Name: In vitro Analiza komórkowej odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem Myd88 na zakażenie zmutowanym szczepem wirusa Zachodniego Nilu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Poznaj metody cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi komórkowej na zakażenie wirusem Zachodniego Nilu. Techniki umożliwiają badanie aktywacji limfocytów T i prezentacji antygenów przez komórki dendrytyczne w warunkach BSL-2.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH dla T.W. (R01AI072060 i R01AI099123). G. Xie był wspierany przez Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship. Dziękujemy dr Richardowi Flavellowi (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) i dr Shizuo Akirze (Uniwersytet w Osace, Japonia) za dostarczenie MyD88–/– myszy oraz dr Y Cong (UTMB, Galveston) za dostarczenie transgenicznych myszy OTII.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania na Wydziale Medycznym Uniwersytetu w Teksasie.
1. Izolacja DC od myszy niezainfekowanych i zainfekowanych WNV
<ol>
	<li>Zgodność wieku i płci 6-10 tygodniowych, dzikich myszy C57BL/6 (B6) i MyD88−/−. Zaszczepić dootrzewnowo (i.p.) 500 jednostką tworzącą płytkę nazębną (PFU) mutanta WNV NS4B-P38G. W 3 dniu po zakażeniu poddaj myszy eutanazji B6 i MyD88−/− za pomocą CO2. Użyj niezainfekowanych myszy z obu grup jako grupy kontrolnej. Użyj trzech myszy z każdej grupy.</li>
	<li>Zmocz futro po lewej stronie ofiarowanej myszy za pomocą 70% etanolu i odetnij futro wzdłuż lewej strony myszy, mniej więcej w połowie odległości między przednimi i tylnymi nogami. Rozetnij jamę ciała. Usuń śledzionę za pomocą kleszczy. Umieść śledzionę na szalce Petriego z RPMI.</li>
	<li>Wyizoluj DC śledziony za pomocą kulek magnetycznych anty-CD11c zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie i znakowanie limfocytów T transgenicznych myszy OTII
<ol>
	<li>Zbierz jedną śledzionę od naiwnej myszy OTII, jak opisano w kroku 1.2 powyżej, i zhomogenizuj śledzionę między oszronionymi końcami dwóch szkiełk. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, dodać pożywkę RPMI do 14 ml. Pozostawić zawiesinę na 5 minut i przenieść 13 ml do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wyizoluj limfocyty T CD4+ śledziony za pomocą zestawu do izolacji limfocytów T CD4+ zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, przemyć dwukrotnie PBS. Ponownie zawiesić komórki w PBS z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 1 x 106 komórek na ml i dodać 0,5 μmol/ml CFSE. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Dodać 5 ml zimnej, kompletnej pożywki (RPMI-1640 z 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, 1/100 obj. antybiotykami/lekami przeciwgrzybiczymi, 1/100 obj. L-glutaminą i 1/1000 obj. 1,000 x 2-merkaptoetanolem).</li>
	<li>Inkubować na lodzie przez 5 minut. Umyć komórki raz PBS, utrwalić 0,2 x 106 znakowanych limfocytów T CD4 + w 2% PFA i pobrać na cytometr przepływowy. Użyj tej próbki, aby określić podstawowy poziom CFSE. Ponownie zawieś resztę znakowanych komórek na pełnym podłożu.</li>
</ol>
3. Wspólna hodowla limfocytów T OTII z DC myszy zakażonych WNV
<ol>
	<li>Hodowla 2 x 105 oczyszczonych limfocytów T CD4 + myszy OTII samodzielnie lub z oczyszczonymi DC myszy typu dzikiego lub MyD88−/− (2 x 104) na 24-dołkowej płytce z lub bez reszty OVA 323-339 (1 g / ml) w 1 ml kompletnej pożywki na basenik.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 dni. Zebrać komórki, przemyć dwukrotnie w buforze FACS (PBS z 1% FBS) i utrwalić w 0,25 ml 2% PFA. Wir natychmiast.</li>
</ol>
4. Analiza metodą cytometrii przepływowej gruntowania limfocytów T in vitro
<ol>
	<li>Aby uzyskać akwizycję, kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania do cytometrii przepływowej. Aby uzyskać wykres gęstości liniowej FSC-A w porównaniu z liniową SSC-A, wybierz kanały od 0 do 200 000 w FSC-A i od 0 do 200 000 w SSC-A. Następnie utwórz bramkę na żywych komórkach (P2; patrz rysunek 1A).</li>
	<li>Aby przeanalizować intensywność fluorescencji CFSE, otwórz histogram kanału FL1 i uzyskaj 20 000 zdarzeń w populacji bramkowanej. Ustaw marker na próbkach dla komórek OTII hodowanych samodzielnie (Figura 1A).</li>
	<li>W podobny sposób należy pobrać próbki komórek OTII hodowanych wspólnie z DC typu dzikiego (Figura 1B) lub DCs MyD88−/− (Figura 1C).</li>
</ol>
5. Izolacja i stymulacja splenocytów do oznaczania cytokin
<ol>
	<li>Zainfekuj myszy B6 i MyD88−/− mutantem WNV NS4B-P38G, stosując tę samą procedurę, jak opisano w kroku 1.1. W 30 dniu po zakażeniu ponownie prowokuj myszy, które przeżyły, za pomocą 2000 PFU dzikiego szczepu WNV i.p. W 8 i 21 dniu po pierwotnym zakażeniu WNV lub w 4 dniu po wtórnym zakażeniu należy poddać myszy eutanazji za pomocą CO2 w celu pobrania śledziony. 
	UWAGA: Użyliśmy 2-3 myszy na grupę dla każdego punktu czasowego.</li>
	<li>Wykonaj jednokomórkową zawiesinę splenocytów, jak opisano powyżej w kroku 1.2 i kroku 2.2. Policz komórki za pomocą hemocytometru i ponownie zawiesić je w 10 ml kompletnej pożywki.</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki kompletną pożywką do 2,5 x 106 komórek/ml. Dodać 1 ml splenocytów do 1,5 ml probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Aby symulować limfocyty T CD8 +, rozcieńczyć peptydy NS4B i E specyficzne dla WNV (SSVWNATTA i IALTFLAV) do 1 mg / ml w DMSO. W celu stymulacji limfocytów T CD4 + należy rozcieńczyć peptydy NS3 i E specyficzne dla WNV (RRWCFDGPRTNTILE i PVGRLVTVNPFVSVA) do 1 mg / ml w DMSO. Dodać 10 μl peptydów do komórek, a następnie 1 μl roztworu Brefeldin A. Użyj komórek bez leczenia peptydami jako kontroli. Wymieszaj komórki.</li>
	<li>Przebij dwa otwory igłą 18 G w nasadce tuby. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 godzin.</li>
</ol>
6. Barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych
<ol>
	<li>Przenieś komórki do nowej probówki mikrowirówkowej. Wiruj komórki przez 5 minut w temperaturze 300-400 x g i odlej supernatant. Dodać 1 ml buforu FACS, wirować przez 5 minut w temperaturze 300-400 x g i ponownie zawiesić komórki, pipetując ze 120 μl buforu FACS.</li>
	<li>Dodać 2 μl blokera Fc i inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Do każdej probówki dodać 1 ml buforu FACS. Wirowanie 5 min przy 300 - 400 x g.</li>
	<li>Ponownie zawieś komórki w buforze FACS o pojemności 300 μl i podziel je na trzy probówki (około 0,8 x 10,6 komórek na probówkę). Jak pokazano w Tabeli 1, należy zarezerwować pierwszą probówkę z każdego warunku hodowli do barwienia IgG-PE szczurów. Do drugiej probówki dodać 3 μl anty-CD4 APC do komórek traktowanych peptydami CD4, 3 μl anty-CD8 FITC do komórek traktowanych peptydami CD8 lub oba przeciwciała do komórek bez leczenia peptydami. Użyj trzeciej probówki do barwienia kompensacyjnego. Dla każdego warunku hodowli należy użyć trzech probówek komórek wybarwionych samymi przeciwciałami CD4 sprzężonymi z APC, CD8 sprzężonymi z FITC lub CD3 znakowanymi PE (3 μl na probówkę) jako kontrole kompensacji kanałów FL1, FL2 i FL4.</li>
	<li>Krótko zawiruj komórki. Pozostaw na lodzie na 20 minut i chroń przed światłem. Dodać 1,4 ml buforu FACS. Odwirować 5 minut w temperaturze 300-400 x g i odlać z supernatantu.</li>
	<li>Mieszać, aby rozbić osad komórkowy (lub krótko wir). Ponownie zawiesić osad komórkowy w 250 μl roztworu do utrwalania/przepuszczalności przez pipetowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut i chronić przed światłem.</li>
	<li>Dodać 1,2 ml buforu FACS. Wirować 5 minut przy 300-400 x g i ponownie zawiesić komórki w 300 μl buforze FACS. 
	UWAGA: W tym momencie komórki można przenieść do laboratorium BL2 w celu dalszego przetwarzania lub przechowywać w lodówce i chronić przed światłem przez okres do trzech dni.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu FACS. Wirować przez 5 minut przy 300-400 x g i ponownie zawiesić komórki w 500 μl 1x buforu przepuszczalnego/płuczącego. Wirowanie 5 min przy 300-400 x g.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 100 μl 1x trwała ondulacja/płukanie, dodać 3,5 μl anty-IFNγ-PE do probówki wcześniej dodanej z przeciwciałami dla markerów limfocytów T CD4 i/lub CD8 w kroku 6.3 i 3,5 μl szczurzej IgG-PE w probówce przeznaczonej do kontroli IgG przez 25 minut na lodzie i chronić przed światłem. Przemyć komórki, dodając 1,4 ml 1x buforu do przepuszczania/przemywania wody. Wirowanie 5 min przy 300-400 x g. Powtórz etap płukania, dodając 1,4 ml 1x bufor do przepuszczania/płukania.</li>
	<li>Odwirować 5 minut przy 300-400 x g i zdekantować supernatant. Przemyć komórki, dodając 1,4 ml buforu FACS i ponownie zawiesić w 400 μl buforu FACS w celu ostatecznego pobrania.</li>
</ol>
7. Analiza cytometrii przepływowej wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin
<ol>
	<li>Użyj tych samych ustawień pobierania, co w kroku 4.1. Utwórz bramkę na aktywnych komórkach (P2; patrz Rysunek 2A). Dostosuj napięcia za pomocą lamp kompensacyjnych dla każdej grupy.</li>
	<li>Otwórz dwa nowe wykresy kropkowe, jeden do wyświetlania danych zebranych dla FL1 vs. FL2 (CD8 kontra. IFN-γ), a drugi ma na celu wyświetlenie danych zebranych dla FL4 vs. FL2 (CD4 vs. IFN-γ). Uzyskaj 50 000 zdarzeń dla populacji bramkowanej każdej próbki.</li>
</ol>

<ol><li>Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">West Nile virus.</a> Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).</li>
<li>Welte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+an+attenuated+West+Nile+virus+NS4B-P38G+mutant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain.</a> Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).</li>
<li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+control+of+the+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor control of the adaptive immune responses.</a> Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).</li>
<li>Akira, S., Hemmi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+pathogen-associated+molecular+patterns+by+TLR+family%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family.</a> Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).</li>
<li>Xie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+West+Nile+virus+NS4B-P38G+mutant+strain+induces+adaptive+immunity+via+TLR7-MyD88-dependent+and+independent+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A West Nile virus NS4B-P38G mutant strain induces adaptive immunity via TLR7-MyD88-dependent and independent signaling pathways.</a> Vaccine. 31 (38), 4143-4151 (2013).</li>
<li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+T+cells+promote+the+maturation+of+dendritic+cells+during+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">gammadelta T cells promote the maturation of dendritic cells during West Nile virus infection.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 59, 71-80 (2010).</li>
<li>Silva, M. C., Guerrero-Plata, A., Gilfoy, F. D., Garofalo, R. P., Mason, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activation+of+human+monocyte-derived+and+plasmacytoid+dendritic+cells+by+West+Nile+virus+generated+in+different+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential activation of human monocyte-derived and plasmacytoid dendritic cells by West Nile virus generated in different host cells.</a> J. Virol. 81, 13640-13648 (2007).</li>
<li>Shrestha, B., Samuel, M. A., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+Cells+Require+Perforin+To+Clear+West+Nile+Virus+from+Infected+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T Cells Require Perforin To Clear West Nile Virus from Infected Neurons.</a> J. Virol. 80, 119-129 (2006).</li>
<li>Wang, Y., Lobigs, M., Lee, E., Mullbacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+mediate+recovery+and+immunopathology+in+West+Nile+virus+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells mediate recovery and immunopathology in West Nile virus encephalitis.</a> J. Virol. 77, 13323-13334 (2003).</li>
<li>Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+measure+T-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Methods to measure T-cell responses.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).</li>
<li>Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+cell+division+in+vivo+and+in+vitro+using+flow+cytometric+measurement+of+CFSE+dye+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution.</a> J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).</li>
<li>Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Hantaan+virus-containing+samples+for+subsequent+investigations+outside+biosafety+level+3+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities.</a> Intervirology. 48, 255-261 (2005).</li>
<li>Saxena, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hamster-derived+west+nile+virus+isolate+induces+persistent+renal+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl.+Trop.+Dis%22%5BJournal%5D)">A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275(2013).</li>
<li>Welte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vgamma4%2B+T+cells+regulate+host+immune+response+to+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

WNV jest patogenem BL3. Ze względu na przepisy bezpieczeństwa, testy immunologiczne z próbkami zakażonymi WNV są często ograniczone dostępnością sprzętu w obiektach BL3 lub bardziej długotrwałe i żmudne do wykonania. W niedawnym badaniu zastosowaliśmy dwie metody oparte na cytometrii przepływowej do zbadania odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem komórek podczas infekcji WNV5. W obu testach komórki zakażone WNV traktowano bezpośrednio 1-2% PFA lub roztworem utrwalającym/przepuszczalnym zawierającym 4% PFA...

Wirus Zachodniego Nilu (WNV), neurotropowy, flawiwirus z plusem, stanowi nowe zagrożenie dla zdrowia publicznego. Obecnie żadna szczepionka nie została zatwierdzona do stosowania u ludzi1. Wiadomo, że atenuowany szczep WNV, który ma substytucję P38G w białku niestrukturalnym (NS)4B, nie indukuje śmiertelności u myszy, ale wyższe wrodzone cytokiny i odpowiedzi komórek T u myszy niż szczepWNV NY99 typu dzikiego 2. Myszy zaszczepione mutantem NS4B-P38G były chronione przed wtórnym wyzwaniem śmiertelnym dzikim WNV. Sugeruje to, że mutant NS4B-P38G ma odpowiednie cechy dla idealnego kandydata na szczepionkę. Mechanizmy, za pomocą których mutant NS4B-P38G indukuje wysoką ochronną odporność adaptacyjną, nie są jeszcze dokładnie poznane. Receptory toll-podobne (TLR), które rozpoznają wzorce molekularne związane z patogenem, odgrywają zasadniczą rolę w inicjacji wrodzonej odporności na infekcję wirusową. Rdzeń szlaku sygnałowego TLR wykorzystuje gen pierwotnej odpowiedzi szpiku 88 (MyD88) jako główny adaptor3,4. W niedawnym badaniu wykazano, że sygnalizacja MyD88 odgrywa ważną rolę w rozwoju odporności komórkowej podczas infekcji mutantem WNV NS4B-P38G u myszy5. Komórki dentrytyczne (DC) są jednymi z najważniejszych komórek prezentujących antygen, wykazującymi unikalną zdolność do inicjowania pierwotnych odpowiedzi limfocytów T podczas infekcji wirusowej6,7. Limfocyty T CD4 + i CD8 + przyczyniają się do długotrwałej odporności ochronnej i są ważne dla przetrwania gospodarza po zakażeniu WNV typu dzikiego8,9. W tym badaniu zastosowano dwa testy immunologiczne w celu oceny funkcji tych komórek u myszy zakażonych mutacją NS4B-P38G.
Po pierwsze, test in vitro na bazie limfocytów T został wykorzystany do porównania zdolności do prezentacji antygenu przez DC myszy typu dzikiego i MyD88−/− zakażonych WNV. Aby zwiększyć czułość testu, naiwne limfocyty T CD4 + wyizolowano od myszy transgenicznych OTII, które wyrażają TCR Vα2 / Vβ5 specyficzny dla peptydu albuminy jaja kurzego (OVA) 323 - 339. DC myszy zakażonych WNV oczyszczono i współhodowano z limfocytami T CD4 + znakowanymi karboksyfluoresceiną sukcynimidylem wielkanocnym (CFSE) w obecności peptydu OVA. Po 5 dniach kohodowli komórki zebrano i utrwalono za pomocą paraformaldehydu (PFA) i przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Testy proliferacyjne tradycyjnie przeprowadza się poprzez włączenie 5-bromo-2'-deoksyurydyny (BrdU) lub trityowanego deoksyrybozydu tyminy (3HTdr)10. Niemniej jednak testy te są albo radioaktywne, albo wymagają specjalnego sprzętu w obiektach na poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BL) 3, w których prowadzone są badania WNV. Analiza cytometryczna przepływowa proliferacji limfocytów poprzez seryjne zmniejszanie o połowę intensywności fluorescencji ważnego barwnika CFSE stała się częściej stosowana w testach immunologicznych, ponieważ barwnik jest bardziej stabilnie i równomiernie wprowadzany do komórek, łatwo wykrywany przez cytometrię przepływową i jest nieradioaktywny11. Test ma również możliwość oceny liczby podziałów komórkowych. Jedną z głównych zalet stosowania tego testu w badaniach WNV jest to, że utrwalenie zakażonych komórek za pomocą 1-2% PFA może dezaktywować WNV12, co umożliwi pobranie próbki za pomocą cytometru przepływowego w laboratorium BL2.
Następnie, zmodyfikowana procedura barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych (ICS) została użyta do zbadania roli sygnalizacji MyD88 w regulacji odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla WNV u myszy zakażonych mutacją NS4B-P38G. W tym teście splenocyty wyizolowane od zakażonych myszy traktowano in vitro peptydami specyficznymi dla WNV. Brefeldyna A została dodana w celu zatrzymania cytokin w komórce. Po 5 godzinach inkubacji komórki zebrano, umyto i wybarwiono pod kątem podzbiorów limfocytów T. Komórki następnie utrwalono w PFA, przeniknięto i wybarwiono pod kątem interferonu (IFN)-γ i przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Podobnie jak w przypadku innych testów opartych na cytometrii przepływowej, po potraktowaniu komórek buforem utrwalającym i przepuszczalnym zawierającym PFA, zakażone próbki można przenieść do laboratorium BL2 w celu dalszego przetwarzania i analizy. W kilku opublikowanych badaniach użyliśmy ICS do pomiaru funkcji efektorów limfocytów T u myszy zakażonych WNV13,14. Chociaż jest to dobrze znane, jedną z głównych wad tego testu jest to, że procedura jest bardzo długa i może być bardziej czasochłonna, gdy jest wykonywana w obiektach BL3. W tym przypadku wykazano, że metoda ICS oparta na probówkach mikrowirówkowych jest bardziej wykonalna, łatwiejsza do przeprowadzenia i mniej czasochłonna, gdy jest wykonywana w laboratorium BL3.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td>rozgrzewka przy 37 stopniach; </td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne C anty-CD11c</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td>są zgodne z zaleceniami producenta s instrukcje</td></tr><tr><td>koraliki magnetyczne anty-CD4</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-248</td><td>postępuj zgodnie z instrukcjami producenta s instrukcje</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Reszta OVA 323-339</td><td>Genscript Corporation</td><td>RP10610</td><td></td></tr><tr><td>Peptydy</td><td>Proimmune</td><td>PC0AD-D Brefeldin</td><td></td></tr><tr><td>A roztwór</td><td>BD Bioscience</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Mysi bloker Fc</td><td>e-Bioscience</td><td>14-0161-85</td><td></td></tr><tr><td>CD4</td> <td>sprzężony z APCe-Bioscience</td><td>17-0041-81</td><td></td></tr><tr><td>CD8 sprzężony z FITC</td><td>e-Bioscience</td><td>11-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do utrwalania/permeabilizacji</td><td>BD-Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do permeabilizacji/płukania</td><td>BD-Bioscience</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>anty-IFN&gamma;-PE</td><td>e-Bioscience</td><td>12-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Accuri</td><td>BD Biologią</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro analiza komórkowej odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem myd88 na zakażenie zmutowanym szczepem wirusa zachodniego nilu

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Atenuowany wirus Zachodniego Nilu (WNV), niestrukturalny (NS) mutant 4B-P38G, indukował wyższe wrodzone odpowiedzi cytokin i limfocytów T niż dziki typ WNV u myszy. Niedawno wykazano, że sygnalizacja czynnika różnicowania szpiku 88 (MyD88) jest ważna dla początkowego pobudzania limfocytów T i rozwoju komórek T pamięci podczas infekcji mutantem WNV NS4B-P38G. W tym badaniu wykorzystano dwie metody oparte na cytometrii przepływowej – test pobudzania limfocytów T in vitro i wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin (ICS) – do oceny komórek dendrytycznych (DC) i funkcji limfocytów T. W teście primingu limfocytów T proliferację komórek analizowano za pomocą cytometrii przepływowej po wspólnej hodowli DC z obu grup myszy z estrem karboksyfluoresceiny sukcynimidylowej (CFSE) - znakowanymi limfocytami T CD4 + myszy transgenicznych OTII. Podejście to pozwoliło na dokładne określenie odsetka proliferujących limfocytów T CD4 + przy znacznie lepszej ogólnej czułości niż tradycyjne testy z odczynnikami promieniotwórczymi. System probówek mikrowirówkowych zastosowano zarówno w procedurach barwienia hodowli komórkowych, jak i cytokin w protokole ICS. W porównaniu z tradycyjnym systemem opartym na płytkach do hodowli tkankowych, ta zmodyfikowana procedura była łatwiejsza do wykonania w obiektach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BL) 3. Co więcej, komórki zakażone WNV poddano działaniu paraformaldehydu w obu testach, co umożliwiło dalszą analizę poza obiektami BL3. Ogólnie rzecz biorąc, te testy immunologiczne in vitro mogą być wykorzystywane do skutecznej oceny odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem komórek podczas infekcji WNV.

W teście primingu limfocytów T, limfocyty T CD4+ znakowane CFSE hodowano z oczyszczonymi komórkami DC od myszy typu dzikiego oraz myszy MyD88−/− zainfekowanych mutantem NS4B-P38G, w obecności lub wobec braku peptydów OVA. Jako kontrole negatywne wykorzystano znakowane limfocyty T hodowane osobno, z OVA lub bez niej, przez 5 dni. Jak pokazano na Rysunku 1A, całkowitą populację limfocytów T wyodrębniono w celu analizy intensywności fluorescencji w kanale FL1. Mar...

Dwie metody oparte na cytometrii przepływowej - test in vitro na bazie limfocytów T i wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin zostały wykorzystane do zmierzenia zdolności komórek dendrytycznych do prezentacji antygenu i odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu na infekcję mutantem wirusa Zachodniego Nilu u myszy.

In vitro Analiza komórkowej odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem Myd88 na zakażenie zmutowanym szczepem wirusa Zachodniego Nilu

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Ogólnym celem tego badania jest wprowadzenie dwóch testów immunologicznych opartych na cytometrii przepływowej do pomiaru odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem komórek na zakażenie wirusem Zachodniego Nilu w teście pobudzania limfocytów T in vitro komórek dendrytycznych lub dcs oczyszczonych z myszy zakażonych wirusem West Nll. Kokultura z naiwnymi limfocytami T znakowanymi CFSE oczyszczonymi z OT dwóch transgenicznych myszy w obecności peptydu jajowego. Odpowiedź proliferacyjna limfocytów T jest następnie analizowana za pomocą cytometrii przepływowej w laboratorium drugiego poziomu bezpieczeństwa biologicznego w zmodyfikowanym wewnątrzkomórkowym teście barwienia cytokin cytokin cytów od myszy zakażonych wirusem Zachodniego Nilu, A stymulowanego ex vivo peptydami specyficznymi dla Zachodniego Nilu w probówce mikrowirówkowej, a następnie komórka podtrzymuje się do wewnątrzkomórkowej produkcji cytokin i jest analizowana w probówce za pomocą cytometrii przepływowej w laboratorium drugiego poziomu bezpieczeństwa biologicznego.Ostatecznie metody te mogą być wykorzystane do zbadania roli specyficznych szlaków sygnałowych w aktywacji limfocytów T u zwierząt zakażonych wirusem Zachodniego Nilu i znacznie skracają czas działania w obiektach o trzecim poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w odporność komórkową zachodniego wirusa N, można ją również zastosować do innych patogenów trzeciego poziomu bezpieczeństwa biologicznego do testu pobudzania limfocytów T in vitro. Zacznij od wyizolowania komórek dendrytycznych śledziony od dzikich myszy typu C 57 black six A, moich myszy D eight eight knockout zaszczepionych wirusem Zachodniego Nilu i kontroluj niezakażone zwierzęta za pomocą kulek magnetycznych anty CD 11 C zgodnie z instrukcjami producenta.Następnie, aby wyizolować limfocyty T, homogenizuj śledzionę wyciętą od myszy OT dwóch z matowymi końcami dwóch szkiełek, przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów, a następnie dodaj pożywkę RPMI do końcowej objętości 40 mililitrów. Pozwól komórkom osiąść przez pięć minut, a następnie przenieś 30 mililitrów powstającego sup do nowej 50-mililitrowej stożkowej probówki. Następnie użyj zestawu do izolacji czterech dodatnich limfocytów T CD zgodnie z instrukcjami producenta, aby posortować cztery dodatnie komórki T CD, a następnie przenieś zebrane komórki do 50-mililitrowej stożkowej probówki, a następnie dwukrotnie przepłucz w PBS Po drugim przemyciu inkubuj komórki w PBS z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej w jednym czasie z sześciu komórek na mililitr i 0,5 mikromola na mililitr CFSE w temperaturze 37 stopni Celsjusza chronionych Ze światła po 10 minutach inkubować komórki w pięciu mililitrach zimnego, kompletnego podłoża na lodzie przez pięć minut.Następnie, po kolejnym płukaniu PBS, przymocuj 0,2 razy 10 do sześciu znakowanych przez CFSE CD czterech dodatnich limfocytów T w 2% PFA i określ podstawowy poziom ekspresji CFSE komórek T za pomocą cytometrii przepływowej. Ponownie zawiesić resztę komórek znakowanych CFSE, niekompletnych, pożywkę, a następnie hodować dwa razy 10 do pięciu oczyszczonych lub dwóch CD czterech dodatnich limfocytów T samodzielnie lub dwa razy 10 do czterech oczyszczonych dzikich typów lub moich D osiem osiem knockout dcs w 24-dołkowej płytce z lub bez jednego mikrograma na mililitr nad pozostałością 3 23 3 39 w jednym mililitrze kompletnej pożywki na studzienkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza po pięciu dniach zbierz komórki i umyj je dwukrotnie w buforze faktów i utrwal granulki w 0,25 mililitra 2% PFA i natychmiast wiruj próbki w celu uzyskania danych cytometrii przepływowej. Kliknij dwukrotnie oprogramowanie do cytometrii przepływowej i wybierz kanały od zera do 200 000 w przypadku rozproszenia do przodu i od zera do 200 000 w przypadku rozproszenia bocznego, aby wygenerować wykres gęstości.Następnie utwórz bramkę na studniach pod napięciem, aby przeanalizować intensywność fluorescencji CFSE. Otwórz histogram dla jednego kanału FL i uzyskaj 20 000 zdarzeń w populacji bramkowanej. Następnie ustaw marker na próbkach dla dwóch komórek OT hodowanych samodzielnie.Uzyskaj dane dotyczące kohodowli dwóch komórek OT z typem dzikim lub moim D osiem knockout dcs w podobny sposób dla wewnątrzkomórkowego testu barwienia cytokin. Po wytworzeniu pojedynczej zawiesiny komórkowej ze śledziony zebranej z wirusa Zachodniego Nilu, zakażone myszy w odpowiednich punktach czasowych liczą komórki, a następnie rozcieńczają je kompletną pożywką do 2,5 razy centa z sześciu komórek na mililitr stężenia. Następnie Eloqua jeden mililitr cytów do 1,5 mililitrowej rurki mikrocentrycznej.A następnie, aby stymulować CD osiem dodatnich limfocytów T, dodaj 10 mikrolitrów świeżo rozcieńczonych peptydów specyficznych dla Zachodu, a następnie jeden mikrolitr felda. W roztworze dokładnie wymieszaj zawiesiny komórek, a następnie przebij dwa otwory w nasadce probówki igłą o rozmiarze 18 i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć godzin. Po przeniesieniu komórek do nowej mikroprobówki wirówkowej i odwirowaniu ich po umyciu jednego mililitra bufora faksowego, ponownie zawiesić drugą osadkę w 120 mikrolitrach bufora faksu.Następnie zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania blokiem FC i oznacz probówki odpowiednimi przeciwciałami eksperymentalnymi i kontrolnymi, jak opisano w tabeli. Następnie inkubować komórki w buforze utrwalającym i przenikającym, a następnie przenieść komórki do poziomu bezpieczeństwa biologicznego do laboratorium w celu znakowania przeciwciałami kontrolnymi lub antyinterferonowymi przeciwciałami gamma zgodnie z tabelą. Aby zmierzyć produkcję cytokin wewnątrzkomórkowych, ustaw wykres punktowy do przodu po boku, jak pokazano, a następnie bramkuj żywe komórki za pomocą rurek kompensacyjnych, aby w razie potrzeby dostosować napięcia.Utwórz jeden wykres punktowy, aby wyświetlić dane zebrane dla ośmiu komórek dodatnich i interferonowych komórek gamma-dodatnich w porównaniu z interferonem gamma, a następnie drugi dla czterech komórek dodatnich w porównaniu z interferonem gamma-dodatnich i uzyskaj 50 000 zdarzeń dla bramkowanej populacji każdej próbki. W tym eksperymencie całkowite komórki C zostały bramkowane w celu określenia szybkości proliferacji podstawowych limfocytów T. W przypadku braku kokultury z dcs.Gdy limfocyty T były współhodowane z DC izolowanym ze zwierząt zakażonych wirusem Zachodniego Nilu, limfocyty T CFSE wykazywały 87% proliferację Limfocyty T znakowane CFSE Kohodowla z DCS z myszy z nokautem moich D osiem osiem w obecności nadmiernej wykazano 74,5% szybkość proliferacji, co sugeruje, że niedobór w szlaku sygnałowym my D eight eight prowadzi do upośledzenia zdolności prezentowania antygenu przez DCS podczas zmutowanego West null zakażenie wirusem. Odsetek limfocytów T CD z czterema dodatnimi interferonami gamma i CD ośmioma z dodatnim interferonem gamma wyizolowanymi z myszy typu dzikiego zakażonych wirusem Zachodniego Nilu w tej reprezentatywnej liczbie wynosił odpowiednio 0,4% i 1,7%. Podczas gdy odsetek podwójnie dodatnich limfocytów T śledziony wyizolowanych z wirusa Zachodniego Nilu zainfekował moje myszy z nokautem D osiem osiem wynosiły tylko 0,2% i 0,6%Podobne analizy przeprowadzono z cytami wyizolowanymi od niezakażonych myszy, bez zaobserwowania różnicy w odsetku podwójnie dodatnich populacji komórek T między dwiema grupami.Co więcej, pojedyncze dodatnie populacje czterech dodatnich limfocytów T CD i ośmiu dodatnich limfocytów T CD od zakażonych myszy typu dzikiego stanowiły 21% i 13,3% całkowitych bramkowanych cytów SP, podczas gdy określono je na tylko 15,9% i 11,2% moich ośmiu cytów SP z nokautem w porównaniu z grupami zakażonymi, zarówno cztery dodatnie CD, jak i osiem dodatnich odpowiedzi limfocytów T CD osiem były zmniejszone w porównaniu z moimi ośmioma myszami z nokautem do grupy typu dzikiego w ósmym dniu po zakażeniu zmutowanym wirusem ślimaka zachodniego. Podsumowując, moja sygnalizacja D eight eight bierze udział w początkowej aktywacji limfocytów T obu populacji i przyczynia się do dodatnich odpowiedzi limfocytów T CD four na późniejszym etapie infekcji. Cytometria flupejkowa oparta na prymazie limfocytów t in vitro przy użyciu dwóch limfocytów T znakowanych OT w CFSE zapewnia dokładniejsze określenie procentu proliferujących limfocytów T CD4-dodatnich przy znacznej poprawie ogólnej czułości niż obecne standardowe protokoły.Rurka mikropolowa, ICS Math third nie wymaga żadnych specjalnych instrumentów, co oferuje zarówno bardziej ekonomiczny, jak i bardziej elastyczny wybór dla badaczy.

in-vitro-analysis-myd88-mediated-cellular-immune-response-to-west

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

System genetyki odwrotnej dla szczepionkowego szczepu MP-12 wirusa gorączki Doliny Rift jest użytecznym narzędziem do tworzenia dodatkowych mutantów MP-12 o zwiększonej atenuacji i immunogenności. Opisujemy protokół generowania i charakteryzacji szczepów mutantów NSs.

Wykorzystanie genetyki odwrotnej do manipulacji genem NSs szczepu MP-12 wirusa gorączki doliny Rift w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności szczepionki

γ-herpeswirusy (γ-HVs) ustanawiają dożywotnią persistencję w organizmie gospodarza. Zakażenie myszy wirusem γ-HV68 zapewnia genetycznie dostępny model in vivo do charakteryzacji cyklu życiowego i patogenezy γ-HVs. Niniejszy protokół opisuje wykrywanie i oznaczanie ilościowe zakażenia γHV68 w fazie ostrej i latentnej po zakażeniu, z wykorzystaniem metody tworzenia blaszek, metody ognisk zakaźnych oraz analizy qPCR.

Pomiar zakażenia $\gamma$HV68 u myszy

Opisujemy protokół pomiaru produkcji cytokin przeciwwirusowych u myszy zakażonych modelowym herpeswirusem, mysim gamma herpesvirus 68 (γHV68), który jest blisko spokrewniony z ludzkim wirusem opryszczki Kaposiego (KSHV) i wirusem Epsteina-Barr (EBV). Wykorzystując genetycznie zmodyfikowane szczepy myszy i mysie fibroblasty embrionalne (MEF), oceniliśmy produkcję cytokin przeciwwirusowych zarówno in vivo, jak i ex vivo. "Odtwarzając" ekspresję wrodzonych składników odpornościowych w...

Analiza wrodzonej sygnalizacji immunologicznej w unikaniu produkcji cytokin przez wirusa

Wirus Zika (ZIKV), nowy patogen, jest powiązany z nieprawidłowościami rozwojowymi płodu i małogłowiem. Stworzenie skutecznego systemu hodowli komórek zakaźnych ma kluczowe znaczenie dla badań nad replikacją ZIKV, a także dla opracowywania szczepionek i leków. W niniejszej pracy zilustrowano i omówiono różne testy wirusologiczne dotyczące ZIKV.

System zakaźnych hodowli komórek wirusa Zika i profilaktyczne działanie interferonów in vitro

Wirusy grypy typu A (IAV) są ważnymi ludzkimi patogenami układu oddechowego. Aby zrozumieć patogenność wirusów IAV i przeprowadzić badania przedkliniczne nowych metod szczepień, potrzebne są modele zwierzęce naśladujące ludzką fizjologię. W tym miejscu opisujemy techniki oceny patogenezy IAV, odpowiedzi humoralnych i skuteczności szczepionki przy użyciu mysiego modelu infekcji.

Badania wirusa grypy A w mysim modelu infekcji

Opisano protokół oceny odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu w narządach immunouprzywilejowanych mysiego modelu Ifnar1-/- dla infekcji wirusem Zika (ZIKV). Metoda ta ma kluczowe znaczenie dla badania komórkowych mechanizmów ochrony i immunopatogenezy szczepionek ZIKV, a także jest cenna dla oceny ich skuteczności.

Ocena odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla wirusa Zika w narządach z uprawnieniami immunologicznymi zakażonych myszy Ifnar1-/-

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia immunokompetentnego mysiego modelu infekcji ośrodkowego układu nerwowego ICR (Institute of Cancer Research), aby pokazać rozwój neuropatii. Monitorowanie ostrych wirusowych zaburzeń encefalitycznych za pomocą identycznych wyników choroby można przeprowadzić w celu wykazania neuropatii wywołanej wirusem dengi in vivo.

Mysi model ostrej choroby podobnej do wirusowego zapalenia mózgu wywołanej wirusem dengi

Celem protokołu jest zademonstrowanie technik używanych do badania chorób wirusowych poprzez izolację i ilościowe określenie wirusa Zika z wielu narządów u myszy po zakażeniu.

Izolacja i kwantyfikacja wirusa Zika z wielu narządów myszy

Ten artykuł opisuje protokoły oceny odpowiedzi Tfh i GC B w mysim modelu infekcji wirusem grypy.

Ocena komórek pomocniczych pęcherzyków T i odpowiedzi centrum rozrodczego podczas infekcji wirusem grypy A u myszy

Do wykrywania wewnątrzkomórkowej Wolbachii użyto czterech metod, które wzajemnie się uzupełniały i poprawiały dokładność wykrywania infekcji Wolbachia Aa23 pochodzącej z Aedes albopictus i Aa23-T wyleczonej z rodzimej infekcji Wolbachia za pomocą antybiotyków.

Wykrywanie szczepu Wolbachia wAlbB w liniach komórkowych Aedes albopictus

Poznaj metody cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi komórkowej na zakażenie wirusem Zachodniego Nilu. Techniki umożliwiają badanie aktywacji limfocytów T i prezentacji antygenów przez komórki dendrytyczne w warunkach BSL-2.

In vitro Analiza komórkowej odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem Myd88 na zakażenie zmutowanym szczepem wirusa Zachodniego Nilu (Wideo) | JoVE Journal

In vitro Analiza komórkowej odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem Myd88 na zakażenie zmutowanym szczepem wirusa Zachodniego Nilu

Przeglądaj więcej filmów