Identyfikacja miejsc interakcji białko-białko za pomocą macierzy peptydowych

Ogólnym celem tej procedury jest odwzorowanie interakcji między dwoma białkami lub domenami białkowymi. W tym przypadku nadal badane są domeny białkowe związane z rakiem i CHFR. Ogólnym celem tej procedury jest odwzorowanie interakcji między dwoma białkami lub domenami białkowymi.

W tym przypadku nadal badane są domeny białkowe związane z rakiem i CHFR. Drugim krokiem jest inkubacja macierzy peptydowej CHFR z jej partnerem wiążącym, białkiem niegazowanym. Następnie matryca jest myta i inkubowana z peroksydazą chrzanu, sprzężonym przeciwciałem.

Matryca jest następnie poddawana detekcji luminescencji chemicznej w celu wykrycia wiązania. Ostatnim krokiem jest analiza wyników i identyfikacja miejsc wiązania między białkami. Badanie to toruje drogę do zaprojektowania racjonalnych inhibitorów ciągłego wiązania CHFR, których niekontrolowana interakcja może prowadzić do rozwoju nowotworu.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad interakcjami białek, takie jak jakie są konkretne regiony, które medytują Interakcja między dwoma białkami, Podziel sekwencję białka docelowego na 10 do 20 peptydów resztowych. To się częściowo pokrywa. Stopień nakładania się może być różny, ale zasadniczo im dłuższe nakładanie się, tym lepiej.

Projektując peptydy, należy wziąć pod uwagę znane drugorzędowe elementy struktury białka, które mogą być odpowiedzialne za interakcję. Projektowaną macierz peptydową można zamówić za pośrednictwem dostawców komercyjnych. W tym eksperymencie peptydy z reszt domeny CHFR od 4 24 do 6 62 są kowalencyjnie związane z tablicą przez koniec C.

Po otrzymaniu zaprojektowanej tablicy przygotuj ją do eksperymentu, najpierw ją blokując, aby zapobiec niespecyficznemu powiązaniu. Przygotuj roztwór blokujący o masie 2,5% na objętość. Odtłuszczone mleko w proszku w roztworze buforowym tris zawierającym 0,05% Tween 20 lub TBST, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.

Zanurz tablicę w pięciu mililitrach roztworu blokującego. Inkubować matrycę przez dwie do czterech godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na shakerze. Najpierw umyj matrycę pięcioma mililitrami roztworu blokującego przez 30 sekund.

Następnie umyj matrycę dwukrotnie pięcioma mililitrami TBST przez pięć minut na wytrząsarce w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj umytą matrycę z pięcioma mililitrami roztworu białka znakowanego polihistydyną zawierającego 2,5% masy na objętość. Odtłuszcz mleko w proszku, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.

W tym przypadku stosuje się 4,5 mikromolowy roztwór nieruchomych reszt białkowych od 500 do sześciu 50. Następnie inkubuj matrycę w roztworze białkowym przez trzy do ośmiu godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji w roztworze białkowym.

Umyj tablicę pięcioma mililitrami TBST przez 30 sekund na wytrząsarce w temperaturze pokojowej, a następnie wykonaj dwa dodatkowe pięciominutowe mycia. Teraz inkubuj umytą matrycę z pięcioma mililitrami rozcieńczonego przeciwciała sprzężonego z peroksydazą chrzanową w buforze inkubacyjnym, który zawiera te same składniki w tych samych stężeniach co roztwór blokujący przez jedną godzinę na wytrząsarce w temperaturze pokojowej, przeciwciało może związać białko docelowe lub znacznik, przeprowadzić eksperymenty kontrolne, testując oddziaływanie przeciwciała z peptydami na tablicy, powtarzając ten sam protokół na oddzielnej tablicy suwak bez inkubacji z białkiem przed odczytaniem tablic. Umyj je jak poprzednio pięcioma mililitrami TBST.

Przeprowadź rozwój chemiluminescencji za pomocą ulepszonego zestawu substratów do blottingu chemiluminescencyjnego. Wykonaj detekcję za pomocą luminescencyjnego analizatora obrazu, takiego jak kamera Fuji film LAS 3000. Przeanalizuj wyniki, upewniając się, że oba duplikaty na tablicy pokazują te same sygnały, aby wyniki były wiarygodne.

Jeśli struktura partnera białkowego jest znana, należy poszukać w strukturze peptydów wiążących i poszukać miejsc wiązania. Należy pamiętać, że peptydy, które znajdują się daleko w sekwencji, mogą znajdować się razem w strukturze trzeciorzędowej i tworzyć miejsce wiązania. W naszym przykładzie nadal jest bardzo ważnym białkiem Centro Somal, które kontroluje prawidłowy podział komórek, a proliferacja komórek nadal oddziałuje z kilkoma białkami poprzez swój wewnętrznie nieuporządkowany region.

Za pomocą zaprojektowanej macierzy peptydowej ujawniono nadal wiążące miejsca w supresorze guza CHFR. Każda plama w tablicy reprezentuje peptyd pochodzący z A-C-H-F-R, który musi nadal zauważać, że każdy peptyd pojawia się dwukrotnie, ponieważ istnieje w duplikacie, co weryfikuje wiarygodność wyników. Badanie przesiewowe macierzy peptydowej ujawniło siedem peptydów pochodzących z CHFR, które wiązały się z wciąż wewnętrznie nieuporządkowanymi resztami regionu od 500 do sześciu 50.

Wyniki te pozwoliły nam zmapować miejsce wiązania destylatora na CHFR. Pomimo odległości tych siedmiu peptydów od sekwencji pierwszorzędowej CHFR. Tworzą one dobrze zdefiniowane miejsce wiązania dla nieruchomej struktury trzeciorzędowej CHFR.

Metoda ta ma zastosowanie do charakteryzowania każdej interakcji białkowej z białkiem zgodnie z tą procedurą. Metody ilościowe, takie jak fluorescencja i izotop lub ITC, powinny być stosowane w celu sprawdzenia, w celu ilościowego określenia wprowadzenia peptydu.