Name: Hodowla in vivo i in vitro nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae i Heterorhabditidae) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj metody hodowli in vivo i in vitro nicieni entomopatogenicznych z rodzin Steinernematidae i Heterorhabditidae. Techniki te wykorzystują żywe gospodarze oraz pożywki agarowe z bakteriami symbiotycznymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować byłym członkom laboratorium Stock: Ming-Min Lee, Kathryn Plichta, Victorii Miranda-Thompson i Sam-Kyu Kim za ich wkład w ulepszenie wielu z tych protokołów. Praca ta została częściowo sfinansowana przez grant Narodowej Fundacji Nauki IOS-0840932 i IOS-0724978 dla S. P. Stock

1. Hodowla in vivo nicieni entomopatogenicznych z ich bakteriami symboidalnymi
<ol>
	<li>Odwróć plastikową szalkę Petriego o wymiarach 100 x 15 mm i umieść dwa krążki bibuły filtracyjnej (90 mm) w pokrywie naczynia.</li>
	<li>Równomiernie rozprowadzić 1 ml zawiesiny wodnej IJ (zakaźne młode osobniki) (o stężeniu 1,000-2,000 IJ/ml) na bibule filtracyjnej. 
	UWAGA: IJ nie muszą być sterylizowane powierzchniowo.</li>
	<li>Dodaj do naczynia 10 larw ostatniego stadium rozwojowego większej Galleria mellonella. Celem jest dostarczenie około 100-200 IJs/larwę.</li>
	<li>Przykryj pokrywkę dnem szalki Petriego (Rysunek 1) i oznacz szalkę Petriego. Podaj następujące informacje: nazwę gatunku nicieni (jeśli jest znana); wyizolować kod/oznaczenie; Data zastawienia pułapki infekcji.</li>
	<li>Umieść naczynie w luźno zamkniętej plastikowej torbie (w celu oszczędzania wilgoci) i przechowuj je w ciemności w temperaturze pokojowej lub w inkubatorze w temperaturze 20-25 °C. Sprawdzaj naczynia codziennie 
	UWAGA: Ciemność ułatwia infekcję nicieniami, ponieważ naśladuje naturalne warunki infekcji w glebie.</li>
	<li>Po 3-5 dniach usuń zwłoki z objawami zakażenia nicieniami do zmodyfikowanej białej pułapki7, 
	UWAGA: Jeśli zwłoki pachną zgnilizną, może to oznaczać, że hodowla się nie powiodła i/lub doszło do skażenia. Ustaw nową komorę infekcyjną z nową partią nicieni i owadów.</li>
</ol>
2. Hodowla in vitro nicieni entomopatogenicznych z ich symbiotycznymi bakteriami
<ol>
	<li>Metoda agarowa wątroba-nerka9,19
	<ol>
		<li>Pokrój wątrobę i nerki na małe kawałki (2cm3 lub mniej) i włóż do blendera z NaCl, agarem i 300 ml wody i miksuj, aż mięso stanie się płynną miazgą, gęstą pastą lub puree. Następnie przenieść mieszaninę do kolby Erlenmeyera o pojemności 1 l.</li>
		<li>Dodać ostatnie 200 ml wody do naczynia miksera i zdekantować pozostałe podłoże do kolby Erlenmeyera. Autoklaw przez 15 min w temperaturze 121 °C. Po sterylizacji w autoklawie pozwól agarowi ostygnąć do dotknięcia przed nalaniem . 
		UWAGA: Nie zaleca się pipetowania podłoża, ponieważ to podłoże ma tendencję do zawierania kawałków mięsa.</li>
		<li>Wlać ~20 ml agaru na szalki Petriego o średnicy 5 (lub 6) cm, ręcznie mieszając lub obracając kolbę Erlenmeyera między nalewaniami, aby uzyskać bardziej jednorodne podłoże. Pozostawić agar do zestalenia się i przechowywać naczynia w temperaturze 4 °C, aż będą potrzebne 
		UWAGA: Użyj metalowej szpatułki wysterylizowanej płomieniem, aby rozdrobnić duże kawałki mięsa wsypane na szalkę Petriego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metoda agaru lipidowego9,19
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę z agaru lipidowego, mieszając ze sobą bulion odżywczy, agar i ekstrakt drożdżowy, a następnie rozlać mieszaninę do kolby Erlenmeyera o pojemności 2 litrów. Dodać destylowaneH2Oi MgCl2•6H2Oi autoklawować przez 15 minut w temperaturze 121 °C.</li>
		<li>Dodaj sterylną mieszankę oleju kukurydzianego i syropu kukurydzianego i mieszaj energicznie lub często mieszaj, aby równomiernie rozproszyć kropelki oleju. 
		UWAGA: Sterylizuj olej kukurydziany i syrop, umieszczając potrzebną objętość w sieciowniku UV. Olej nie rozpuści się w płynie, ale upewnij się, że jest w maleńkich kropelkach.</li>
		<li>Wlej ~20 ml agaru na 5 (lub 6) cm szalki Petriego i pozwól agarowi zastygnąć i przechowuj szalki w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będą potrzebne.</li>
		<li>Umieść pożądane symbiotyczne bakterie na płytce z agarem lipidowym i inkubuj płytki w temperaturze 28 °C przez 24-48 godzin. 
		UWAGA: Rozprowadź 100-200 μl subkultury LB przez noc (12-16 godzin).</li>
		<li>Następnego dnia dodać około 0,4 ml wysterylizowanej powierzchniowo zawiesiny nicieni (jaj lub zakaźnych osobników młodocianych) i inkubować płytki w temperaturze pokojowej w ciemności lub w inkubatorze w temperaturze 22 ±3 °C. 
		UWAGA: Nie dodawaj więcej niż 0,4 ml zawiesiny nicieni, ponieważ może to stworzyć nadmiernie wilgotne środowisko, które jest niekorzystne dla rozwoju nicieni.</li>
		<li>Codziennie monitoruj kultury. Kultury powinny wytworzyć nową generację IJ w ciągu około 12 dni (ryc. 2).</li>
		<li>Przenieść dolne naczynie z agarem, gdy zauważysz nicienie pełzające po bokach naczynia (ryc. 3A) do zmodyfikowanej białej pułapki (patrz Orozco i wsp.12) w celu zbierania IJ (rys. 3B). Wykonaj ten krok pod okapem z przepływem laminarnym, aby zmniejszyć zanieczyszczenie mediów.</li>
		<li>Po wynurzeniu zbierz IJ ze zmodyfikowanej białej pułapki i przepłucz zawiesinę IJ, aby usunąć wszelkie średnie zanieczyszczenia. Przechowywać IJ w wysterylizowanej wodzie destylowanej o temperaturze 10 °C (w inkubatorze do pracy w niskiej temperaturze lub w chłodni) lub w razie potrzeby zużyć natychmiast. 
		UWAGA: W zależności od celu badania, wysiej płytki nicieniami skolonizowanymi przez symbionty lub aposymbiotycznymi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Hodowla in vitro aposymbiotycznych (wolnych od symbiontów) nicieni entomopatogennych
<ol>
	<li>Zakażone 10-20 larw G. mellonella IJ pożądanego gatunku nicieni (patrz punkt 1). Po 3 lub 4 dniach (w tym czasie IJ powinny dojrzeć do pierwszego pokolenia dorosłych) zbieraj zwłoki. 
	UWAGA: Czas do osiągnięcia dojrzałości i liczba samic potrzebnych do uzyskania odpowiedniej liczby jaj będą się różnić w zależności od gatunku. W razie potrzeby należy zainfekować więcej larw G. mellonella i rozpocząć sekcje już po 48 godzinach od zakażenia, aby ocenić, czy są one we właściwej fazie rozwoju.</li>
	<li>Umieścić każde zwłoki pojedynczo na szalce Petriego z roztworem soli fizjologicznej (bufor M918). Rozkrój zwłoki, ciągnąc ich głowę kleszczami z cienką końcówką.</li>
	<li>Zebrać co najmniej 20 grawiarek (z jajami w środku) za pomocą cienkiej igły (najlepiej w kształcie litery L) i umieścić je w szkiełku zegarkowym zawierającym 10 ml buforu M9 (Rysunek 4A).</li>
	<li>Przygotuj roztwór axenizujący, biorąc pod uwagę następujące składniki: 6,75 ml wody destylowanej, 1,25 ml 5 N NaOH i 2,25 ml dostępnego w handlu roztworu wybielacza rozcieńczonego do 3% podchlorynu. 
	UWAGA: NaOH jest podstawowym rozwiązaniem - należy nosić rękawice, okulary i inną odpowiednią odzież ochronną. 
	UWAGA: Za każdym razem przygotuj świeży roztwór do axenizacji, ponieważ wybielacz ulega degradacji w świetle. Przygotuj kilka partii roztworu do axenizacji i przeprowadź sterylizację powierzchni i zbiór jaj w wielu szkiełkach zegarkowych.</li>
	<li>Przepłukać samice co najmniej trzy razy buforem M9, napełnić szkiełko zegarka roztworem buforowym i zassać bufor za pomocą pipety. Upewnij się, że samice pozostają w szkiełku zegarka. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Natychmiast dodaj roztwór do aksenizacji i pozwól samicom pozostać w tym roztworze nie dłużej niż 10–15 minut. Obserwuj, jak tkanki nicieni zaczynają się rozpadać, podczas gdy jaja (które są odporne na roztwór aksenizujący) pozostają nienaruszone.</li>
	<li>Ręcznie rozdrabniaj kobiece ciała, aby przyspieszyć ten proces, przecinając je igłą lub skalpelem (ryc. 4B, C). Usunąć jaja, pipetując je do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, unikając dodawania nierozpuszczonej tkanki. 
	UWAGA: Użyj tylu probówek do mikrowirówek, ile potrzeba, aby zebrać jaja i pracować szybko, ponieważ żywotność jaj zmniejszy się w miarę długotrwałego wystawienia na działanie roztworu axenizującego.</li>
	<li>Wiruj rurki przez 15 sekund, używając "ustawienia wysokiej prędkości", aby dalej usunąć tkanki nicieni przyczepione do jaj. Alternatywnie, jeśli wir jest niedostępny, należy kilkakrotnie pipetować roztwór w górę i w dół.</li>
	<li>Jaja w granulkach przez odwirowanie w ilości około 18 000 g przez 2 minuty. Zwiększ prędkość, jeśli jaja nie są wystarczająco granulowane. Usunąć roztwór do aksenizacji i spłukać dwukrotnie, napełniając probówkę mikrowirówki sterylną wodą destylowaną i ponownie odwirować przy 900 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>Po ostatnim umyciu ponownie zawieś jajka w 300–500 μl sterylnej wody destylowanej i umieść je na sterylnej szalce Petriego o średnicy 3 cm lub wysterylizowanym szkiełku zegarkowym. Pamiętaj, że jaja są teraz sterylizowane powierzchniowo, więc używaj sterylnych pipet i/lub końcówek pipeter oraz wody, aby utrzymać jaja w czystości.</li>
	<li>Zbadaj jaja pod mikroskopem preparacyjnym (powiększenie 30-50x), aby potwierdzić, że są nienaruszone (ryc. 4D) i przenieś je na 5 cm płytkę z agarem wątroba-nerka (patrz sekcja 2.1) 
	UWAGA: Nie dodawaj więcej niż 400 μl zawiesiny jaj na talerze, ponieważ spowoduje to nadmierne zwilżenie agaru.</li>
	<li>Oznaczyć tabliczki odpowiednimi informacjami i przechowywać je w pozycji pionowej w ciemności w temperaturze 28 °C. Wylęg jaj powinien być widoczny w nocy. 
	UWAGA: Woda może skraplać się na pokrywie naczynia, ale wyparuje po 1 lub 2 dniach. W tym czasie umieść naczynie w plastikowej torbie, aby zatrzymać wilgoć z agaru i uniknąć jego wysuszenia.</li>
	<li>Okresowo obserwuj naczynia i wyrzucaj wszelkie naczynia, które wykazują oznaki zanieczyszczenia grzybiczego lub bakteryjnego. Gdy zobaczysz IJ migrujące w górę ścianki szalki Petriego, zdejmij pokrywkę i przenieś dolne naczynie z agarem do zmodyfikowanej białej pułapki12. Weź pod uwagę sterylne warunki podczas przenoszenia naczynia do zmodyfikowanej białej pułapki, aby uniknąć zanieczyszczenia odsłoniętego podłoża.</li>
	<li>Kontynuuj monitorowanie Białych Pułapek i zbieraj IJ w razie potrzeby. 
	UWAGA: Nicienie aposymbiotyczne będą nadal migrować do wody Białej Pułapki przez wiele dni, a nawet tygodni.</li>
</ol>

<ol><li>Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+dimorphism+in+Xenorhabdus+spp.%2C+bacteria+symbiotically+associated+with+the+insect+pathogenic+nematodes%2C+Neoaplectana+and+Heterorhabditis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis.</a> J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).</li>
<li>Dunphy, G. B., Webster, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monoxenic+culture+of+Neoaplectana+carpocapsae+DD+136+and+Heterorhabditis+heliothidis%5BTitle%5D)+AND+%22Revue+Nematol%22%5BJournal%5D)">The monoxenic culture of Neoaplectana carpocapsae DD 136 and Heterorhabditis heliothidis.</a> Revue Nematol. 12, 113-123 (1989).</li>
<li>Boemare, N. Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoemare%2C+N+%22Entomopathogenic+Nematology%22">Entomopathogenic Nematology</a>. Gaugler, R. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).</li>
<li>Boemare, N. E., Akhurst, R. A. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoemare%2C+NE+%22The+Prokaryotes%22">The Prokaryotes</a>. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, NY. 473-488 (2002).</li>
<li>Ehlers, R. U., Wulff, A., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+axenic+Steinernema+feltiae.+Xenorhabdus+bovienii.+and+the+bacto-helminthic+complex+to+larvae+of+Tipula+oleracea+%28Diptera%29+and+Galleria+mellonella+%28Lepidoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Invertebrate+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of axenic Steinernema feltiae. Xenorhabdus bovienii. and the bacto-helminthic complex to larvae of Tipula oleracea (Diptera) and Galleria mellonella (Lepidoptera).</a> Journal Invertebrate Pathology. 69, 212-217 (1997).</li>
<li>Gaugler, R., Kaya, H. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGaugler%2C+R+%22Entomopathogenic+Nematodes+in+Biological+Control.+Boca%22">Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca</a>. , CRC Press. Raton, FL. (1990).</li>
<li>Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Xenorhabdus+nematophila+genes+required+for+mutualistic+colonization+of+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes.</a> Molecular Microbiology. 45, 1337-1353 (2002).</li>
<li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes.</a> Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).</li>
<li>Kaya, H. K., Stock, S. P. Techniques in insect nematology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaya%2C+HK+%22Manual+of+techniques+in+insect+pathology%22">Manual of techniques in insect pathology</a>. Lackey, L. A. , Academic Press. London. 281-324 (1997).</li>
<li>Koppenhöfer, H. Bacterial Symbionts of Steinernema and Heterorhabditis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoppenh%C3%B6fer%2C+H+%22Entomopathogenic+Nematodes%3A+Systematics%2C+Phylogeny+and+Bacterial+Symbionts%22">Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts</a>. Nguyen, K. B., Hunt, D. J. , Brill. Leiden-Boston. 735-759 (2007).</li>
<li>Lunau, S., Stoessel, S., Schmidt Peisker, A. J., Ehlers, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+monoxenic+inocula+for+scaling+up+in+vitro+cultures+of+the+entomopathogenic+nematodes+Steinernema+spp+and+Heterorhabditis+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">Establishment of monoxenic inocula for scaling up in vitro cultures of the entomopathogenic nematodes Steinernema spp and Heterorhabditis spp.</a> Nematologica. 39, 385-399 (1993).</li>
<li>Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+sampling+and+isolation+of+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernematidae%2C+Heterorhabditidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae).</a> J. Vis. Exp. (89), (2014).</li>
<li>Poinar, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+Achromobacter+nematophilus+in+the+infective+stage+of+a+Neoaplectana+sp+%28Steinernematidae%3A+Nematoda%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda).</a> Nematologica. 12, 105-108 (1966).</li>
<li>Poinar, G. O. Jr, Thomas, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+Achromobacter+nematophilus+sp.+nov.+%28Achromobacteriaceae%3A+Eubacteriales%29+associated+with+a+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Bull.+Bacteriol.+Nomencl.+Taxon%22%5BJournal%5D)">Significance of Achromobacter nematophilus sp. nov. (Achromobacteriaceae: Eubacteriales) associated with a nematode.</a> Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 15, 249-252 (1966).</li>
<li>Sicard, M., Brugirard-Ricaud, K., Pagès, S., Lanois, A., Boemare, N. E., Brehéli, M., Givaudan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+infection+during+the+tripartite+interaction+between+Xenorhabdus+nematophila%2C+its+nematode+vector%2C+and+insect+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473-6480 (2004).</li>
<li>Sicard, M., Hinsinger, J., LeBrun, N., Pagès, S., Boemare, N., Moulia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecific+competition+between+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernema%29+is+modified+by+their+bacterial+symbionts+%28Xenorhabdus%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Interspecific competition between entomopathogenic nematodes (Steinernema) is modified by their bacterial symbionts (Xenorhabdus).</a> BMC Evolutionary Biology. 6, 68-78 (2006).</li>
<li>Snyder, H., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+colonization+and+release+processes+of+Xenorhabdus+nematophila+and+the+morphology+and+ultrastructure+of+the+bacterial+receptacle+of+its+nematode+host%2C+Steinernema+carpocapsae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae.</a> Applied and environmental microbiology. 73, 5338-5346 (2007).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. ed, C. .elegans.W. ormB. ook. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">http://www.wormbook.org</a> (2006).</li>
<li>Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. Nematode parasites, pathogens and associated of insects and invertebrates of economic importance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStock%2C+SP+%22Manual+of+Techniques+in+Invertebrate+Pathology%22">Manual of Techniques in Invertebrate Pathology</a>. Lacey, L. A. , Elsevier. Yakima, WA. 373-426 (2012).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Wykorzystanie odpowiedniego żywiciela jest kluczowym czynnikiem udanej hodowli in vivo EPN. Zwykle zarówno steinernematydy, jak i heterorhabditidae mogą rozmnażać się i pomyślnie zakończyć swój cykl życiowy w larwach woskowej, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). Można jednak wziąć pod uwagę inne gatunki owadów z różnych rodzin i/lub rzędów. Wiadomo, że kilka z obecnie opisanych gatunków nicieni ma specyficzność dla konkretnego owada żywiciela. Na przykład S. kushidai i S. scarabae...

Nicienie entomopatogeniczne (EPN) Steinernema i Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) oraz ich bakteryjne symbionty, Xenorhabdus i Photorhabdus spp (Enterobacteriaceae) są uważane za wyłaniający się model symbiotycznych relacji między zwierzętami a mikroorganizmami2-4,6,10,19. Xenorhabdus i Photorhabdus spp. są noszone jako symbionty w jelicie jedynego wolno żyjącego stadium nicieni, znanego również jako zakaźny młodociany (IJ) lub infekcyjny młodociany wtrzecim stadium 8,10,13. Para bakteria-nicień jest chorobotwórczy dla szerokiej gamy owadów i została z powodzeniem wdrożona w programach kontroli biologicznej i integrowanej ochrony przed szkodnikami na całym świecie6,8.
Tutaj pokazujemy wybór technik in vivo i in vitro, które są często stosowane do hodowli EPN w warunkach laboratoryjnych. Metody in vivo uwzględniają żywiciela owadów do hodowli nicieni. Zwykle za odpowiednich gospodarzy uważa się niedojrzałe stadia różnych rzędów owadów (tj. Lepidoptera, Coleoptera, Diptera itp.). Metody in vivo są zwykle brane pod uwagę w celu utrzymania kultur nicieni w laboratorium. Ta metoda może nie być odpowiednia, jeśli rozważa się masową produkcję nicieni. W tym celu mogą być potrzebne duże ilości żywicieli owadów, co wymaga więcej czasu i dodatkowych kosztów związanych z hodowlą owadów.
Nicienie entomopatogeniczne mogą być również hodowane in vitro na kilku pożywkach. W zależności od celu badania; Metody in vitro mogą lub uwzględniają włączenie bakterii symbiotycznych do pożywki. W niniejszej prezentacji opisujemy dwie powszechnie stosowane metody rozmnażania EPN. Składniki pożywki stanowią źródło składników odżywczych dla bakterii symbiotycznej i źródło steroli dla nicieni. Metody in vitro mają tę zaletę, że hodowla EPN odbywa się bez udziału owadzich żywicieli.
Pierwotnie, wiele z opracowanych pożywek in vitro było używanych do namnażania EPN, gdy odpowiednie owadzie gospodarze nie są dostępne. Jednak w ostatnich latach metody hodowli in vitro stały się szeroko stosowane w badaniach mających na celu zrozumienie wzajemnego związku między EPN a ich symbiotycznymi bakteriami17,19.
Techniki opisane w tej prezentacji odpowiadają tym opisanym przez różnych autorów i udoskonalonym przez Stock Laboratory, University of Arizona (Tucson, AZ, USA). Techniki te różnią się od technik stosowanych w masowej produkcji tych organizmów do celów ochrony przed szkodnikami.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Dla In vivo Infekcje</td></tr><tr><td>100 x 15 szalki Petriego</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna, 9 cm celuloza klasy 1</td><td>Whatman/VWR</td><td>28450-081</td><td>Zalecana bibuła filtracyjna klasy 1</td></tr><tr><td>Żywiciele owadów</td><td>Timberline</td><td>http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td><td>Galleria mellonella to polecane</td></tr><tr><td colspan="4">Dla agaru wątrobowo-nerkowego (na 500 ml)</td></tr><tr><td>60 x 15 mm szalki Petriego</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Wątroba wołowa, 50 g</td><td>Pozyskiwana lokalnie; rzeźnik lub supermarket</td><td></td><td>Pozostała część może być przechowywana zamrożona i rozmrożona do wykorzystania w przyszłości</td></tr><tr><td>Nerka wołowa, 50 g</td><td>Pozyskiwane lokalnie; rzeźnik lub supermarket</td><td></td><td>Pozostałe mogą być przechowywane zamrożone i rozmrożone do wykorzystania w przyszłości</td></tr><tr><td>Chlorek sodu 2,5 g (0,5% stężenie końcowe)</td><td>Acros/VWR</td><td>200002-434</td><td>można użyć dowolnego NaCl klasy badawczej</td></tr><tr><td>Agar, 7,5 g (1,5% agaru, stężenie końcowe)</td><td>HiMedia/VWR</td><td>95026-642</td><td>można użyć dowolnego agaru klasy pożywki</td></tr><tr><td>500 ml destylowanego H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Do agaru lipidowego (na 1 l)</td></tr><tr><td>100 x 15 szalek Petriego</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Odżywczy bulion, 8 g</td><td>BD/VWR</td><td>90002-660</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy, 5 g</td><td>EMD/VWR</td><td>EM1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny 10 ml (0,2 g/ml)</td><td>EMD/VWR</td><td>EM-MX0045-1</td><td></td></tr><tr><td>Olej kukurydziany, 4 ml</td><td>Dowolna marka</td><td>Źródło lokalne; supermarket</td><td>Można użyć</td></tr> <tr><td>oleju kukurydzianego dowolnej markiSyrop kukurydziany, 96 ml Połącz 7 ml syropu kukurydzianego w 89 ml podgrzanego H2O i zawiruj dla uzyskania jednorodności</td><td>Karo</td><td>Pozyskiwane lokalnie; supermarket</td><td></td></tr><tr><td>Agar, 15 g</td><td>HiMedia/VWR</td><td>95026-642</td><td>Można użyć dowolnego agaru klasy podłoża</td></tr><tr><td>Destylowany H2O, 890 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla in vivo i in vitro nicieni entomopatogenicznych (steinernematidae i heterorhabditidae)

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae)

Nicienie entomopatogeniczne (EPN) (Steinernematidae i Heterorhabditidae) mają wzajemne partnerstwo z Gram-ujemnymi Gamma-Proteobacteria z rodziny Enterobacteriaceae. Bakterie Xenorhabdus są związane z nicieniami steinernematidae, podczas gdy Photorhabdus są symbiontami heterorhabditidae. Nicienie i bakterie razem tworzą silny kompleks owadobójczy, który zabija szeroką gamę gatunków owadów w intymnym i specyficznym partnerstwie. W niniejszym artykule demonstrujemy techniki in vivo i in vitro powszechnie stosowane w hodowli tych nicieni w warunkach laboratoryjnych. Co więcej, techniki te stanowią kluczowe kroki w pomyślnym ustanowieniu kultur EPN, a także stanowią podstawę dla innych testów biologicznych, które wykorzystują te organizmy do badań. Produkcja nicieni aposymbiotycznych (wolnych od symbiontów) ma często kluczowe znaczenie dla dogłębnego i wieloaspektowego podejścia do badania symbiozy. Protokół ten nie wymaga dodawania antybiotyków i można go zrealizować w krótkim czasie przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego. Nicienie produkowane w ten sposób są stosunkowo wytrzymałe, chociaż ich przeżywalność w przechowywaniu może się różnić w zależności od użytego gatunku. Techniki wyszczególnione w tej prezentacji odpowiadają technikom opisanym przez różnych autorów i udoskonalonym przez P. Stock's Laboratory, University of Arizona (Tucson, AZ, USA). Techniki te różnią się od technik stosowanych w masowej produkcji tych organizmów do celów ochrony przed szkodnikami.

Metoda hodowli in vivo wykorzystuje żywe owady jako gospodarzy dla wzrostu i reprodukcji nicieni. Komory infekcyjne są wydajną metodą narażania owadów na IJ. Jest to jedyny etap w cyklu życiowym nicieni, który przenosi symbiotyczne bakterie z jednego owada gospodarza na innego. Rysunek 1 przedstawia konfigurację komory infekcyjnej oraz materiały potrzebne do jej zbudowania. Metody hodowli in vitro pozwalają EPN na wzrost bez owada gospodarza, ale są one również stosowane do hodowli nici...

Celem tej prezentacji jest zademonstrowanie in vivo i in vitro technik hodowli nicieni entomopatogenicznych. Metody in vivo uwzględniają hodowlę tych nicieni z owadem żywicielem, podczas gdy metody in vitro wykorzystują bogate podłoża agarowe.

Hodowla in vivo i in vitro nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae i Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (EPN) (Steinernematidae and Heterorhabditidae) have a mutualistic partnership with Gram-negative Gamma-Proteobacteria in the ...

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie technik hodowli entero patogennych nicieni in vivo i in vitro. Metoda in vivo polega na pierwszej inkubacji larw woskowej garia melanoma z zakaźną zawiesiną młodocianą lub IJ. Następnie zwłoki zakażone nicieniami są przenoszone do zmodyfikowanej białej pułapki, aby można je było zebrać.Metoda hodowli in vitro polega na pierwszej naprawie wątroby, nerek lub płytek agaru lipidowego, a następnie usuwa się pożądane bakterie symbiotyczne. Następnie do płytek dodaje się zawiesinę IJ i pozostawia się nicienie do rozwoju. Na koniec naczynie agarowe przenosi się do zmodyfikowanej białej pułapki w celu zebrania nicieni.Ostatecznie techniki te z powodzeniem ustanawiają kultury EPN, a także stanowią podstawę dla innych testów biologicznych, które wykorzystują te organizmy do badań. Przedstawione w tej prezentacji metody inbivo i in vitro mogą być wykorzystane nie tylko do badań nad nicieniami chorobotwórczymi, ale także do szerokiego wachlarza eksperymentów mających na celu zrozumienie interakcji ProCard i eary. Procedury zademonstruje doktorant John McMullen w moim laboratorium.Aby rozpocząć hodowlę in vivo nicieni chorobotwórczych Entero, nal

in-vivo-vitro-rearing-entomopathogenic-nematodes-steinernematidae

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Aby zbadać mutualizm między bakteriami Xenorhabdus a nicieniami Steinernema, opracowano metody monitorowania obecności i lokalizacji bakterii wewnątrz nicieni. Podejście eksperymentalne, które można zastosować w innych systemach, polega na zmodyfikowaniu bakterii w celu ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego oraz wizualizacji bakterii wewnątrz przezroczystego nicienia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Wizualizacja bakterii w nicieniach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Nicienie entomopatogeniczne to glisty zamieszkujące glebę, które pasożytują na szerokiej gamie owadów.  Pokazujemy metody pobierania próbek stosowane do izolacji tych nicieni z gleby przy użyciu dwóch technik: przynęty na owady i zmodyfikowanej białej pułapki, do odzyskiwania nicieni odpowiednio z próbek gleby i zakażonych zwłok owadów.

Pobieranie próbek z gleby i izolacja nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Dzikie nicienie Caenorhabditis są związane z wieloma drobnoustrojami, często w świetle jelit lub infekującymi jelita. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę wzbogacania niekulturowych drobnoustrojów kolonizujących jelito, wykorzystując odporność naskórka dauer.

Selektywne czyszczenie dzikich nicieni Caenorhabditis w celu wzbogacenia o bakterie mikrobiomu jelitowego

Nicienie entomopatogeniczne żyją w symbiozie z bakteriami i razem skutecznie infekują owady, osłabiając ich wrodzony układ odpornościowy. W celu wspierania badań nad genetycznymi podstawami zakażenia nicieniami opisano metody utrzymywania i genetycznej manipulacji nicieniami entomopatogenicznymi.

Hodowla i genetyczna manipulacja nicieniami entomopatogennymi

Ten artykuł demonstruje inżynierię genomu pośredniczoną przez CRISPR-Cas9 w Steinernema hermafroditum, nicieniu entomopatogenicznym (EPN: pasożytniczym owadziem) oraz rozwijającym się modelem genetycznym. Opisana technologia jest przydatna do tworzenia mutantów, umożliwiając wyjaśnienie funkcji genów w biologii nicieni, które są istotne dla symbiozy mutualistycznej i pasożytniczej.

Mutageneza oparta na CRISPR-Cas9 w nicieniu entomopatogenicznym Steinernema hermafroditum oraz utrzymanie linii mutantów

Przedstawiamy dwie metody masowego rozmnażania nicieni entomopatogenicznych jako bioinsektycydów dla rolników. Pierwsza metoda wykorzystuje żel poliakrylamidu jako podłoże do hodowli nicieni, podczas gdy druga metoda wykorzystuje bawełnę polimerową jako podłoże do hodowli. Obie metody opierają się na in vivo rozmnażaniu nicieni wewnątrz padlin owadów.

Uprawa oparta na hodowli in vivo nicieni entomopatogenicznych

Decelularyzacja perfuzyjna jest nowoczesną techniką wytwarzania rusztowań całej wątroby, która zachowuje skład macierzy zewnątrzkomórkowej oraz mikroarchitekturę narządu. W niniejszym opracowaniu opisano metodę przygotowania rusztowań całego narządu z wykorzystaniem decelularyzacji perfuzyjnej i późniejszej repopulacji hepatocytami. Dzięki tej technice możliwe jest wytworzenie funkcjonalnych i możliwych do przeszczepienia graftów wątroby.

Decelularyzacja i recelularyzacja całych wątrób

Samoorganizujące się monowarstwy (SAMs) utworzone z długołańcuchowych alkanotioli na złocie stanowią precyzyjnie zdefiniowane podłoża do tworzenia wzorów białkowych oraz ograniczania przestrzeni wzrostu komórek. Mikro kontaktowy druk heksadekanotiolu przy użyciu stempla z polidimetylosiloksanu (PDMS), a następnie wypełnienie wolnych przestrzeni monomerem alkanotiolu zakończonym grupą glikolową, pozwala na uzyskanie wzoru, w którym białka i komórki adsorbują wyłącznie do obszaru z nadrukowanym...

Tworzenie dwuwymiarowych wzorowanych podłoży do ograniczania przestrzeni białek i komórek

Opisano pełną konstrukcję niestandardowego systemu obrazowania konfokalnego z przeskanowaniem w czasie rzeczywistym. System ten, który może być łatwo wykorzystany do mikroskopii i mikroendoskopii w tempie wideo, umożliwia zastosowanie szeregu geometrii obrazowania i aplikacji niedostępnych w standardowych komercyjnych systemach konfokalnych, przy ułamku ich kosztów.

Skaningowa mikroskopia konfokalna w czasie rzeczywistym i mikroendoskopia

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedurę sekcji, konfigurację aparatury oraz warunki eksperymentalne podczas mapowania optycznego potencjału błonowego (Vm) i wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia (CaT) w nienaruszonych, izolowanych sercach myszy perfundowanych metodą Langendorffa.

Mapowanie optyczne potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia w sercu myszy

Poznaj metody hodowli in vivo i in vitro nicieni entomopatogenicznych z rodzin Steinernematidae i Heterorhabditidae. Techniki te wykorzystują żywe gospodarze oraz pożywki agarowe z bakteriami symbiotycznymi.

Hodowla in vivo i in vitro nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae i Heterorhabditidae)

Przeglądaj więcej filmów