Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie skutecznej metody generowania filmów obrazowania na żywo rozwoju źrenicy dźrenicy drosofilii. Osiąga się to poprzez usunięcie trwałej ondulacji O, obudowy źrenicy i rozerwanie wzdłuż boku, aby odsłonić nabłonek nerwowy jednego oka. Drugim krokiem jest złożenie zestawu do obrazowania i zamontowanie poczwarki na małym kulce wazeliny.

Kolejne seryjne odcinki nabłonka nerwowego w okolicy pasa adhezyjnego pozyskiwane są za pomocą standardowego mikroskopu fluorescencyjnego. Ostatnim krokiem jest ustabilizowanie materiału filmowego i dokonanie korekty kolorów w standardowym oprogramowaniu do edycji obrazu. Ostatecznie obrazowanie żywych komórek nabłonka nerwowego Drosophila służy do wyjaśnienia zachowań komórek, które są wzorcem.

Oko Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ częściowe wypreparowanie poczwarki, a następnie prawidłowe zamontowanie jej w urządzeniu do obrazowania może być trudne, ponieważ poczwarki są na tym etapie dość delikatne. Ponadto prawidłowa orientacja poczwarki i prawidłowe umieszczenie szkiełka nakrywkowego nad nabłonkiem oka ma kluczowe znaczenie dla udanego obrazowania. Procedurę zademonstruje Mark Hellerman z naszego laboratorium.

Aby rozpocząć eksperyment, wybierz białe pre puy z wcześniej skrzyżowanych genotypów i umieść je w 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych. Następnie umieść 10-centymetrowy kwadratowy kawałek chusteczki nasączonej wodą destylowaną w czystym plastikowym pudełku na końcówki. Włóż probówki mikrowirówek do pudełka z końcówkami.

Mokrą tkankę zapobiegnie wysuszeniu poczwarki, a następnie inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 17 do 25 godzin. Po inkubacji umieść kawałek świeżej taśmy dwustronnej na czarnym naczyniu do sekcji cygar. Umieść poczwarkę grzbietową stroną do góry na taśmie i upewnij się, że głowa poczwarki jest przymocowana do taśmy dwustronnej bez przylegania do okolicy piersiowej i brzusznej poczwarki.

Za pomocą kleszczy ostrożnie podnieś i zdejmij trwałą ondulację, aby odsłonić głowę źrenicy. Następnie rozerwij wzdłuż boku obudowy źrenicy. Aby odsłonić obszar wokół jednego oka, delikatnie zdejmij źrenicę z taśmy klejącej.

Zbuduj małą ramkę o powierzchni 15 milimetrów kwadratowych z bibuły i wybij pięciomilimetrowy otwór w środku. Zanurz ramkę i wodę destylowaną i umieść ją na środku mikroskopu. Wstrzyknąć za pomocą strzykawki o pojemności 30 cm3.

Wyciśnij jednolity pierścień wazeliny, aby otoczyć ramkę bibuły. Następnie dodaj małą kulkę wazeliny bezpośrednio na szkiełko. Ostrożnie ułóż poczwarkę na boku i podeprzyj ją kulką wazeliny.

Umieść szkiełko nakrywkowe na pierścieniu z wazeliną tak, aby stykało się z nabłonkiem nad okiem. Delikatnie ścisnąć preparat, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe względem wazeliny i wytworzyć małą płaską powierzchnię kontaktową między obszarem źrenicy oka a obrazem szkiełka nakrywkowego, preparatem źrenicy. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego rejestruj seryjne odcinki przez domenę AAL oka, nabłonek nerwowy w okolicy połączenia przylegającego co siedem minut.

Użyj odpowiedniego oprogramowania do dekonwolucji, aby zredukować tło i zwiększyć kontrast obrazów sekcji szeregowej dla każdego pliku Zack i oprogramowania L-A-S-A-F. Przejdź do panelu narzędzi. Wybierz opcję Dekonwolucja 3D i kliknij przycisk Zastosuj.

Wygeneruj maksymalną projekcję lub obraz MP dla każdego pliku stosu de convoluted. Wyrównaj każdy obraz MP, aby podkreślić zachowania poszczególnych komórek i zmniejszyć rozproszenie spowodowane wzrostem organizmu. Korzystając z wbudowanych algorytmów w Photoshop CS five z zakładki plik w menu głównym, otwórz skrypty i wybierz załaduj pliki do stosu.

Następnie zaimportuj pliki obrazów MP do panelu wczytywania warstw. Upewnij się, że opcja Próba automatycznego wyrównania obrazów źródłowych nie jest zaznaczona. W przeciwnym razie dane obrazu mogą być zniekształcone.

Po załadowaniu wszystkich plików MP do panelu warstw sprawdź, czy wszystkie obrazy są w porządku chronologicznym i czy najwcześniejszy punkt czasowy znajduje się na górze warstwy. Stosuj je przeciągnij i upuść, aż zostaną poprawnie uporządkowane. W razie potrzeby wybierz opcję Automatycznie wyrównuj warstwy.

Wybierz opcję Zmień położenie i kliknij przycisk OK. Nieostre, obszary początkowego obrazu MP mogą być korygowane w celu uzyskania jednolicie ostrego pola siatkówki. Aby rozpocząć przetwarzanie obrazu, należy użyć funkcji kadrowania w systemie LAS.

Saf ręcznie ogranicz początkowe i końcowe warstwy, tak aby obejmowały one tylko pas adhezyjny w początkowo nieostrym obszarze. Kliknij przycisk Zastosuj, aby wygenerować nowy plik stosu, który jest zoptymalizowany pod kątem tego regionu. Następnie wygeneruj nową maksymalną projekcję dla lokalnie zoptymalizowanego stosu i wyeksportuj go jako plik TIF w programie Photoshop.

Otwórz skrypty i wybierz załaduj pliki do stosu. Następnie wprowadź początkowy plik MP i zoptymalizowany plik MP do panelu wczytywania warstw. Ponownie upewnij się, że opcja Próba automatycznego wyrównania obrazów źródłowych nie jest zaznaczona i wybierz opcję OK.

Zaznacz obie warstwy i wybierz warstwy automatycznego mieszania, aby uzyskać jednolicie ostre pole siatkówki. Zapisz ten obraz kompozytowy jako plik TIF. Użyj narzędzia do przekształcania, aby obrócić obrazy w taki sposób, aby grzbietowa oś brzuszna siatkówki była wyrównana z osią Y klatki filmu.

Użyj regulacji poziomu poszczególnych klatek, aby zwiększyć kontrast między błoną komórkową a ciałem komórki. Następnie wybierz opcję Utwórz ramki z warstw, aby przekonwertować obrazy na film. Należy pamiętać, że warstwy są dodawane do panelu animacji w kolejności sekwencyjnej, zaczynając od dołu stosu.

Aby odwrócić kolejność stosów, zaznacz wszystkie klatki, a następnie zaznacz odwróć klatki. Wybierz czas opóźnienia klatki wynoszący 0,8 sekundy dla każdej klatki i wybierz QuickTime. Eksportuj i wybierz żądany format wideo.

Na koniec w obszarze opcji renderowania wybierz liczbę klatek na sekundę do niestandardowej i wprowadź liczbę klatek na sekundę 15. Następnie kliknij przycisk renderuj. Za pomocą tej techniki zaobserwowano wyraźny gradient rozwojowy w całym oku, co skłoniło do szczegółowych opisów wzorców oczu.

Podczas owijania pierwotnego dwie komórki zostały zrekrutowane jako pierwotne, które szybko otoczyły wiązki fotoreceptorów, łącząc się ze sobą, tworząc stabilne połączenia. Niezróżnicowane komórki z materiału intero leżały w niezorganizowanym wzorze, podczas gdy rośliny podstawowe owijały się i uszczelniały. Każdy pakiet fotoreceptorów reorganizuje lokalne ruchy komórek.

Komórki początkowe zgrupowane po grzbietowej i brzusznej stronie każdej omy. Interkalacja międzykomórkowa przegrupowała komórki z dwóch rzędów w jeden wiersz. Po inter interkalacji pod mikroskopem uchwycono konkurencję trzeciorzędową.

Rywalizujące ze sobą komórki zajmowały trzeciorzędową niszę przez pięć do 10 minut przed przemieszczeniem. Ostatecznie pojedyncza komórka ustanowiła stabilną niszę trzeciorzędową. Podczas końcowego przycinania gwałtowny wzrost apoptozy zmniejszył liczbę ICS do minimum wymaganego do wydajnego wytworzenia sieci komórek materiału wejściowego w poprzek oka złożonego.

Po opanowaniu obrazowanie środków ochrony indywidualnej można wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Późniejsza obróbka obrazu trwa około godziny.