Name: Oczyszczanie nieczystości: sekwencjonowanie metagenomów i metatranskryptomów ze złożonych próbek związanych ze zwierzętami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Poznaj kompleksowy workflow do oczyszczania próbek plwociny z mukowiscydozy dla metagenomiki i metatranskryptomiki wirusów oraz bakterii. Ta metoda umożliwia dokładne badanie społeczności mikrobiomowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez Narodowy Instytut Zdrowia (1 R01 GM095384-01) przyznany Forestowi Rohwerowi. Dziękujemy Epicentre, firmie należącej do Illumina, za zapewnienie wczesnego dostępu do zestawów epidemiologicznych Ribo-Zero. Dziękujemy Markowi Hatayowi za zaprojektowanie i wyprodukowanie uchwytu na probówkę do ultrawirówki. Dziękujemy Andreasowi Haasowi i Benjaminowi Knowlesowi za krytyczną lekturę i dyskusję na temat rękopisu, a także Lauren Paul za pomoc w procesie filmowania.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metagenomika wirusowa
Cząsteczki wirusa są zagęszczane za pomocą wytrącania glikolu polietylenowego (PEG) lub koncentratorów o małej objętości. W niektórych przypadkach zatężanie może nie być potrzebne, ale do usunięcia komórek eukariotycznych i drobnoustrojów stosuje się etapy filtracji wstępnej lub wirowania z niską prędkością. Lizaty wirusowe będą dalej wzbogacane i oczyszczane za pomocą ultrawirowania w gradiencie gęstości9,41 lub filtrów o małych rozmiarach (np. 0,45 μm) w celu usunięcia komórek eukariotycznych i dużych komórek drobnoustrojów25. Ultrawirowanie w gradiencie gęstości jest zwykle wykonywane przy użyciu gęstych, ale obojętnych roztworów, takich jak sacharoza lub chlorek cezu, w celu wyizolowania i zagęszczenia cząstek wirusa41. Separacja fizyczna opiera się na wielkości i gęstości wyporu cząstek wirusa. W związku z tym właściwy dobór wielkości porów filtra i rygorystyczne przygotowanie gradientów są niezbędne do wyizolowania określonych społeczności wirusów, ponieważ powodzenie fizycznego odzyskania VLP określa społeczność wyizolowaną41 (tj. cząsteczki wirusa, które nie przechodzą przez filtr lub nie mieszczą się w gęstości ekstrakcji, nie zostaną wykryte w metagenomie). Po wyizolowaniu i zagęszczeniu wirusa w próbce może znajdować się zanieczyszczający niewirusowy materiał genomowy zarówno w postaci wolnych kwasów nukleinowych, jak i komórek drobnoustrojów i komórek eukariotycznych. Dlatego tak ważne jest sprawdzenie czystości cząstek wirusa w próbkach (ryc. 1A i 1B). Leczenie chloroformem jest powszechnie stosowane do lizy pozostałych komórek, a następnie traktowanie nukleazą w celu degradacji wolnych kwasów nukleinowych przed ekstrakcją kwasów nukleinowych.
Zastrzeżeniem do przedstawionego przepływu pracy było zastosowanie separacji gradientu gęstości do izolacji cząstek wirusa, ponieważ może to wykluczyć otoczkowe cząstki wirusa, które mogą być zbyt wyporne, aby dostać się do gradientu CsCl. Alternatywną metodą typu "catch-all" jest pominięcie separacji gradientu gęstości i wyizolowanie DNA zbiorowiska z 0,45 μm – filtratów potraktowanych chloroformem i DNazą I. Takie podejście jest również odpowiednie do uwzględnienia małych objętości próbek, takich jak te z wymazów lub osocza krwi. Może to jednak skutkować zanieczyszczeniem bakteryjnym odpornym na chloroform i większą ilością zewnątrzkomórkowego DNA opornego na DNazę I.
Obecne protokoły sekwencjonowania wymagają od 1 ng do 1 μg kwasów nukleinowych do przygotowania biblioteki sekwencjonowania, przy czym wyższa wydajność DNA zapewnia szerszy wybór opcji sekwencjonowania. Stężenie DNA w generowanych wiromach często waha się od poniżej granicy wykrywalności do ponad 200 ng/μl. Ilość odzyskanych wirusowych kwasów nukleinowych może być niewystarczająca do przygotowania biblioteki sekwencjonowania bezpośredniego. W takich przypadkach niezbędna jest amplifikacja kwasów nukleinowych. Biblioteki amplifikacji linkerowej (LASL)2,42,43 i amplifikacja całego genomu oparta na amplifikacji z wielokrotnym przemieszczeniem (MDA) to dwie metody najczęściej stosowane do generowania wystarczającej ilości DNA do sekwencjonowania. Wiadomo, że metody MDA, takie jak te oparte na polimerazie DNA Phi29, cierpią na błędy amplifikacji i mogą preferencyjnie amplifikować ssDNA i koliste DNA, co skutkuje nieilościową charakterystyką taksonomiczną i funkcjonalną44,45. Wykazano, że zoptymalizowana wersja podejścia LASL wprowadza jedynie minimalne odchylenia, promuje wyższą czułość (dla niewielkich ilości materiału wyjściowego) i jest łatwa do dostosowania do różnych platform sekwencjonowania43. Jednak podejście to składa się z wielu etapów, wymaga specjalistycznego sprzętu w celu zminimalizowania utraty DNA i ogranicza się do matryc dsDNA. W naszym laboratorium podejście to zostało z powodzeniem zaadaptowane do amplifikacji wykrywalnej i niewykrywalnej ilości DNA wyekstrahowanego z VLP pochodzących z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, koralowców i wody morskiej (niepublikowane i Hurwitz i wsp.Tamże, s. 46).
Opracowywanie potoków analizy danych było klasycznie jednym z najtrudniejszych aspektów analizy metagenomiki wirusów ze względu na bardzo zróżnicowany i w dużej mierze nieznany charakter społeczności wirusowych. Chociaż szacuje się, że w biosferze występuje 108 genotypów wirusów, do tej pory obecne bazy danych wirusów zawierają ~ 4 000 genomów wirusowych, co stanowi około 1/100 000 tej przybliżonej całkowitej różnorodności wirusów. W związku z tym poszukiwania oparte na podobieństwie (takie jak BLAST47) w celu przypisania taksonomicznego i funkcjonalnego w metagenomach wirusowych wiążą się z nieodłącznymi wyzwaniami. Wiele sekwencji nie wykazuje znaczących podobieństw do genomów w bazie danych i dlatego są klasyfikowane jako nieznane. Mimo że wyszukiwania oparte na homologii są najważniejszymi zastosowaniami do przypisywania taksonomii i funkcji do danych sekwencji, opracowano alternatywne podejścia oparte na analizie niezależnej od bazy danych48-50. Fancello i wsp.51 zawierają pełny przegląd narzędzi obliczeniowych i algorytmów stosowanych w metagenomice wirusów.
Metagenomika mikrobiologiczna
Zazwyczaj całkowita ilość DNA wyekstrahowanego ze zbiorowisk drobnoustrojów poddanych hipotonicznej lizie (HL-DNA) waha się od 20 ng do 5 μg. Wydajność jest w dużym stopniu zależna od stanu zdrowia pacjenta i ilości pobranej próbki plwociny, co wyjaśnia różnice obserwowane w całkowitej wydajności HL-DNA wyekstrahowanego w tym badaniu (Tabela 2). Krytyczne kroki generowania dobrej jakości danych sekwencyjnych zależą od jakości generowanych bibliotek sekwencjonowania. Rysunek 2 przedstawia typowy zakres rozmiarów bibliotek sekwencjonowania wygenerowanych z DNA drobnoustrojów pochodzących z plwociny CF przy użyciu procedury fragmentacji DNA opartej na enzymatyce. Optymalna wielkość biblioteki zależy od wyboru platformy sekwencjonowania i aplikacji, dlatego procedurę fragmentacji można w razie potrzeby zoptymalizować za pomocą alternatywnych podejść, takich jak sonikacja i nebulizacja. Oprócz przedstawionych reprezentatywnych wyników, sukces przedstawionej metody na plwocinie mukowiscydozy pobranej od wielu pacjentów w wielu punktach czasowych zilustrowano również w Lim i wsp. (2012)9 oraz Lim i wsp. (2014)Rozdział 10.
Poprzednie badania9,10 sugerują, że każdy pacjent jest nosicielem unikalnego zestawu społeczności drobnoustrojów, który zmienia się w czasie, odzwierciedlając w ten sposób trwałość głównych graczy w społeczności, podczas gdy wahania są prawdopodobnie spowodowane zaburzeniami, takimi jak leczenie antybiotykami. To, czy fluktuacje te występują codziennie, nawet bez zewnętrznych zakłóceń, czy też z powodu procedury pobierania próbek i przetwarzania próbek, jest nadal wątpliwe. Na podstawie analizy metagenomicznej HL-DNA i amplikonu 16S rDNA, 7-dniowe pobieranie próbek podłużnych pokazuje, że dzienne wahania profili mikrobiologicznych bez zaburzeń antybiotykowych (dzień 1, 2 i 3) były minimalne (ryc. 3A i 3B). Po wprowadzeniu doustnych antybiotyków natychmiast po pobraniu próbek w dniu 3, zmiany w profilu społeczności stały się widoczne w dniu 4. Podczas gdy antybiotyk cyprofloksacyna jest ukierunkowany na szerokie spektrum znanych patogenów bakteryjnych, takich jak P. aeruginosa, Staphylococcus aureus i Streptococcus pneumonia, leczenie zwiększyło względną liczebność P. aeruginosa, jednocześnie zmniejszając Streptococcus spp. i P. melaninogenica. Do dnia 6 społeczność powoli wracała do początkowej struktury społeczności. Wyniki sugerują, że wahania profili mikrobiologicznych u jednego pacjenta są bardziej prawdopodobne z powodu zaburzeń środowiskowych w drogach oddechowych.
Biorąc pod uwagę spójność między profilami mikrobiologicznymi bibliotek 16S rDNA a metagenomami z DNA pochodzącego z HL, wykluczyliśmy odchylenia pochodzące ze starterów 16S rRNA użytych w tym badaniu. Jednym z możliwych wyjaśnień różnic obserwowanych w profilach taksonomicznych 16S rDNA wygenerowanych z całkowitego DNA i DNA pochodzącego z HL (Figura 3B) może być obecność dużych ilości zewnątrzkomórkowego DNA Pseudomonas spp. po leczeniu antybiotykami. Potwierdzają to wyniki, że różnice te były najbardziej widoczne w dniu 7, trzy dni po leczeniu antybiotykami, które są skierowane przeciwko Pseudomonas spp. oprócz innych. Ciprofloksacyna jest powszechnie stosowana jako lek pierwszego rzutu u pacjentów z mukowiscydozą i przewlekłym zakażeniem P. aeruginosa, mimo że jej spektrum działania obejmuje większość patogenów związanych z mukowiscydozą. Postawiliśmy hipotezę, że antybiotykoterapia eliminuje podatne społeczności, w tym Streptococcus spp., tworząc w ten sposób niszę wypełnioną przez oporny P. aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa może uzyskać odporność poprzez zwiększenie swoich zbiorowisk biofilmu, a zewnątrzkomórkowe DNA okazało się być głównym wsparciem strukturalnym architektury biofilmu52. Nawet gdy struktura społeczności się odbudowała, zewnątrzkomórkowe DNA mogło pozostać w plwocinie mukowiscydozy. Dlatego dane te sugerują, że hipotoniczna liza i etapy mycia przedstawione w tym przepływie pracy potencjalnie przynoszą korzyści nie tylko w usuwaniu DNA pochodzącego od człowieka, ale także zewnątrzkomórkowego DNA pochodzącego z drobnoustrojów, które może błędnie przedstawiać rzeczywiste profile mikrobiologiczne.
Metatranskryptomika
Metatranskryptom wysokiej jakości powinien zawierać stosunkowo niewiele sekwencji rybosomalnego RNA (rRNA) i reprezentować bezstronną próbkę transkryptów społeczności (mRNA). Ze względu na krótki okres półtrwania i ograniczoną ilość mRNA, bardzo ważne jest, aby przedstawiony tutaj protokół minimalizował obsługę próbek, aby zmaksymalizować liczbę odzyskanych transkryptów.
W ostatnich latach opracowano kilka podejść do zubożenia rRNA, które zaadaptowano do dostępnych na rynku zestawów. Należą do nich MICROBEnrich, Ribo-Zero i specyficzne dla próbki hybrydyzacjesubtraktywne 53 , które są oparte na hybrydyzacji oligonukleotydowej, oraz zestaw mRNA-ONLY, który opiera się na aktywności enzymatycznej egzonukleazy ukierunkowanej na RNA zawierającą monofosforan 5'. Ponadto dostępnych jest również kilka podejść do wzbogacania mRNA, takich jak zestaw MessageAmp II-Bacteria Kit, który preferencyjnie poliadenyluje i amplifikuje liniowe RNA. Niektóre z tych metod (np. mRNA-ONLY, MICROBExpress i MessageAmp) są stosowane jednocześnie w celu uzyskania optymalnej wydajności. Jednak skuteczność wszystkich tych podejść jest ograniczona, zwłaszcza podczas pracy z częściowo zdegradowanym rRNA, co często obserwuje się w całkowitym RNA wyekstrahowanym z próbek mukowiscydozy. Amplifikacja RNA zależna od poliadenylacji nie może być stosowana do generowania metatranskryptomów składających się zarówno z eukariotycznego, jak i prokariotycznego mRNA. Ponadto, ogon poli(A) dodany do sekwencji może zmniejszyć ilość użytecznych danych sekwencji. Regiony z rozciągnięciem homopolimeru będą miały tendencję do uzyskiwania niższych wyników jakości, co spowoduje, że znaczna liczba odczytów zostanie odfiltrowana przez oprogramowanie do sekwencjonowania i sekwencjonowania, a średnia użyteczna długość odczytu po odcięciu ogonów poli (A) zostanie znacznie zmniejszona54.
Mając do czynienia ze złożonymi zbiorowiskami drobnoustrojów mukowiscydozy i częściowo zdegradowanym RNA (ryc. 4A i 4C), nasze poprzednie badanie wykazało, że metoda hybrydyzacji-wychwytywania za pomocą zestawu Ribo-Zero Gold była bardziej skuteczna w usuwaniu zarówno ludzkiego, jak i mikrobiologicznego rRNA w porównaniu z łączonymi zabiegami przy użyciu innych zestawów9 (Tabela 3). Uzyskane w ten sposób dane pozwalają na jednoczesną analizę zarówno transkryptów ludzkiego gospodarza, jak i mikrobiologicznych. W zależności od wydajności i jakości RNA, a także ostatecznego wyboru platformy sekwencjonowania, wiele z tych procesów, w tym etap syntezy cDNA, można usprawnić dzięki generowaniu biblioteki sekwencjonowania. Na przykład RNA traktowane Ribo-Zero można wykorzystać do tworzenia bibliotek sekwencjonowania metatranskryptomu przy użyciu zestawu ScriptSeq RNA-Seq Library Preparation Kit.
Analiza metagenomiczna społeczności związanych ze zwierzętami zapewnia kompleksową reprezentację ogólnej jednostki funkcjonalnej, która obejmuje gospodarza i powiązane z nim społeczności. Przedstawiony tutaj przepływ pracy można dostosować do różnych złożonych próbek związanych ze zwierzętami, zwłaszcza tych, które zawierają gęsty śluz, duże ilości szczątków komórkowych, zewnątrzkomórkowe DNA, kompleksy białkowe i glikoproteinowe, a także komórki gospodarza oprócz pożądanych cząstek wirusowych i mikrobiologicznych. Mimo że cząsteczki wirusów i drobnoustrojów mogą zostać utracone na każdym kroku, izolacja i oczyszczanie cząstek są niezbędne, aby zminimalizować ilość DNA gospodarza. Podczas gdy dane metagenomiczne dostarczają potencjałów metabolicznych badanych społeczności, metatranskryptomika uzupełnia je, ujawniając różnicową ekspresję zakodowanych funkcji9. Kompleksowa ocena danych genomicznych i transkryptów dostarczyła nowych informacji na temat dynamiki interakcji społeczności i ułatwia opracowanie ulepszonych terapii9,10,55.

Wirusowe i mikrobiologiczne społeczności związane z ludzkim ciałem były intensywnie badane w ciągu ostatniej dekady za pomocą technologii sekwencjonowania1,2. Wyniki doprowadziły do uznania znaczenia mikroorganizmów w zdrowiu i chorobach człowieka. Główna inicjatywa pochodzi z projektu Human Microbiome Project, który opisuje bakterie (i niektóre archeony) żyjące na ludzkiej skórze oraz w jamach ustnych, drogach oddechowych, drogach moczowych i przewodzie pokarmowym3. Dalsze badania mikrobiomu zdrowych ludzkich dróg oddechowych poprzez płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL)4,5 i wymazy z nosogardzieli4 wykazały, że płuca mogą służyć jako urządzenie do pobierania próbek środowiskowych, powodując przejściową kolonizację mikrobiologiczną dróg oddechowych. Jednak wpływ kolonizacji mikrobiologicznej na upośledzone powierzchnie dróg oddechowych może prowadzić do ciężkich i przewlekłych infekcji płuc, takich jak te obserwowane u pacjentów z mukowiscydozą (CF).
mukowiscydoza jest śmiertelną chorobą genetyczną spowodowaną mutacją w genie6 regulatora transbłonowego mukowiscydozy (CFTR). Mutacje te powodują powstawanie wadliwych białek CFTR, które z kolei wpływają na transepiteliczny transport jonów przez wierzchołkową powierzchnię nabłonka. Choroba atakuje wiele układów narządowych, ale większość śmiertelności i zachorowalności można przypisać chorobie płuc związanej z mukowiscydozą7. Płuco mukowiscydozy zapewnia unikalny ekosystem do kolonizacji drobnoustrojów. Defekt transportu jonów powoduje gromadzenie się śluzu w drogach oddechowych mukowiscydozy, tworząc mikrośrodowiska składające się z przedziałów tlenowych, mikroaerofilowych i beztlenowych zakotwiczonych w statycznej, bogatej w składniki odżywcze powierzchni błony śluzowej. Środowisko to ułatwia kolonizację i namnażanie drobnoustrojów, w tym wirusów, bakterii i grzybów. Ostre i przewlekłe infekcje bakteryjne płuc prowadzą do stałych, ale nieskutecznych odpowiedzi immunologicznych, co skutkuje rozległą przebudową dróg oddechowych, utratą pojemności płuc i ostatecznie niewydolnością płuc.
Społeczności bakteryjne związane z płucami z mukowiscydozą zostały dobrze opisane przy użyciu zarówno metod zależnych, jak i niezależnych od hodowli, które obejmują sekwencjonowanie genu 16S rybosomalnego RNA (rRNA)8 i metagenomikę shotgun9,10. Podejście oparte na 16S rRNA jest w stanie scharakteryzować szeroki zakres gatunków drobnoustrojów i uchwycić szerokie zmiany w różnorodności społeczności. Jest jednak ograniczony w swojej rozdzielczości w definiowaniu zbiorowisk (podsumowany w Claesson et al. 201011), a przewidywania potencjałów metabolicznych są ograniczone do tych ogólnych funkcji znanych dla zidentyfikowanych taksonów. W związku z tym metody sekwencjonowania genu 16S rRNA są niewystarczające do uzyskania niezbędnej taksonomicznej i funkcjonalnej dokładności analitycznej różnych społeczności drobnoustrojów obecnych w płucach mukowiscydozy. Opisane tutaj podejście metagenomiczne uzupełnia podejście oparte na 16S rRNA, pokonuje jego ograniczenia i umożliwia stosunkowo skuteczny sposób analizy zarówno taksonomii społeczności drobnoustrojów, jak i zawartości genetycznej w płucach z mukowiscydozą.
Mikrobiologiczne DNA wyizolowane z próbek zwierzęcych często zawiera dużą ilość DNA gospodarza. Próbki plwociny lub tkanki płucnej mukowiscydozy zwykle zawierają dużą ilość ludzkiego DNA uwalnianego przez neutrofile w odpowiedzi immunologicznej, często większą niż 99% całkowitego DNA12-14. Chociaż niektóre nienaruszone komórki ludzkie mogą być obecne, większość tego DNA jest wolna w roztworze lub zaadsorbowana na powierzchni drobnoustrojów. Ponadto obecność wyjątkowo lepkich czopów śluzowych, szczątków komórkowych i innych nieznanych zanieczyszczeń dodatkowo komplikuje izolację komórek drobnoustrojów. Przetestowano kilka metod w celu zubożenia tych próbek ludzkiego DNA, w tym gradienty Percoll do oddzielania komórek ludzkich od mikrobiologicznych15, leczenie DNazą I, monoazydkiem bromku etydyny w celu selektywnej degradacji ludzkiego DNA16 oraz zestaw MolYsis, wszystkie z ograniczonym sukcesem. Do tej pory najskuteczniejszą procedurą oczyszczania mikrobiologicznego DNA z plwociny z mukowiscydozą była modyfikacja procesu opisanego przez Breitensteina i in. (1995)17. Podejście to, znane tutaj jako metoda lizy hipotonicznej (HL), wykorzystuje kombinację β-merkaptoetanolu w celu zmniejszenia wiązań dwusiarczkowych mucyny, hipotonicznej lizy komórek eukariotycznych i leczenia rozpuszczalnego DNA za pomocą DNazyI 9. Pomimo braku alternatyw, metoda HL wzbudziła pewne obawy ze względu na (i) możliwe błędy systematyczne wynikające z niepożądanej lizy drobnoustrojów oraz (ii) to, czy zaobserwowane fluktuacje w składzie społeczności9,10 są artefaktem zmian związanych z przetwarzaniem próbki. Oprócz generowania metagenomów typu shotgun, rozwiązujemy te problemy, porównując profile genów 16S rRNA całkowitego DNA i DNA drobnoustrojów wyekstrahowanych metodą HL przy użyciu tego samego zestawu próbek plwociny pobranych od jednego pacjenta przez siedem kolejnych dni.
W porównaniu do społeczności mikroorganizmów, charakterystyka społeczności wirusowych związanych ze zwierzętami jest ograniczona18,19. Społeczności wirusowe w drogach oddechowych mukowiscydozy zostały scharakteryzowane tylko minimalnie20–22. Pierwsze badanie metagenomiczne charakteryzujące DNA społeczności wirusów w drogach oddechowych mukowiscydozy wykazało, że większość wirusów związanych z płucami mukowiscydozy to fagi20. Potencjał metaboliczny faga u osób z mukowiscydozą i bez mukowiscydozy był znacząco różny. W szczególności społeczności fagów u osób z mukowiscydozą były nosicielami genów odzwierciedlających adaptacje gospodarza bakteryjnego do fizjologii dróg oddechowych mukowiscydozy i zjadliwość bakterii20. Późniejsze badania metagenomiczne wirusów w tkance płucnej mukowiscydozy wykazały wyraźną niejednorodność przestrzenną społeczności wirusowych między regionami anatomicznymi22. Ponadto tkanka płucna mukowiscydozy zawierała najmniejszą różnorodność wirusową zaobserwowaną do tej pory w jakimkolwiek ekosystemie22. Większość zidentyfikowanych wirusów to fagi, które mogą infekować patogeny mukowiscydozy. Jednak wykryto również wirusy eukariotyczne, takie jak herpeswirusy, adenowirusy i wirusy brodawczaka ludzkiego (HPV). W jednym przypadku, w którym podczas sekcji zaobserwowano torbiele w tkance płucnej, odzyskano ponad 99% genomu wirusa brodawczaka ludzkiego, mimo że u pacjenta nigdy nie zdiagnozowano brodawczaka płucnego ani raka. Wskazuje to, że obecna różnorodność wirusów nie tylko odzwierciedla stopień uszkodzenia tkanek, ale może również ujawniać i wyjaśniać leżącą u podstaw niescharakteryzowaną chorobę. Opisane tutaj protokoły zapewniają prosty, ale skuteczny sposób izolowania cząstek wirusopodobnych (VLP) z próbek składających się z dużych ilości gęstego śluzu, komórek gospodarza i drobnoustrojów, wolnego DNA, a także szczątków komórkowych.
Uzupełniając metagenomikę, metatranskryptomika służy do monitorowania dynamiki ekspresji genów w społeczności mikrobiologicznej i gospodarzu9,23. W takim przypadku należy preferencyjnie wybrać mRNA drobnoustrojów, jak i gospodarza. Ponieważ bakteryjne mRNA nie są poliadenylowane, nie można zastosować metody ściągania mRNA opartej na oligo-dT. Amplifikacja RNA zależna od poliadenylacji nie może być stosowana w próbkach związanych z gospodarzem, jeśli wiadomo, że próbki zawierają duże ilości eukariotycznego mRNA. Wiele próbek związanych ze zwierzętami, w tym plwocina mukowiscydoza, zawiera dużą gęstość komórek, a także duże ilości szczątków komórkowych i nukleaz, które zawierają RNazy. Dlatego kolejnym trudnym zadaniem jest zapobieganie nadmiernej degradacji RNA podczas przetwarzania metatranskryptomu. W większości przypadków całkowite RNA wyekstrahowane z plwociny mukowiscydozy ulega częściowej degradacji, co ogranicza dalsze zastosowania i użyteczność uzyskanego RNA. W ostatnich latach opracowano kilka podejść do zubożenia rRNA, które zaadaptowano do dostępnych na rynku zestawów. Skuteczność tych podejść jest jednak ograniczona, zwłaszcza w przypadku pracy z częściowo zdegradowanym rRNA9,24. Zastosowane tu metody pozwoliły na odzyskanie częściowo zdegradowanego całkowitego RNA, nadającego się do skutecznego usuwania całkowitego rRNA w dalszej części procesu. Bezpośrednie porównanie skuteczności usuwania rRNA z częściowo zdegradowanego całkowitego RNA porównującego dwa różne zestawy zostało zilustrowane przez Lim i wsp. (2012)Rozdział 9.
Ogólnie rzecz biorąc, celem tego manuskryptu jest dostarczenie kompletnego zestawu protokołów (Rysunek 1) do generowania wirusowych i mikrobiologicznych metagenomów typu shotgun oraz metatranskryptomu z pojedynczej próbki związanej ze zwierzęciem, na przykładzie próbki indukowanej plwociny. Przepływ pracy w laboratorium molekularnym powinien obejmować oddzielne obszary przed i po amplifikacji, aby zminimalizować zanieczyszczenie krzyżowe. Metody te można łatwo dostosować do innych typów próbek, takich jak tkanki22, wymazy z nosogardzieli i jamy ustneji gardła 25, płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) i koralowce (dane niepublikowane). Każda próbka powinna być przetworzona natychmiast po pobraniu, zwłaszcza gdy pożądane są badania metagenomiki drobnoustrojów i metatranskryptomiki. Jeśli próbki zostały zamrożone, ogranicza to izolację nienaruszonych komórek drobnoustrojów dla metagenomów drobnoustrojów, ponieważ zamrożenie potencjalnie zakłóciłoby integralność komórki. Zamrażanie nie wyklucza jednak metatranskryptomiki i izolacji wirusa, ale proces zamrażania i rozmrażania może mieć wpływ na jakość RNA i ilość odzyskanych cząstek wirusa. Ważne jest, aby zauważyć, że indukowana plwocina służyła jako główne źródło próbek w wielu badaniach związanych z dorosłymi pacjentami z mukowiscydozą i innymi przewlekłymi chorobami płuc26,27, ponieważ BAL może być zbyt inwazyjny. W naszych badaniach próbki plwociny pobrano staranną i spójną metodą pobierania próbek, tj. po płukaniu jamy ustnej i płukaniu jamy ustnej sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby ograniczyć do minimum zanieczyszczenie mikroorganizmami jamy ustnej w próbkach plwociny.

<table><tbody><tr><td>Bufor do lizy RNA na bazie izotiocyjanianu guanidyny</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td>TRIzol LS Odczynnik został użyty w tym badaniu</td></tr><tr><td>Kulki krzemionkowe; 0,1 do 0,15 mm</td><td>Cole-Parmer</td><td>YO-36270-62</td><td>W tym badaniu użyto kulek cyrkonowo-krzemianowych</td></tr><tr><td>Ditiothreitol, klasa cząsteczkowa (suchy proszek)</td><td>Promega</td><td>V3155</td><td>Można kupić w dowolnej innej firmie</td></tr><tr><td>Sterylny filtr strzykawkowy; 0,45 &mikro; m wielkość porów hydrofilowa membrana PVDF</td><td>Milipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>enzym DNazy I&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny filtr strzykawkowy; 0,02 &mikro; m wielkość porów</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-13</td><td>Średnica: 25 mm</td></tr><tr><td>Ultra-przezroczyste probówki wirówkowe</td><td>Beckman</td><td>344059</td><td>9/16 x 3 & frac12; in. (14 x 90 mm), nadaje się do wirnika SW41 Ti i ultrawirowania gradientu gęstości VLP</td></tr><tr><td>SW41 Ti Rotor</td><td>Beckman</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>SS-34 wirnik o stałym kącie</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 polimeraza DNA</td><td>Monserate Biotech</td><td>4001</td><td>10 U/&micro; l</td></tr><tr><td>Phi29 Losowy heksamer</td><td>Thermo Scientific</td><td>S0181</td><td>Wcześniej zakupiony od Fidelity Systems</td></tr><tr><td>Filtr matrycowy z tlenku glinu z pierścieniowym polipropylenowym pierścieniem nośnym; 0,02 i mikro; m wielkość porów</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-34</td><td>W pracy wykorzystano membrany filtracyjne Whatman Anodisc; średnica 25 mm</td></tr><tr><td>SYBR Złota plama w żelu kwasu nukleinowego</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DNaza wolna od RNaz I&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td>Można kupić w dowolnej innej firmie</td></tr><tr><td>Glikogen, klasa RNA</td><td>FisherScientific</td><td>FERR0551</td><td>Można kupić w dowolnej innej firmie</td></tr><tr><td>Szybkie probówki wirówkowe Oak Ridge</td><td>FisherScientific</td><td>05-562-16B</td><td>Do procedury ekstrakcji DNA o dużej objętości, odpowiednia do wirnika SS-34 o stałym kącie działania</td></tr><tr><td>Zestaw do usuwania całkowitego rRNA</td><td>Epicentrum</td><td>MRZE724</td><td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiologia) może być używany do łączenia usuwania rRNA z przygotowaniem biblioteki sekwencjonowania</td></tr><tr><td>Chlorek cezu&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>BP1595-500</td><td></td></tr><tr><td>Bromek heksadecytrimetyloamoniowy (CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5882-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie nieczystości: sekwencjonowanie metagenomów i metatranskryptomów ze złożonych próbek związanych ze zwierzętami

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Dostępność sekwencjonowania o wysokiej przepustowości zrewolucjonizowała wiele dziedzin biologii. Aby lepiej zrozumieć społeczności wirusowe i mikrobiologiczne związane z gospodarzem, opracowano kompleksowy proces ekstrakcji DNA i RNA. Przepływ pracy jednocześnie generuje metagenomy wirusowe i mikrobiologiczne, a także metatranskryptomy, z pojedynczej próbki do sekwencjonowania nowej generacji. Sprzężenie tych podejść zapewnia przegląd zarówno cech taksonomicznych, jak i funkcji kodowanych w społeczności. W prezentowanych metodach wykorzystuje się plwocinę mukowiscydozy (CF), która jest problematycznym typem próbki, ponieważ jest wyjątkowo lepka i zawiera dużą ilość mucyn, wolnego DNA neutrofili i innych nieznanych zanieczyszczeń. Opisane tutaj protokoły są ukierunkowane na te problemy i skutecznie odzyskują wirusowe i mikrobiologiczne DNA przy minimalnym zanieczyszczeniu ludzkiego DNA. Aby uzupełnić badania metagenomiczne, zoptymalizowano protokół metatranskryptomiczny w celu odzyskania mRNA zarówno drobnoustrojów, jak i gospodarza, które zawiera stosunkowo niewiele sekwencji rybosomalnego RNA (rRNA). Przedstawiono przegląd charakterystyki danych, który ma służyć jako punkt odniesienia do oceny skuteczności metod. Pobrano również dodatkowe próbki plwociny CF w celu (i) oceny spójności profili mikrobiomu przez siedem kolejnych dni w obrębie jednego pacjenta oraz (ii) porównania spójności podejścia metagenomicznego z sekwencjonowaniem opartym na genie rybosomalnego RNA 16S. Wyniki wykazały, że dzienne wahania profili mikrobiologicznych bez zaburzeń antybiotyków były minimalne, a profile taksonomiczne powszechnych bakterii związanych z mukowiscydozą były bardzo podobne między bibliotekami 16S rDNA a metagenomami wygenerowanymi z DNA pochodzącego z lizy hipotonicznej (HL). Jednak różnice między profilami taksonomicznymi 16S rDNA wygenerowanymi z całkowitego DNA i DNA pochodzącego z HL sugerują, że hipotoniczna liza i etapy płukania korzystnie wpływają nie tylko na usunięcie DNA pochodzącego od człowieka, ale także zewnątrzkomórkowego DNA pochodzącego z drobnoustrojów, które może fałszywie przedstawiać rzeczywiste profile mikrobiologiczne.

Korzystając z przykładu dróg oddechowych mukowiscydozy, manuskrypt przedstawia kompleksowy przepływ pracy obejmujący kombinację podejść metagenomicznych i metatranskryptomicznych w celu scharakteryzowania społeczności mikrobiologicznych i wirusowych w próbkach związanych ze zwierzętami.

Oczyszczanie nieczystości: sekwencjonowanie metagenomów i metatranskryptomów ze złożonych próbek związanych ze zwierzętami

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Ogólnym celem tej procedury jest zebranie i przetworzenie złożonych próbek związanych z gospodarzem, takich jak plwocina mukowiscydoza, w celu zbadania społeczności wirusowych i drobnoustrojów przy użyciu podejść metagenomicznych i metatranskryptomicznych. Osiąga się to poprzez najpierw wdychanie 7% hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej za pomocą nebulizatora, a następnie pobieranie próbek indukowanej plwociny przez 30 minut. Następnie próbka jest natychmiast homogenizowana i równomiernie rozprowadzana w czterech probówkach oznaczonych jako metagenom wirusowy, metagenom drobnoustrojów, metatranskryptom i dodatkowa plwocina.Następnie probówkę metatranskryptomu zamyka się, umieszcza poziomo, a plwocinę homogenizuje się ze średnią prędkością przez 10 minut. Na koniec poszczególne podwielokrotności są przetwarzane oddzielnie w celu wyizolowania i oczyszczenia komórek wirusowych lub bakteryjnych przed izolacją kwasów nukleinowych do badań metagenomicznych. Ostatecznie wyizolowane kwasy nukleinowe są wykorzystywane do przygotowania biblioteki sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w celu wygenerowania bibliotek metagenomiki i metatranskryptomiki.Główną zaletą tej procedury jest to, że zapewnia ona kompleksowy przepływ pracy do przetwarzania złożonej próbki związanej z gospodarzem w celu badania społeczności wirusowych i bakteryjnych na poziomie DNA i RNA. Wizualna demonstracja tej procedury ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy wstępnej obróbki próbki są ważne, aby zapewnić prawidłowe obchodzenie się z próbką, podczas gdy etapy oczyszczania komórek wirusowych i mikrobiologicznych są trudne do nauczenia Ze względu na złożoność procedury Przed pobraniem próbki oznacz cztery 15-mililitrowe probówki na próbkę następującymi elementami, pierwsza z metagenomem wirusowym, drugi jako metagenom drobnoustrojów numer trzy z metatranskryptomem i rurką numer cztery jako dodatkową plwociną. Dodaj dwa mililitry 0,1 milimetra kulek krzemionki do probówki oznaczonej metatranskryptomem, a następnie sześć mililitrów buforu do lizy RNA na bazie izotiocyjanianu gwinei lub buforu do lizy GITC.Postępując zgodnie z procedurą pobierania próbki opisaną w protokole tekstowym i przy użyciu kubków na próbki przed brodzeniem, należy oszacować objętość próbki, ważąc kubek po pobraniu próbki i odjąć masę pustego kubka. W przypadku pozostałej masy jeden gram będzie odpowiadał jednemu mililitrowi próbki. Jeśli objętość próbki jest mniejsza niż osiem mililitrów, dodaj odpowiednią objętość 0,02 mikrometra przefiltrowaną przez jeden XPBS, aby uzyskać końcową objętość do ośmiu mililitrów.Następnie natychmiast użyj trzymililitrowej strzykawki do homogenizacji próbki, aż w plwocinie nie pozostaną żadne widoczne grudki, za pomocą tej samej strzykawki natychmiast pobrać dwa mililitry plwociny i wstrzyknąć ją do probówki mikrotranskryptomicznej zawierającej kulki krzemionkowe i bufor do lizy GITC. Zamknij pokrywkę i użyj folii para, aby bezpiecznie uszczelnić pokrywę Aby uniknąć wycieku, użyj wiru, proszę pana, aby natychmiast homogenizować plwocinę ze średnią prędkością przez 10 minut. Za pomocą tej samej podwielokrotności strzykawki należy umieścić po dwa mililitry plwociny w probówkach oznaczonych metagenomem wirusa i metagenomem drobnoustrojów, a pozostałą plwocinę przenieść z kubka na plwocinę do probówki z dodatkową plwociną.Przechowuj wszystkie probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub na lodzie i w razie potrzeby transportuj do laboratorium w celu wygenerowania metagenomu wirusa. Po przygotowaniu i roztworów. Próbki należy poddać wstępnej obróbce, dodając 0,02 mikrometra przefiltrowanego buforu soli fizjologicznej do całkowitej objętości sześciu mililitrów.Aby wspomóc rozpuszczanie śluzu, dodaj sześć mililitrów 6,5 milimola DTT do każdej próbki. Energicznie wirować, mieszać i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po energicznym wirowaniu próbki ponownie wirują w temperaturze 3056 g i 10 stopni Celsjusza przez 15 do 20 minut.Zbierz każdy supernatant do nowej 15-mililitrowej probówki. Następnie użyj 45-milimetrowego filtra mikrometrycznego zamontowanego na strzykawce, aby przefiltrować supernatanty do nowych 15-mililitrowych probówek. Usunąć 100 mikrolitrów próbki do mikroprobówki fuge, a następnie przeprowadzić obróbkę chloroformem.Wyekstrahować supernatant i wykonać zabieg DN one. Dodać równą objętość 4% para formaldehydu, aby utrwalić próbkę. W przypadku mikroskopii fluorescencyjnej epi należy zapoznać się z protokołem tekstowym, aby uzyskać kompleksowe podejście do wzbogacania cząstek wirusa.W przeciwnym razie, używając świeżo przygotowanych roztworów chlorku cezu, ustaw gradient chlorku cezu, ładując jeden mililitr 1,7 grama na mililitr roztworu chlorku cezu do każdej probówki, a następnie jeden mililitr 1,5 grama na mililitr, jeden mililitr jednego punktu 35 gramów na mililitr, a na koniec jeden mililitr 1,2 grama na mililitr roztworu chlorku cezu. Na koniec załaduj od sześciu do ośmiu mililitrów próbki do pojedynczych probówek gradientowych. Zaznacz poszczególne warstwy, aby wskazać położenie każdej frakcji.Następnie zrównoważ każdą przeciwstawną parę dwójek z dokładnością do jednego miligrama. Ostrożnie zablokuj każdą rurkę w wiadrze wirującym. Załaduj na wirnik i odwiruj w temperaturze 82, 844 G i czterech stopniach Celsjusza przez dwie godziny.Po odwirowaniu ostrożnie wyjmij probówki z uchwytu, nie przerywając gradientów gęstości za pomocą igły o rozmiarze 18 dołączonej do trzymililitrowej strzykawki. Upewnij się, że otwarty koniec igły jest skierowany do góry. Przebić probówkę tuż poniżej warstwy o gęstości 1,5 grama na mililitr i powoli wciągnąć około 1,5 mililitra roztworu do strzykawki.Powoli wyjmij igłę i pozwól, aby pozostała frakcja w tubce spłynęła do nowej 15-mililitrowej probówki przez nakłucie. Oznacz to jako górna frakcja talii Przenieś roztwór w strzykawce zawierającej V ps do dwóch nowych mikroprobówek fuge. Po przygotowaniu i roztworów, zgodnie z protokołem tekstowym, dodać pięć objętości punktu 22 mikrometra przefiltrowanego jeden XPBS Aby rozcieńczyć każdy homogenat pod kapturem chemicznym, dodać beta MAR capta etanol do końcowego stężenia 2% objętości do objętości i wstrząsnąć mieszaniną w temperaturze pokojowej przez dwie godziny po inkubacji.Wirować próbkę w temperaturze 3056 GS i 10 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po odrzuceniu supernatantu użyj 10 mililitrów wody molekularnej do ponownego zawieszenia osadu i inkubacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut przed powtórzeniem prania. Po ostatnim zawirowaniu i po wyrzuceniu natiny SUP użyj pięciu mililitrów jednego bufora XDNA, aby ponownie zawiesić granulkę przed dodaniem 15 mikrolitrów ds.Jeden na mililitr próbki Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wielokrotnym mieszaniem przez dwie godziny. Po odwirowaniu próbek i wyrzuceniu snat, użyj 10 mililitrów buforu SE do ponownego zawieszenia osadu. Następnie odwiruj próbkę i powtórz pranie.Użyj dwóch mililitrów bufora SE do ponownego zawieszenia granulatu i przenieś zawiesinę do dwóch mikro probówek fuge. Następnie wiruj probówki w temperaturze 16 000 GS w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Na koniec, po usunięciu supernatantu, użyj zestawu do ekstrakcji genomowego DNA, postępując zgodnie z instrukcjami dla bakterii Gram-dodatnich.Aby wyizolować DNA, poprzednie wyniki w celu wygenerowania metagenomów wirusowych są podsumowane tutaj. Wiromy zawierają niewiele sekwencji pochodzenia ludzkiego, przy czym tylko jedna próbka zawierająca 70% próbki ludzkiego DNA CCF czwarta A została pominięta na etapie ultrawirowania gradientu gęstości, w wyniku czego zawierała więcej niż 97% sekwencji pochodzących od człowieka. Rysunek ten przedstawia fluorescencyjny obraz typowej próbki plwociny CF przed i po ultrawirowaniu w gradiacji gęstości.Wyraźne vlp zaobserwowano przy braku dużych cząstek po zaobserwowanej tutaj separacji gradientu gęstości. Siedem próbek plwociny dziennie pobierano od jednego pacjenta z mukowiscydozą, który rozpoczął doustne antybiotyki. Po trzecim dniu od pobrania, całkowita wydajność pochodzącej lizy hipotonicznej lub HL DNA pobranego z każdej próbki wahała się od 210 nanogramów do ponad pięciu mikrogramów z bibliotek sekwencjonowania Illumina wygenerowanych dla każdej próbki.Wszystkie biblioteki z wyjątkiem jednej dały ponad 1 milion sekwencji, a ponad 85% sekwencji o wysokiej jakości zostało zachowanych po wstępnym przetworzeniu danych. Korzystając z oprogramowania do sekwencjonowania druku, całkowita ilość sekwencji pochodzących od człowieka wahała się od 14% do 46%Jak pokazano tutaj, profile mikrobiologiczne podpróbek są bardzo podobne do próbek po dwóch zabiegach lizy hipotonicznej. Ponadto druga liza hipotoniczna zwiększa frakcję sekwencji innych niż ludzkie o sześć do 17% w metagenomach.Nie zapominaj, że praca z próbkami klinicznymi i potencjalnymi patogenami może być niezwykle niebezpieczna. Podczas obchodzenia się z próbką należy zawsze używać środków ochrony indywidualnej. Podczas wykonywania tej procedury wymagane są dobre techniki biologii molekularnej i mikrobiologii, aby zapewnić brak zanieczyszczeń.Po tej procedurze powinno być możliwe wykonanie metagenomicznych badań metagenomicznych wirusów i drobnoustrojów, a także metatranskryptomicznych z próbek złożonych, takich jak plwocina z mukowiscydozy.

purifying-impure-sequencing-metagenomes-metatranscriptomes-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten protokół służy do ekstrakcji i koncentracji białka i DNA z biomasy mikrobiologicznej zebranej z wody morskiej, a następnie do generowania peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy proteomicznej opartej na tandemowej spektrometrii mas.

Przebieg metaproteomiki mikrobiologicznej organizmów wodnych: od komórek do peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy opartej na tandemowej spektrometrii mas

Opisujemy wydajną, solidną i opłacalną metodę ekstrakcji kwasu nukleinowego z wymazów w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA. Metoda ta pozwala na zastosowanie wspólnego podejścia do przetwarzania wielu typów próbek i uwzględnia szereg dalszych procesów analitycznych.

Wydajna ekstrakcja kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych

Ten protokół opisuje szybką i szeroko stosowaną metodę bezstronnego sekwencjonowania RNA próbek wirusa z ludzkich izolatów klinicznych.

Bezstronne, głębokie sekwencjonowanie wirusów RNA z próbek klinicznych

Metagenomics została wykorzystana do zbadania mikrobiomu paszy dla bydła na kiszonkę. Analizę przeprowadzono za pomocą sekwencjonowania typu shotgun. Podejście to wykorzystano do scharakteryzowania składu zbiorowiska mikrobiologicznego w paszy dla bydła.

Analiza metagenomiczna kiszonki

Celem tego protokołu jest wykorzystanie kombinacji badań obliczeniowych i laboratoryjnych do znalezienia nowych sekwencji, które nie mogą być łatwo oddzielone od sekwencji współoczyszczającej, która może być tylko częściowo znana.

Odkrycie nowych sekwencji za pomocą genomiki subtraktywnej

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Sekwencjonowanie nanoporowe to nowatorska technologia, która pozwala na efektywne kosztowo sekwencjonowanie w odległych lokalizacjach i miejscach o ograniczonych zasobach. W tym miejscu przedstawiamy protokół sekwencjonowania mRNA z krwi pełnej, który jest zgodny z takimi warunkami.

Sekwencjonowanie mRNA z krwi pełnej za pomocą sekwencjonowania nanoporowego

Prezentujemy szczegółowy protokół naprawy małej biblioteki RNA z mniejszym odchyleniem niż standardowe metody i zwiększoną czułością dla 2'-O-metylowych RNA. Protokół ten można przestrzegać, używając domowych odczynników w celu zaoszczędzenia kosztów lub używając zestawów dla wygody.

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

Ta metoda opisuje kroki mające na celu poprawę jakości i ilości danych sekwencyjnych, które można uzyskać z próbek RNA zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie. Opisujemy metodologię dokładniejszej oceny jakości próbek FFPE-RNA, przygotowania bibliotek sekwencjonowania i analizy danych z próbek FFPE-RNA.

Optymalizacja sekwencjonowania i analizy zdegradowanych próbek FFPE-RNA

Technologia MAPS została opracowana w celu zbadania celu określonego regulatorowego RNA in vivo. Interesujący sRNA jest znakowany aptamerem MS2, który umożliwia wspólne oczyszczanie partnerów RNA i ich identyfikację za pomocą sekwencjonowania RNA. Ten zmodyfikowany protokół jest szczególnie odpowiedni dla bakterii Gram-dodatnich.

Oczyszczanie powinowactwa MS2 w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA u bakterii Gram-dodatnich

Metaproteomika kliniczna oferuje wgląd w ludzki mikrobiom i jego wpływ na choroby. Wykorzystaliśmy moc obliczeniową platformy Galaxy do opracowania modułowego przepływu pracy bioinformatycznego, który ułatwia złożoną analizę metaproteomiczną opartą na spektrometrii mas i charakteryzację różnych typów próbek klinicznych istotnych dla badań nad chorobami.

Przepływ pracy metaproteomiki klinicznej wdrożony w ramach platformy bioinformatycznej Galaxy w celu analizy interakcji gospodarz-mikrobiom leżących u podstaw chorób człowieka

Poznaj kompleksowy workflow do oczyszczania próbek plwociny z mukowiscydozy dla metagenomiki i metatranskryptomiki wirusów oraz bakterii. Ta metoda umożliwia dokładne badanie społeczności mikrobiomowych.

Oczyszczanie nieczystości: sekwencjonowanie metagenomów i metatranskryptomów ze złożonych próbek związanych ze zwierzętami

Przeglądaj więcej filmów