Wielkoskalowa sekcja embrionalnego serca danio pręgowanego do analizy transkrypcyjnej
January 12th, 2015
Aby przeanalizować profile ekspresji genów sercowych podczas rozwoju serca danio pręgowanego, należy wyekstrahować całkowite RNA z izolowanych serc. W tym miejscu przedstawiamy protokół pobierania funkcjonalnych/bijących serc poprzez szybką ręczną sekcję z zarodków danio pręgowanego w celu uzyskania mRNA specyficznego dla serca.
Ogólnym celem tej procedury jest pobranie serc poprzez szybką ręczną sekcję z żywych zarodków danio pręgowanego w celu uzyskania specyficznego dla serca Mr.NA.Osiąga się to poprzez pierwsze pipetowanie, wiele znieczulonych zarodków w górę iw dół przez wąską końcówkę pipety, aby jednocześnie uwolnić serca z ciał embrionalnych. Następnie wypreparowane serca są oddzielane od szczątków embrionalnych w dwóch szybkich etapach filtracji. Następnie fluorescencyjnie oznaczone serca są ręcznie sortowane z pozostałych zanieczyszczeń.
Na koniec z pobranych serc ekstrahuje się specyficzne dla serca RNA. Ostatecznie protokół sekcji serca służy do zebrania wystarczającej ilości embrionalnych serc do przeprowadzenia analizy transkryptomu. Metoda ta pomoże zadać kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju serca rybika cukrowego, takie jak to, który transkrypt ulega ekspresji w sercu na różnych etapach rozwoju, a także porównać dziką i zmutowaną ekspresję serca Aby uzyskać zarodki danio pręgowanego do ekstrakcji serca, krzyżuj dorosłe ryby transgeniczne wyrażające białko fluorescencyjne w sercu, takie jak transgeniczna mila siódma EGFP pod mikroskopem stereoskopowym.
Monitoruj rozwój zarodków. Sprawdź, czy serca są rzeczywiście znakowane fluorescencyjnie i ręcznie usuń powłokę zarodków, gdy osiągną pożądany etap. Przenieś około 100 zarodków do 1,5 mililitrowej probówki fuge i dodaj 16 miligramów na mililitr trica w trzech pożywkach, aby je znieczulić.
Połóż rurkę na lodzie. Usuń roztwór trica i użyj jednego mililitra lodowatego podłoża L 15 10% FBS do umycia zarodków, trzymając je na lodzie. Po usunięciu tego płukania dodaj jeden mililitr L 15 FBS i użyj okrągłej końcówki ładującej żel, aby pipetować zarodki w górę iw dół pięć do ośmiu razy, aby całkowicie rozbić żółtka, pipetować zarodki kroplami na powierzchnię roztworu, tak aby kropla pękła, a zarodki zostały delikatnie przerwane.
W przypadku pierwszej partii wypreparowanych zarodków pod mikroskopem stereoskopowym należy ocenić ich integralność i proporcję wypreparowanych serc oraz odpowiednio dostosować sposób pipetowania. W przypadku kolejnych partii należy umieścić filtr o średnicy 100 mikrometrów na 50-mililitrowej probówce wirówkowej i nałożyć próbkę embrionalną. Następnie użyj jednego mililitra L 15 FBS do przepłukania rurki fuge i nałóż roztwór na filtr, aby wypłukać serca, które pozostały w filtrze.
Użyj L 15 FBS, aby umyć go dwukrotnie. Następnie umieść filtr o średnicy 30 mikrometrów na 15-mililitrowej probówce wirówkowej i przeprowadź przepływ przez serca zawierające serca. Użyj L 15 FBS do wypłukania tego filtra, który zatrzymuje serca i zmywa mniejsze zanieczyszczenia.
Następnie odwróć filtr o średnicy 30 mikrometrów do góry nogami na szalce Petriego pokrytej agrosem i zastosuj trzy jednomililitrowe płukania pożywki L 15 FBS, aby wypłukać serca z filtra Pod mikroskopem fluorescencyjnym użyj kleszczy, aby ręcznie oddzielić serca GFP dodatnie od tkanek niefluorescencyjnych, koncentrując je w środku naczynia. Fizjologia serc wydaje się normalna, ponieważ po rozwarstwieniu nadal biją. Procedura. Aby wyizolować mRNA z serc, zbierz je w jak najmniejszej objętości pożywki i pipetuj do 1,5 mililitrowej probówki na lodzie zawierającej 0,75 mililitra RNA.
Później pod mikroskopem fluorescencyjnym. View końcówkę pipety, aby sprawdzić, czy żadne serca nie są przyklejone do końcówki pipety. Po pobraniu serc z kilku rund izolacji do probówki RNA później, zgodnie z protokołem tekstowym, odwiruj próbki w temperaturze 15, 700 g i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut.
Następnie, pod mikroskopem fluorescencyjnym, ostrożnie zebrać jak najwięcej satu i przenieść na 1% pokrytą agros szalkę Petriego zawierającą trzy mililitry pożywki L 15 10%FBS. Następnie, pod kapturem chemicznym, dodaj 0,5 mililitra triolu do probówki zawierającej osadzone serca i trzymaj na lodzie Pod mikroskopem fluorescencyjnym przenieś serca, które pozostały w supernatencie, do świeżego naczynia pokrytego 1% agros z L 15 10% FBS, aby później rozcieńczyć RNA, który jest bardzo lepki. Następnie zbierz serca w małej objętości i przenieś je do probówki z osadzonymi sercami w triolu, aby rozbić serca, zawirować probówkę i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Następnie pod kapturem chemicznym dokładnie dodaj 100 mikrolitrów chloroformu i przenieś roztwór do 1,5 mililitrowej probówki PrepU, PLG Inkubuj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, odwiruj próbkę w temperaturze 15, 700 G i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut i przenieś fazę wodną do nowej 1,5 mililitrowej probówki. Następnie dodaj od pięciu do 10 mikrogramów glikogenu i 250 mikrolitrów wstępnie schłodzonego izopropanolu. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza następnego dnia.
Odwirować próbki w temperaturze 15, 700 g i czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut, a następnie wyrzucić nasączony. Nałóż jeden mililitr 75% etanolu do umycia wirówki paletowej i wyrzuć snat. Pozwól, aby pozostały etanol odparował z osadu w temperaturze pokojowej, aż granulka stanie się biała.
Dodaj 20 mikrolitrów wolnej od RNA, podwójnie destylowanej wody do osadu i inkubuj w temperaturze 55 stopni przez 10 do 15 minut, aby rozpuścić RNA. Następnie umieść rurki na lodzie. Użyj spektrofotometru, aby określić stężenie i czystość RNA i uruchom próbkę na 1% żelu agros, aby ocenić integralność porównania RNAA próbek serca przed sortowaniem z resztek embrionalnych po 56 godzinach od zapłodnienia w porównaniu z 36 godzinami po zapłodnieniu.
Zarodki po 56 godzinach od zapłodnienia dały więcej szczątków embrionalnych niż po 36 godzinach od zapłodnienia po filtracji w celu określenia czystości próbki serca 56 HPF, poziomy ekspresji transkryptów sercowych w porównaniu z dodatkowymi transkryptami sercowymi porównano za pomocą R-T-Q-P-C-R. Żel ten pokazuje RNA wyekstrahowane z izolowanych serc oraz z uszkodzonych zarodków bez serc. Pomiary absorbancji wykazały, że 300 serc dało około 660 nanogramów RNA.
To 33 nanogramy na mikrolitr w końcowej objętości 20 mikrolitrów. Względne poziomy ekspresji genów obliczono za pomocą eksperymentów R-T-Q-P-C-R dla pokazanych tutaj markerów. Zgodnie z oczekiwaniami, siódma mila była znacznie wzbogacona w próbce serca w porównaniu z zarodkiem bez próbki serca, jak widać tutaj.
Marker komórek śródbłonka, KDRL, był umiarkowanie wzbogacony w sercu. Marker erytrocytów hemoglobina beta embrionalna 1.1 był nadreprezentowany w próbce serca, mimo że serca nadal biły po sekcji, która powinna wydalić czerwone krwinki z serca. W przeciwieństwie do poziomów krystalicznego markera soczewki alfa A i markera OUN, GFAP był znacznie obniżony w próbce serca.
Wyniki te pokazują, że protokół sekcji serca daje wysokiej jakości swoiste dla serca RNA z całych zarodków danio pręgowanego. W tym eksperymencie ważne jest, aby monitorować próbkę, aby uniknąć utraty serca podczas procedury sekcji.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół zbierania funkcjonalnych serc z żywych zarodków danio pręgowanego poprzez szybkie ręczne sekcjonowanie. Metoda ta pozwala na ekstrakcję mRNA specyficznego dla serca, ułatwiając analizę profili ekspresji genów podczas rozwoju serca.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Rozwój serca
- Model danio pręgowanego
- Analiza ekspresji genów
Tło
- Danio pręgowane są cennym modelem do badania rozwoju serca kręgowców.
- Rozumienie ekspresji genów serca jest kluczowe dla wnikliwej wiedzy z dziedziny biologii rozwoju.
- Transgeniczne danio pręgowane mogą być wykorzystane do wizualizacji określonych tkanek serca.
- Ekstrakcja RNA z izolowanych serc jest niezbędna do analizy transkryptomu.
Cel badania
- Rozwój niezawodnej metody izolowania bijących serc z zarodków danio pręgowanego.
- Możliwość ekstrakcji RNA specyficznego dla serca do dalszej analizy.
- Badanie ekspresji genów na różnych etapach rozwoju.
Zastosowane metody
- Znieczulenie zarodków danio pręgowanego do sekcji.
- Pipetowanie zarodków w celu uwolnienia serc z ciał embrionalnych.
- Kroki filtracji w celu oddzielenia serc od resztek.
- Ręczne sortowanie ufluorescynowanych serc.
Główne wyniki
- Sukces w zbieraniu funkcjonalnych serc z zarodków.
- Ekstrakcja wystarczających ilości RNA specyficznego dla serca.
- Ułatwienie analizy transkryptomu w celu badania ekspresji genów.
- Wgląd w różnice w ekspresji genów między sercami dzikimi i mutantami.
Wnioski
- Opracowana metoda jest skuteczna w ekstrakcji RNA sercowego.
- Ta metoda może postępować w badaniach nad rozwojem serca i genetyką.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać to podejście do eksploracji funkcji serca u danio pręgowanego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolating cardiac-specific transcriptomes from zebrafish embryos enables precise interrogation of developmental gene expression, reducing noise from non-cardiac tissues. This approach supports target validation in cardiovascular discovery by providing high-purity RNA for mechanistic studies. The method accelerates preclinical de-risking by linking genetic perturbations to functional heart phenotypes in a scalable vertebrate model.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cardiac-specific transcriptional profiles to validate therapeutic targets in heart development pathways.
- Operational Value: Provides a rapid dissection workflow to collect sufficient hearts for reproducible RNA extraction and downstream qPCR analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative cardiac RNA readouts that enable comparison of wild-type and mutant gene expression profiles.
- Operational Value: Uses fluorescent labeling and filtration to standardize heart isolation, reducing variability in sample preparation for assay readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports phenotypic screening of cardiac mutants by isolating beating hearts for transcriptome analysis, facilitating genotype-to-phenotype mapping.
- Operational Value: Yields high-integrity RNA suitable for RT-qPCR, enabling detection of stage-specific expression changes in developmental time courses.
Pipeline & Workflow Integration
The protocol fits within early discovery workflows where cardiac-specific molecular readouts are needed to de-risk targets before lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating hearts to measure cardiac-enriched transcripts like myl7 and kdrl, clarifying pathway activity.
- Screening: Enables standardized preparation of transgenic hearts for quantitative analysis, improving reproducibility across experimental batches.
- Analytics: Produces RNA suitable for RT-qPCR, delivering quantitative dependent variable measurements that allow comparison of gene expression under different genetic or experimental conditions.
- Translational Research: Connects genetic manipulation to cardiac transcriptome outcomes, supporting preclinical validation of disease-relevant mechanisms in zebrafish.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable dissection and RNA extraction pipeline for cardiac studies, reducing redevelopment costs across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by minimizing transcriptome contamination and enriching cardiac-specific signals.
- Operational Value: Standardizes heart collection through filtration and fluorescent sorting, improving scalability and reproducibility.
- Strategic Value: Reduces biological noise in target validation, leading to more reliable go/no-go decisions in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on cardiac-specific expression evidence from a physiologically relevant model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, fluorescent microscopy, and manual dissection under stereo visualization.
- Dependent on access to transgenic zebrafish lines expressing cardiac fluorescent markers and standard dissection tools (filtration units, forceps, coated dishes).
- Necessitates standardized RNA extraction reagents and equipment (TRIzol, chloroform, isopropanol, centrifuge, spectrophotometer) for consistent downstream processing.
- Adaptation to non-fluorescent or non-cardiac tissues would require alternative isolation strategies, as the method relies on heart-specific labeling and differential adhesion.
- Practical limitations include the need for rapid processing to maintain sample homogeneity due to fast zebrafish heart development and potential RNA degradation during manual steps.
