Name: Wykorzystanie oprogramowania plusTipTracker do pomiaru dynamiki mikrotubul w stożkach wzrostu Xenopus laevis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj metodę analizy dynamiki mikrotubul w stożkach wzrostu Xenopus laevis za pomocą oprogramowania plusTipTracker. Automatyczne śledzenie EB1-GFP umożliwia szybkie i precyzyjne badanie białek +TIP w żywych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Gaudenzowi Danuserowi i członkom jego laboratorium za stworzenie oprogramowania plusTipTracker oraz za pomocną dyskusję na temat korzystania z oprogramowania, w szczególności Marii Bagonis i Sebastiena Bessona. Szczególnie dziękujemy Boston College Media Center za pomoc i wsparcie w tworzeniu i montażu filmu. Dziękujemy również członkom Lowery Lab za użyteczne dyskusje i konstruktywną krytykę, a także Abigail Antoine za korektę manuskryptu. Ta praca została sfinansowana z nagrody NIH R00 MH095768 dla LAL.

Ten protokół i wideo mają służyć jako dodatek do oryginalnego artykułu opisującego pakiet oprogramowania bardziej szczegółowo4, jak również do raportu technicznego, który jest dołączony do pobrania oprogramowania na stronie internetowej Danuser Lab. Zachęcamy czytelników do uważnego zapoznania się z tymi dokumentami, jeśli pojawią się dodatkowe pytania dotyczące korzystania z oprogramowania.
1. Przed analizą obrazu
<ol>
	<li>Konwertuj każdy film poklatkowy na sekwencję plików graficznych TIFF (Tagged Image File Format). Jeśli w danym filmie znajduje się wiele stożków/komórek wzrostu, najpierw przytnij każdy stożek/komórkę wzrostu, aby utworzyć własną sekwencję obrazu. 
	Uwaga: Nie jest to konieczne, ponieważ poszczególne regiony zainteresowania (ROI) można wybrać w plusTipTracker. Jednak użycie mniejszych wymiarów obrazu zwiększa szybkość przetwarzania obliczeniowego, dlatego ten krok jest zalecany, jeśli w obrazie jest dużo pustego miejsca.</li>
	<li>Zapisz każdą serię TIFF w osobnym folderze o nazwie "images" w ścieżce, do której program MATLAB ma dostęp (należy pamiętać, że w polu "images" rozróżniana jest wielkość liter). Aby dodać nową ścieżkę, przejdź do odpowiedniego katalogu plików w oknie "Bieżący folder", kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę katalogu i wybierz "Dodaj do ścieżki – Wybrane foldery i podfoldery". Ważne jest, aby folder oprogramowania plusTipTracker został również dodany do Ścieżki.</li>
</ol>
2. plusTipGetTracks
Uwaga: Pierwszym krokiem w analizie obrazu jest wykrycie komet EB1-GFP, połączenie komet w ścieżki i określenie parametrów dynamiki mikrotubul. Uzyskuje się to za pomocą polecenia "plusTipGetTracks"4.
<ol>
	<li>Aby rozpocząć analizę, otwórz aplikację MATLAB i wpisz "plusTipGetTracks" w oknie poleceń. Spowoduje to pojawienie się nowego okna dialogowego.</li>
	<li>Kliknij "Skonfiguruj nowe projekty" i wybierz jeden (lub więcej) z poprzedniej serii obrazów TIFF, wybierając odpowiedni folder "images" (lub katalogi zawierające foldery "images"). Po wykonaniu tego kroku zostanie utworzony katalog plików (roi_1) (w tym samym folderze, w którym znajdują się "obrazy"), który będzie zawierał przyszłe pliki danych. Uwaga: krok "Konfiguracja nowych projektów" można wykonać z wyprzedzeniem, podczas osobnej sesji.</li>
	<li>Pojawi się nowe okno: "Wybierz wielokąt, kliknij prawym przyciskiem myszy ostatni punkt i kliknij 'Utwórz maskę'". Kliknij "OK". Następnie zostanie wyświetlony pierwszy obraz z wybranej serii obrazów. Użyj myszy, aby kliknąć i utworzyć wielokąt, który obejmuje cały stożek wzrostu. Kliknij dwukrotnie myszą, aby zamknąć wielokąt.</li>
	<li>Po zamknięciu wielokąta pojawi się okno dialogowe: "Czy chcesz wybrać inny ROI?" Jeśli obraz ma inny stożek wzrostu do analizy, wybierz "Tak"; w przeciwnym razie wybierz "Nie".</li>
	<li>Wybierz projekty, które będą od razu analizowane. Kliknij "Wybierz projekty" i wybierz folder (roi_X) do analizy.</li>
	<li>Pojawi się ekran listSelectGUI. Wybierz projekty z lewej strony ekranu i przenieś je na prawą stronę ekranu. Kliknij "OK". Wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać listę projektów i kliknij "Zapisz".</li>
	<li>Wybierz "Wykrywanie", "Śledzenie" i "Przetwarzanie końcowe". Po dokonaniu tych wyborów prawa strona okna dialogowego stanie się konfigurowalna. Skonfiguruj każdą opcję.
	<ol>
		<li>Parametry te są używane do łączenia wykrytych komet ze śladami MT. Szczegółowe informacje na temat wyboru tych parametrów sterowania do śledzenia znajdują się na stronach 9-10 raportu technicznego w formacie PDF, który jest dołączony do pobrania pakietu oprogramowania; Przeczytaj uważnie ten raport, jeśli wystąpią problemy. Do celów śledzenia komet EB1-GFP w stożkach wzrostu Xenopus laevis należy użyć następujących ustawień śledzenia: Zakres promienia wyszukiwania (piksele) 5-12, Minimalna długość toru podrzędnego (klatki) 3; Maksymalna długość odstępu (klatki): 8; Maksymalny współczynnik skurczu 0,8, maksymalny kąt do przodu 50, maksymalny kąt do tyłu 10, promień wahań 2,5. Te ustawienia pokazano na rysunku 1.</li>
	</ol>
	 
	Uwaga: Maksymalny współczynnik skurczu jest ustawiony w celu zmniejszenia liczby wykrywanych "luk wstecznych", ponieważ "luki wsteczne" nie są przydatne do analizy w kontekście stożków wzrostu, biorąc pod uwagę zatłoczone warunki i prawdopodobne błędy w połączeniach torów. Dodatkowo, zarówno maksymalny kąt do przodu, jak i promień fluktuacji są ustawione stosunkowo wysoko, ponieważ stożki wzrostu wykazują małe częste translokacje oprócz wzrostów i skurczów, a zwiększenie tych ustawień kontrolnych pozwala na zwiększony ruch podczas kroku połączenia.
	<ol>
		<li>Wypełnij ustawienia przetwarzania końcowego w zależności od żądanych określonych ustawień akwizycji obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po skonfigurowaniu ustawień kliknij "Start". Oprogramowanie uruchomi się niezależnie od wybranych ustawień. Może to potrwać od kilku minut do kilku godzin, w zależności od liczby wybranych projektów i ich rozmiarów. W oknie poleceń wyświetlany jest szacowany czas pozostały dla każdej funkcji. Po zakończeniu kroku plusTipGetTracks w oknie poleceń pojawi się komunikat "Zakończono!" 
	Uwaga: Długa lista szczegółowych parametrów dynamiki MT została teraz obliczona przez to oprogramowanie (szczegółowe informacje można znaleźć w Piśmiennictwie 4), ale w przypadku analizy dynamiki MT w stożkach wzrostu, najbardziej przydatnymi parametrami do zbadania są prędkość ścieżki wzrostu MT (w mikronach / minutę), czas życia ścieżki wzrostu (w sekundach) i długość ścieżki wzrostu (w mikronach).</li>
</ol>
3. plusTipSeeTracks
Uwaga: Teraz, gdy ścieżki mikrotubul zostały zdefiniowane, funkcja "plustipSeeTracks" jest używana do wizualizacji ścieżek4. Ta funkcja może zapewnić wiele danych wyjściowych do wizualizacji, w tym przestrzenne mapy dynamiki MT i filmy o prędkości, ale tutaj nacisk kładziony jest wyłącznie na użycie funkcji "Track Movies" do wyświetlania ścieżek MT nałożonych na obrazy stożka wzrostu. Podczas gdy plusTipGetTracks może analizować wiele filmów jednocześnie, plusTipSeeTracks może analizować tylko jeden film na raz.
<ol>
	<li>Wpisz "plusTipSeeTracks" w oknie poleceń.</li>
	<li>Po załadowaniu okna dialogowego kliknij "Wybierz projekt". Wybierz katalog nadrzędny zawierający projekt do wizualizacji i kliknij "Wybierz folder". Pojawi się nowe okno: "Wybierz projekt, który chcesz zwizualizować". Wybierz plik do wizualizacji i kliknij "OK".</li>
	<li>Następnie kliknij "Wybierz zapisany zwrot z inwestycji". Przejdź do tego samego folderu roi_X, co wybrany w poprzednim kroku i wybierz plik o nazwie "roiYX".</li>
	<li>Kliknij "Wybierz katalog wyjściowy", aby wskazać, gdzie MATLAB zapisze pliki wizualizacji ścieżek. Uwaga: Zalecamy użycie tego samego folderu, który zawiera resztę danych.</li>
	<li>Wybierz "Make Track Movie", a pojawi się ekran wyświetlający wszystkie ścieżki plusTipGetTracks obliczone na podstawie komet +TIP. Ten krok zapisuje śledzone szeregi czasowe w formacie filmu, w pliku "allTracks_X_X_X". Istnieje możliwość zapisania filmu jako pliku AVI, w przeciwnym razie domyślnym formatem jest plik Quicktime.mov.</li>
</ol>

4. plusTipGroupAnalysis
Uwaga: Ta ostatnia funkcja służy do tworzenia grup filmów do analizy i porównania ich parametrów ścieżki MT.
<ol>
	<li>Wpisz "plusTipGroupAnalysis" w oknie poleceń. Aby ręcznie wybrać grupy do porównania, najpierw usuń zaznaczenie opcji "Automatycznie grupuj z hierarchii". Następnie kliknij "Wybierz projekty". Przejdź do katalogów nadrzędnych zawierających wszystkie foldery roi_X do analizy.</li>
	<li>Pojawi się ekran listSelectGUI. Zaznacz wszystkie projekty, które mają zostać uwzględnione w grupach, z lewej strony ekranu i przenieś je na prawą stronę ekranu. Kliknij "OK". Wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać listę projektów i kliknij "Zapisz".</li>
	<li>Pojawi się okno: "Proszę wybrać pierwszą grupę z listy". Kliknij "OK". Okno listSelectGUI zostanie ponownie wyświetlone. Tym razem wybierz tylko te pliki, które odpowiadają pierwszej grupie, które powinny zostać połączone w pulę. Kliknij "OK".</li>
	<li>Następnie wprowadź nazwę grupy i kliknij "OK". Pojawi się okno: "Wybierz inną grupę?" Odpowiedz odpowiednio i kontynuuj wybieranie grup. Pojawi się okno: "Wybierz lokalizację, aby zapisać listę grup". Przejdź do lokalizacji i kliknij "Zapisz".</li>
	<li>Kliknij "Wybierz katalog wyjściowy", aby wybrać, gdzie będą przechowywane foldery wyjściowe.</li>
	<li>Wybierz typ analizy grupowej, którą chcesz przeprowadzić – czy ścieżki MT powinny być łączone dla każdej grupy, czy też ma być wykonywana analiza dla każdej komórki. Zalecane testy statystyczne są już wyznaczone. Aby uwzględnić wszystkie ścieżki w analizie, usuń zaznaczenie opcji "Usuń ścieżki na początku/końcu filmu". W przeciwnym razie zaznaczenie tego pola spowoduje usunięcie wszystkich ścieżek wzrostu MT, które są w toku na początku lub na końcu filmu.</li>
	<li>Po dokonaniu wyboru Analiza grupy wybierz opcję "Porównaj grupy".</li>
</ol>

<ol><li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+%28end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit%2FMAST%2FCLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. , 913-926 (2004).</li>
<li>Purro, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+regulates+axon+behavior+through+changes+in+microtubule+growth+directionality%3A+a+new+role+for+adenomatous+polyposis+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).</li>
<li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((plusTipTracker%3A+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).</li>
<li>Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Explant+Cultures+from+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neural Explant Cultures from Xenopus laevis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232(2012).</li>
<li>Long, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+analysis+of+CLASP-interacting+protein+functions+during+interphase+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics.</a> Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).</li>
<li>Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+ECM+mechanosensing+pathways+regulate+microtubule+dynamics+to+control+endothelial+cell+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis.</a> The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).</li>
<li>Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+microtubule+growth+dynamics+identifies+MARK2+as+a+regulator+of+leading+edge+microtubules+downstream+of+Rac1+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells.</a> PLoS One. 7, e41413(2012).</li>
<li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+ends%3A+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).</li>
<li>Schuyler, S. C., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+%27plus-end-tracking+proteins%27%3A+The+end+is+just+the+beginning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning.</a> Cell. 105, 421-424 (2001).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubule+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li>
<li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).</li>
<li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+plus-end+tracking+by+CLIP-170+requires+EB1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EB1+promotes+microtubule+dynamics+by+recruiting+Sentin+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells.</a> The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).</li>
<li>Maurer, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li>
<li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li>
<li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+development%22%5BJournal%5D)">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22(2013).</li>
<li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+%28XCLASP1%29+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

PlusTipTracker zapewnia prosty, graficzny interfejs użytkownika, który szybko i automatycznie wykrywa praktycznie wszystkie widoczne komety EB1-GFP w komórce lub stożku wzrostu, łączy komety w ścieżki i oblicza parametry MT. Inne publikacje donosiły o projektowaniu podobnych typów oprogramowania (na przykład Marx i in. również wykorzystali analizę ilościową oznaczonej dynamiki EB1 w stożkach wzrostu18). Ale to oprogramowanie wydaje się być wyjątkowe pod względem łatwości dostępu, ponieważ można je bez...

Celem tej metody jest uzyskanie ilościowych informacji na temat dynamiki mikrotubul (MT) plus białka śledzącego koniec (+TIP) w żywych stożkach wzrostu. MT +TIP to grupa białek, które lokalizują się na końcach dodatnich MT9,10. Pełnią one szereg funkcji regulujących parametry niestabilności dynamicznej MT11, w tym szybkość polimeryzacji, katastrofy i ratownictwa. Jedną z dobrze stosowanych metod analizy dynamiki MT jest śledzenie zachowania +TIP EB1, który wiąże się konkretnie z rosnącymi dodatnimi końcami MT1,12. Wiadomo, że EB1 rekrutuje kilka innych białek do wzrostu plus-endMT 13,14, a ostatnio został uznany za czynnik dojrzewania MT15, promując zarówno wzrost MT, jak i częstotliwość katastrof15,16.
Wiele badań dynamiki MT w stożkach wzrostu wykorzystywało metody śledzenia ręcznego do pomiaru zmian dynamiki EB1-GFP w czasie1-3, ponieważ lokalizacja EB1 na plus-końcach MT może być używana jako marker polimeryzacji MT. Kluczową korzyścią płynącą z badania komet EB1-GFP jako wskaźnika wzrostu MT jest to, że dynamika MT może być mierzona nawet w regionach, w których MT w znacznym stopniu się pokrywają. Chociaż metoda ręcznego śledzenia komet EB1-GFP dostarczyła użytecznych informacji na temat zachowań MT1-3, jest czasochłonna i może być stronnicza. Ponadto, ponieważ nieprawidłowe zachowania stożków wzrostu są prawdopodobnie wynikiem niewielkich zmian w dynamice cytoszkieletu, analizowanie tylko niewielkiego podzbioru MT (zwykle niezbędnego podczas śledzenia ręcznego) może pominąć istotne informacje.
Tak więc, mierzymy globalne parametry dynamiki MT za pomocą pakietu oprogramowania plusTipTracker4, po uzyskaniu wysokiej rozdzielczości, na żywo obrazów oznaczonych jako EB1 w hodowanych stożkach wzrostu embrionalnego5. Oprogramowanie to, opracowane w laboratorium Danuser, zostało wykorzystane w kilku badaniach charakteryzujących dynamikę MT w różnych typach komórek6-8. Jest to przyjazny dla użytkownika, oparty na MATLAB pakiet typu open source, który obejmuje automatyczne wykrywanie, śledzenie, wizualizację i analizę filmów z fluorescencyjnie oznakowanymi +TIP. Długa lista szczegółowych parametrów dynamiki MT jest obliczana przez to oprogramowanie (szczegółowe informacje można znaleźć w Piśmiennictwie 4), ale do analizy dynamiki MT w stożkach wzrostu najbardziej przydatnymi parametrami są prędkość ścieżki wzrostu MT (w mikronach / minutę), czas życia ścieżki wzrostu (w sekundach) i długość ścieżki wzrostu (w mikronach). Oprogramowanie można pobrać bezpośrednio ze strony internetowej Danuser Lab (w zakładce "Oprogramowanie"). Podczas gdy Danuser Lab obsługuje obecnie nowszy interfejs do analizy śledzenia +TIP, który jest włączony do pakietu oprogramowania o nazwie u-track 2.0, oryginalne, samodzielne oprogramowanie pozostanie dostępne. Podstawowe algorytmy między tymi dwoma programami są takie same (przynajmniej od 2014 r.), z różnicą w interfejsie i wynikach analizy. Dla początkujących użytkowników z niewielkim doświadczeniem w MATLAB i/lub analizie obliczeniowej, plusTipTracker ma bardziej przyjazne dla użytkownika funkcje, w tym automatyczne dane wyjściowe parametrów statystycznych.
Tutaj opisujemy kroki analizy obrazów dynamiki EB1-GFP w hodowlanych stożkach wzrostu Xenopus laevis. Protokół ten został wykorzystany w niedawnym artykule badającym dynamikę MT17. Zobacz także Lowery i in. 20125, aby uzyskać szczegółowe instrukcje dotyczące hodowli stożków wzrostu wyrażających EB1-GFP. Chociaż ten artykuł koncentrował się głównie na badaniu dynamiki EB1-GFP w stożkach wzrostu, ten sam protokół można zastosować do innych typów komórek17. W przypadku wszystkich typów komórek odstęp czasu między ramkami powinien wynosić od 0,5 do 2 sekund, aby zapewnić optymalne śledzenie +TIP. Możliwy jest odstęp czasowy do 4 sekund między klatkami, ale ten wydłużony czas interwału powoduje dodatkowe błędy śledzenia.

<table><tbody><tr><td>Oprogramowanie plusTipTracker</td><td>Danuser Lab</td><td><a href="http://lccb.hms.harvard.edu/software.html">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</a></td><td>To oprogramowanie może być w przyszłości hostowane na innej stronie internetowej.&nbsp; Jeśli wymieniona witryna nie istnieje, wyszukaj "Danuser Lab Software" w wyszukiwarce internetowej, aby ją znaleźć.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie MATLAB</td><td>Mathworks</td><td><a href="http://www.mathworks.com/products/matlab/">http://www.mathworks.com/products/matlab/</a></td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie oprogramowania plustiptracker do pomiaru dynamiki mikrotubul w stożkach wzrostu xenopus laevis

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Białka śledzące plus-end (+TIP) mikrotubul (MT) lokalizują się na rosnących plus-końcach MT i regulują dynamikę MT1,2. Jednym z najbardziej znanych i szeroko stosowanych +TIP do analizy dynamiki MT jest białko wiążące koniec, EB1, które wiąże wszystkie rosnące plus-końce MT, a tym samym jest markerem polimeryzacji MT1. W wielu badaniach nad zachowaniem EB1 w stożkach wzrostu wykorzystano czasochłonne i stronnicze, wspomagane komputerowo metody śledzenia rąk do analizy poszczególnych MT1-3. Nasze podejście polega na ilościowym określeniu globalnych parametrów dynamiki MT przy użyciu pakietu oprogramowania plusTipTracker4, po uzyskaniu wysokiej rozdzielczości, żywych obrazów znakowanego EB1 w hodowanych embrionalnych stożkach wzrostu5. To oprogramowanie jest opartym na MATLAB, otwartym i przyjaznym dla użytkownika pakietem, który łączy w sobie automatyczne wykrywanie, śledzenie, wizualizację i analizę filmów z fluorescencyjnie oznakowanymi +TIP. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykorzystania plusTipTracker do analizy znakowanych fluorescencyjnie komet +TIP w hodowanych stożkach wzrostu Xenopus laevis. Jednak oprogramowanie to może być również używane do charakteryzowania dynamiki MT w różnych typach komórek6-8.

Użycie tego oprogramowania w opisany tutaj sposób pozwoli uzyskać kilka plików z informacjami, które kwantyfikują dynamikę +TIP w żywych komórkach.
Funkcja plusTipGetTracks identyfikuje ścieżki (korzystając z przykładowych ustawień pokazanych na Rysunku 1), a następnie dostarcza parametrów dotyczących ścieżek +TIP. Aby wyświetlić informacje uzyskane przez oprogramowanie, przejdź do katalogu roi_X utworzonego w kroku 2.2. Folder „feat” zawiera „overlayImages”, czyli serię obraz...

Oparty na MATLAB, pakiet oprogramowania open source, plusTipTracker, może być używany do analizy serii obrazów znakowanych fluorescencyjnie +TIPS w celu ilościowego określenia dynamiki mikrotubul.

Wykorzystanie oprogramowania plusTipTracker do pomiaru dynamiki mikrotubul w stożkach wzrostu Xenopus laevis

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Celem tej procedury jest uzyskanie informacji ilościowych dotyczących mikrotubuli plus białka śledzącego koniec lub plus dynamiki końcówki i żywych stożków wzrostu przy użyciu pakietu oprogramowania i śledzenia końcówek. Tutaj opisujemy etapy analizy obrazów dynamiki EB one GFP i hodowanych stożków wzrostu XUS lavis, ale podobny protokół można zastosować do innych typów komórek po uzyskaniu obrazów na żywo o wysokiej rozdzielczości oznakowanych EB one i hodowanych stożków wzrostu embrionalnego. Pierwszym krokiem w procedurze jest użycie komendy plus końcówka, pobranie ścieżek w celu wykrycia komet EB one GFP, połączenie komet w ścieżki i określenie parametrów dynamiki mikrotubul.Drugim krokiem jest użycie polecenia oraz ścieżek końcówki C w celu wizualizacji ścieżek mikrotubul nałożonych na obrazy stożków wzrostu. Ostatnim krokiem jest użycie analizy grup końcówek plus do analizy i porównania parametrów toru mikrotubul grup filmów. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak wykorzystanie śledzenia dłoni do analizy poszczególnych ścieżek i końcówek, jest to, że metoda ta pozwala na szybkie i zautomatyzowane wykrywanie, śledzenie, wizualizację i analizę.Pierwszym krokiem w analizie obrazu jest wykrycie komet EB one GFP, połączenie komet w tory i określenie parametrów dynamiki mikrotubul. Uzyskuje się to za pomocą polecenia plus końcówka. Pobierz ścieżki przed analizą obrazu.Przekonwertuj każdy film poklatkowy na sekwencję plików graficznych TIFF i zapisz każdą serię w osobnym folderze o nazwie obrazy. Należy pamiętać, że w obrazach rozróżniana jest wielkość liter. Aby rozpocząć analizę, otwórz aplikację MATLAB i wpisz plus tip get tracks w oknie poleceń.Spowoduje to pojawienie się nowego okna dialogowego. Kliknij, skonfiguruj nowe projekty i wybierz jeden lub więcej z poprzednich serii obrazów TIFF, wybierając odpowiedni folder obrazów. Po wykonaniu tego kroku zostanie utworzony katalog plików.Kliknij na, w porządku. Po wyświetleniu pierwszego obrazu kliknij myszką i utwórz wielokąt. Następnie obejmuje całość stożka wzrostu.Kliknij dwukrotnie myszą, aby zamknąć wielokąt. Pojawi się okno dialogowe, jeśli obraz ma inny stożek wzrostu. Aby przeanalizować, wybierz pozycję tak.W przeciwnym razie wybierz opcję nie. Kolejnym krokiem jest wybór projektów, które będą od razu analizowane. Kliknij wybierz projekty i wybierz folder.Aby przeanalizować listę, pojawi się lepki ekran. Wybierz projekty po lewej stronie ekranu i przenieś je na prawą stronę. Kliknij na, w porządku.Wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać listę projektów i kliknij Zapisz, wybierz Wykrywanie, Śledzenie i Przetwarzanie końcowe. Po dokonaniu tych wyborów prawa strona okna dialogowego stanie się konfigurowalna. Wypełnij ustawienia przetwarzania końcowego.W zależności od żądanych konkretnych ustawień pozyskiwania obrazu kliknij Start. Oprogramowanie uruchomi następnie wszystkie kroki, które zostały wprowadzone. W oknie poleceń wyświetlany jest szacowany czas pozostały dla każdej funkcji i będzie wskazywany, kiedy krok zostanie zakończony.Teraz, gdy ścieżki mikrorurkowe zostały zdefiniowane, funkcja plus ścieżki końcówki C służy do wizualizacji ścieżek i wyświetlania ścieżek mikrorurkowych nałożonych na obrazy stożków wzrostu. Jest to uzyskiwane za pomocą typu ścieżek polecenia plus końcówka C oraz ścieżek końcówki C w oknie poleceń. Po załadowaniu okna dialogowego kliknij wybierz projekt.Wybierz katalog nadrzędny zawierający projekt do wizualizacji i kliknij wybierz folder. Gdy pojawi się okno, wybierz plik do wizualizacji i kliknij. Okej, następnie kliknij wybierz zapisany ROI, przejdź do tego samego folderu obszaru zainteresowania, co wybrany w poprzednim kroku i wybierz plik o nazwie R-O-I-Y-X.Kliknij wybierz katalog wyjściowy, aby wskazać, gdzie MATLAB zapisze pliki wizualizacji ścieżek, a następnie wybierz opcję utwórz film ścieżki. Pojawi się ekran wyświetlający wszystkie utwory. Plus tip pobiera ścieżki obliczone na podstawie komentarzy do plus tip.Ten krok zapisuje szereg czasowy ścieżki w formacie filmu. Ostatnia funkcja służy do tworzenia grup filmów do analizy i porównania parametrów toru mikrorurkowego. Jest to uzyskiwane za pomocą polecenia i analizy grupy końcówek.Raz plus wskazówka pobierz ścieżki zostały uruchomione dla wielu filmów, a różne podzbiory danych są gotowe do porównania. Wpisz plus porada analiza grupy w oknie poleceń Aby ręcznie wybrać grupy do porównania, najpierw usuń zaznaczenie grupy automatycznej z hierarchii. Następnie kliknij wybierz projekty.Przejdź do katalogów nadrzędnych zawierających wszystkie foldery ROI. Aby przeanalizować listę, wybierz opcję Pojawi się okno GUI. Zaznacz wszystkie projekty, które chcesz uwzględnić w grupach, z lewej strony ekranu i przenieś je na prawą stronę.Kliknij na, w porządku. Następnie wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać listę projektów i kliknij zapisz, pojawi się okno. Kliknij na.Okej, i wyświetli się lepkie okno wyboru listy. Ponownie wybierz tylko te pliki, które odpowiadają pierwszej grupie, które należy zebrać razem, i kliknij. Porządku. Wpisz nazwę grupy i kliknij, w porządku.Pojawi się okno, odpowiedz odpowiednio i kontynuuj wybieranie grup. Następnie wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać listę grup i kliknij Zapisz. Kliknij wybierz katalog wyjściowy, aby wybrać, gdzie będą przechowywane foldery wyjściowe.Na koniec wybierz typ analizy grupowej, którą chcesz przeprowadzić. Tutaj wybieramy dane puli ze wszystkich komórek i grup. Kliknij porównaj grupy.Ten obraz przedstawia parametry dynamiki mikrorurek uzyskane z funkcji oraz ścieżki git końcówki. Ten film przedstawia ścieżki mikrotubul uzyskane z funkcji oraz ścieżki końcówki C. Wreszcie, ten obraz przedstawia parametry mikrotubul uzyskane z analizy funkcji i grupy końcówek.Korzystanie z aplikacji do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. Te parametry uzyskane z różnych grup filmów można również badać jako wykresy pudełkowe za pomocą programu do przetwarzania A. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak korzystać z narzędzia do śledzenia końcówek plus, aby uzyskać informacje ilościowe dotyczące dynamiki mikrotubul i końcówki oraz żywych stożków wzrostu, wykorzystując funkcje plus ścieżki git końcówki i ścieżki końcówki C oraz analizę grup końcówek plus.

using-plustiptracker-software-to-measure-microtubule-dynamics-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikrotubule są z natury niestabilnymi polimerami, a ich przełączanie między wzrostem a skracaniem jest stochastyczne i trudne do kontrolowania. Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące segmentowane mikrotubule z fotoablakowalnymi czapeczkami stabilizującymi. Depolimeryzacja segmentowanych mikrotubul może być wyzwalana z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną, wspomagając w ten sposób analizę ruchów z demontującymi końcami mikrotubul.

Przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul

Szczegółowo opisano protokoły hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), przejściowej transfekcji znakowanych fluorescencyjnie markerów wzrostu mikrotubul, obrazowania żywych komórek i automatycznej analizy dynamiki wzrostu mikrotubul międzyfazowych.

Obrazowanie poklatkowe w wysokiej rozdzielczości i automatyczna analiza dynamiki mikrotubul w żywych ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej

Prezentujemy oprogramowanie do półautomatycznego śledzenia względnego stężenia białka na całej długości dynamicznych wypukłości komórkowych.

Graficzny interfejs użytkownika do wspomaganego programowo śledzenia stężenia białka w dynamicznych wypukłościach komórkowych

Tutaj prezentujemy solidną i szczegółową metodę analizy dynamiki mikrotubul w komórkach zsynchronizowanych w prometafazie przy użyciu mikroskopii konfokalnej z żywym krążkiem komórkowym i przetwarzania obrazów opartego na MATLAB.

Pomiar dynamiki mikrotubul za pomocą mikroskopii wirujących dysków w monopolarnych wrzecionach mitotycznych

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Ten protokół jest dedykowany do wizualizacji mikrotubul plus-end poprzez transfekcję białka EB3 w celu zbadania ich dynamicznych właściwości w pierwotnej hodowli komórkowej. Protokół został wdrożony na ludzkich pierwotnych fibroblastach skóry uzyskanych od pacjentów z chorobą Huntingtona.

Wizualizacja dynamiki plus-end mikrotubul w modelu choroby Huntingtona opartym na pierwotnych fibroblastach skóry człowieka

Ten protokół ma na celu zmierzenie parametrów dynamicznych (wypukłości, retrakcje, falbany) wypukłości na krawędzi komórek rozsiewających.

Pomiar dynamiki wypukłości krawędzi komórki podczas rozprzestrzeniania się za pomocą mikroskopii żywych komórek

Aby się rozwijać, stożki wzrostu muszą wywierać siłę napędową na środowisko zewnętrzne. Wytwarzanie sił uciągu zależy od dynamiki aktyny i sprzężenia sprzęgła. W niniejszej pracy opisano metody analizy dynamiki aktyny, sprzęgu sprzęgła i sił trakcyjnych dla wyprzedzenia stożka wzrostu.

Analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Poznaj metodę analizy dynamiki mikrotubul w stożkach wzrostu Xenopus laevis za pomocą oprogramowania plusTipTracker. Automatyczne śledzenie EB1-GFP umożliwia szybkie i precyzyjne badanie białek +TIP w żywych komórkach.

Wykorzystanie oprogramowania plusTipTracker do pomiaru dynamiki mikrotubul w stożkach wzrostu Xenopus laevis

Przeglądaj więcej filmów