Synergiczne zastosowanie neuronalnych komórek prekursorowych i samoorganizujących się peptydów w eksperymentalnym uszkodzeniu rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym

Ogólnym celem tej procedury jest wprowadzenie modelu klipsa uciskowego stłuczenia szyjki macicy u szczurów oraz protokołu leczenia skojarzonego obejmującego wstrzyknięcie SAP i przeszczep NPC. Najpierw klips do tętniaka umieszcza się wokół rdzenia kręgowego i utrzymuje na miejscu przez jedną minutę. Powoduje to obustronny uraz kompresyjny spowodowany stłuczeniem.

Następnie SAP są wstrzykiwane w epicentrum urazu, NPC są wstrzykiwane natychmiast po wstrzyknięciu SAP. Wprowadza się pompę osmotyczną z cewnikiem podtwardówkowym w celu zapewnienia ciągłego dostarczania czynników wzrostu. Zabieg ten powoduje dostarczenie NPC do uszkodzonego rdzenia kręgowego.

Przeżywalność i wszczepianie NPC jest wspierane przez leczenie skojarzone SAP i czynnikami wzrostu. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii urazowego uszkodzenia rdzenia kręgowego, ponieważ zapewnia ona klinicznie istotny model, który można wykorzystać do badania terapii COMBINATOR opartych na komórkach, które promują regenerację rdzenia kręgowego. Poniższy protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersyteckiej Sieci Zdrowia w Toronto w Kanadzie i jest zgodny z zasadami ustanowionymi w przewodniku dotyczącym opieki i wykorzystywania zwierząt doświadczalnych przygotowanym przez Kanadyjską Radę Opieki nad Zwierzętami.

Wszystkie zabiegi chirurgiczne muszą być wykonywane w sterylnych warunkach przy użyciu sterylnego sprzętu i roztworów, a zgodnie z wytycznymi instytucji i rządu, w procedurze tej wykorzystuje się szczury o wadze od 250 do 270 gramów przed rozpoczęciem zabiegu. W dniu zabiegu należy zapewnić zwierzętom antybiotyki w wodzie do picia przez dwa dni. Po umieszczeniu szczura w komorze anestezjologicznej i wywołaniu znieczulenia 5% fluorem ISO w tlenie jeden do jednego tlenu i podtlenku azotu przez jedną minutę, zmniejsz fluor ISO do 1,8 do 2,2%Nałóż maść lambic na oczy i potwierdź znieczulenie chirurgiczne, wykonując uszczypnięcie łapy.

Następnie umieść szczura na podgrzewanej poduszce i przymocuj głowę do ramy stereotaktycznej ze stożkiem nosowym. Po zgoleniu sierści wokół kręgosłupa szyjnego zdezynfekuj skórę, pobierając wymaz z jodem powidonu, a następnie 70% etanolem po wykonaniu nacięcia w linii środkowej od okolicy C dwóch kręgów szyjnych do wydatnego wyrostka trzonu kręgu piersiowego T dwa. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć zewnętrzną warstwę mięśni kręgowych bezpośrednio na linii środkowej w kierunku rozpieszczania czaszki, użyj nożyczek chirurgicznych, aby stępić głębsze warstwy mięśni, aż do osiągnięcia wyrostka, osis i laminatu.

Włóż kątomierze i przytrzymaj. Otwórz warstwy mięśniowe, a następnie zorientuj wydatną wyrostek trzonu kręgu T i zidentyfikuj docelowe poziomy laminektomii. Następnie użyj skalpela numer 15, aby przeciąć warstwę więzadła, aby poluzować lamini i processis posis.

Następnie użyj maszynki do strzyżenia kości, aby przeciąć lamini boczną do rdzenia kręgowego i delikatnie usuń lamini bez uciskania rdzenia kręgowego. Teraz poświęć chwilę na zidentyfikowanie pojawiających się korzeni nerwowych, aby oszczędzić im przycinania. Następnie za pomocą haczyka poluzuj oponę twardą brzuszną od grzbietowej strony trzonów kręgów i przygotuj korytarz dla klipsa.

Upewnij się, że sprężyna pierścieniowa zacisku jest ustawiona tak, aby dostarczała żądaną siłę. Siła zacisku określa zakres urazu i ściskania. Włóż otwarty zacisk wokół rdzenia kręgowego i pozwól mu się zatrzasnąć, aby wywołać kontuzję.

Często stosuje się siły zacisku od 15 do 35 gramów, a czas przycinania wynosi jedną minutę po wykonaniu urazu rdzenia kręgowego. Zdejmij klips i zamknij mięśnie w dwóch warstwach, a następnie zamknij skórę. Po prawidłowym zamknięciu rany przerwij znieczulenie i obserwuj szczura, gdy się budzi.

Po tym, jak zwierzę odzyska wystarczającą przytomność do mostka, leżąc, umieść szczura w czystej klatce. Ze względu na ciężkość tego typu urazów konieczne jest przestrzeganie następujących zabiegów pooperacyjnych. Po pierwsze, należy podawać leki przeciwbólowe, takie jak buprenorfina i meloksykam, przez trzy do pięciu dni, w zależności od objawów.

Zapobiegaj również odwodnieniu podskórnie. Wstrzykiwanie od pięciu do 10 mililitrów soli fizjologicznej dwa razy dziennie przez trzy dni i kontynuowanie podawania antybiotyków w wodzie pitnej przez pięć dni. Po operacji. Ściskaj pęcherz moczowy dwa do trzech razy dziennie, aż konsekwentne odzyskiwanie funkcji pęcherza będzie widoczne, nawet po tym, jak zwierzęta wydają się wyleczone.

Należy obserwować operowane zwierzęta pod kątem deficytów neurologicznych i stanu fizjologicznego. Iniekcję wykonuje się 14 dni po urazie rdzenia kręgowego. Przed rozpoczęciem operacji należy przygotować SAP w stężeniu 1% masy na objętość w sterylnej wodzie i napełnić szklaną kapilarnę o grubości 100 mikrometrów przymocowaną do strzykawki Hamiltona.

Za pomocą roztworu przymocuj strzykawkę Hamiltona do ramy stereotaktycznej. Po znieczuleniu szczur umieszcza głowę w ramce stereotaktycznej i dezynfekuje miejsce operacji jodowidonem i 70% alkoholem. Tak jak poprzednio, jeszcze raz, po otwarciu skóry, ostrożnie wypreparuj parę mięśni kręgowych i włóż retraktory.

Użyj skalpela numer 15, aby usunąć tkankę bliznowatą z opony twardej i ponownie odsłonić miejsce zmiany. Następnie użyj końcówki ostrej igły, aby ostrożnie otworzyć oponę twardą. Na koniec, stereotaktycznie, wprowadź szklaną kapilarnę na głębokość dwóch milimetrów do uszkodzonego rdzenia kręgowego i wstrzyknij SAP.

Po wstrzyknięciu SAPs należy pozostawić naczynia włosowate w miejscu wstrzyknięcia przez jedną minutę przed usunięciem, aby umożliwić rozciągnięcie tkanki w celu dostosowania się do wstrzykniętego roztworu. Następnie powtórzyć wstrzyknięcie w następnym miejscu. W tym przypadku NPC zostały wyizolowane ze strefy przykomorowej dorosłej myszy czerwonej DS i hodowane zgodnie z wcześniej opublikowanymi procedurami.

Tuż przed mikroiniekcją rozcieńczyć NPC w pożywce wzrostowej do stężenia 50 razy 10 do trzeciej żywej komórki na mikrolitr do przeszczepu komórek i załadować do szklanej kapilary na strzykawce Hamiltona. NPC są wstrzykiwane natychmiast po wstrzyknięciu SAP-ów. W tym celu należy umieścić szklaną kapilarnę strzykawki Hamiltona w odległości 0,2 milimetra od miejsca urazu i 1,5 milimetra poniżej grzbietowej powierzchni rdzenia kręgowego.

Wstrzyknąć dwa mikrolitry zawiesiny komórkowej w tempie około 0,5 mikrolitra na minutę. Po zakończeniu pierwszego wstrzyknięcia należy pozostawić naczynia włosowate w rdzeniu kręgowym przez jedną minutę, tak jak poprzednio, a następnie wycofać naczynia włosowate, przenieść je w sąsiednie miejsce i powtórzyć procedurę wstrzyknięcia. Po odczekaniu minuty, tak jak poprzednio, cofnij kapilę i przesuń ją o dwa milimetry do miejsca urazu.

Wykonaj dwa wstrzyknięcia po dwa mikrolitry w tym miejscu. Ten obraz pokazuje wszystkie miejsca wstrzyknięć w stosunku do urazu rdzenia kręgowego. Implantacja podtwardówkowych mini pomp osmotycznych w celu wsparcia czynnika wzrostu wykonywana jest bezpośrednio po iniekcjach NPC.

Najpierw wybierz miejsce implantacji. Preferowanymi miejscami są boczne boki okolicy piersiowo-brzusznej, aby uniknąć dyskomfortu spowodowanego przez samą pompę. Po zdezynfekowaniu obszaru, tak jak poprzednio, przygotowuje się wgłębienie podskórne dla pompy.

Następnie należy wykonać laminektomię górnego lub dolnego kręgu przylegającego do urazu rdzenia kręgowego. W tym przypadku uraz rdzenia kręgowego został wykonany w C 7 T jeden, a więc laminektomia jest wykonywana w C 5. Teraz umieść pompę w wgłębieniu podskórnym, następnie przytnij cewnik na niezbędną długość, a na koniec użyj szwów 6.0, aby przymocować go do pary mięśni kręgowych.

Unikanie przemieszczeń związanych z ruchem. Użyj końcówki ostrej igły, aby otworzyć oponę twardą poniżej laminektomii. Następnie wprowadź cewnik do przestrzeni podtwardówkowej i pozwól mu przesuwać się w kierunku rozpieszczania bez oporu i bez uszkadzania pępowiny.

Teraz sprawdź, czy cewnik działa płynnie i nie ma żadnych załamań ani fałd, jak pokazano tutaj. Następnie zamknij mięśnie warstwa po warstwie za pomocą szwów lub klipsów, a następnie zamknij skórę. Po prawidłowym zamknięciu rany przerwij znieczulenie i obserwuj zwierzę, gdy się budzi.

Po tym, jak zwierzę odzyska wystarczającą przytomność do leżenia mostka, umieść szczura w czystej klatce. Należy przestrzegać wszystkich procedur leczenia pooperacyjnego, w tym monitorowania zwierzęcia i analgezji pooperacyjnej. Leczenie immunosupresyjne należy podawać odpowiednio dwa dni przed wstrzyknięciem NPC i do siedmiu dni po przeszczepieniu i do momentu uśmiercenia.

Ten obraz z mikroskopii fluorescencyjnej pokazuje podłużny przekrój uszkodzonego rdzenia kręgowego szczura. Barwienie to fluorescencyjne SAP DPI oznaczone QL six. Plamistości wydają się zielone i agregują się w epicentrum zmiany.

Wstrzyknięte czerwone NPC DS dyfundują w kierunkach rostralnym i rozpieszczanym wskazanym przez czerwoną fluorescencję. Pasek skali reprezentuje pięć milimetrów. Tutaj obraz ze skaningowego mikroskopu elektronowego pokazuje tworzenie się rusztowania z nanowłókien ze zmontowanych SAP.

Podziałka skali reprezentuje jeden mikrometr. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć procedury chirurgiczne związane z kompresją klipsów, SCI oraz to, jak obiecujące podejście do leczenia skojarzonego z SAP i NPC może być badane w tym modelu.