Oczyszczanie nieczystości: sekwencjonowanie metagenomów i metatranskryptomów ze złożonych próbek związanych ze zwierzętami

Ogólnym celem tej procedury jest zebranie i przetworzenie złożonych próbek związanych z gospodarzem, takich jak plwocina mukowiscydoza, w celu zbadania społeczności wirusowych i drobnoustrojów przy użyciu podejść metagenomicznych i metatranskryptomicznych. Osiąga się to poprzez najpierw wdychanie 7% hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej za pomocą nebulizatora, a następnie pobieranie próbek indukowanej plwociny przez 30 minut. Następnie próbka jest natychmiast homogenizowana i równomiernie rozprowadzana w czterech probówkach oznaczonych jako metagenom wirusowy, metagenom drobnoustrojów, metatranskryptom i dodatkowa plwocina.

Następnie probówkę metatranskryptomu zamyka się, umieszcza poziomo, a plwocinę homogenizuje się ze średnią prędkością przez 10 minut. Na koniec poszczególne podwielokrotności są przetwarzane oddzielnie w celu wyizolowania i oczyszczenia komórek wirusowych lub bakteryjnych przed izolacją kwasów nukleinowych do badań metagenomicznych. Ostatecznie wyizolowane kwasy nukleinowe są wykorzystywane do przygotowania biblioteki sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w celu wygenerowania bibliotek metagenomiki i metatranskryptomiki.

Główną zaletą tej procedury jest to, że zapewnia ona kompleksowy przepływ pracy do przetwarzania złożonej próbki związanej z gospodarzem w celu badania społeczności wirusowych i bakteryjnych na poziomie DNA i RNA. Wizualna demonstracja tej procedury ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy wstępnej obróbki próbki są ważne, aby zapewnić prawidłowe obchodzenie się z próbką, podczas gdy etapy oczyszczania komórek wirusowych i mikrobiologicznych są trudne do nauczenia Ze względu na złożoność procedury Przed pobraniem próbki oznacz cztery 15-mililitrowe probówki na próbkę następującymi elementami, pierwsza z metagenomem wirusowym, drugi jako metagenom drobnoustrojów numer trzy z metatranskryptomem i rurką numer cztery jako dodatkową plwociną. Dodaj dwa mililitry 0,1 milimetra kulek krzemionki do probówki oznaczonej metatranskryptomem, a następnie sześć mililitrów buforu do lizy RNA na bazie izotiocyjanianu gwinei lub buforu do lizy GITC.

Postępując zgodnie z procedurą pobierania próbki opisaną w protokole tekstowym i przy użyciu kubków na próbki przed brodzeniem, należy oszacować objętość próbki, ważąc kubek po pobraniu próbki i odjąć masę pustego kubka. W przypadku pozostałej masy jeden gram będzie odpowiadał jednemu mililitrowi próbki. Jeśli objętość próbki jest mniejsza niż osiem mililitrów, dodaj odpowiednią objętość 0,02 mikrometra przefiltrowaną przez jeden XPBS, aby uzyskać końcową objętość do ośmiu mililitrów.

Następnie natychmiast użyj trzymililitrowej strzykawki do homogenizacji próbki, aż w plwocinie nie pozostaną żadne widoczne grudki, za pomocą tej samej strzykawki natychmiast pobrać dwa mililitry plwociny i wstrzyknąć ją do probówki mikrotranskryptomicznej zawierającej kulki krzemionkowe i bufor do lizy GITC. Zamknij pokrywkę i użyj folii para, aby bezpiecznie uszczelnić pokrywę Aby uniknąć wycieku, użyj wiru, proszę pana, aby natychmiast homogenizować plwocinę ze średnią prędkością przez 10 minut. Za pomocą tej samej podwielokrotności strzykawki należy umieścić po dwa mililitry plwociny w probówkach oznaczonych metagenomem wirusa i metagenomem drobnoustrojów, a pozostałą plwocinę przenieść z kubka na plwocinę do probówki z dodatkową plwociną.

Przechowuj wszystkie probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub na lodzie i w razie potrzeby transportuj do laboratorium w celu wygenerowania metagenomu wirusa. Po przygotowaniu i roztworów. Próbki należy poddać wstępnej obróbce, dodając 0,02 mikrometra przefiltrowanego buforu soli fizjologicznej do całkowitej objętości sześciu mililitrów.

Aby wspomóc rozpuszczanie śluzu, dodaj sześć mililitrów 6,5 milimola DTT do każdej próbki. Energicznie wirować, mieszać i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po energicznym wirowaniu próbki ponownie wirują w temperaturze 3056 g i 10 stopni Celsjusza przez 15 do 20 minut.

Zbierz każdy supernatant do nowej 15-mililitrowej probówki. Następnie użyj 45-milimetrowego filtra mikrometrycznego zamontowanego na strzykawce, aby przefiltrować supernatanty do nowych 15-mililitrowych probówek. Usunąć 100 mikrolitrów próbki do mikroprobówki fuge, a następnie przeprowadzić obróbkę chloroformem.

Wyekstrahować supernatant i wykonać zabieg DN one. Dodać równą objętość 4% para formaldehydu, aby utrwalić próbkę. W przypadku mikroskopii fluorescencyjnej epi należy zapoznać się z protokołem tekstowym, aby uzyskać kompleksowe podejście do wzbogacania cząstek wirusa.

W przeciwnym razie, używając świeżo przygotowanych roztworów chlorku cezu, ustaw gradient chlorku cezu, ładując jeden mililitr 1,7 grama na mililitr roztworu chlorku cezu do każdej probówki, a następnie jeden mililitr 1,5 grama na mililitr, jeden mililitr jednego punktu 35 gramów na mililitr, a na koniec jeden mililitr 1,2 grama na mililitr roztworu chlorku cezu. Na koniec załaduj od sześciu do ośmiu mililitrów próbki do pojedynczych probówek gradientowych. Zaznacz poszczególne warstwy, aby wskazać położenie każdej frakcji.

Następnie zrównoważ każdą przeciwstawną parę dwójek z dokładnością do jednego miligrama. Ostrożnie zablokuj każdą rurkę w wiadrze wirującym. Załaduj na wirnik i odwiruj w temperaturze 82, 844 G i czterech stopniach Celsjusza przez dwie godziny.

Po odwirowaniu ostrożnie wyjmij probówki z uchwytu, nie przerywając gradientów gęstości za pomocą igły o rozmiarze 18 dołączonej do trzymililitrowej strzykawki. Upewnij się, że otwarty koniec igły jest skierowany do góry. Przebić probówkę tuż poniżej warstwy o gęstości 1,5 grama na mililitr i powoli wciągnąć około 1,5 mililitra roztworu do strzykawki.

Powoli wyjmij igłę i pozwól, aby pozostała frakcja w tubce spłynęła do nowej 15-mililitrowej probówki przez nakłucie. Oznacz to jako górna frakcja talii Przenieś roztwór w strzykawce zawierającej V ps do dwóch nowych mikroprobówek fuge. Po przygotowaniu i roztworów, zgodnie z protokołem tekstowym, dodać pięć objętości punktu 22 mikrometra przefiltrowanego jeden XPBS Aby rozcieńczyć każdy homogenat pod kapturem chemicznym, dodać beta MAR capta etanol do końcowego stężenia 2% objętości do objętości i wstrząsnąć mieszaniną w temperaturze pokojowej przez dwie godziny po inkubacji.

Wirować próbkę w temperaturze 3056 GS i 10 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po odrzuceniu supernatantu użyj 10 mililitrów wody molekularnej do ponownego zawieszenia osadu i inkubacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut przed powtórzeniem prania. Po ostatnim zawirowaniu i po wyrzuceniu natiny SUP użyj pięciu mililitrów jednego bufora XDNA, aby ponownie zawiesić granulkę przed dodaniem 15 mikrolitrów ds.

Jeden na mililitr próbki Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wielokrotnym mieszaniem przez dwie godziny. Po odwirowaniu próbek i wyrzuceniu snat, użyj 10 mililitrów buforu SE do ponownego zawieszenia osadu. Następnie odwiruj próbkę i powtórz pranie.

Użyj dwóch mililitrów bufora SE do ponownego zawieszenia granulatu i przenieś zawiesinę do dwóch mikro probówek fuge. Następnie wiruj probówki w temperaturze 16 000 GS w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Na koniec, po usunięciu supernatantu, użyj zestawu do ekstrakcji genomowego DNA, postępując zgodnie z instrukcjami dla bakterii Gram-dodatnich.

Aby wyizolować DNA, poprzednie wyniki w celu wygenerowania metagenomów wirusowych są podsumowane tutaj. Wiromy zawierają niewiele sekwencji pochodzenia ludzkiego, przy czym tylko jedna próbka zawierająca 70% próbki ludzkiego DNA CCF czwarta A została pominięta na etapie ultrawirowania gradientu gęstości, w wyniku czego zawierała więcej niż 97% sekwencji pochodzących od człowieka. Rysunek ten przedstawia fluorescencyjny obraz typowej próbki plwociny CF przed i po ultrawirowaniu w gradiacji gęstości.

Wyraźne vlp zaobserwowano przy braku dużych cząstek po zaobserwowanej tutaj separacji gradientu gęstości. Siedem próbek plwociny dziennie pobierano od jednego pacjenta z mukowiscydozą, który rozpoczął doustne antybiotyki. Po trzecim dniu od pobrania, całkowita wydajność pochodzącej lizy hipotonicznej lub HL DNA pobranego z każdej próbki wahała się od 210 nanogramów do ponad pięciu mikrogramów z bibliotek sekwencjonowania Illumina wygenerowanych dla każdej próbki.

Wszystkie biblioteki z wyjątkiem jednej dały ponad 1 milion sekwencji, a ponad 85% sekwencji o wysokiej jakości zostało zachowanych po wstępnym przetworzeniu danych. Korzystając z oprogramowania do sekwencjonowania druku, całkowita ilość sekwencji pochodzących od człowieka wahała się od 14% do 46%Jak pokazano tutaj, profile mikrobiologiczne podpróbek są bardzo podobne do próbek po dwóch zabiegach lizy hipotonicznej. Ponadto druga liza hipotoniczna zwiększa frakcję sekwencji innych niż ludzkie o sześć do 17% w metagenomach.

Nie zapominaj, że praca z próbkami klinicznymi i potencjalnymi patogenami może być niezwykle niebezpieczna. Podczas obchodzenia się z próbką należy zawsze używać środków ochrony indywidualnej. Podczas wykonywania tej procedury wymagane są dobre techniki biologii molekularnej i mikrobiologii, aby zapewnić brak zanieczyszczeń.

Po tej procedurze powinno być możliwe wykonanie metagenomicznych badań metagenomicznych wirusów i drobnoustrojów, a także metatranskryptomicznych z próbek złożonych, takich jak plwocina z mukowiscydozy.