Name: Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo neuroepitelium oka poczwarki Drosophila. Protokół stabilizuje tkankę i wizualizuje granice komórkowe za pomocą białek GFP, umożliwiając szczegółową analizę zachowań komórkowych podczas rozwoju oka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Davidowi Larsonowi za opracowanie oryginalnego protokołu obrazowania żywego oka poczwarki Drosophila. Dziękujemy naszym kolegom Richardowi Carthew, Shoichiro Tsukita i Matthew Freemanowi, którzy opracowali transgeniczne muchy, które połączyliśmy, aby wygenerować nasze linie muchowe do obrazowania na żywo. Brittany Baldwin-Hunter udzieliła pomocnych komentarzy na temat rękopisu. Prace te były wspierane przez fundusze na rozpoczęcie działalności przyznane Ruth Johnson przez Uniwersytet Wesleyan.

Rysunek 3 przedstawia podsumowanie procedury eksperymentalnej.
1. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>W celu określenia konsekwencji zmodyfikowanej ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania, należy założyć następującą krzyżówkę w dwóch egzemplarzach i utrzymywać w temperaturze 25 °C: UAS-transgen (mężczyźni)X GMR-GAL4; UAS-α-kat:GFP, ubi-DE-Cad:GFP ; + / SM5-TM6b (dziewicze samice) UWAGA: Aby uzyskać tkankę kontrolną, skrzyżuj samce UAS-lacZ z GMR-GAL4; UAS-α-cat:GFP, ubi-DE-Cad:GFP samice. β-Galaktozydaza nie powoduje defektów w zachowaniu komórek w siatkówce.</li>
	<li>Aby zwiększyć skuteczność transgenów RNAi, krzyżuj samce UAS-RNAi z GMR-GAL4, UAS-Dcr-2; UAS-α-cat:GFP, ubi-DE-Cad:GFP; + / SM5-TM6b dziewicze samice. 
	UWAGA: Zaobserwowano sporadyczne defekty w zachowaniu komórek w siatkówkach wykazujących ekspresję ektopowego Dcr-2 (dane nie pokazane). W przypadku stosowania tego podejścia zaleca się zachowanie czujności.</li>
	<li>Wybrać białe poczwarki o odpowiednich genotypach i umieścić w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Jeśli poczwarki wykazują ekspresję Dcr-2, wybierz poczwarki męskie lub żeńskie: ekspresja UAS-Dcr-2, wstawki na chromosomie X, jest silniejsza u samców. Poczwarki powinny być seksowane po 0 godz. APF przed pigmentacją poczwarki – gonady samców są widoczne jako duże półprzezroczyste kule po bocznych stronach poczwarki (około jednej trzeciej od tyłu).</li>
	<li>Inkubować probówki do mikrowirówek zawierające poczwarki w czystym plastikowym pojemniku na końcówki w temperaturze 25 °C. Aby zapobiec wysuszeniu poczwarek, umieść 10 cm2 kawałek chusteczki nasączonej wodą destylowaną w pudełku na końcówki. 
	UWAGA: jeśli wilgotność w pudełku na końcówkę stanie się zbyt wysoka, skrzynka poczwarki może stać się rozmoczona i trudna do wypreparowania w kolejnych krokach.</li>
	<li>Inkubować przez odpowiedni czas. Aby uchwycić zachowania komórek związane z modelowaniem oka, przygotuj poczwarki do obrazowania po około 17 godzinach APF, 20 godzinach APF lub 24 godzinach APF. Zobacz Reprezentatywne wyniki, aby uzyskać dalszą dyskusję na temat tego, kiedy najlepiej zaobserwować określone zachowania komórek.</li>
	<li>Umieść kawałek świeżej taśmy dwustronnej na czarnym naczyniu preparacyjnym Sylgard. Umieść poczwarkę grzbietem do góry, tak aby głowa poczwarki przylegała do taśmy dwustronnej (ryc. 1A). Staraj się nie przyklejać okolicy piersiowej i brzusznej poczwarki do taśmy dwustronnej. Za pomocą kleszczy ostrożnie podnieś i wyjmij wieczko, aby odsłonić głowę poczwarki. Rozerwij wzdłuż boku koperty poczwarki, aby odsłonić obszar wokół jednego oka.</li>
	<li>Delikatnie usuń poczwarkę z taśmy klejącej. Jeśli poczwarka pozostaje przylegająca, nałóż niewielką ilość wody destylowanej na połączenie między obudową poczwarki a taśmą, aby osłabić przyczepność.</li>
</ol>
2. Montaż
<ol>
	<li>Zbuduj małą ramkę o średnicy 15 mm2 z bibuły i wybij otwór w środku o średnicy 5,5 mm (Rysunek 1B). Zanurz w wodzie destylowanej i umieść na środku szkiełka mikroskopowego. Za pomocą strzykawki o pojemności 30 ml wyciśnij jednolity pierścień wazeliny, aby otoczyć ramkę bibuły. Upewnij się, że pierścień z wazeliny jest nieznacznie wyższy niż szerokość poczwarki i że średnica pierścienia jest nieznacznie mniejsza niż szerokość szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Dodaj małą kulkę wazeliny bezpośrednio na szkiełko, w otworze wybitym w bibułce (Rysunek 1C). Ostrożnie ułóż poczwarkę na boku, wspartą na kulce wazeliny (ryc. 1D).</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na pierścieniu wazeliny tak, aby stykało się z nabłonkiem powyżej nabłonka nerwowego oka (ryc. 1D). Delikatnie ściśnij preparat, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe przed wazeliną i wytworzyć małą płaską powierzchnię kontaktową między obszarem oka poczwarki a szkiełkiem nakrywkowym.</li>
</ol>
3. Obrazowanie fluorescencyjne
<ol>
	<li>Zobrazuj preparat poczwarki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Co 7 minut wychwytuj seryjne odcinki przez domenę wierzchołkową neuroepithelium oka, w okolicy połączeń przylegających. 
	UWAGA: a) Odpowiednie sekcje szeregowe to zwykle 4-5 na stos z, składający się z kroków co 0,2 μm. b) Nieprawidłowości w topologii nabłonka, w tym łagodne nierówności i fałdy, mogą utrudniać uzyskanie ostrych obrazów dużych obszarów tkanki. Podczas obrazowania może się okazać, że część obszaru zainteresowania jest wyostrzona, a sąsiedni region jest nieostry. Włączenie małej kropli wody destylowanej między oko poczwarki a szkiełko nakrywkowe może wyeliminować niektóre ostre fałdy tkankowe, ale nie łagodnie nierówną topologię charakterystyczną dla wczesnych stadiów morfogenezy oka poczwarki. W takich przypadkach należy nadpróbkować tkankę, wydłużając stos z, aż zostaną uzyskane ostre wycinki dla całego pola. c) Przechwytywanie odcinków seryjnych co 7 minut powinno umożliwić obrazowanie na żywo przez 3 do 4 godzin bez znacznego zmniejszenia intensywności fluorescencji GFP, która może pogorszyć jakość obrazu. Krótsze odstępy czasu mogą skrócić całkowity czas obrazowania.</li>
	<li>Kontynuuj obrazowanie przez 3 do 4 godzin. Nie należy korzystać z funkcji automatycznego ustawiania ostrości i czasu, która jest dostępna w wielu mikroskopach fluorescencyjnych, ponieważ wzrost poczwarki i pompowanie hemolimfy przesuwa pozycję siatkówki i wymagane jest czujne ponowne ustawianie ostrości co 14-21 minut. Należy pamiętać, że obrazowanie powyżej 4 godzin może spowolnić lub zatrzymać morfogenezę oka.</li>
	<li>Użyj odpowiedniego oprogramowania do dekonwolucji, aby zmniejszyć tło i zwiększyć kontrast obrazów sekcji szeregowej. Dla każdego pliku z-stack wykonaj następujące czynności w oprogramowaniu LAS AF (patrz Spis materiałów): Przejdź do panelu Narzędzia, wybierz opcję Dekonwolucja 3D i kliknij przycisk Zastosuj.</li>
	<li>Wygeneruj obraz maksymalnej projekcji (MP) dla każdego pliku stosu bez konwolucji: Przejdź do panelu Narzędzia, wybierz opcję Projekcja 3D i kliknij przycisk Zastosuj. 
	UWAGA: Algorytm projekcji maksymalnej może nie wygenerować jednolicie ostrego obrazu dla tkanki, która została poddana nadpróbkowaniu. Technika wyostrzania nieostrych obszarów została opisana w kroku 5.2.</li>
</ol>
4. Ratowanie poczwarek po obrazowaniu i weryfikacja fenotypu
<ol>
	<li>Aby ustalić, czy podczas obrazowania wprowadzono artefakty, czy poczwarka została uszkodzona, należy ostrożnie usunąć poczwarkę ze stanowiska do obrazowania: za pomocą kleszczy usuń szkiełko nakrywkowe i przenieś poczwarkę do czystej fiolki z jedzeniem. Przechowywać w temperaturze pokojowej lub 25 °C do momentu pojawienia się dorosłej muchy.</li>
	<li>Dokładnie zbadaj fenotyp dorosłego oka i porównaj z oczami dorosłych much wyłaniających się z oryginalnej krzyżówki muchowej.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie obrazu
<ol>
	<li>Automatyczne wyrównanie obrazu: 
	UWAGA: Żywa tkanka Drosophila będzie się przesuwać i rosnąć w trakcie procesu obrazowania. W związku z tym środki obrazów zebranych w kolejnych punktach czasowych mogą nie odpowiadać temu samemu punktowi w tkance Drosophila. Ponadto cały krążek siatkówki obraca się o około 30° między ~21 a 23 godziną APF. Aby podkreślić zachowania poszczególnych komórek i zmniejszyć rozproszenie uwagi spowodowane wzrostem organizmu, wyrównaj każdy obraz MP. Chociaż można to zrobić ręcznie, użyte tutaj oprogramowanie do edycji obrazu (patrz Spis materiałów) ma wbudowane algorytmy, które mogą przyspieszyć ten proces.
	<ol>
		<li>Na karcie Plik w menu głównym otwórz Skrypty i wybierz Załaduj pliki do stosu.</li>
		<li>Zaimportuj pliki obrazów MP do panelu Wczytaj warstwy i wybierz przycisk OK. Upewnij się, że opcja Spróbuj automatycznie wyrównać obrazy źródłowe nie jest zaznaczona. 
		UWAGA: Jeśli ta opcja jest wybrana, oprogramowanie może używać algorytmu wyrównywania, który zniekształca dane obrazu.</li>
		<li>Po załadowaniu wszystkich plików MP do panelu Warstwy upewnij się, że wszystkie obrazy są w porządku chronologicznym, tak aby najwcześniejszy punkt czasowy znajdował się na górze stosu warstw. Jeśli warstwy nie są w prawidłowej kolejności, przeciągnij je i upuść, aż zostaną poprawnie uporządkowane.</li>
		<li>Wybierz opcję Automatycznie wyrównaj warstwy na karcie Edycja w menu głównym. Wybierz opcję Zmień położenie i kliknij przycisk OK.</li>
		<li>Jeśli algorytm automatycznego wyrównywania nie zdoła ustawić ramek w odpowiednim punkcie ogniskowym, wprowadź drobne zmiany za pomocą narzędzia Przesuń.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrzenie kompozytu: 
	UWAGA: Nieostre obszary początkowego obrazu MP można wyostrzyć, "przycinając" odpowiedni zdekonwolucyjny stos w oprogramowaniu LAS AF. Przycinanie pliku stosu pozwala na ręczne ograniczenie interwału stosu z, który jest poddawany algorytmowi projekcji maksymalnej.
	<ol>
		<li>Znajdź funkcję Przytnij w panelu Narzędzia (na karcie Proces). Ręcznie ogranicz początkowe i końcowe warstwy w taki sposób, aby obejmowały tylko pas adhezyjny w obszarze początkowo nieostrym. Kliknij przycisk Zastosuj, aby wygenerować nowy plik stosu, który jest zoptymalizowany dla tego regionu.</li>
		<li>Wygeneruj nową maksymalną projekcję dla lokalnie zoptymalizowanego stosu i wyeksportuj jako plik TIFF.</li>
		<li>W oprogramowaniu do edycji obrazów (patrz Spis materiałów) otwórz Skrypty (znajdujące się w zakładce Plik w menu głównym) i wybierz opcję Załaduj pliki do stosu.</li>
		<li>Zaimportuj początkowy plik obrazu MP i lokalnie zoptymalizowany plik MP dla określonego punktu czasowego do panelu Wczytaj warstwy i wybierz przycisk OK. Upewnij się, że opcja Spróbuj automatycznie wyrównać obrazy źródłowe nie jest zaznaczona.</li>
		<li>Zaznacz obie warstwy w panelu Warstwy, a następnie wybierz opcję Warstwy automatycznego mieszania (znajdującą się na karcie Edycja w menu głównym), aby automatycznie zamaskować odpowiednie obszary dwóch obrazów, uzyskując jednolicie ostre pole siatkówki. Zapisz ten obraz kompozytowy jako plik TIFF.</li>
		<li>Powtórz kroki od 5.2.1 do 5.2.5 dla wszystkich nieoptymalnych obrazów MP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dalsze regulacje: Obracanie, przycinanie i dostosowywanie poziomów warstw filmu:
	<ol>
		<li>Po zaznaczeniu wszystkich warstw użyj narzędzia Przekształć (Edycja > Przekształcanie swobodne), aby obrócić obrazy tak, aby oś grzbietowo-brzuszna siatkówki była wyrównana z osią y klatki filmu.</li>
		<li>W razie potrzeby użyj narzędzia Kadrowanie, aby zmniejszyć pole widzenia do żądanego rozmiaru i kształtu.</li>
		<li>Użyj regulacji poziomu (poszczególnych klatek), aby zwiększyć kontrast między błoną komórkową a ciałem komórki.</li>
		<li>Ze względów stylistycznych i w celu podkreślenia określonych zachowań komórek wprowadź fałszywe kolory, aby wyróżnić punkty zainteresowania w każdej klatce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Animacja: Przekształć obrazy w film:
	<ol>
		<li>Otwórz okienko Animacja na karcie Windows w menu głównym. Wybierz opcję Utwórz klatki z warstw z menu znajdującego się w prawym górnym rogu panelu Animacja.</li>
		<li>Należy zauważyć, że warstwy są dodawane do panelu animacji w kolejności sekwencyjnej, zaczynając od dołu stosu. Aby odwrócić kolejność klatek, najpierw zaznacz wszystkie klatki, a następnie wybierz opcję Odwróć klatki z menu panelu Animacja.</li>
		<li>Wybierz czas opóźnienia klatki dla każdej klatki, korzystając z menu rozwijanego pod miniaturą klatki. 
		UWAGA: Opóźnienie klatek dla filmów od 1 do 4 przedstawionych w tym artykule wynosi 0,8 sekundy.</li>
		<li>Na karcie Plik w menu głównym otwórz Eksportuj i wybierz Renderuj wideo. Wybierz Eksport QuickTime w Opcjach pliku i wybierz żądany format wideo. W obszarze Opcje renderowania ustaw opcję Liczba klatek na sekundę na Niestandardowa, wprowadź liczbę klatek na sekundę 15 i kliknij przycisk Renderuj.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).</li>
<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+features+of+adherens+junctions+during+Drosophila+embryonic+epithelial+morphogenesis+revealed+by+a+Dalpha-catenin-GFP+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein.</a> Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).</li>
<li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li>
<li>Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+specification+in+the+developing+Drosophila.+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Suppl%22%5BJournal%5D)">Cell fate specification in the developing Drosophila. retina.</a> Dev Suppl. , 19(1993).</li>
<li>Bate, M., Arias, A. M. Pattern formation in the Drosophila. retina. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolff%2C+T+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1277-1325 (1993).</li>
<li>Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+behavior+in+the+developing.+Drosophila+pupal+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina.</a> Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).</li>
<li>Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+death+zone%3A+a+spatially+restricted+region+for+programmed+cell+death+that+sculpts+the+fly+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye.</a> Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).</li>
<li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+Drosophila+Dicer-1+and+Dicer-2+in+the+siRNA%2FmiRNA+silencing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways.</a> Cell. 117, 69-81 (2004).</li>
<li>Zitserman, D., Roegiers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+sensory+organ+precursor+cells+in+intact+Drosophila+pupae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae.</a> J. Vis. Exp. (51), 2706(2011).</li>
<li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).</li>
<li>Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waves+of+differentiation+in+the+fly+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Waves of differentiation in the fly visual system.</a> Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).</li>
<li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).</li>
<li>Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+simulation+of+cellular+patterning+within+the+Drosophila+pupal+eye%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye.</a> PLoS Comput. Biol. 6, e1000841(2010).</li>
<li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).</li>
<li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+is+required+for+successive+cell+decisions+in+the+developing+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina.</a> Genes Dev. 1099, 1112(1989).</li>
<li>Miller, D. T., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+induction+of+patterning+and+programmed+cell+death+in+the+developing+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina.</a> Development. 125, 2327-2335 (1998).</li>
<li>Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+argos+in+regulating+cell+fate+decisions+during+Drosophila+eye+and+wing+vein+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development.</a> Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).</li>
<li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+of+signals+regulating+effector+and+initiator+caspases+in+the+developing+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye.</a> Development. 129, 3269-3278 (2002).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tugging+force+regulates+the+size+of+cell-cell+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).</li>
<li>Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+tension+is+required+for+correct+recruitment+of+adherens+junction+components+and+zonula+occludens+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation.</a> Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opis rozwoju typu dzikiego (powyżej) stanowi podstawę do porównań zdarzeń wzorcowych w genotypach RNAi lub nadekspresji. Porównania rozwoju żywych tkanek są nieocenione przy precyzyjnym określaniu, które zachowania komórek są regulowane przez białko będące przedmiotem zainteresowania. Ponadto, co nie zostało tutaj opisane, obrazowanie żywych komórek umożliwia jakościowe i/lub ilościowe opisy roli interesującego genu w zdarzeniach, które kształtują oko. Do 30-32 godzin APF większość komórek barwnikowych osiągnęła stabilne...

Oko złożone Drosophila charakteryzuje się stereotypowym układem jego ~750 ommatidia oddzielonych siatką o strukturze plastra miodu z dodatkowych komórek pigmentowych 4,5. Te komórki pigmentowe są wzorowane na skoordynowanej kombinacji zdarzeń: lokalnych ruchów komórek, wzrostu komórek, zmian kształtu komórki i apoptozy. Wizualizacja tego nabłonka na żywo pozwala na badanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tych zdarzeń w fizjologicznie istotnym i niezakłóconym kontekście trójwymiarowym.
W przeciwieństwie do poprzednich protokołów 6,7, przedstawiona tutaj technika zawiera skuteczną metodę stabilizacji ruchu obcych tkanek, które nie mogą być odłączone od procesu obrazowania. Metoda ta wzbogaca badania nad zachowaniem komórek w rozwijającym się nabłonku oka poczwarki Drosophila – tkance, która rośnie, obraca się i przesuwa w trakcie obrazowania. Ponadto opisana tutaj technika stabilizacji ruchu będzie przydatna do badania komórek w innych kontekstach, w których występuje ruch zewnętrzny.
Aby zobrazować granice komórek w polu siatkówkowym Drosophila, wygenerowano transgeniczne linie much, które wyrażają ubi-DE-Cadherin:GFP oraz UAS-α-katenina:GFP pod kontrolą specyficznego dla oka sterownika GMR-GAL4 1-3. Zastosowanie dwóch markerów błonowych oznaczonych GFP pozwala na wizualizację granic komórek przy mniejszym natężeniu światła. Minimalizuje to uszkodzenia tkanek i fotowybielanie przy wielokrotnej ekspozycji na fale o wysokiej energii, umożliwiając zwiększenie liczby klatek na sekundę i czasu trwania filmu. Aby zwiększyć skuteczność transgenów RNAi, UAS-Dcr-2 został również włączony do drugiej linii muchowej 8.
W trzeciej aktualizacji z poprzednich protokołów, opisano prostszy system do obrazowania, który można łatwo zmontować w większości laboratoriów. Aparatura ta eliminuje wymóg posiadania specjalistycznego sprzętu do obrazowania generowanego przez uniwersytecki "warsztat mechaniczny" lub podobną usługę. Ten zestaw do obrazowania jest podobny do tego, który jest używany do obrazowania innych tkanek poczwarek 9,10.
Prezentowany tutaj jest prosty protokół obrazowania żywych komórek, który może być użyty do bezpośredniej oceny zdarzeń morfogenetycznych, które przyczyniają się do wzorca oka od ~17 do 42 godzin po utworzeniu poczwarki (hr APF). W szczególności protokół ten umożliwia określenie konsekwencji modyfikacji ekspresji genów podczas rozwoju poczwarki.

<table><tbody><tr><td>GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b</td><td>Dostępne na życzenie u autorów</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b&nbsp;</td><td>Dostępne na życzenie u autorów</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podwójna taśma klejąca</td><td>klejąca 3M</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie</td><td></td><td></td> preparacyjne Sylgard <td>Napełnij szklaną szalkę Petriego do brzegu Sylgardem (zabarwionym na czarno drobno zmielonym węglem drzewnym w proszku) lub Sylgard 170; pozostawić w temperaturze pokojowej na 24-48 godzin w celu polimeryzacji</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard ()</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td>SYLG170</tr><tr><td>Szklana szalka Petriego</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 x 1 mm szklane szkiełko mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 mm szklane szkiełko nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Papier chromatograficzny Whatman 3 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-713-336</td><td></td></tr><tr><td>Wazelina</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086-291</td><td>Lub kup w lokalnej aptece.</td></tr><tr><td>Strzykawka 30 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>S7510-30</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Leica TCS SP5 DM</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF Wersja 2.6.0.7266 Oprogramowanie mikroskopowe</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo oka poczwarki drosophila

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Nieodłączne procesy rozwoju poczwarki Drosophila mogą przesuwać i zniekształcać nabłonek oka w sposób, który utrudnia śledzenie zachowania poszczególnych komórek podczas obrazowania żywych komórek. Procesy te obejmują: rotację siatkówki, wzrost komórek i ruch organizmu. Ponadto nieregularności w topologii nabłonka, w tym subtelne nierówności i fałdy często pojawiające się, gdy poczwarka jest przygotowywana do obrazowania, utrudniają uzyskanie ostrych obrazów więcej niż kilku ommatidiów w jednej płaszczyźnie ogniskowej. Opisany tutaj przepływ pracy rozwiązuje te problemy, umożliwiając łatwą analizę procesów komórkowych podczas rozwoju oka poczwarki Drosophila. Odpowiednio ułożone poczwarki są umieszczane w urządzeniu do obrazowania, które można łatwo zmontować w większości laboratoriów. Ubikwityna-DE-Kadheryna:GFP i GMR-GAL4 UAS-α-katenina:GFP są używane do wizualizacji granic komórkowych w nabłonku oka 1-3. Po zastosowaniu dekonwolucji do obrazów fluorescencyjnych uchwyconych w wielu płaszczyznach ogniskowych, maksymalne obrazy projekcyjne są generowane dla każdego punktu czasowego i poprawiane za pomocą oprogramowania do edycji obrazu. Algorytmy wyrównywania służą do szybkiej stabilizacji zbędnego ruchu, dzięki czemu zachowanie poszczególnych komórek jest łatwiejsze do śledzenia.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki jest skuteczną strategią obserwacji zachowań komórek przyczyniających się do wzorcowania neuroepitelium. Rola konkretnych białek może być łatwo oceniona poprzez ekspresję transgenów modyfikujących poziomy białek podczas rozwoju oka. W tym celu wykorzystuje się GMR-GAL4 do napędzania ekspresji transgenów za bruzdą morfogenetyczną. Daje to korzyść w postaci braku zakłócania wcześniejszych zdarzeń ustalających pole oka podczas dwóch pierwszych stadiów larwalnych. Ponadto wiele tran...

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie skutecznej metody generowania filmów obrazowania na żywo rozwoju źrenicy dźrenicy drosofilii. Osiąga się to poprzez usunięcie trwałej ondulacji O, obudowy źrenicy i rozerwanie wzdłuż boku, aby odsłonić nabłonek nerwowy jednego oka. Drugim krokiem jest złożenie zestawu do obrazowania i zamontowanie poczwarki na małym kulce wazeliny.Kolejne seryjne odcinki nabłonka nerwowego w okolicy pasa adhezyjnego pozyskiwane są za pomocą standardowego mikroskopu fluorescencyjnego. Ostatnim krokiem jest ustabilizowanie materiału filmowego i dokonanie korekty kolorów w standardowym oprogramowaniu do edycji obrazu. Ostatecznie obrazowanie żywych komórek nabłonka nerwowego Drosophila służy do wyjaśnienia zachowań komórek, które są wzorcem.Oko Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ częściowe wypreparowanie poczwarki, a następnie prawidłowe zamontowanie jej w urządzeniu do obrazowania może być trudne, ponieważ poczwarki są na tym etapie dość delikatne. Ponadto prawidłowa orientacja poczwarki i prawidłowe umieszczenie szkiełka nakrywkowego nad nabłonkiem oka ma kluczowe znaczenie dla udanego obrazowania. Procedurę zademonstruje Mark Hellerman z naszego laboratorium.Aby rozpocząć eksperyment, wybierz białe pre puy z wcześniej skrzyżowanych genotypów i umieść je w 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych. Następnie umieść 10-centymetrowy kwadratowy kawałek chusteczki nasączonej wodą destylowaną w czystym plastikowym pudełku na końcówki. Włóż probówki mikrowirówek do pudełka z końcówkami.Mokrą tkankę zapobiegnie wysuszeniu poczwarki, a następnie inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 17 do 25 godzin. Po inkubacji umieść kawałek świeżej taśmy dwustronnej na czarnym naczyniu do sekcji cygar. Umieść poczwarkę grzbietową stroną do góry na taśmie i upewnij się, że głowa poczwarki jest przymocowana do taśmy dwustronnej bez przylegania do okolicy piersiowej i brzusznej poczwarki.Za pomocą kleszczy ostrożnie podnieś i zdejmij trwałą ondulację, aby odsłonić głowę źrenicy. Następnie rozerwij wzdłuż boku obudowy źrenicy. Aby odsłonić obszar wokół jednego oka, delikatnie zdejmij źrenicę z taśmy klejącej.Zbuduj małą ramkę o powierzchni 15 milimetrów kwadratowych z bibuły i wybij pięciomilimetrowy otwór w środku. Zanurz ramkę i wodę destylowaną i umieść ją na środku mikroskopu. Wstrzyknąć za pomocą strzykawki o pojemności 30 cm3.Wyciśnij jednolity pierścień wazeliny, aby otoczyć ramkę bibuły. Następnie dodaj małą kulkę wazeliny bezpośrednio na szkiełko. Ostrożnie ułóż poczwarkę na boku i podeprzyj ją kulką wazeliny.Umieść szkiełko nakrywkowe na pierścieniu z wazeliną tak, aby stykało się z nabłonkiem nad okiem. Delikatnie ścisnąć preparat, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe względem wazeliny i wytworzyć małą płaską powierzchnię kontaktową między obszarem źrenicy oka a obrazem szkiełka nakrywkowego, preparatem źrenicy. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego rejestruj seryjne odcinki przez domenę AAL oka, nabłonek nerwowy w okolicy połączenia przylegającego co siedem minut.Użyj odpowiedniego oprogramowania do dekonwolucji, aby zredukować tło i zwiększyć kontrast obrazów sekcji szeregowej dla każdego pliku Zack i oprogramowania L-A-S-A-F. Przejdź do panelu narzędzi. Wybierz opcję Dekonwolucja 3D i kliknij przycisk Zastosuj.Wygeneruj maksymalną projekcję lub obraz MP dla każdego pliku stosu de convoluted. Wyrównaj każdy obraz MP, aby podkreślić zachowania poszczególnych komórek i zmniejszyć rozproszenie spowodowane wzrostem organizmu. Korzystając z wbudowanych algorytmów w Photoshop CS five z zakładki plik w menu głównym, otwórz skrypty i wybierz załaduj pliki do stosu.Następnie zaimportuj pliki obrazów MP do panelu wczytywania warstw. Upewnij się, że opcja Próba automatycznego wyrównania obrazów źródłowych nie jest zaznaczona. W przeciwnym razie dane obrazu mogą być zniekształcone.Po załadowaniu wszystkich plików MP do panelu warstw sprawdź, czy wszystkie obrazy są w porządku chronologicznym i czy najwcześniejszy punkt czasowy znajduje się na górze warstwy. Stosuj je przeciągnij i upuść, aż zostaną poprawnie uporządkowane. W razie potrzeby wybierz opcję Automatycznie wyrównuj warstwy.Wybierz opcję Zmień położenie i kliknij przycisk OK. Nieostre, obszary początkowego obrazu MP mogą być korygowane w celu uzyskania jednolicie ostrego pola siatkówki. Aby rozpocząć przetwarzanie obrazu, należy użyć funkcji kadrowania w systemie LAS.Saf ręcznie ogranicz początkowe i końcowe warstwy, tak aby obejmowały one tylko pas adhezyjny w początkowo nieostrym obszarze. Kliknij przycisk Zastosuj, aby wygenerować nowy plik stosu, który jest zoptymalizowany pod kątem tego regionu. Następnie wygeneruj nową maksymalną projekcję dla lokalnie zoptymalizowanego stosu i wyeksportuj go jako plik TIF w programie Photoshop.Otwórz skrypty i wybierz załaduj pliki do stosu. Następnie wprowadź początkowy plik MP i zoptymalizowany plik MP do panelu wczytywania warstw. Ponownie upewnij się, że opcja Próba automatycznego wyrównania obrazów źródłowych nie jest zaznaczona i wybierz opcję OK.Zaznacz obie warstwy i wybierz warstwy automatycznego mieszania, aby uzyskać jednolicie ostre pole siatkówki. Zapisz ten obraz kompozytowy jako plik TIF. Użyj narzędzia do przekształcania, aby obrócić obrazy w taki sposób, aby grzbietowa oś brzuszna siatkówki była wyrównana z osią Y klatki filmu.Użyj regulacji poziomu poszczególnych klatek, aby zwiększyć kontrast między błoną komórkową a ciałem komórki. Następnie wybierz opcję Utwórz ramki z warstw, aby przekonwertować obrazy na film. Należy pamiętać, że warstwy są dodawane do panelu animacji w kolejności sekwencyjnej, zaczynając od dołu stosu.Aby odwrócić kolejność stosów, zaznacz wszystkie klatki, a następnie zaznacz odwróć klatki. Wybierz czas opóźnienia klatki wynoszący 0,8 sekundy dla każdej klatki i wybierz QuickTime. Eksportuj i wybierz żądany format wideo.Na koniec w obszarze opcji renderowania wybierz liczbę klatek na sekundę do niestandardowej i wprowadź liczbę klatek na sekundę 15. Następnie kliknij przycisk renderuj. Za pomocą tej techniki zaobserwowano wyraźny gradient rozwojowy w całym oku, co skłoniło do szczegółowych opisów wzorców oczu.Podczas owijania pierwotnego dwie komórki zostały zrekrutowane jako pierwotne, które szybko otoczyły wiązki fotoreceptorów, łącząc się ze sobą, tworząc stabilne połączenia. Niezróżnicowane komórki z materiału intero leżały w niezorganizowanym wzorze, podczas gdy rośliny podstawowe owijały się i uszczelniały. Każdy pakiet fotoreceptorów reorganizuje lokalne ruchy komórek.Komórki początkowe zgrupowane po grzbietowej i brzusznej stronie każdej omy. Interkalacja międzykomórkowa przegrupowała komórki z dwóch rzędów w jeden wiersz. Po inter interkalacji pod mikroskopem uchwycono konkurencję trzeciorzędową.Rywalizujące ze sobą komórki zajmowały trzeciorzędową niszę przez pięć do 10 minut przed przemieszczeniem. Ostatecznie pojedyncza komórka ustanowiła stabilną niszę trzeciorzędową. Podczas końcowego przycinania gwałtowny wzrost apoptozy zmniejszył liczbę ICS do minimum wymaganego do wydajnego wytworzenia sieci komórek materiału wejściowego w poprzek oka złożonego.Po opanowaniu obrazowanie środków ochrony indywidualnej można wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Późniejsza obróbka obrazu trwa około godziny.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszej pracy opisujemy protokół badania migracji komórek glejowych do rozwijającego się oka Drosophila za pomocą analizy mikroskopowej żywych tkanek z wykorzystaniem komórek glejowych znakowanych GFP.

Obrazowanie na żywo migracji komórek glejowych w tarczceImaginal oka Drosophila

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna działa poza limitami penetracji charakterystycznymi dla fluorescencyjnej mikroskopii sekcji tkanek. Technika ta opiera się na oświetleniu wieloprojekcyjnym oraz opisie transportu fotonów. Demonstrujemy wizualizację 3D całego organizmu in-vivo podczas morfogenezy wyobraźników skrzydeł wykazujących ekspresję GFP u Drosophila melanogaster.

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in-vivo rozwijających się Drosophila

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Niniejszy protokół opisuje trzy preparaty Drosophila: 1) wypreparowanie mózgu dorosłego osobnika, 2) wypreparowanie siatkówki dorosłego osobnika oraz 3) wypreparowanie kompleksów rozwijającego się krążka oka i mózgu. Szczególny nacisk położono na specjalne techniki przygotowania i warunki obrazowania żywych tkanek, choć wszystkie preparaty mogą być wykorzystane do immunohistochemii tkanek utrwalonych.

Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

Źródło: Hellerman, M. B., et al. Obrazowanie na żywo Drosophila Oko poczwarki. J. Vis. exp. (2015){{TAG_ 28}}Film demonstruje technikę obrazowania na żywo do badania wzorców oczu u poczwarki Drosophila melanogaster. Markery znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) umożliwiają wizualizację organizacji i różnicowania komórek podczas tworzenia rozwijającej się struktury oka.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Metoda Tomato/GFP-FLP/FRT polega na wizualizacji mozaikowych komórek fotoreceptorowych u żywych Drosophila. Może być używany do śledzenia losów poszczególnych komórek fotoreceptorowych w siatkówce przez kilka dni lub tygodni. Metoda ta idealnie nadaje się do badań nad zwyrodnieniami siatkówki i chorobami neurodegeneracyjnymi czy rozwojem komórek fotoreceptorowych.

Metoda pomidorów/GFP-FLP/FRT do obrazowania na żywo mozaikowych dorosłych komórek fotoreceptorowych Drosophila

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Ten protokół opisuje szczegółową metodę długoterminowej hodowli ex vivo i obrazowania na żywo wyobrażonego dysku Drosophila. Pokazuje różnicowanie fotoreceptorów i rotację ommatidialną w ciągu 10 godzin obrazowania na żywo tarczy oka. Protokół jest prosty i nie wymaga kosztownej konfiguracji.

Długoterminowe obrazowanie na żywo dysku oka Drosophila

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

Tutaj przedstawiono protokół długoterminowego obrazowania na żywo nogi Drosophila w fazie poczwarki, obejmujący całkowite usunięcie poczwarki. Protokół ten można również zastosować do innych tkanek.

Długoterminowe obrazowanie na żywo rozwoju nogi poczwarki Drosophila po usunięciu pupary

Poznaj metodę obrazowania na żywo neuroepitelium oka poczwarki Drosophila. Protokół stabilizuje tkankę i wizualizuje granice komórkowe za pomocą białek GFP, umożliwiając szczegółową analizę zachowań komórkowych podczas rozwoju oka.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Przeglądaj więcej filmów