Wykorzystanie oprogramowania plusTipTracker do pomiaru dynamiki mikrotubul w stożkach wzrostu Xenopus laevis
7 września 2014
Oparty na MATLAB, pakiet oprogramowania open source, plusTipTracker, może być używany do analizy serii obrazów znakowanych fluorescencyjnie +TIPS w celu ilościowego określenia dynamiki mikrotubul.
Celem tej procedury jest uzyskanie informacji ilościowych dotyczących mikrotubuli plus białka śledzącego koniec lub plus dynamiki końcówki i żywych stożków wzrostu przy użyciu pakietu oprogramowania i śledzenia końcówek. Tutaj opisujemy etapy analizy obrazów dynamiki EB one GFP i hodowanych stożków wzrostu XUS lavis, ale podobny protokół można zastosować do innych typów komórek po uzyskaniu obrazów na żywo o wysokiej rozdzielczości oznakowanych EB one i hodowanych stożków wzrostu embrionalnego. Pierwszym krokiem w procedurze jest użycie komendy plus końcówka, pobranie ścieżek w celu wykrycia komet EB one GFP, połączenie komet w ścieżki i określenie parametrów dynamiki mikrotubul.
Drugim krokiem jest użycie polecenia oraz ścieżek końcówki C w celu wizualizacji ścieżek mikrotubul nałożonych na obrazy stożków wzrostu. Ostatnim krokiem jest użycie analizy grup końcówek plus do analizy i porównania parametrów toru mikrotubul grup filmów. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak wykorzystanie śledzenia dłoni do analizy poszczególnych ścieżek i końcówek, jest to, że metoda ta pozwala na szybkie i zautomatyzowane wykrywanie, śledzenie, wizualizację i analizę.
Pierwszym krokiem w analizie obrazu jest wykrycie komet EB one GFP, połączenie komet w tory i określenie parametrów dynamiki mikrotubul. Uzyskuje się to za pomocą polecenia plus końcówka. Pobierz ścieżki przed analizą obrazu.
Przekonwertuj każdy film poklatkowy na sekwencję plików graficznych TIFF i zapisz każdą serię w osobnym folderze o nazwie obrazy. Należy pamiętać, że w obrazach rozróżniana jest wielkość liter. Aby rozpocząć analizę, otwórz aplikację MATLAB i wpisz plus tip get tracks w oknie poleceń.
Spowoduje to pojawienie się nowego okna dialogowego. Kliknij, skonfiguruj nowe projekty i wybierz jeden lub więcej z poprzednich serii obrazów TIFF, wybierając odpowiedni folder obrazów. Po wykonaniu tego kroku zostanie utworzony katalog plików.
Kliknij na, w porządku. Po wyświetleniu pierwszego obrazu kliknij myszką i utwórz wielokąt. Następnie obejmuje całość stożka wzrostu.
Kliknij dwukrotnie myszą, aby zamknąć wielokąt. Pojawi się okno dialogowe, jeśli obraz ma inny stożek wzrostu. Aby przeanalizować, wybierz pozycję tak.
W przeciwnym razie wybierz opcję nie. Kolejnym krokiem jest wybór projektów, które będą od razu analizowane. Kliknij wybierz projekty i wybierz folder.
Aby przeanalizować listę, pojawi się lepki ekran. Wybierz projekty po lewej stronie ekranu i przenieś je na prawą stronę. Kliknij na, w porządku.
Wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać listę projektów i kliknij Zapisz, wybierz Wykrywanie, Śledzenie i Przetwarzanie końcowe. Po dokonaniu tych wyborów prawa strona okna dialogowego stanie się konfigurowalna. Wypełnij ustawienia przetwarzania końcowego.
W zależności od żądanych konkretnych ustawień pozyskiwania obrazu kliknij Start. Oprogramowanie uruchomi następnie wszystkie kroki, które zostały wprowadzone. W oknie poleceń wyświetlany jest szacowany czas pozostały dla każdej funkcji i będzie wskazywany, kiedy krok zostanie zakończony.
Teraz, gdy ścieżki mikrorurkowe zostały zdefiniowane, funkcja plus ścieżki końcówki C służy do wizualizacji ścieżek i wyświetlania ścieżek mikrorurkowych nałożonych na obrazy stożków wzrostu. Jest to uzyskiwane za pomocą typu ścieżek polecenia plus końcówka C oraz ścieżek końcówki C w oknie poleceń. Po załadowaniu okna dialogowego kliknij wybierz projekt.
Wybierz katalog nadrzędny zawierający projekt do wizualizacji i kliknij wybierz folder. Gdy pojawi się okno, wybierz plik do wizualizacji i kliknij. Okej, następnie kliknij wybierz zapisany ROI, przejdź do tego samego folderu obszaru zainteresowania, co wybrany w poprzednim kroku i wybierz plik o nazwie R-O-I-Y-X.
Kliknij wybierz katalog wyjściowy, aby wskazać, gdzie MATLAB zapisze pliki wizualizacji ścieżek, a następnie wybierz opcję utwórz film ścieżki. Pojawi się ekran wyświetlający wszystkie utwory. Plus tip pobiera ścieżki obliczone na podstawie komentarzy do plus tip.
Ten krok zapisuje szereg czasowy ścieżki w formacie filmu. Ostatnia funkcja służy do tworzenia grup filmów do analizy i porównania parametrów toru mikrorurkowego. Jest to uzyskiwane za pomocą polecenia i analizy grupy końcówek.
Raz plus wskazówka pobierz ścieżki zostały uruchomione dla wielu filmów, a różne podzbiory danych są gotowe do porównania. Wpisz plus porada analiza grupy w oknie poleceń Aby ręcznie wybrać grupy do porównania, najpierw usuń zaznaczenie grupy automatycznej z hierarchii. Następnie kliknij wybierz projekty.
Przejdź do katalogów nadrzędnych zawierających wszystkie foldery ROI. Aby przeanalizować listę, wybierz opcję Pojawi się okno GUI. Zaznacz wszystkie projekty, które chcesz uwzględnić w grupach, z lewej strony ekranu i przenieś je na prawą stronę.
Kliknij na, w porządku. Następnie wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać listę projektów i kliknij zapisz, pojawi się okno. Kliknij na.
Okej, i wyświetli się lepkie okno wyboru listy. Ponownie wybierz tylko te pliki, które odpowiadają pierwszej grupie, które należy zebrać razem, i kliknij. Porządku. Wpisz nazwę grupy i kliknij, w porządku.
Pojawi się okno, odpowiedz odpowiednio i kontynuuj wybieranie grup. Następnie wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać listę grup i kliknij Zapisz. Kliknij wybierz katalog wyjściowy, aby wybrać, gdzie będą przechowywane foldery wyjściowe.
Na koniec wybierz typ analizy grupowej, którą chcesz przeprowadzić. Tutaj wybieramy dane puli ze wszystkich komórek i grup. Kliknij porównaj grupy.
Ten obraz przedstawia parametry dynamiki mikrorurek uzyskane z funkcji oraz ścieżki git końcówki. Ten film przedstawia ścieżki mikrotubul uzyskane z funkcji oraz ścieżki końcówki C. Wreszcie, ten obraz przedstawia parametry mikrotubul uzyskane z analizy funkcji i grupy końcówek.
Korzystanie z aplikacji do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. Te parametry uzyskane z różnych grup filmów można również badać jako wykresy pudełkowe za pomocą programu do przetwarzania A. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak korzystać z narzędzia do śledzenia końcówek plus, aby uzyskać informacje ilościowe dotyczące dynamiki mikrotubul i końcówki oraz żywych stożków wzrostu, wykorzystując funkcje plus ścieżki git końcówki i ścieżki końcówki C oraz analizę grup końcówek plus.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje zastosowanie pakietu oprogramowania opartego na systemie MATLAB, plusTipTracker, do analizy dynamiki mikrotubul z wykorzystaniem fluorescencyjnie znakowanych białek +TIP. Przedstawiona procedura oferuje systematyczne podejście do ilościowego określenia zachowania białek śledzących koniec plus mikrotubul w żywych stożkach wzrostu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Dynamika mikrotubul
Wstęp
- Mikrotubule odgrywają kluczową rolę w strukturze i funkcjonowaniu komórki.
- +TIPy to białka wiążące się z rosnącymi końcami mikrotubul.
- Ilościowa analiza dynamiki +TIP jest niezbędna do zrozumienia procesów komórkowych.
- Istniejące metody śledzenia mikrotubul mogą być czasochłonne i mniej wydajne.
Cel badania
- Dostarczenie szczegółowego protokołu analizy dynamiki mikrotubul przy użyciu oprogramowania plusTipTracker.
- Pogłębienie zrozumienia zachowania białek +TIP w żywych komórkach.
- Wykazanie zalet automatycznego śledzenia w porównaniu z metodami manualnymi.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie polecenia plusTip, get tracks do wykrywania komet EB1-GFP.
- Łączenie komet w ścieżki w celu wyznaczenia parametrów dynamiki mikrotubul.
- Wizualizacja ścieżek mikrotubul za pomocą polecenia plusTip C tracks.
- Analiza grupowa parametrów ścieżek mikrotubul w wielu filmach.
Główne wyniki
- Osiągnięto zautomatyzowaną detekcję i śledzenie dynamiki mikrotubul.
- Techniki wizualizacji zapewniły jasny wgląd w zachowanie mikrotubul.
- Analiza grupowa umożliwiła przeprowadzenie badań porównawczych w różnych warunkach.
- Metoda ta okazała się szybsza i bardziej wydajna niż tradycyjne metody śledzenia.
Wnioski
- plusTipTracker jest cennym narzędziem do badania dynamiki mikrotubul.
- Zautomatyzowane podejście zwiększa dokładność i efektywność analizy.
- Protokół ten można dostosować do różnych typów komórek i warunków.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe określanie dynamiki mikrotubul w stożkach wzrostu neuronów dostarcza informacji mechanistycznych na temat prowadzenia aksonów i tworzenia synaps, które są procesami istotnymi dla modeli zaburzeń neurorozwojowych. Zautomatyzowana analiza trajektorii komet +TIP umożliwia wysokoprzepustowe badanie związków wpływających na regulację cytoszkieletu, co wspiera walidację celów w procesach odkrywania leków w neuronauce. Podejście to ogranicza błąd analityczny i zwiększa wydajność w porównaniu z ręcznym śledzeniem, poprawiając wiarygodność prognostyczną we wczesnych etapach badań nad angażowaniem celu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie dynamiki polimeryzacji mikrotubul jako funkcjonalnego odczytu dla celów regulujących wzrost lub stabilność aksonów.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ustandaryzowanych, ilościowych parametrów (prędkość wzrostu, częstotliwość pauz, szybkość katastrof) dla spójnej oceny fenotypu celów w bibliotekach związków.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie powtarzalnych, multiparametrycznych odczytów zachowania mikrotubul, odpowiednich do miniaturyzacji i automatyzacji analiz w formatach 96- i 384-dołkowych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia standaryzację analiz między laboratoriami poprzez zdefiniowanie jasnych zasad wyboru ROI, parametrów śledzenia oraz progów analizy grupowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy fenotypy dynamiki mikrotubul in vitro z mechanizmami istotnymi dla chorób w modelach neurorozwojowych lub neurodegeneracyjnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość badań od pierwotnych kultur neuronów do walidacji na plastrach organotypowych lub in vivo dzięki zastosowaniu zachowawczej metodologii śledzenia białek +TIP.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum wczesnego etapu odkrywania leków, w którym ilościowe fenotypy cytoszkieletu służą do wyboru celu przed identyfikacją związku wiodącego i badaniami nad skutecznością przedkliniczną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących celów w postaci kinaz, fosfataz lub białek związanych z mikrotubulami poprzez bezpośredni pomiar dynamiki komet +TIP w żywych stożkach wzrostu.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, znormalizowanych wyników (gęstość komet, długość śladu, rozkłady prędkości), umożliwiając obliczenie czynnika Z' i potwierdzenie trafień.
- Analityka: Zapewnia statystyczne porównania na poziomie grup (średnia, wariancja, przesunięcia rozkładu), niezbędne do oceny efektów związków w powtórzonych próbach biologicznych.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy cytoszkieletu z badaniami nad wzrostem aksonów lub tworzeniem synaps, co jest zgodne z przedklinicznymi punktami końcowymi funkcji.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia scentralizowane ramy analityczne oparte na środowisku MATLAB, które można zastosować do różnych typów komórek (neurony, fibroblasty, linie nowotworowe) wykazujących ekspresję fluorescencyjnych +TIP.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie modulacji celu poprzez redukcję zmienności właściwej dla manualnego śledzenia oraz umożliwienie wykrywania subtelnych przesunięć dynamicznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki zautomatyzowanemu wykrywaniu komet, standaryzowanym algorytmom śledzenia oraz przetwarzaniu seryjnemu serii time-lapse.
- Wartość strategiczna: Zwiększa efektywność podejmowania decyzji go/no-go poprzez wcześniejsze dostarczanie multiparametrycznych profili cytoszkieletu w harmonogramie procesu odkrywania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie ilościowej oceny nasilenia fenotypu mikrotubul oraz stopnia efektu rescue indukowanego przez związek.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu żywych komórek, pracy w środowisku MATLAB oraz znakowaniu białkami fluorescencyjnymi (np. EB1-GFP) w pierwotnych kulturach neuronów.
- Zależy od systemów akwizycji time-lapse o wysokiej rozdzielczości i niskiej fototoksyczności, zdolnych do rejestrowania dynamiki komet +TIP w odstępach 1–2 sekund.
- Wymaga standaryzacji definicji ROI (obwód stożka wzrostu), parametrów śledzenia (odległość łączenia, przerwa między klatkami) oraz filtrów postprocessingu pomiędzy zespołami.
- Uwzględnia kwestie adaptacji do różnych morfologii komórkowych (np. stożki wzrostu vs. trzony aksonalne) oraz różnych poziomów ekspresji +TIP w systemach modelowych.
- Ograniczony wymogiem wykrywalności trwałych komet +TIP; metoda może nie mieć zastosowania w warunkach z wysoce niestabilnymi lub rzadkimi zdarzeniami polimeryzacji mikrotubul.
