Name: Oczyszczanie na dużą skalę zewnętrznych segmentów fotoreceptorów świń lub bydła do oznaczania fagocytozy na komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania zewnętrznych segmentów fotoreceptorów z siatkówki świń lub bydła przy użyciu ultrawirówki z gradientem sacharozy. Technika umożliwia przygotowanie dużych zapasów POS do badań nad fagocytozą w komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses/Jeunes Chercheurs do EFN), Fondation Voir et Entendre i Fondation Bettencourt Schueller (Stypendia dla Młodych Badaczy dla EFN), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, stałe stanowisko dla EFN) oraz The National Eye Institute of the National Institutes of Health (R01-EY13295 do SCF). Ponadto Institut de la Vision jest finansowany przez Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, Centre National de la Recherche Scientifique i Départment de Paris.

Ten eksperyment z izolacją POS jest czasochłonny i może zająć do 12 godzin, jeśli POS jest oznaczony przed przechowywaniem. Protokół został zaadaptowany z artykułu opublikowanego przez R.S. Moldaya i współpracowników w 1987 r.31 i zmodyfikowany przez S.C. Finnemanna i współpracowników w 1997 r.
Zwierzęta były traktowane zgodnie z oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Protokoły zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Komitet Etyki Karola Darwina z Uniwersytetu Pierre and Marie Curie-Paris 06 oraz Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie Fordham.
1. Ogólna konfiguracja
<ol>
	<li>Zdobądź 80 świeżych oczu świni lub krowy tak świeżych jak najszybciej po uboju i przechowuj je w chłodzie w ciemności. Przekaż instrukcje dostawcy, aby firma postępowała w ten sam sposób. Ten protokół jest zoptymalizowany dla 80 oczu. Aby postępować z większą liczbą oczu i uzyskać większe zapasy (np. ze 160 oczu), podwój ilość roztworu i wykonaj 2 rundy ultrawirowania; próbki z puli na późniejszym etapie pobierania (zob. etap 2.2.2).</li>
	<li>Ustaw na ławce czerwoną lampę safelight, wkładki chłonne, chusteczki (tabela materiałów). Przygotuj 15-centymetrowe naczynia i worki na zagrożenia biologiczne do zbierania odpadów (niewykorzystane części oczu, ciało szkliste...). Noś obcisły fartuch laboratoryjny, rękawice, ochraniacze rękawów i gogle.</li>
	<li>Środki ostrożności:
	<ol>
		<li>Wstępnie schłodź wszystkie roztwory, a następnie utrzymuj je w chłodzie podczas wszystkich etapów. Utrzymuj oczy i pochyłości w chłodzie na lodzie tak bardzo, jak to możliwe.</li>
		<li>Oczy i pobrane tkanki należy trzymać w ciemności tak długo, jak to możliwe, aż do etapu pobierania po ultrawirowaniu, aby uniknąć fotowybielania pigmentów wizualnych i utraty pomarańczowo-różowego koloru aktywnej formy fotopigmentów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Działania protokołu
<ol>
	<li>Przygotuj roztwory i gradienty:
	<ol>
		<li>Całkowicie rozmrozić bulion z tauryny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przygotować wszystkie roztwory z roztworów podstawowych (Tabela 1, Roztwory podstawowe) i dokładnie wymieszać sacharozę z innymi składnikami, używając mieszadła magnetycznego dla każdego roztworu.
		<ol>
			<li>Przygotować 15 ml roztworu homogenizacyjnego do końcowego stężenia 20% sacharozy, 20 mM octanu tris o pH 7,2, 2 mM MgCl2, 10 mM glukozy i 5 mM tauryny.</li>
			<li>Przygotować 25% roztwór sacharozy do końcowego stężenia 25% sacharozy (przy użyciu 70% sacharozy), 20 mM octanu tris pH 7,2, 10 mM glukozy i 5 mM tauryny.</li>
			<li>Przygotować 60% roztwór sacharozy do końcowego stężenia 60% sacharozy (przy użyciu sacharozy w proszku), 20 mM octanu tris o pH 7,2, 10 mM glukozy i 5 mM tauryny.</li>
			<li>Przygotować roztwór Wash 1 do końcowego stężenia 20 mM octanu tris, pH 7,2 i 5 mM tauryny.</li>
			<li>Przygotować roztwór Wash 2 do końcowego stężenia 10% sacharozy, 20 mM octanu tris, pH 7,2 i 5 mM tauryny.</li>
			<li>Przygotować roztwór Wash 3 do końcowego stężenia 10% sacharozy, 20 mM fosforanu sodu o pH 7,2 i 5 mM tauryny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ustabilizować ekspres gradientowy na mieszadle magnetycznym i włożyć mieszadło do komory najbliżej wyjścia, do którego zostanie wprowadzony 60% roztwór. Użyj odciętej końcówki pipety P200 umieszczonej na wyjściu rurki, aby uzyskać odpowiednią prędkość odlewania.</li>
		<li>Delikatnie odlać gradienty liniowe, rozcieńczając i mieszając 60% roztwór sacharozy z 25% roztworem, używając 12 ml z każdego roztworu (tj. łącznie 6 probówek na 80 oczu) we wstępnie schłodzonych probówkach ultrawirówek. Dobrze wymieszaj stopniowo rozcieńczający 60% roztwór sacharozy. Ustal prędkość przepływu gradientowego, wlewając roztwór płynnie i niezbyt szybko. 
		UWAGA: Aby uzyskać ciągły, liniowy gradient, należy utrzymać otwór końcówki pipety dokładnie na powierzchni roztworu przez cały proces tworzenia gradientu.</li>
		<li>Pozostaw gradienty na lodzie na około 1 godzinę w celu stabilizacji. Utrzymuj gradienty w chłodzie do momentu załadowania. Nie potrząsaj rurkami, aby zapobiec zakłóceniu gradientu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie tkanek:
	<ol>
		<li>Zbieraj tkanki w przyćmionym czerwonym świetle. Weź oko w jedną rękę i szturchnij przód krawędzią żyletki, trzymając oko z dala (aby uniknąć rozpryskiwania; Rysunek 1). Użyj żyletki, aby przeciąć przednią gałkę oczną na 2 połówki (rogówka plus co najmniej 5 mm w twardówce). Zdejmij soczewkę i odwróć muszlę oczną na lewą stronę, tak aby można ją było trzymać na czubku jednego palca, odsłaniając w ten sposób siatkówkę.</li>
		<li>Używając żyletki pod kątem, delikatnie zeskrob siatkówkę, łatwo odrywając się i wyglądając jak różowawa warstwa, z powierzchni tapety i przeciąć głowę nerwu wzrokowego (ryc. 1). Zebrać wszystkie siatkówki w 2 probówkach po 50 ml, z których każda zawiera 15 ml roztworu homogenizacyjnego na lodzie.</li>
		<li>Homogenizacja siatkówki:
		<ol>
			<li>Energicznie wstrząsać zawiesiną ręcznie przez 2 minuty w celu przerwania różnych warstw komórek, oderwania POS od reszty komórki PR, fragmentacji POS i homogenizacji zawiesiny siatkówki.</li>
			<li>Przefiltruj 3x przez podwójną warstwę czystej gazy, aby usunąć duże fragmenty tkanek i zebrać przepływ do czystych probówek o pojemności 50 ml (Rysunek 1). Zawiesina siatkówki jest dość gruba, aby zmaksymalizować wydajność, delikatnie dociśnij gazę, aby uwolnić pozostałe rozdrobnione tkanki po każdej filtracji.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja fragmentu zewnętrznego segmentu fotoreceptora (POS):
	<ol>
		<li>Delikatnie ułóż surowy preparat siatkówki, około 6 - 7 ml na probówkę, na 6 x 30 ml probówek ultrawirówek, z których każda zawiera 24 ml świeżo schłodzonej, ciągłej sacharozy o 25-60% gradiencie (ryc. 1). Zrównoważyć przeciwległe rury odpowiednio do używanego wirnika. Ultrawirować przy 106 000 x g przez 50 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usunąć większość roztworu powyżej pomarańczowo-różowego pasma w górnej jednej trzeciej gradientu przez aspirację (Rysunek 2A). Zbierz pomarańczowo-różową opaskę z odciętą końcówką P1000 do zlewki. Wyrzuć resztę po neutralizacji za pomocą wybielacza (odpady biologiczne).</li>
		<li>Rozcieńczyć ~4 - 5 objętościami lodowatego roztworu Wash 1. Rozdzielić na tyle probówek o pojemności 30 ml, ile potrzeba. Wirować przy 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie wyrzucić sklarowany sklarowany osad.</li>
		<li>Zawiesić granulki w 10 ml roztworu Wash 2 i wirować w temperaturze 3 000 x g przez 10 minut, jak opisano powyżej. Zawiesić granulki w 15 ml Wash 3 i ponownie wirować w temperaturze 3 000 x g przez 10 min. Połącz zawiesiny z kilku granulek, aby zmniejszyć liczbę probówek potrzebnych przed odwirowaniem w roztworach Wash 2 i Wash 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Porcjowanie POS bez etykietowania:
	<ol>
		<li>Zawieś ponownie POS w 10 - 20 ml DMEM. Rozcieńczyć wstępnie 10 μl w 490 μl DMEM (1:50) i policzyć wydłużone oraz wirowane POS w komorze do liczenia komórek (rysunek 2B). Obliczanie wydajności i stężenia w cząstkach POS na ml. 
		UWAGA: Wydajność jest różna, w zależności głównie od wieku i rasy świń/krów oraz wielkości oczu, np. dobry preparat waha się od 5 - 8 x 109 POS od 80 oczu świni.</li>
		<li>Zdecyduj o końcowej objętości DMEM (zwykle 10 - 20 ml) i dodaj sacharozę, aby uzyskać końcowe stężenie 2,5% sacharozy.</li>
		<li>Przygotować porcje o pożądanej wielkości, np. 5 x 107 POS na probówkę na 2 ml objętości do ponownego zaparcia w 96-dołkowym eksperymencie przy 40 μl/basenik. Wirować 1 porcję przez 5 minut przy 2,300 x g przy RT i ocenić wielkość granulki. Przygotuj różne wielkości porcji dla różnych objętości aplikacji, ponieważ POS NIE powinien być dwukrotnie zamrażany i rozmrażany.</li>
		<li>Zamrażać porcje POS w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia. 
		UWAGA: Podwielokrotności są stabilne przez wiele miesięcy. W naszych rękach nieoznakowane lub oznaczone POS mogą być przechowywane przez co najmniej rok.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Etykietowanie i porcjowanie POS: 
	UWAGA: Zazwyczaj używamy FITC do oznaczania POS do ilościowego oznaczania testów fagocytozy, ale w zależności od potrzeb można również stosować inne barwniki.
	<ol>
		<li>Zawiesić 1 fiolkę 10 mg FITC o stężeniu 2,5 mg/ml w 0,1 M buforze węglanowym o pH 9,5, mieszając 2,6 ml 0,1 M NaHCO3 o pH 8,4 z 1,4 ml 0,1 M Na2CO3 pH 11,5 (Tabela 2, roztwory podstawowe). Obracaj przez 1 godzinę przy natężeniu obrotowym, chroniąc przed światłem i wiruj przez 5 minut z maksymalną prędkością, aby osadzać niezawieszone ciała stałe FITC.</li>
		<li>Zawiesić osad POS w 10 ml roztworu Wash 3 (lub DMEM) i dodać 2 ml roztworu FITC na 80 oczu. Przechowuj resztki FITC zamrożone w temperaturze -80 °C. Obracaj przez co najmniej 1,5 godziny w temperaturze RT. Chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej.</li>
		<li>Przemyć oznakowany POS dwukrotnie roztworem Wash 3, jak opisano w sekcji 2.3.4, a następnie raz lub dwa razy w DMEM, aż prawie nie będzie widać wolnego FITC we frakcji sklarowanej nad osadem. Ponownie zawieś POS w DMEM i postępuj jak w przypadku nieoznakowanego POS do liczenia i porcjowania (sekcja 2.4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Korzystanie z POS w eksperymentach:
	<ol>
		<li>Rozmrozić POS w RT i trzymaj je w ciemności tak bardzo, jak to możliwe, jeśli są oznaczone fluorescencyjnie. Wirować przez 5 minut przy 2 300 x g przy RT. Odessać supernatant.</li>
		<li>Natychmiast ponownie zawiesić w odpowiedniej objętości roztworu do oznaczania, zgodnie z zaleceniami doświadczenia. W przypadku różnych godzin wyzwania POS, przechowuj zawieszony POS w RT w ciemności między punktami czasowymi przez kilka godzin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Trzy etapy lub warunki są kluczowe dla zoptymalizowanego oczyszczania: jakość odlewu gradientowego i delikatna manipulacja rurkami gradientowymi, utrzymywanie tkanek w chłodzie i ciemności do etapu pobierania, siła wstrząsania homogenatów siatkówki w celu uzyskania właściwej izolacji POS od reszty komórki PR. Jeśli pojawią się jakieś problemy z prawidłowym widzeniem pomarańczowego paska, najprawdopodobniej są one spowodowane jednym z trzech powyższych powodów (patrz również drugi akapit sekcji Wyniki ). ...

W siatkówce widzenie jest wyzwalane przez izomeryzację światłoczułych cząsteczek zwanych opsynami, zanim zostanie przekształcone w sygnał, który może być przekazywany między neuronami aż do obszarów wzrokowych w mózgu. Cząsteczki te są osadzone w stosach błoniastych dysków przypominających naleśniki, które stanowią zewnętrzne części segmentowe komórek fotoreceptorowych (PR). Będąc narażonym na ciągłą ekspozycję na światło, a tym samym znaczny poziom stresu oksydacyjnego, PR stale odnawiają swoje zewnętrzne segmenty, aby ograniczyć potencjalne uszkodzenia oksydacyjne. Zewnętrzne segmenty fotoreceptorów są w bliskim kontakcie z mikrokosmkami wierzchołkowymi sąsiednich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Komórki RPE stanowią zewnętrzną część bariery krew-siatkówka i zapewniają liczne zadania, które są kluczowe dla zdrowia i funkcji fotoreceptorów1, takie jak tłumienie promieni świetlnych przez pigmenty melaniny, reizomeryzacja fotoreaktywnego składnika opsyny siatkówki, dostarczanie składników odżywczych i czynników wzrostu, udział w usuwaniu metabolitów PR.
Ponadto, komórki RPE eliminują zużyte POS i przetwarzają swoje komponenty, co jest codziennym zajęciem, które jest regulowane przez rytm dobowy siatkówki ssaków2,3. Odprawa szopy POS jest absolutnie niezbędna do przetrwania PR. Po całkowitym zniesieniu gromadzą się zanieczyszczenia POS i PR ulegają degeneracji, powodując szybką utratę wzroku4,5. Jeśli profil rytmiczny zostanie utracony i zastąpiony ciągłą aktywnością, wady PR i RPE kumulują się w wieku6 lat. Dlatego bardzo ważne jest scharakteryzowanie molekularnej regulacji fagocytozy RPE in vitro, aby zrozumieć fenotypy związane z jej dysfunkcją. Co ciekawe, maszyneria molekularna w komórkach RPE jest bardzo podobna do tej używanej przez makrofagi do usuwania komórek apoptotycznych i obie są zależne od rozpoznania odsłoniętej fosfatydyloseryny na szczątkach fagocytarnych7-9. Mimo to komórki RPE i makrofagi inaczej regulują fagocytozę, ponieważ makrofagi decydują się na natychmiastową eliminację komórek apoptotycznych w czasie spotkania, podczas gdy komórki RPE rytmicznie pochłaniają POS tylko raz dziennie, pomimo ich stałego kontaktu z zewnętrznymi segmentami. Sugeruje to specyficzne mechanizmy regulacji, które nie są jeszcze w pełni poznane.
Wiele cząsteczek związanych z maszynerią fagocytarną RPE zostało zidentyfikowanych lub zweryfikowanych dzięki użyciu izolowanych testów POS i fagocytozy hodowli komórkowych. Receptor integryny alfavbeta5 zlokalizowany na powierzchni komórki wierzchołkowej RPE, w koordynacji ze swoim ligandem MFG-E8, wiąże się specyficznie z POS10-12, które są następnie internalizowane przez receptor kinazy tyrozynowej MerTK13-15. Wykazano, że receptor wymiatający CD36 uczestniczy w przyjmowaniu POS i wpływa na jego prędkość16,17 i może służyć jako czujnik utlenionych fosfolipidów na powierzchni POS18. Internalizacja wymaga rekrutacji białek związanych z cytoszkieletem F-aktyny, takich jak aneksyna 2,19, miozyna II20 i miozyna VIIA21,22. Natywne lub utlenione POS in vitro są również wykorzystywane do zrozumienia fenotypów starzenia się komórek RPE in vivo związanych z akumulacją słabo strawionego utlenionego POS23-28. Generacja komórek RPE pochodzących z komórek macierzystych zainicjowała nowe zastosowanie izolowanych POS, które są wykorzystywane do udowodnienia funkcjonalności komórek przed ich przeszczepieniem zwierzętom lub pacjentom29,30,27.
Po raz pierwszy opisany przez Moldaya i współpracowników w 198731 roku, protokół izolacji bydła POS łączy etap ultrawirowania homogenatów siatkówki na ciągłych gradientach sacharozy z obserwacją charakterystycznego pomarańczowego wyglądu niebielonego fotopigmentu siatkówki (przenoszącego 11-cis siatkówki). W ciągu ostatnich 10 lat, ze względu na środki ostrożności podjęte w celu zminimalizowania ryzyka choroby szalonych krów, stosowanie oczu świń stało się coraz bardziej widoczne. Opisany tutaj protokół pokazuje, jak uzyskać duże ilości POS z oczu świń lub bydła, które mogą być porcjowane i przechowywane przez dłuższy czas. Eliminuje to konieczność przygotowania POS z oczu gryzoni, co wymaga użycia dużej liczby zwierząt na przygotowanie i test POS32,33,21,22. Ponadto podano szczegółowe informacje na temat etykietowania POS przed przechowywaniem przy użyciu cząsteczek fluorescencyjnych, aby określić ilościowo i wizualizować POS w uproszczony i porównywalny sposób dla niektórych zastosowań w porównaniu z etykietowaniem POS po teście fagocytozy32,10. Dlatego te duże zapasy pozwalają na powtarzalność i łatwość użycia w wielu różnych typach eksperymentów.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Specyficzny materiał/Wyposażenie</td></tr><tr><td>2 Ekspres</td><td></td><td></td> gradientowy <td>do komór Gradient z komorami 30 ml Rurki</td></tr><tr><td></td><td></td><td>silikonowe o średnicy 3 mm</td><td>do odlewania gradientowego</td></tr><tr><td>Mały rozmiar mieszadła</td><td></td><td></td><td>magnetycznego Mieszadło pasujące do komory gradientu Czerwona</td></tr><tr><td>lampa</td><td></td><td></td> safelight <td>Lampa inaktyniczna do preparacji w ciemne</td></tr><tr><td>probówki Ultra Clear 25 x 89 cm</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>Probówki do ultrawirówek</td></tr><tr><td>PP Dąb Probówki kalenicowe</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050</td><td>Probówki wirówkowe 30 ml</td></tr><tr><td>Optima LE-80K</td><td>Ultrawirówka Beckman Coulter</td><td>365668</td><td>SW</td></tr><tr><td>32Ti Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369694</td><td>Rotor obrotu do ultrawirówki</td></tr><tr><td>Avanti J-26 XP</td><td></td><td>Wirówka</td>do <td>393124</td> Beckman Coulter</tr><tr><td>JA-25.50 Rotor</td><td>363058 redlic Beckman do</td><td></td><td>wirówki Avanti J-26 XP</td></tr><tr><td>FITC Isomer I</td><td>Life Technologies</td><td>F-1906</td><td>Barwnik</td></tr><tr> fluorescencyjny<td colspan="4">Inne materiały/urządzenia</td></tr><tr><td>Komora liczenia (np. Neubauer lub Malassez)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciemne wiadra na lód z pokrywkami</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wagi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne i drążek</td><td></td><td></td><td></td>podtrzymujący</tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td></td><td></td><td></td>chłodnicza</tr><tr><td>37 &deg; C łaźnia</td><td></td><td></td><td></td> wodna-80</tr> <tr><td>&deg; C zamrażarka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Fartuch</td><td></td><td></td> laboratoryjny <td>Bezpieczeństwo i higiena pracy</td></tr><tr><td>Rękawice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ochraniacze rękawów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Gogle</td></tr><tr><td>Wkładki</td><td></td><td></td><td></td>chłonne</tr><tr><td>Worki i kosze</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>na śmieci Biohazard<td>Ostrza Weck-Prep</td><td>Rozwarstwianie</td><td></td><td>Ostrza maszynki do golenia o szerokości 60 mm/2,25 cala Plastikowe</td></tr><tr><td>naczynie</td><td></td><td></td><td></td>15 cm</tr><tr><td>Sterylne arkusze</td><td></td><td></td><td></td>gazy</tr><tr><td>Probówki 15 i 50 ml Typowe</td><td></td><td></td><td>materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Mikroprobówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Folia</td><td></td><td></td><td></td> aluminiowa</tr></tbody></table>

oczyszczanie na dużą skalę zewnętrznych segmentów fotoreceptorów świń lub bydła do oznaczania fagocytozy na komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Analiza jednej z istotnych funkcji komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), fagocytoza zużytych starych dystalnych fragmentów zewnętrznych segmentów fotoreceptorów (POS) może być przeprowadzona in vitro. Zewnętrzne segmenty fotoreceptorów ze stosami błoniastych dysków zawierających maszynerię fototransdukcji są stale odnawiane w siatkówce. Zużyte punkty sprzedaży są codziennie eliminowane przez komórki RPE. Komórki RPE gryzoni, świń/bydła i ludzi rozpoznają POS różnych gatunków w podobny sposób. Aby ułatwić przeprowadzanie dużych serii eksperymentów o niewielkiej zmienności, duży zapas POS można wyizolować z oczu świń i przechowywać w postaci zamrożonej w porcjach. Protokół ten wykorzystuje cechę fotopigmentów, które mają pomarańczowy kolor, gdy są przechowywane w ciemności. W przyćmionym czerwonym świetle siatkówki są zbierane w buforze z otwartych muszli ocznych przeciętych na pół. Zawiesina komórek siatkówki jest homogenizowana, filtrowana i ładowana do ciągłego gradientu sacharozy. Po odwirowaniu POS znajdują się w dyskretnym paśmie w górnej części gradientu, który ma charakterystyczny pomarańczowy kolor. POS są następnie zbierane, wirowane, ponownie zawieszane sekwencyjnie w myjących, zliczane i porcjowane. Uzyskany w ten sposób POS może być wykorzystany do oznaczania fagocytozy i analizy aktywacji, lokalizacji lub interakcji białek w różnych momentach po prowokacji POS. Alternatywnie, POS może być oznaczony fluoroforami, e. g., FITC, przed podaniem w celu późniejszego ilościowego określenia fluorescencji wiązania lub pochłaniania POS. Inne możliwe zastosowania obejmują wykorzystanie zmodyfikowanego POS lub prowokacji POS w połączeniu z warunkami stresowymi w celu zbadania wpływu stresu oksydacyjnego lub starzenia się na komórki RPE.

Połączenie liniowego gradientu sacharozy i ultrawirowania umożliwia rozdzielenie różnych składników zawiesiny siatkówki w zależności od ich gęstości. Cięższe, większe zanieczyszczenia siatkówki oraz komórki RPE opadają na dno lub w okolice dna gradientu (Rysunek 2A). Lżejsze POS oraz lżejsze pojedyncze komórki lub fragmenty komórek siatkówki migrują w postaci oddzielnych prążków, osiągając górną połowę gradientu pod koniec procesu wirowania. Dzięki przechowywaniu oczu i próbek w ciemności aż do zakończen...

Ten artykuł opisuje protokół oczyszczania fragmentów zewnętrznych segmentów fotoreceptorów (POS) poprzez ultrawirowanie z siatkówki świni/bydła przy użyciu homogenizacji i wirowania w gradionym smaku sacharozy. Protokół ten pozwala na przygotowanie dużych zapasów porcji POS, oznakowanych lub nieoznakowanych, które mogą być następnie przechowywane w temperaturze -80 °C.

Oczyszczanie na dużą skalę zewnętrznych segmentów fotoreceptorów świń lub bydła do oznaczania fagocytozy na komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie na dużą skalę zapasów zewnętrznych segmentów fotoreceptorów, oczyszczonych ze znaku wojennego lub oczu bydlęcych. Badanie jednej z najważniejszych funkcji barwnika siatkówki, komórek nabłonkowych, ich rytmicznej dziennej aktywności kwasu OC. Osiąga się to poprzez pierwsze odlanie gradientów od 25 do 60% sacharozy w probówkach ultrawirówek.Następnie wycina się oczy świń lub bydła, a Rey są zbierane i homogenizowane. Następnie re są filtrowane i ładowane do gradientu sacharozy i odwirowywane w celu oddzielenia zewnętrznych segmentów fotoreceptora. Na koniec, pomarańczowa wstęga zawierająca zewnętrzne segmenty fotoreceptora jest albo zbierana w podwielokrotności przechowywana bez zmian, albo oznaczana przed Ali, cytując i przechowując.Ostatecznie zautomatyzowane skanowanie fluorescencyjne, mikroskopia fluorescencyjna lub immunoblotting są wykorzystywane do badania aktywności fagocytarnej linii komórkowych, zróżnicowanych komórek pochodzących z komórek macierzystych lub kultur pierwotnych w różnych warunkach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z izolacją segmentów automatycznych od masy lub oczu dla każdego eksperymentu jest to, że ta sama pula materiału może być użyta do kilku eksperymentów, co pozwala na wyższy stopień odtwarzalności. Wizualna demonstracja tej metody jest praktyczna, ponieważ krytycznym krokiem jest odlewanie jonów, ponieważ warunkuje ona zakres izolowanych segmentów zewnętrznych.Procedurę zademonstruje Celia Parino, doktorantka i zadowolona technik z mojego laboratorium Po uzyskaniu 80 świeżych oczu świni lub krowy zgodnie z protokołem tekstowym, trzymaj je w ciemności i schłodzone na lodzie tak bardzo, jak to możliwe. Aby uniknąć fotograficznego wybielania pigmentów wizualnych i utraty pomarańczowo-różowego koloru ustawionego na ławce, czerwona bezpieczna lampa świetlna pochłania wkładki i chusteczki. Przygotuj 15-centymetrowe naczynie, worki na zagrożenia biologiczne do zbierania odpadów i żyletki.Po przygotowaniu wszystkich roztworów, zgodnie z protokołem tekstowym, należy je wstępnie schłodzić i utrzymywać w chłodzie podczas wszystkich etapów. Ustabilizować gradient na magnetycznej płytce mieszającej i włożyć mieszadło do komory znajdującej się najbliżej wyjścia, do którego zostanie wlany 60% roztwór. Użyj końcówki pipety P 200 umieszczonej na wyjściu rurki, aby uzyskać odpowiednią prędkość odlewania z 12 mililitrami każdego 25% i 60% roztworu sacharozy.Mieszając 60% roztwór, odlej liniowy gradient sacharozy do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej, utrzymując otwór końcówki pipety na powierzchni stale rosnącego roztworu gradientowego. Aby przeprowadzić pobieranie tkanek, noś ciasno przylegający fartuch laboratoryjny, rękawice, ochraniacze rękawów i gogle w słabym czerwonym świetle, trzymając oko w jednej ręce z odwróconą powierzchnią cięcia, użyj krawędzi żyletki, aby przekłuć przód oka. Następnie użyj żyletki, aby przeciąć przednią gałkę oczną na dwie połowy.Zdejmij soczewkę i odwróć muszlę oczną na lewą stronę, aby można ją było trzymać na czubku jednego palca. Odsłaniając w ten sposób siatkówkę za pomocą żyletki pod kątem, delikatnie zeskrob siatkówkę, która łatwo się odklei i pojawi się jako różowawa warstwa z powierzchni tężca i przetnie się na głowie nerwu wzrokowego. Przenieś siatkówki do jednej z dwóch do 50 mililitrowych probówek zawierających 15 mililitrów roztworu homogenizacyjnego na lodzie.Po zebraniu wszystkich siatkówek energicznie potrząsać zawiesiną ręcznie przez dwie minuty. Aby zakłócić różne warstwy komórek, oderwij zewnętrzne segmenty fotoreceptora lub POS od reszty fotoreceptorów, podziel POS i homogenizuj zawiesinę siatkówki. Aby usunąć duże fragmenty tkanki, użyj podwójnej warstwy czystej gazy, aby trzykrotnie przefiltrować zawiesinę do 50-mililitrowej probówki.Delikatnie dociśnij gazę, aby uwolnić pozostałe rozdrobnione tkanki. Po każdej filtracji delikatnie połóż surowy preparat siatkówki na sześciu do 24 mililitrach, gradientach od 25 do 60% sacharozy. Po zbalansowaniu probówek Ultra wirować w temperaturze 106 000 G przez 50 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po zakończeniu wirowania odessaj większość roztworu powyżej pomarańczowo-różowego pasma w górnej jednej trzeciej gradientu. Następnie za pomocą końcówki P 1000 zbierz pomarańczowo-różową opaskę do zlewki. Użyj około czterech do pięciu objętości myjki, aby rozcieńczyć roztwór i podzielić na tyle 30 mililitrowych probówek, ile potrzeba.Wirować w temperaturze 3000 GS przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ostrożnie wyrzucić supernatant. Następnie przepłucz dwa roztwory reus, zawieś granulki przed ponownym wirowaniem. Użyj roztworu do mycia trzech roztworów, aby umyć granulki.Trzeci raz. Aby podzielić POS. Użyj od 10 do 20 mililitrów DMM do ponownego zawieszenia komórek.Następnie użyj 490 mikrolitrów DMM do rozcieńczenia 10 mikrolitrów ogniw i ponownie oblicz wydajność i stężenie cząstek POS na mililitr. Zdecyduj o końcowej objętości DMM i dodaj sacharozę do końcowego stężenia 2,5%Przygotuj żądane porcje. Wirować pojedynczą porcję w temperaturze 2 300 GS przez trzy do pięciu minut w temperaturze pokojowej.Oceń wielkość granulek i przygotuj różne podwielokrotne objętości, aby uniknąć rozmrażania przez zamrażanie więcej niż jeden raz. Aby oznaczyć komórki przed mocowaniem Eloqua. Użyj 0,1-molowego buforu węglanu sodu, aby ponownie zawiesić jedną 10-miligramową fiolkę ZI do stężenia 2,5 miligrama na mililitr.Obracaj przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności i wiruj z maksymalną prędkością przez pięć minut, aby osadzać pozostałe ciała stałe ZI. Używając 10 mililitrów roztworu do mycia trzech lub dmm, ponownie zawieś granulkę POS i dodaj dwa mililitry roztworu Fite na 80 oczu. Użyj folii aluminiowej, aby chronić przed światłem i obracaj przez co najmniej 1,5 godziny.W temperaturze pokojowej. Użyj roztworu do płukania trzech, aby umyć komórki dwukrotnie, jak opisano wcześniej w filmie, a następnie DM EM jeden do dwóch razy, aż w supernatancie nie będzie prawie widać wolnego pasowania. Użyj DM EM, aby ponownie zawiesić POS i policzyć kwaty podobną do nieoznaczonego POS, jak pokazano tutaj.Utrzymując oczy i próbki w ciemności do momentu zakończenia etapu wirowania, zakaz gradientu sacharozy zawierający POS można natychmiast rozpoznać po jego jasnopomarańczowym kolorze. A jeśli są uszkodzone, będą wyglądać jak znacznie mniejsze kawałki, trochę jak zakurzone tło. Zazwyczaj, po odpowiednim odizolowaniu, POS powinien wydawać się wydłużony, prosty lub wygięty.Obserwowane pod mikroskopem, w zależności od płaszczyzny ostrości mikroskopu, mogą wydawać się ciemne lub błyszczące. Jeśli nie zostaną odpowiednio zawieszone, pozostaną w kępach. Izolowane POS służą do bezpośredniego testowania zdolności fagocytarnych zmutowanych komórek RPE.W tym przykładzie POS są łatwo fagocytozą przez pierwotne komórki RPE od myszy typu dzikiego, podczas gdy komórki z myszy beta pięć integryny i MFG osiem nokautują mniej POS w tym samym czasie. Kwantyfikacja fagocytozy POS może być przeprowadzona albo przez ręczne liczenie POS oznaczonych FSE na zdjęciach mikroskopowych, mierząc intensywność fluorescencji, albo przez cytometrię przepływową po trypsynie komórkowym. Rysunek ten analizuje rekrutację białek za pomocą immunofluorescencji, testów kolokalizacji, a rekrutację lub aktywację białek można zwalidować na blokach immunologicznych po immunoprecypitacji lub poprzez sprawdzenie fosforylacji Po jej rozwojeniu.Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się fagocytozą za pośrednictwem sejiny fosforanowej do zbadania i scharakteryzowania maszynerii molekularnej w komórkach płatków barwnikowych siatkówki oraz porównania wyników z innymi komórkami fagocytarnymi, takimi jak makrofagi.

large-scale-purification-porcine-or-bovine-photoreceptor-outer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie opisujemy technikę izolowania komórek nabłonka tęczówki i barwnika siatkówki z oczu świń w celu uzyskania ich pierwotnych kultur do badań in vivo i ex vivo. Te komórki pigmentowe mogą być genetycznie modyfikowane w celu zbadania metod regeneracyjnych w leczeniu chorób oczu.

Izolacja komórek IPE i RPE: technika uzyskiwania pigmentowanych komórek nabłonkowych z izolowanego oka świni

Ten film pokazuje procedurę izolacji komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) i komórek nabłonka barwnika tęczówki (IPE) z pobranych oczu bydła. Wyizolowane komórki można hodować w celu zbadania ich roli w leczeniu chorób oczu.

Izolowanie komórek RPE i IPE z oka bydła: procedura zbierania i hodowli pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego bydła

Tutaj przedstawiono protokół izolacji i transfekcji pierwotnych komórek nabłonka tęczówki i barwnika siatkówki od różnych ssaków (myszy, szczury, króliki, świnie i bydło). Metoda ta idealnie nadaje się do badania podejść do ocznej terapii genowej w różnych konfiguracjach do analiz ex vivo i badań in vivo, które można przenieść na ludzi.

Izolacja, hodowla i inżynieria genetyczna pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego ssaków do niewirusowej terapii genowej

Ten protokół, który pierwotnie został zgłoszony przez Fernandez-Godino et al. w 2016 roku1, opisuje metodę efektywnego izolowania i hodowli mysich komórek RPE, które tworzą funkcjonalną i spolaryzowaną monowarstwę RPE w ciągu jednego tygodnia na płytkach Transwell. Zabieg trwa około 3 godzin.

Skuteczna dyssekcja i hodowla pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Ten protokół przedstawia dwie techniki izolowania subkomórkowych przedziałów fotoreceptorów mysich pręcików do analizy białek. Pierwsza metoda wykorzystuje żywe siatkówki i celulozową bibułę filtracyjną do oddzielenia zewnętrznych segmentów pręcika, podczas gdy druga wykorzystuje liofilizowane siatkówki i taśmę klejącą do odklejania wewnętrznych i zewnętrznych warstw segmentów pręcika.

Dwie metody peelingu do izolacji przedziałów komórek fotoreceptorowych w siatkówce myszy w celu analizy białek

Ten manuskrypt opisuje uproszczony protokół stopniowej izolacji komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z oczu myszy. Protokół obejmuje wyłuszczenie i sekcję oczu myszy, a następnie izolację, wysiew i hodowlę komórek RPE.

Izolacja pierwotnych komórek barwnikowego nabłonka siatkówki myszy

Tutaj prezentowana jest łatwa do naśladowania metoda hodowli pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świni in vitro.

Pierwotna hodowla komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świń

Opisujemy prostą i skuteczną metodę izolowania komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od oczu młodych pigmentowanych świnek morskich. Procedura ta pozwala na dalsze badania biologii molekularnej wyizolowanego RPE, w tym analizy ekspresji genów.

Izolacja komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z oczu świnki morskiej

Ten protokół opisuje model akumulacji lipofuscyny w wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych kulturach ludzkiego nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) oraz ulepszony test fagocytozy zewnętrznego segmentu (OS) w celu wykrycia całkowitej zdolności ZORE/degradacji OS. Metody te przezwyciężają ograniczenia poprzednich modeli lipofuscyny i klasycznych testów fagocytozy zewnętrznego segmentu z pościgiem impulsowym.

Ulepszone modele lipofuscyny i kwantyfikacja zdolności fagocytozy segmentu zewnętrznego w wysoce spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki

Ten protokół opisuje procedurę pozyskiwania i hodowli pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z lokalnie pozyskiwanych oczu świń. Komórki te służą jako wysokiej jakości alternatywa dla komórek macierzystych i nadają się do badań siatkówki in vitro.

Izolacja pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świń do modelowania in vitro

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) działa jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, promując zdrowie i funkcję typów komórek siatkówki, takich jak fotoreceptory. W tym miejscu opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji i hodowli dorosłego mysiego RPE.

Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy

Poznaj metodę oczyszczania zewnętrznych segmentów fotoreceptorów z siatkówki świń lub bydła przy użyciu ultrawirówki z gradientem sacharozy. Technika umożliwia przygotowanie dużych zapasów POS do badań nad fagocytozą w komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki.

Oczyszczanie na dużą skalę zewnętrznych segmentów fotoreceptorów świń lub bydła do oznaczania fagocytozy na komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki (Wideo) | JoVE Journal

Oczyszczanie na dużą skalę zewnętrznych segmentów fotoreceptorów świń lub bydła do oznaczania fagocytozy na komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki

Przeglądaj więcej filmów