poniższym protokołem
	<ol>
		<li>Przygotuj rozpuszczalny w kwasach kolagen typu I z ludzkiego łożyska (15 mg kolagenu z 25 ml wody dejonizowanej i 50 μl lodowatego kwasu octowego).</li>
		<li>Przykryj zlewkę Parafilm i mieszaj umiarkowanie w temperaturze 37 °C, aż do rozpuszczenia pasm kolagenu.</li>
		<li>Sterylny roztwór kolagenu z filtrem filtrującym 0,22 μm.</li>
		<li>Przefiltrowany kolagen rozcieńczyć w stosunku 1:10 wodą dejonizowaną. Ten rozcieńczony materiał jest roztworem o stężeniu roboczym do powlekania powierzchni tworzyw sztucznych i membran</li>.
		<li>Kolagen pokrywa powierzchnie plastikowe, szklane i membranowe przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w temperaturze 37°C lub O/N w temperaturze 2-8 °C.</li>
		<li>Usuń nadmiar płynu z powlekanej powierzchni i pozostaw do wyschnięcia O/N.</li>
		<li>Spłucz sterylną wodą do hodowli tkanek lub HBSS przed wprowadzeniem komórek i pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść hAEC w gęstości 25 000 komórek/cm2 w podłożu bez surowicy i pozwól na przyłączenie przez 72-96 godzin.</li>
	<li>Po przymocowaniu należy zmieniać pożywkę, ostrożnie odsysając i zastępując odpowiednią objętością pożywki bez surowicy co 2-3 dni.</li>
	<li>Komórki pasażowe korzystające z poniższego protokołu
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę do hodowli komórkowych i przemyć 1 x objętością sterylnego HBSS</li>
		<li>Dodać 1x objętość enzymatycznego roztworu trawiącego i inkubować przez 5-15 minut lub do momentu, gdy zaobserwuje się, że komórki odrywają się od powierzchni hodowli komórkowej.</li>
		<li>Zebrać enzymatyczny roztwór trawiący zawierający komórki, upewniając się, że komórki są oderwane od powierzchni hodowli komórkowej poprzez wielokrotne pipetowanie enzymatycznego roztworu trawiącego do powierzchni hodowli komórkowej</li>
		<li>Wirować przy 700 x g przez 5 min.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości HBSS zawierającego 1 mg/ml inhibitora enzymów na bazie soi. Delikatnie odpipetować kilkakrotnie pipetą o pojemności 1 ml, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.</li>
		<li>Dodać pożywkę bez surowicy do przybliżonego stężenia 1 miliona komórek/ml. Określić liczbę komórek i żywotność za pomocą automatycznego lub ręcznego liczenia z wykluczeniem błękitu trypanowego.</li>
		<li>Płytkować hAEC o gęstości 25 000 komórek/cm2 w podłożu bez surowicy i kontynuować standardowe metody hodowli.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurphy%2C+SV+%22Stem+Cells+and+Regenerative+Medicine%22">Stem Cells and Regenerative Medicine</a>. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).</li>
<li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+fluid+and+placental+membranes%3A+unexpected+sources+of+highly+multipotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Reprod.+Med%22%5BJournal%5D)">Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells.</a> Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).</li>
<li>Parolini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+isolation+and+characterization+of+cells+from+human+term+placenta%3A+outcome+of+the+first+international+Workshop+on+Placenta+Derived+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells.</a> Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).</li>
<li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preterm+human+amnion+epithelial+cells+have+limited+reparative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential.</a> Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).</li>
<li>Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+pluripotent+stem+cell+line+derived+from+human+amniotic+membranes+and+initiation+of+germ+layers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro.</a> Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).</li>
<li>Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+amniotic+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of amniotic epithelial stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3(2007).</li>
<li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amnion+epithelial+cell+isolation+and+characterization+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6(2010).</li>
<li>Ilancheran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+derived+from+human+fetal+membranes+display+multilineage+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential.</a> Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).</li>
<li>Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+amnion+epithelium+into+skin+and+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles.</a> Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).</li>
<li>Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+characteristics+of+amniotic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells.</a> Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).</li>
<li>Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+ocular+surface+with+heterologous+limbal+epithelium+and+amniotic+membrane+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model.</a> Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).</li>
<li>Sankar, V., Muthusamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+human+amniotic+epithelial+cell+transplantation+in+spinal+cord+injury+repair+research%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research.</a> Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).</li>
<li>Yuge, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+human+amniotic+epithelial+cells+express+connexin+26+and+Na-K-adenosine+triphosphatase+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear.</a> Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppressive+factors+secreted+by+human+amniotic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amniotic+epithelial+cells+ameliorate+behavioral+dysfunction+and+reduce+infarct+size+in+the+rat+middle+cerebral+artery+occlusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model.</a> Shock. 29 (5), 603-611 (2008).</li>
<li>Venkatachalam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+neurotrophic+factor+secreted+by+amniotic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biocell%22%5BJournal%5D)">Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells.</a> Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).</li>
<li>Manuelpillai, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amniotic+epithelial+cell+transplantation+induces+markers+of+alternative+macrophage+activation+and+reduces+established+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis.</a> PLoS One. 7 (6), e38631(2012).</li>
<li>Wei, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion-isolated+cells+normalize+blood+glucose+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).</li>
<li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+prevent+bleomycin-induced+lung+injury+and+preserve+lung+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function.</a> Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).</li>
<li>Murphy, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+induced+to+express+functional+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> PLoS One. 7 (9), e46533(2012).</li>
<li>Murphy, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+do+not+abrogate+pulmonary+fibrosis+in+mice+with+impaired+macrophage+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function.</a> Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).</li>
<li>Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amnion+epithelial+cells+as+a+candidate+therapy+for+acute+and+chronic+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+Int%22%5BJournal%5D)">Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury.</a> Stem cells Int. 2012, 709763(2012).</li>
<li>Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+mediate+lung+repair+by+directly+modulating+macrophage+recruitment+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization.</a> , (2013).</li>
<li>Litvinov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule+%28Ep-CAM%29+modulates+cell-cell+interactions+mediated+by+classic+cadherins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).</li>
<li>Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial+cell+adhesion+molecule+%28Ep-CAM%29+as+a+morphoregulatory+molecule+is+a+tool+in+surgical+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology.</a> The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).</li>
<li>Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mesenchymal+stem+cells+obtained+from+different+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues.</a> Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).</li>
<li>Park, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPark%2C+A+%22Newborn+Stem+Cells%3A+Identity%2C+Function%2C+and+Clinical+Potential%22">Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential</a>. , John Wiley & Sons, Inc. 119-137 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieje kilka krytycznych parametrów, które mogą mieć znaczący wpływ na powodzenie tej metodologii. Przechowywanie łożyska lub owodni przez okres do 3 godzin przed izolacją hAEC może być pożądane do celów logistycznych lub planowania, jednak zaleca się, aby tkanka została przetworzona tak szybko, jak to możliwe. Jeżeli tkanka ma być przechowywana, zaleca się, aby przechowywanie odbywało się po rozebraniu i umyciu błony owodniowej. Owodnia może być przechowywana w sterylnym HBSS zawierającym antybiotyki w temperaturze 4 ...

Komórki pochodzące ze źródeł okołoporodowych, takich jak łożysko, błony łożyskowe, pępowina i płyn owodniowy, przyciągnęły uwagę badaczy i klinicystów jako potencjalne źródło komórek dla medycyny regeneracyjnej1,2. Powodem tego zainteresowania jest fakt, że wszystkie te typy komórek posiadają pewien stopień plastyczności i zdolności immunomodulacyjnych3, które są fundamentalne dla ich potencjalnych zastosowań terapeutycznych.
hAEC to niejednorodna populacja nabłonkowa, która może pochodzić z błony owodniowej4 lub przedwczesnej, stanowiąc obfite potencjalne źródło regeneracyjnego materiału komórkowego. Właściwości, które sprawiają, że hAEC są atrakcyjne jako terapia komórkowa, obejmują ich multipotencję, niską immunogenność i właściwości przeciwzapalne. Stwierdzono, że hAEC są wysoce multipotencjalne zarówno in vitro, jak i in vivo, zdolne do różnicowania się w linie mezodermalne (kardiomiocyty, miocyty, osteocyty, adipocyty), linie endodermalne (komórki trzustki, komórki wątroby, komórki płuc) i linie ektodermalne (włosy, skóra, komórki nerwowe i astrocyty)5-10.
Pocieszająco, pomimo swojej wielomocności, hAEC nie wydają się tworzyć guzów ani sprzyjać rozwojowi guza in vivo. Co więcej, hAEC są również uprzywilejowane immunologicznie, wykazując niską ekspresję ludzkich antygenów leukocytarnych (HLA) klasy II)8. Ta właściwość prawdopodobnie leży u podstaw ich zdolności do unikania odrzucenia immunologicznego po przeszczepie allogenicznym i ksenogennym, jak wykazano w badaniach z udziałem kompetentnych immunologicznie małp, królików, świnek morskich, szczurów i świń11-13. hAEC wykazują silne właściwości immunomodulujące i immunosupresyjne, a tym samym oferują znaczące korzyści praktyczne dla potencjalnych zastosowań klinicznych w terapii chorób autoimmunologicznych. Uważa się, że hAEC pełnią funkcje immunomodulujące zarówno w wrodzonym, jak i nabytym układzie odpornościowym. Jednym z sugerowanych mechanizmów jest wydzielanie czynników immunomodulujących14.
Obecne zastosowania hAEC w przedklinicznych modelach chorób zwierzęcych obejmują leczenie udaru mózgu, stwardnienia rozsianego, chorób wątroby, cukrzycy oraz przewlekłych i ostrych chorób płuc. Naukowcy wykazali zainteresowanie wykorzystaniem hAEC w leczeniu zapalenia mózgu po udarze ze względu na ich unikalne właściwości. Istnieją dowody na to, że hAEC mogą przekraczać barierę krew-mózg, gdzie mogą się wszczepiać, przeżywać do 60 dni, różnicować się w neurony, zmniejszać stan zapalny i promować regenerację uszkodzonej tkanki ośrodkowego układu nerwowego w zwierzęcych modelach chorób neurologicznych15.
hAEC oferują możliwość namierzania i odwracania wielu ścieżek patologicznych, które przyczyniają się do rozwoju i progresji stwardnienia rozsianego. Na przykład wyniki przedklinicznych badań na zwierzętach sugerują, że hAEC są silnie immunosupresyjne i mogą potencjalnie indukować obwodową tolerancję immunologiczną i odwracać trwające reakcje zapalne. Wykazano również, że hAEC mają zdolność różnicowania się w komórki nerwowe in vivo i wzmacniania endogennej neuroregeneracji poprzez wydzielanie szerokiej gamy czynników neurotroficznych16.
Komórki nabłonkowe owodni ludzkiej i gryzońskiej już wykazały swoją skuteczność terapeutyczną w leczeniu chorób wątroby na modelach zwierzęcych. W modelu indukcji uszkodzenia czterochlorku węgla w chorobie wątroby, przeszczep hAEC prowadzi do wszczepienia żywotnych hAEC do wątroby, czemu towarzyszy zmniejszona apoptoza hepatocytów oraz zmniejszenie stanu zapalnego i zwłóknienia wątroby17.
hAEC mogą być stymulowane do wyrażania czynników trzustkowych, w tym transporterów insuliny i glukozy. W kilku badaniach analizowano potencjał hAEC do przywracania poziomu glukozy we krwi u myszy z cukrzycą18. U myszy otrzymujących hAEC zarówno masa ciała zwierzęcia, jak i poziom glukozy we krwi spadły do normalnego poziomu po wstrzyknięciu komórek. Badania te stanowią mocne argumenty przemawiające za stosowaniem hAEC w leczeniu cukrzycy.
hAEC mają udowodnioną rolę w zapobieganiu i leczeniu eksperymentalnych ostrych i przewlekłych uszkodzeń płuc zarówno u dorosłych, jak i u noworodków19. Badania te wykazały, że hAEC różnicują się in vitro w funkcjonalne komórki nabłonka płuc wykazujące ekspresję wielu białek związanych z płucami, w tym transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR), kanału jonowego, który jest zmutowany u pacjentów z mukowiscydozą20. Dodatkowo, gdy hAEC są dostarczane do uszkodzonego płuca dorosłego i noworodka, wywierają swoje działanie naprawcze poprzez modulację komórek odpornościowych gospodarza, zmniejszając rekrutację leukocytów płucnych, w tym neutrofili, makrofagów i limfocytów21-23.
Biorąc pod uwagę ich obfitość, bezpieczeństwo i sprawdzone zastosowania kliniczne dla wielu chorób, badania kliniczne z użyciem hAEC są nieuniknione. Mając na celu przyspieszenie przełożenia terapii hAEC na badania kliniczne, opracowaliśmy metody izolacji, kriokonserwacji i hodowli hAEC w sposób odpowiedni dla badań klinicznych, przy użyciu odczynników niepochodzących z produktów pochodzenia zwierzęcego zgodnie z aktualnymi wytycznymi dobrej praktyki wytwarzania (cGMP).
Oparliśmy ten protokół na wcześniej opublikowanym protokole, którego z powodzeniem używaliśmy do izolowania hAEC za pomocą odczynników pochodzenia zwierzęcego6. Zmieniliśmy pierwotny protokół, aby zastąpić produkty pochodzenia zwierzęcego odczynnikami niezawierającymi produktów pochodzenia zwierzęcego, a następnie przeprowadziliśmy optymalizację w celu optymalizacji wydajności, żywotności i czystości komórek. Naszym celem było opracowanie protokołu, który byłby zgodny ze standardami regulacyjnymi dotyczącymi produkcji komórek do badań klinicznych na ludziach.

<table><tbody><tr><td>Zestaw</td><td></td><td></td><td></td>do zbierania</tr><tr><td>ubrań Tacka do zdejmowania izolacji</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-361B</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze opatrunkowe Liberty, spiczaste 13 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17329&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki - Ostre/Proste</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0562592&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne rękawiczki lateksowe&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-643&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Odzież</td><td></td><td></td><td></td>ochronna</tr><tr><td>Odzież ochronna (fartuch)</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>Fartuchy izolacyjne</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne rękawice lateksowe&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-643&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Maska na twarz ogólnego przeznaczenia</td><td>Cardinal Health</td><td>AT7511</td><td></td></tr><tr><td>Maski</td><td>Medline</td><td>CRI1001</td><td></td></tr><tr><td>Ochraniacze na buty</td><td>U-line</td><td>S-7873W</td><td></td></tr><tr><td>Media i odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td>bez wapnia i magnezu</td></tr><tr><td>TrypZean (produkt pochodzenia zwierzęcego&ndash; wolna rekombinowana trypsyna)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3449</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny sojowej&nbsp; 1g/50mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS5</td><td>BioLife Solutions</td><td>205102</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik do błękitu trypanowego</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EpCam-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130 - 091-253</td><td></td></tr><tr><td>Izotyp PE kontrola</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-845</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD90-PeCy5</td><td>BD Pharmingen</td><td>555597</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola izotypu PeCy5</td><td>BD Pharmingen</td><td>557224</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD105-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola izotypu APC</td><td>Pharmingen</td><td>340754</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen Typ VI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7521</td><td></td></tr><tr><td>Materiały eksploatacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta miarowa 50 ml</td><td>BD/Falcon</td><td>356550</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta miarowa 10 ml</td><td>BD/Falcon</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta miarowa 5 ml</td><td>BD/Falcon</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki Falcon</td><td>BD/Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki Falcon</td><td>BD/Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>15 cm szalki Petriego</td><td>Corning</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m filtry</td><td>BD/Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m filtry</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Końcówki do pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-401</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Końcówki do pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-409</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Strzykawka</td><td>BD/Medical</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa szpatułka</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-245-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa łódka wagowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-102&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki kriogeniczne</td><td>Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mr Frosty</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Szafka na</td><td></td><td></td><td></td> zagrożenia biologiczne</tr></tbody></table>

izolacja, kriokonserwacja i hodowla ludzkich komórek nabłonka owodni do zastosowań klinicznych

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Ludzkie komórki nabłonkowe owodni (hAEC) pochodzące z błon owodniowych przyciągnęły uwagę badaczy i klinicystów jako potencjalne źródło komórek dla medycyny regeneracyjnej. Powodem tego zainteresowania są dowody na to, że komórki te mają wysoce multipotencjalną zdolność różnicowania, niską immunogenność i funkcje przeciwzapalne. Właściwości te skłoniły naukowców do zbadania potencjału hAEC do stosowania w leczeniu różnych chorób i zaburzeń w przedklinicznych badaniach na zwierzętach z dużym sukcesem.
hAEC znalazły szerokie zastosowanie w leczeniu wielu chorób i zaburzeń. Potencjalne zastosowania kliniczne hAEC obejmują leczenie udaru mózgu, stwardnienia rozsianego, chorób wątroby, cukrzycy oraz przewlekłych i ostrych chorób płuc. Przejście od przedklinicznych badań na zwierzętach do badań klinicznych wymaga wyższego standardu kontroli jakości i bezpieczeństwa produktów terapii komórkowej. Ze względów bezpieczeństwa i kontroli jakości zaleca się, aby protokoły izolacji komórek wykorzystywały odczynniki niezawierające produktów pochodzenia zwierzęcego. 
Opracowaliśmy protokoły, które pozwalają badaczom izolować, kriokonserwować i hodować hAEC przy użyciu odczynników wolnych od produktów zwierzęcych. Zaletą tej metody jest to, że komórki te mogą być izolowane, charakteryzowane, kriokonserwowane i hodowane bez ryzyka dostarczenia potencjalnie szkodliwych patogenów zwierzęcych ludziom, przy jednoczesnym zachowaniu odpowiedniej wydajności komórek, żywotności i potencjału wzrostu. Dla badaczy przechodzących od badań przedklinicznych na zwierzętach do badań klinicznych metodologie te znacznie przyspieszą zatwierdzanie przez organy regulacyjne, zmniejszą ryzyko i poprawią jakość populacji komórek terapeutycznych.

Przy prawidłowym przeprowadzeniu tej procedury należy spodziewać się średniej wydajności na poziomie 120 milionów hAECs, przy typowym zakresie od 80 do 160 milionów komórek. Przy takiej wydajności można oczekiwać średniej żywotności na poziomie 83 ± 4%. Zwiększona średnia wydajność i nieco niższa żywotność w metodzie klinicznej mogą wynikać z wyższej aktywności trypsyny w porównaniu z produktem pochodzenia zwierzęcego, a być może również z braku białek surowiczych. Izolowane hAECs charakteryzują się średnim profilem powi...

Opisujemy protokół izolacji i hodowli ludzkich komórek nabłonka owodni (hAEC) przy użyciu odczynników wolnych od produktów zwierzęcych, zgodnie z aktualnymi wytycznymi dobrej praktyki produkcyjnej (cGMP).

Izolacja, kriokonserwacja i hodowla ludzkich komórek nabłonka owodni do zastosowań klinicznych

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie populacji komórek nabłonka z ludzkiej błony owodniowej. Osiąga się to poprzez usunięcie błony owodniowej z błony korionowej, a w drugim etapie łożyska. Błona owodniowa jest oczyszczana ze wszystkich śladów krwi, a następnie trawiona roztworem enzymu trypsyny wolnym od produktów zwierzęcych.W ostatnim etapie zawiesina tkankowa jest filtrowana w celu zebrania wyizolowanych komórek nabłonka. Ostatecznie czystość populacji komórek nabłonka owodni można ocenić za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że nie wymaga ekspozycji komórek na produkty pochodzenia zwierzęcego, co oznacza, że komórki te są przydatne w badaniach klinicznych.Aby wyizolować komórki nabłonka owodni, zacznij od umieszczenia łożyska na sterylnej powierzchni w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy drugiej. Następnie użyj sterylnego HBSS, aby zmyć jak najwięcej krwi z powierzchni łożyska. Następnie umieść łożysko tak, aby pępowina i błony łożyskowe były skierowane do góry i ręcznie usuń błonę owodniową z błony korionowej łożyska, pracując wokół krawędzi błony w kierunku pępowiny.Należy zwrócić uwagę, aby usunąć wszelkie kawałki zanieczyszczającej błony korionowej z owodni, a następnie za pomocą sterylnych nożyczek przeciąć błonę owodniową około dwóch centymetrów od podstawy pępowiny i umieścić błonę w 500-mililitrowym pojemniku zawierającym 250 mililitrów HBSS, zamknąć pojemnik i dokładnie nim wstrząsnąć, aby umyć tkankę, a następnie użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść membranę na 15-centymetrową szalkę Petriego. Teraz pokrój membranę na pionowe kawałki o długości pięciu centymetrów i umyj je jeszcze trzy do pięciu razy, jak właśnie pokazano, aż membrana stanie się przezroczysta bez zanieczyszczającej krwi. Po usunięciu całej krwi przenieś kawałki tkanki do 50 mililitrów roztworu do trawienia enzymatycznego, pobierając ker, aby zminimalizować przenoszenie HBSS i inkubować tkankę owodniową w ciepłym pomieszczeniu w temperaturze 37 stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem, aby usunąć pozostałą krew po 15 minutach, przeciągnij każdy kawałek wzdłuż wewnętrznej krawędzi pojemnika, aby odsączyć stary roztwór trawiący i dodaj kawałki do 100 mililitrów świeżego enzymatycznego roztworu do trawienia.Po godzinnym trawieniu w tych samych warunkach przenieś błony do nowego pojemnika z roztworem do trawienia enzymatycznego. Uważając, aby osuszyć tkanki, jak właśnie pokazano, i delikatnie mieszać błony przez ostatnie 60 minut po drugim trawieniu. Przecedź zawiesinę komórek przez filtr o średnicy 70 mikrometrów, a następnie odwiruj zawiesinę komórek przez 10 minut W temperaturze 1000 G i temperaturze pokojowej delikatnie ponownie zawieś osad w czterech mililitrach inhibitora enzymów na bazie soi, aby utworzyć zawiesinę pojedynczej komórki, a następnie dodaj HBSS do komórek do końcowej objętości od 10 do 20 mililitrów.Określ liczbę żywotnych komórek przez wykluczenie błękitu triamowego, a następnie kriokonserwuj izolowane komórki nabłonkowe owodni. Najpierw zegnij je na pięć minut w temperaturze 700 serów i temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawiesić osad na raz 10 z sześciu do jednego razy 10 siódmych komórek na mililitr w pożywce do kriokonserwacji bez produktów zwierzęcych i pipetować odpowiednią objętość komórek do fiolek do krioprezerwacji z pierścieniem.Na koniec umieścić fiolki w aparacie do zamrażania z kontrolowaną szybkością, w którym chłodzenie następuje z prędkością około jednego stopnia Celsjusza na minutę, aż do osiągnięcia minus 80 stopni Celsjusza, a następnie przenieść fiolki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania. Wiele nośników wolnych od produktów pochodzenia zwierzęcego działa odpowiednio. Jednak optymalne stężenie DMSO wynosi około pięciu do 10%Zazwyczaj oczekiwana żywotność po rozmrożeniu jest o pięć do 10% mniejsza niż żywotność przed krioprezerwacją i może być znacznie wyższa dla niedoświadczonego użytkownika.Hodowlę komórkową można przeprowadzić na ludzkich komórkach nabłonka owodni, aby umożliwić charakterystykę lub różnicowanie komórek do dalszej analizy, ponieważ zachowują one swój fenotyp nabłonka w pożywkach hodowlanych wolnych od surowicy. Oprócz właściwości immunoregulacyjnych i przeciwzapalnych, wykazano, że ludzkie komórki nabłonka owodni są bardzo silne, in vitro i in vivo, różnicując się w linie komórkowe reprezentatywne dla trzech podstawowych listków rozrodczych po jego opracowaniu. Technika ta utorowała naukowcom drogę do przeprowadzania badań klinicznych w stanach takich jak choroba płuc i choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi.

isolation-cryopreservation-culture-human-amnion-epithelial-cells-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Od czasu opracowania przez Jamesa Thomsona i współpracowników w 1998 roku techniki izolacji i hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hES) in vitro, zamrażanie komórek do późniejszego wykorzystania oraz rozmrażanie i namnażanie komórek z zapasów mrożonych stały się istotnymi procedurami wykonywanymi w rutynowej hodowli komórek hES. Ponieważ komórki hES są bardzo wrażliwe na stresy towarzyszące zamrażaniu i rozmrażaniu, należy zachować szczególną ostrożność. W niniejszym materiale...

Mrożenie i rozmrażanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i błonowych mezenchymalnych komórek macierzystych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu nieintegrującego podejścia epizodycznego w pełni zdefiniowanych chemicznie warunkach. Szczegółowo opisano procedury ekstrakcji, hodowli, przeprogramowania i charakterystyki powstałych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą rygorystycznych metod.

Przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów

To badanie przedstawia zweryfikowaną i zoptymalizowaną procedurę izolacji i hodowli ludzkich komórek zrębu endometrium do przeprowadzenia testu decydualizacji in vitro. Co więcej, badanie to dostarcza szczegółowej metody skutecznego knockdown określonego genu za pomocą siRNA w ludzkich komórkach zrębu endometrium.

Izolacja ludzkich komórek zrębu endometrium do dendualizacji in vitro

Ten protokół opisuje izolację komórek nabłonkowych z różnych regionów anatomicznych błony owodniowej człowieka w celu określenia ich heterogeniczności i właściwości funkcjonalnych do ewentualnego zastosowania w modelach klinicznych i fizjopatologicznych.

Hodowla in vitro komórek nabłonkowych z różnych regionów anatomicznych ludzkiej błony owodniowej

Tutaj opisujemy metodę ogrzewania zeszklonych ludzkich blastocyst, hodowli ich przez okres implantacji in vitro, trawienia ich do pojedynczych komórek i zbierania wczesnych komórek trofoblastu do dalszych badań.

Jednokomórkowy zbiór komórek trofoblastu w zarodkach ludzkich w okresie okołoimplantacyjnym

Niniejsze badanie przedstawia protokół badań przesiewowych chromosomów ludzkich embrionów, który wykorzystuje zużytą pożywkę hodowlaną, co pozwala uniknąć biopsji zarodka i umożliwia identyfikację ploidalności chromosomów za pomocą NGS. W niniejszym artykule przedstawiono szczegółową procedurę, w tym przygotowanie pożywki hodowlanej, amplifikację całego genomu (WGA), przygotowanie biblioteki sekwencjonowania nowej generacji (NGS) oraz analizę danych.

Badania przesiewowe chromosomów ludzkich zarodków przedimplantacyjnych przy użyciu zużytej pożywki hodowlanej: pobieranie próbek i analiza ploidalności chromosomów

Tutaj opisujemy izolację, amplifikację i różnicowanie pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka nosa (HNE) na granicy powietrze-ciecz oraz protokół biobankowania pozwalający na skuteczne zamrażanie, a następnie rozmrażanie amplifikowanego HNE. W protokole analizowane są właściwości elektrofizjologiczne zróżnicowanych komórek HNE i korekcja wydzielania chlorków związanych z CFTR po różnych zabiegach modulatorowych.

Pierwotne ludzkie komórki nabłonka nosa: biobankowanie w kontekście medycyny precyzyjnej

To badanie dostarcza szczegółowego protokołu do efektywnej kriokonserwacji komórek nabłonkowych barwnika siatkówki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych.

Kriokonserwacja ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z komórek macierzystych w optymalnym stadium

Obecne badanie przedstawia łatwiejszy, oszczędzający czas i ekonomiczny protokół efektywnego izolowania i hodowania pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka (HMEC) z małych ilości tkanki sutka. Protokół ten jest odpowiedni do szybkiego wytwarzania pierwotnych HMEC zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych.

Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka

Protokół ten opisuje nowatorski trójwymiarowy (3-D) model hodowli wykorzystujący hydrożel hialuronowy połączony z tyraminą do enkapsulacji i hodowli pęcherzyków preantralnych z jajnika myszy. Szczegółowo opisujemy również dwa podejścia do kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych przez witryfikację.

Zastosowanie nowego hydrożelu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli pęcherzyków jajnikowych i metodologii kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych myszy

Poznaj metodę izolacji ludzkich komórek nabłonka owodni bez użycia produktów pochodzenia zwierzęcego, zgodną z wytycznymi cGMP. Technika ta umożliwia uzyskanie czystej populacji komórek hAECs do zastosowań klinicznych i badań nad medycyną regeneracyjną.

Izolacja, kriokonserwacja i hodowla ludzkich komórek nabłonka owodni do zastosowań klinicznych

Przeglądaj więcej filmów