Name: Wielkoskalowa sekcja embrionalnego serca danio pręgowanego do analizy transkrypcyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj metodę szybkiej manualnej sekcji serc z embrionów Danio rerio w celu izolacji kardiospacyficznego RNA. Technika ta umożliwia analizę transkryptomiczną i badanie ekspresji genów podczas rozwoju serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować C. Burnsowi, C. McRae za nakreślenie podstawowej zasady tego protokołu oczyszczania oraz F. Prillerowi za wstępne wdrożenie tej metody w naszym laboratorium. S.A.-S. jest wspierany przez profesurę Heisenberga w Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Prace te były wspierane przez DFG grant SE2016/7-1.

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi niemieckiego i berlińskiego prawa krajowego dotyczącymi opieki nad zwierzętami; postępowanie z danio pręgowanym było monitorowane przez lokalne władze ochrony zwierząt (LaGeSo, Berlin-Brandenburgia).
1. Pozyskiwanie zarodków danio pręgowanego do ekstrakcji serca
<ol>
	<li>Krzyżówka reporterowa danio pręgowanego, taka jak transgeniczna linia9 Tg(myl7:EGFP)twu34 w celu uzyskania zarodków z ekspresją GFP specyficzną dla serca.</li>
	<li>Utrzymać zarodki w wodzie jajowej w temperaturze 28,5 °C do pożądanego stadium embrionalnego10,11. Należy zapewnić, aby pobrana populacja zarodków była jednorodna zarówno pod względem genetycznym, jak i pod względem etapu rozwoju, aby ograniczyć różnice w ekspresji genów.</li>
	<li>Ręcznie odkorówkować zarodki.</li>
</ol>
2. Sekcja embrionalnych serc danio pręgowanego
UWAGA: Wszystkie roztwory należy przechowywać na lodzie. Jeśli to możliwe, wykonuj pracę zespołową: jedna osoba preparuje serca z zarodków, podczas gdy inna osoba sortuje serca pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Pozwala to na przetworzenie kilkuset zarodków w ciągu kilku godzin.
<ol>
	<li>Przenieś około 100 zarodków do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Znieczulić zarodki trikainą (0,16 mg/ml w pożywce E3). Kontynuuj, gdy zarodki zostaną wyraźnie znieczulone (nie pływają i osadzają się na dnie rurki, ale ich serca nadal biją).</li>
	<li>Usunąć roztwór tricainy/E3 i raz umyć zarodki 1 ml pożywki L-15/10% FBS i utrzymać na lodzie. 
	UWAGA: Pożywka L-15/10% FBS jest ważna dla utrzymania narządów i komórek przy życiu podczas całej procedury preparacji, dopóki serca nie zostaną przeniesione do RNAlater lub Trizolu.</li>
	<li>Dodaj 1 ml pożywki L-15/10% FBS do zarodków i pipetuj w górę i w dół 5-8 razy za pomocą okrągłej końcówki ładującej żel, aż żółtko zostanie całkowicie rozerwane. Pipetować zarodki kroplami na powierzchnię roztworu, tak aby kropla pękła, a zarodki zostały delikatnie przerwane. 
	UWAGA: To, jak energicznie i jak często należy pipetować zarodki w górę i w dół, zależy od etapu rozwoju zarodków, tj. w późnych stadiach (np. przy 56 hpf) potrzebne jest większe pipetowanie.</li>
	<li>W przypadku pierwszej partii wypreparowanych zarodków należy ocenić integralność zarodków i proporcję wypreparowanych serc pod mikroskopem stereoskopowym, ponieważ niektóre serca mogą pozostać przyczepione do zarodków, jeśli zostaną zbyt delikatnie pipetowane. Odpowiednio dostosować sposób pipetowania do następnych rund sekcji. 
	UWAGA: Używaj końcówek do pipet o niskiej retencji i probówek do mikrowirówek, aby zminimalizować przywieranie serc do plastiku.</li>
	<li>Umieścić próbkę na filtrze 100 μm umieszczonym w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml; przepłukać probówkę o pojemności 1,5 ml 1 ml pożywki L-15/10% FBS, a następnie nałożyć ją na filtr w celu zminimalizowania strat próbki (niektóre serca mogą przyklejać się do ścianek probówki). Umyj filtr dwukrotnie 1 ml L-15/10% FBS. Na tym etapie serca przechodzą przez filtr i są zbierane w probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Nanieść przepływowy filtr na filtr 30 μm umieszczony na probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i przepłukać filtr raz 1 ml pożywki L-15/10% FBS. W tym drugim etapie filtracji serca są zatrzymywane w filtrze, a mniejsze zanieczyszczenia są zmywane.</li>
	<li>Odwróć filtr do góry nogami i wypłucz serca z filtra do pokrytej 1% agarozą szalki Petriego, stosując trzy kolejne płukania 1 ml L-15/10% FBS.</li>
	<li>Ręcznie oddzielić serca GFP-dodatnie od niefluorescencyjnych szczątków embrionalnych (np. soczewek oczu) za pomocą kleszczy pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym i skoncentrować je w środku naczynia. Zbierz je zgodnie z krokiem 3. 
	UWAGA: Jeśli zarodki są starsze niż 24 hpf, serca powinny bić, co wskazuje, że tkanki są nadal fizjologicznie normalne.</li>
</ol>
3. Izolowanie mRNA z wypreparowanych serc
<ol>
	<li>Zebrać serca w jak najmniejszej objętości (np. 10 μl) i odpipetować do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 0,75 ml RNAlater (na lodzie). Sprawdź, czy w końcówce pipety nie pozostały żadne serca, wyświetlając je pod stereoskopowym mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
	<li>Alternatywnie, jeśli w bezpośrednim sąsiedztwie mikroskopu fluorescencyjnego dostępny jest kaptur chemiczny, należy przenieść zebrane serca do Trizolu (UWAGA) pod kapturem chemicznym. Pozwala to uniknąć ewentualnej utraty serc przyklejających się do końcówki pipety, a także podczas wirowania serc (kroki 3.4, 3.5 i 3.7). Zebrać serca z kilku rund izolacji w tej samej probówce z lekiem Trizol i przejść bezpośrednio do kroku 3.8; końcowa objętość nie powinna przekraczać 10% pierwotnej objętości Trizolu. 
	UWAGA: Przed użyciem należy zapoznać się z Kartą Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej (MSDS) firmy Trizol. Odczynnik Trizol należy obchodzić pod kapturem i nosić zalecane środki ochrony osobistej. Unikać kontaktu ze skórą, oczami i odzieżą. Usuń wszystkie źródła zapłonu.</li>
	<li>Połącz serca z kilku rund izolacji w tej samej probówce z RNAlater (na lodzie), ponieważ skuteczność izolacji RNA poprawia się wraz z ilością zebranej tkanki. Jeśli całkowita objętość próbki przekracza 10% pierwotnej objętości RNAlater, należy użyć dodatkowej probówki z 0,75 ml RNAlater do przechowywania (na lodzie).</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 15 700 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia serc.</li>
	<li>Pod stereoskopowym mikroskopem fluorescencyjnym ostrożnie zebrać jak najwięcej supernatantu na pokrytą 1% agarozą szalkę Petriego, zawierającą 3 ml pożywki L-15/10% FBS, ale nie należy naruszać osadzonych serc na dnie probówki wirówkowej. Ponieważ do 15% serc może pozostać w supernatancie ze względu na wysoką lepkość RNAlater, należy je pobrać w sposób opisany w kroku 3.7.</li>
	<li>Pod kapturem chemicznym dodaj 0,5 ml Trizolu do probówki zawierającej osadzone serca i trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Pod mikroskopem fluorescencyjnym przenieść serca (z kroku 3.5) z 1% naczynia pokrytego agarozą zawierającego roztwór RNAlater/L-15/10% FBS do innego naczynia pokrytego 1% agarozą z 3 ml L-15/10% FBS w celu rozcieńczenia RNAlater. Zbierz serca na środku szalki Petriego i przenieś je w małej objętości do probówki z osadzonymi sercami w Trizol pod kapturem chemicznym.</li>
	<li>Wprowadzić wir w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej serca w leku Trizol w celu rozbicia serc i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pod kapturem chemicznym dodać 100 μl chloroformu (UWAGA), dokładnie wymieszać i przenieść roztwór Trizol/chloroform do 1,5 ml wstępnie odwirowanej probówki PLG (przed użyciem odwirować 30 sekund z maksymalną prędkością). Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Przeczytaj kartę charakterystyki chloroformu przed użyciem. Z odczynnikiem chloroformowym należy obchodzić się pod maską i nosić zalecane środki ochrony osobistej. Unikać kontaktu ze skórą, oczami i odzieżą. Przechowywać z dala od niekompatybilnych substancji, takich jak metale, zasady.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 15 700 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i przenieść fazę wodną do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 5-10 μg glikogenu i 250 μl wstępnie schłodzonego (w temperaturze -20 °C) izopropanolu; dobrze wymieszać i inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 15 700 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Przemyć osad 1 ml 75% etanolu, odwirować przy 15 700 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Pozwól etanolowi odparować, susząc granulkę w temperaturze pokojowej, aż stanie się biała (np. przez 10-15 minut).</li>
	<li>Dodać 20 μl ddH2O wolnych od RNaz do osadu i inkubować przez 10-15 minut w temperaturze 55 °C w celu rozpuszczenia RNA; następnie przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Ocenić stężenie i czystość RNA za pomocą pomiaru absorbancji. Oceń integralność RNA, umieszczając próbkę na 1% żelu agarozowym.</li>
</ol>

<ol><li>Stainier, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+the+formation+and+function+of+the+cardiovascular+system+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo.</a> Development. 123, 285-292 (1996).</li>
<li>Chen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+the+cardiovascular+system+and+other+internal+organs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish.</a> Development. 123, 293-302 (1996).</li>
<li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).</li>
<li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends Genet. 10, 73-74 (1994).</li>
<li>Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+real+time+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A novel method for real time quantitative RT-PCR.</a> Genome Res. 6, 995-1001 (1996).</li>
<li>Epstein, C. B., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+technology+-+enhanced+versatility%2C+persistent+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge.</a> Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).</li>
<li>Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+Technology+and+Its+Application+in+Fish+Transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22OMICS%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics.</a> OMICS. 18, 98-110 (2014).</li>
<li>Burns, C. G., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hearts+from+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Purification of hearts from zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 40, 274-278 (2006).</li>
<li>Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transmission+of+a+myocardium-specific+GFP+transgene+reveals+critical+regulatory+elements+in+the+cardiac+myosin+light+chain+2+promoter+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish.</a> Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th, University of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Veerkamp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilateral+dampening+of+Bmp+activity+by+nodal+generates+cardiac+left-right+asymmetry%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry).</a> Dev Cell. 24, 660-667 (2013).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li>
<li>Brownlie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+embryonic+globin+genes+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish.</a> Dev Biol. 255, 48-61 (2003).</li>
<li>Marvin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+patterns+of+the+zebrafish+small+heat+shock+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins.</a> Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).</li>
<li>Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain.</a> Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li>
<li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li>
<li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten pozwala na szybkie wzbogacenie embrionalnej tkanki serca danio pręgowanego do analiz ekspresji genów. Ilość i jakość próbki RNA specyficznej dla serca zależy w dużej mierze od kilku kluczowych kroków: po pierwsze, ilość próbki jest znacznie lepsza, jeśli zapobiega się utracie serca na każdym etapie protokołu, ponieważ oczyszczanie RNA będzie działać tylko przy wystarczającej ilości materiału wyjściowego. Po drugie, czystość próbki, która zależy całkowicie od eksperymentatora, jest określana przez sortowanie ...

Danio rerio) jest szeroko stosowany w biologii rozwojowej do badania organogenezy in vivo ze względu na szybki, przejrzysty i pozamaciczny rozwój embrionalny, w połączeniu z niewielkimi rozmiarami i dostępnością transgenicznych linii reporterowych z tkankowo specyficzną ekspresją białek fluorescencyjnych. Ten mały kręgowiec jest szczególnie dobrze przystosowany do badania rozwoju serca, ponieważ natlenienie wczesnego zarodka danio pręgowanego nie zależy od bicia serca i przepływu krwi; Cechy te pozwoliły na scharakteryzowanie dużej liczby mutantów sercowo-naczyniowych1,2, a danio pręgowany jest obecnie powszechnie uznanym organizmem modelowym do badania chorób serca3.
Aby badać ekspresję genów podczas rozwoju embrionalnego, transkrypty są często analizowane za pomocą hybrydyzacji in situ (WISH)4, RT-qPCR5, mikromacierzy6 lub sekwencjonowania nowej generacji (RNA-Seq)7. Podczas gdy WISH pozwala na przestrzenno-czasową analizę ekspresji genów w całym zarodku, poziomy transkryptów są zwykle oceniane za pomocą RT-qPCR, mikromacierzy lub metod sekwencyjnych RNA. Metody te wymagają jednak wzbogacenia tkanek w celu specyficznego profilowania ekspresji genów.
Ponieważ embrionalne serce danio pręgowanego stanowi mały ułamek całego zarodka, badania transkryptomu podczas rozwoju serca wymagają protokołu do sekcji i wzbogacania serc. Ponadto, aby uzyskać fizjologicznie istotne dane, ważne jest, aby utrzymać w pełni funkcjonalną tkankę serca do momentu ekstrakcji RNA. W tym miejscu opisujemy protokół szybkiej izolacji fizjologicznie prawidłowych i bijących serc z setek zarodków danio pręgowanego w celu skutecznego uzyskania wysokiej jakości próbek RNA do dalszych analiz. Obecna metoda opiera się na protokole opisanym przez Burnsa i MacRae, 20068. Do wzbogacania tkanki serca obie metody wykorzystują transgeniczną linię reporterową mięśnia sercowego i wykorzystują zróżnicowane właściwości adhezyjne embrionalnych serc danio pręgowanego w porównaniu z innymi tkankami. Krótko mówiąc, poprzez pipetowanie wielu zarodków w górę i w dół przez wąską końcówkę pipety, serca są jednocześnie uwalniane z ciał embrionalnych, a następnie oddzielane od szczątków embrionalnych w dwóch szybkich etapach filtracji; Serca znakowane fluorescencyjnie są następnie ręcznie sortowane z pozostałych zanieczyszczeń i zbierane do dalszej obróbki.

<table><tbody><tr><td>Sprzęt do hodowli ryb i zbierania jaj&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Szczegółowe informacje można znaleźć w Księdze Zebrafish11</td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td></td><td></td><td></td>fluorescencyjny</tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td></td><td></td><td></td>z chłodzeniem</tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td></td><td></td> <td>UVnp. Thermo Scientific Nanodrop 2000</td></tr><tr><td>Komora</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>do elektroforezy kwasów nukleinowychszalki Petriego 4 cm & Oslash;, pokryte 1% agarozą w pożywce</td><td></td><td></td><td></td>E3</tr><tr><td>Mikropipety i końcówki (P20, P100, P1000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 1,5 ml 15</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ml i 50 ml Para</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kleszczyków</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Dumont #5ExactaCruz&handel; Okrągłe końcówki do ładowania żelu w sterylnym stojaku, 1-200 i mu; l&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-201732</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m filtr (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu; m filtr (Filtry wstępnej separacji-30 i mikro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Żel do synchronizacji fazy, ciężki, tubki 1,5 ml&nbsp;</td><td>Prime</td><td>2302810</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże</td><td></td><td></td> jajeczne <td>60 &mu; g/ml Rozpuszczalne sól oceaniczna w ddH2O, 0,00001% (w/v) Błękit metylenowy</td></tr><tr><td>E3 średni&nbsp;</td><td></td><td></td><td>5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4</td></tr><tr><td>Trikaina (kwas 3-aminobenzoesowyetyloester)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td>4 mg/ml roztwór podstawowy trikainy, pH 7</td></tr><tr><td>1% agarozy (w pożywce E3)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% żelu agarozowym (w buforze TBE)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&acute; s L-15 średni&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Surowica bydlęca płodu)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Ambion</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>1559606</td><td></td></tr><tr><td>glikogen&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10814-010</td><td>20 &mikro; g/&mikro; l w wodzie wolnej od RNaz</td></tr><tr><td>chloroform</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>izopropanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% etanolu (w DEPC-ddH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Woda wolna od nukleaz lub sterylizowana DDH2O</td><td></td><td></td><td></td>poddana działaniu DEPC</tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td><td></td>ładujący kwas nukleinowy</tr><tr><td>Bufor TBE (Tris / Boran / EDTA) do elektroforezy</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wielkoskalowa sekcja embrionalnego serca danio pręgowanego do analizy transkrypcyjnej

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Serce embrionalne danio pręgowanego składa się tylko z kilkuset komórek, reprezentujących tylko mały ułamek całego zarodka. Dlatego, aby zapobiec maskowaniu transkryptomu serca przez globalny transkryptom embrionalny, konieczne jest zebranie wystarczającej liczby serc do dalszych analiz. Ponadto, ponieważ rozwój serca danio pręgowanego przebiega szybko, metody pobierania serca i ekstrakcji RNA muszą być szybkie, aby zapewnić jednorodność próbek. W tym miejscu przedstawiamy protokół szybkiej ręcznej sekcji do zbierania funkcjonalnych/bijących serc z zarodków danio pręgowanego. Jest to niezbędny warunek wstępny dla późniejszej ekstrakcji RNA specyficznego dla serca w celu określenia poziomów ekspresji genów specyficznych dla serca za pomocą analiz transkryptomu, takich jak ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR). Metoda opiera się na zróżnicowanych właściwościach adhezyjnych serca zarodka danio pręgowanego w porównaniu z innymi tkankami; Pozwala to na szybkie fizyczne oddzielenie tkanki serca od tkanki pozasercowej poprzez połączenie rozerwania płynnej siły ścinającej, stopniowej filtracji i ręcznego pobierania transgenicznych fluorescencyjnie znakowanych serc.

W niniejszej pracy opisujemy reprezentatywny eksperyment z wycinania serca z wykorzystaniem transgenicznej linii zebrafish Tg(myl7:GFP)twu349, która wykazuje ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) wyłącznie w mięśniu sercowym (Ryc. 1). Zebraliśmy zarówno wycięte serca, jak i embriony, z których one pochodziły, aby ocenić czystość próbki serca. W skrócie, homozygotyczne zebrafish Tg(myl7:GFP)twu349 krzyżowano z osobnikami typu dzik...

Aby przeanalizować profile ekspresji genów sercowych podczas rozwoju serca danio pręgowanego, należy wyekstrahować całkowite RNA z izolowanych serc. W tym miejscu przedstawiamy protokół pobierania funkcjonalnych/bijących serc poprzez szybką ręczną sekcję z zarodków danio pręgowanego w celu uzyskania mRNA specyficznego dla serca.

Wielkoskalowa sekcja embrionalnego serca danio pręgowanego do analizy transkrypcyjnej

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Ogólnym celem tej procedury jest pobranie serc poprzez szybką ręczną sekcję z żywych zarodków danio pręgowanego w celu uzyskania specyficznego dla serca Mr.NA.Osiąga się to poprzez pierwsze pipetowanie, wiele znieczulonych zarodków w górę iw dół przez wąską końcówkę pipety, aby jednocześnie uwolnić serca z ciał embrionalnych. Następnie wypreparowane serca są oddzielane od szczątków embrionalnych w dwóch szybkich etapach filtracji. Następnie fluorescencyjnie oznaczone serca są ręcznie sortowane z pozostałych zanieczyszczeń.Na koniec z pobranych serc ekstrahuje się specyficzne dla serca RNA. Ostatecznie protokół sekcji serca służy do zebrania wystarczającej ilości embrionalnych serc do przeprowadzenia analizy transkryptomu. Metoda ta pomoże zadać kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju serca rybika cukrowego, takie jak to, który transkrypt ulega ekspresji w sercu na różnych etapach rozwoju, a także porównać dziką i zmutowaną ekspresję serca Aby uzyskać zarodki danio pręgowanego do ekstrakcji serca, krzyżuj dorosłe ryby transgeniczne wyrażające białko fluorescencyjne w sercu, takie jak transgeniczna mila siódma EGFP pod mikroskopem stereoskopowym.Monitoruj rozwój zarodków. Sprawdź, czy serca są rzeczywiście znakowane fluorescencyjnie i ręcznie usuń powłokę zarodków, gdy osiągną pożądany etap. Przenieś około 100 zarodków do 1,5 mililitrowej probówki fuge i dodaj 16 miligramów na mililitr trica w trzech pożywkach, aby je znieczulić.Połóż rurkę na lodzie. Usuń roztwór trica i użyj jednego mililitra lodowatego podłoża L 15 10% FBS do umycia zarodków, trzymając je na lodzie. Po usunięciu tego płukania dodaj jeden mililitr L 15 FBS i użyj okrągłej końcówki ładującej żel, aby pipetować zarodki w górę iw dół pięć do ośmiu razy, aby całkowicie rozbić żółtka, pipetować zarodki kroplami na powierzchnię roztworu, tak aby kropla pękła, a zarodki zostały delikatnie przerwane.W przypadku pierwszej partii wypreparowanych zarodków pod mikroskopem stereoskopowym należy ocenić ich integralność i proporcję wypreparowanych serc oraz odpowiednio dostosować sposób pipetowania. W przypadku kolejnych partii należy umieścić filtr o średnicy 100 mikrometrów na 50-mililitrowej probówce wirówkowej i nałożyć próbkę embrionalną. Następnie użyj jednego mililitra L 15 FBS do przepłukania rurki fuge i nałóż roztwór na filtr, aby wypłukać serca, które pozostały w filtrze.Użyj L 15 FBS, aby umyć go dwukrotnie. Następnie umieść filtr o średnicy 30 mikrometrów na 15-mililitrowej probówce wirówkowej i przeprowadź przepływ przez serca zawierające serca. Użyj L 15 FBS do wypłukania tego filtra, który zatrzymuje serca i zmywa mniejsze zanieczyszczenia.Następnie odwróć filtr o średnicy 30 mikrometrów do góry nogami na szalce Petriego pokrytej agrosem i zastosuj trzy jednomililitrowe płukania pożywki L 15 FBS, aby wypłukać serca z filtra Pod mikroskopem fluorescencyjnym użyj kleszczy, aby ręcznie oddzielić serca GFP dodatnie od tkanek niefluorescencyjnych, koncentrując je w środku naczynia. Fizjologia serc wydaje się normalna, ponieważ po rozwarstwieniu nadal biją. Procedura. Aby wyizolować mRNA z serc, zbierz je w jak najmniejszej objętości pożywki i pipetuj do 1,5 mililitrowej probówki na lodzie zawierającej 0,75 mililitra RNA.Później pod mikroskopem fluorescencyjnym. View końcówkę pipety, aby sprawdzić, czy żadne serca nie są przyklejone do końcówki pipety. Po pobraniu serc z kilku rund izolacji do probówki RNA później, zgodnie z protokołem tekstowym, odwiruj próbki w temperaturze 15, 700 g i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut.Następnie, pod mikroskopem fluorescencyjnym, ostrożnie zebrać jak najwięcej satu i przenieść na 1% pokrytą agros szalkę Petriego zawierającą trzy mililitry pożywki L 15 10%FBS. Następnie, pod kapturem chemicznym, dodaj 0,5 mililitra triolu do probówki zawierającej osadzone serca i trzymaj na lodzie Pod mikroskopem fluorescencyjnym przenieś serca, które pozostały w supernatencie, do świeżego naczynia pokrytego 1% agros z L 15 10% FBS, aby później rozcieńczyć RNA, który jest bardzo lepki. Następnie zbierz serca w małej objętości i przenieś je do probówki z osadzonymi sercami w triolu, aby rozbić serca, zawirować probówkę i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie pod kapturem chemicznym dokładnie dodaj 100 mikrolitrów chloroformu i przenieś roztwór do 1,5 mililitrowej probówki PrepU, PLG Inkubuj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, odwiruj próbkę w temperaturze 15, 700 G i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut i przenieś fazę wodną do nowej 1,5 mililitrowej probówki. Następnie dodaj od pięciu do 10 mikrogramów glikogenu i 250 mikrolitrów wstępnie schłodzonego izopropanolu. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza następnego dnia.Odwirować próbki w temperaturze 15, 700 g i czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut, a następnie wyrzucić nasączony. Nałóż jeden mililitr 75% etanolu do umycia wirówki paletowej i wyrzuć snat. Pozwól, aby pozostały etanol odparował z osadu w temperaturze pokojowej, aż granulka stanie się biała.Dodaj 20 mikrolitrów wolnej od RNA, podwójnie destylowanej wody do osadu i inkubuj w temperaturze 55 stopni przez 10 do 15 minut, aby rozpuścić RNA. Następnie umieść rurki na lodzie. Użyj spektrofotometru, aby określić stężenie i czystość RNA i uruchom próbkę na 1% żelu agros, aby ocenić integralność porównania RNAA próbek serca przed sortowaniem z resztek embrionalnych po 56 godzinach od zapłodnienia w porównaniu z 36 godzinami po zapłodnieniu.Zarodki po 56 godzinach od zapłodnienia dały więcej szczątków embrionalnych niż po 36 godzinach od zapłodnienia po filtracji w celu określenia czystości próbki serca 56 HPF, poziomy ekspresji transkryptów sercowych w porównaniu z dodatkowymi transkryptami sercowymi porównano za pomocą R-T-Q-P-C-R. Żel ten pokazuje RNA wyekstrahowane z izolowanych serc oraz z uszkodzonych zarodków bez serc. Pomiary absorbancji wykazały, że 300 serc dało około 660 nanogramów RNA.To 33 nanogramy na mikrolitr w końcowej objętości 20 mikrolitrów. Względne poziomy ekspresji genów obliczono za pomocą eksperymentów R-T-Q-P-C-R dla pokazanych tutaj markerów. Zgodnie z oczekiwaniami, siódma mila była znacznie wzbogacona w próbce serca w porównaniu z zarodkiem bez próbki serca, jak widać tutaj.Marker komórek śródbłonka, KDRL, był umiarkowanie wzbogacony w sercu. Marker erytrocytów hemoglobina beta embrionalna 1.1 był nadreprezentowany w próbce serca, mimo że serca nadal biły po sekcji, która powinna wydalić czerwone krwinki z serca. W przeciwieństwie do poziomów krystalicznego markera soczewki alfa A i markera OUN, GFAP był znacznie obniżony w próbce serca.Wyniki te pokazują, że protokół sekcji serca daje wysokiej jakości swoiste dla serca RNA z całych zarodków danio pręgowanego. W tym eksperymencie ważne jest, aby monitorować próbkę, aby uniknąć utraty serca podczas procedury sekcji.

large-scale-zebrafish-embryonic-heart-dissection-for-transcriptional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano przejrzystą, zestandaryzowaną metodę sekcji i izolacji serca danio pręgowanego na wielu etapach rozwoju. Omówiono również techniki adnotacji i kwantyfikacji.

Sekcja serca w larwalnym, młodzieżowym i dorosłym zebrafish, Danio rerio

Opisano szybką metodę immunobarwienia embrionalnego serca danio pręgowanego. W porównaniu z metodą immunobarwienia całych preparatów, metoda ta znacznie zwiększa penetrację przeciwciał, co pozwala na uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, ujawniających struktury komórkowe i podkomórkowe w sercu przy znacznie krótszym czasie przetwarzania.

Immunobarwienie wypreparowanego serca embrionalnego ryby danio

Ten film opisuje technikę izolowania serca od danio pręgowanego na wielu etapach rozwoju w celu zbadania rozwoju, dojrzewania i starzenia się serca.

Sekcja serca: metoda obserwacji rozwoju serca danio pręgowanego

Wykorzystanie danio pręgowanego do badań sercowo-naczyniowych rozszerza się w kierunku badań nad dorosłymi sercami. W przypadku tych zastosowań szybka i prosta izolacja tkanek serca ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia zmian pośmiertnych i uzyskania odpowiedniej liczby próbek. Tutaj opisujemy szybką i powtarzalną metodę preparowania serc dorosłych danio pręgowanego.

Odzyskiwanie serc dorosłych ryb danio pręgowanego do zastosowań o wysokiej przepustowości

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji rozwijających się serc u danio pręgowanego w 4-Dimensions (4-D). Obrazowanie 4D, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszami świetlnymi (LSFM), wykonuje trójwymiarowe (3-D) obrazy w czasie, aby zrekonstruować rozwijające się serca. Pokazujemy jakościowo i ilościowo, że naprężenie ścinające aktywuje sygnalizację wsierdzia Notch podczas rozwoju komory, co sprzyja trabekulacji serca.

Mikroskopia fluorescencyjna arkuszy świetlnych w celu uchwycenia 4-wymiarowych obrazów wpływu modulacji naprężeń ścinających na rozwijające się serce danio pręgowanego

Celem tego protokołu jest szczegółowe opracowanie nowatorskiej metody oceny segmentalnej funkcji serca u embrionalnych ryb danio pręgowanych, zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych.

Analiza przemieszczenia mechanicznej deformacji mięśnia sercowego (DIAMOND) ujawnia segmentalną heterogeniczność funkcji serca u embrionalnego danio pręgowanego

Opisujemy zoptymalizowane narzędzia do badania serca danio pręgowanego in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego. W szczególności sugerujemy jasne transgeniczne linie serca i prezentujemy nowe techniki delikatnego osadzania i unieruchamiania, które pozwalają uniknąć wad rozwojowych i wad serca. Przewidziano również możliwy potok pozyskiwania i analizy danych dostosowany do obrazowania serca.

Mikroskopia świetlna szybkiej dynamiki serca w zarodkach danio pręgowanego

Protokół ten opisuje tanią metodę mikroskopii świetlnej do oceny morfologii i funkcji serca w embrionach danio pręgowanych, umożliwiającą powtarzalną ocenę rozwojowej kardiotoksyczności bez potrzeby stosowania zaawansowanych systemów obrazowania.

Funkcjonalne obrazowanie serca w zarodkach danio dano za pomocą standardowej mikroskopii i analizy wideo: zastosowania w badaniach środowiskowych i biomedycznych

Badanie to ustanawia czułą metodę obrazowania opartą na immunofluorescencji do ilościowego określenia globalnej metylacji DNA w pojedynczych zarodkach danio pręgowanych. To podejście pokonuje wyzwanie ograniczonej ilości tkanek i pomija konieczność konwersji bisulfytów.

Wykrywanie globalnej metylacji DNA w sercach larw danio pręgowanych

Poznaj metodę szybkiej manualnej sekcji serc z embrionów Danio rerio w celu izolacji kardiospacyficznego RNA. Technika ta umożliwia analizę transkryptomiczną i badanie ekspresji genów podczas rozwoju serca.

Wielkoskalowa sekcja embrionalnego serca danio pręgowanego do analizy transkrypcyjnej

Przeglądaj więcej filmów