Name: Regioselektywne celowanie biolistyczne w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu zmodyfikowanego pistoletu genowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Poznaj regioselektywną biolistykę w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu zmodyfikowanego pistoletu genowego. Ta metoda umożliwia precyzyjną transfekcję określonych regionów przy zachowaniu cech in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować warsztatom MRC-LMB za wyprodukowanie ulepszonej lufy pistoletu genowego. Chcielibyśmy również podziękować dr Davidowi R. Hampsonowi z Uniwersytetu w Toronto za wykorzystanie sprzętu i zasobów.

Wykorzystanie zwierząt i tkanek zwierzęcych powinno ściśle przestrzegać zgody komisji etycznej zgodnie z lokalnymi zasadami i regulacjami. Wszystkie tkanki uzyskane podczas tego badania były zgodne z wytycznymi MRC-LMB dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach.
1. Przygotowanie materiałów i podłoży hodowlanych
<ol>
	<li>Przygotować wszystkie roztwory przy użyciu wody Millipore; używać tylko odczynników o czystości analitycznej. Przygotuj i przechowuj wszystkie odczynniki w temperaturze pokojowej (chyba że wskazano inaczej).</li>
	<li>Przygotować 500 ml soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES (10 mM HEPES, 120 mM NaCl pH 7,2). Przefiltrować przez sterylną jednostkę filtrującą 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 500 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,4). Sterylizuj w autoklawie.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę neuronalną, uzupełniając DMEM (zmodyfikowaną pożywkę orła Dulbecco) 25 mM HEPES, 10% płodową surowicę cielęcą, 30 mM glukozy, suplement 1:100 N2, penicylinę-streptomycynę 1,100 U/ml; pH 7,2. Filtr ze sterylną jednostką filtrującą 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy poliwinylopirolidonu (PVP) z 20 mg PVP w 1 ml 100% etanolu. Podzielić to na 1 ml ilości, zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C. Roztwór roboczy ma moc 0,05 mg/ml, dlatego dodać 10 μl roztworu podstawowego PVP na każde 4 ml 100% etanolu.</li>
	<li>Przygotować 0,05 M roztwór podstawowy spermidyny w wodzie Millipore; dostosować pH do 7,2.</li>
	<li>Przygotować 2% roztwór agarozy w DMEM (2 g agarozy klasy do elektroforezy w 100 ml DMEM w wysterylizowanej butelce z zakrętką). Podgrzewaj to w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się rozpuści. W razie potrzeby przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C przez kilka tygodni.</li>
</ol>
2. Przygotowanie plastrów organotypowych
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji myszy C57 Black 6 w pożądanym wieku przez uduszenie CO2, a następnie ścięcie. Usuń mózg za pomocą bocznych nacięć czaszki, zaczynając od otworu wielkiego, a kończąc na płatach węchowych. Delikatnie unieś czaszkę od tyłu, aby odsłonić mózg.</li>
	<li>Przecięcie między płatami węchowymi a korą czołową i rostralne do móżdżku. Delikatnie unieś rostralną część mózgu i przetnij nerwy wzrokowe. Na koniec usuń mózg i umieść go na szalce Petriego wypełnionej lodowatą solą fizjologiczną buforowaną przez HEPES na lodzie.</li>
	<li>Używając mikroskopu preparacyjnego, oderwij pia za pomocą cienkich kleszczy; ostrożnie usuń naczynia krwionośne i opony mózgowe wokół mózgu.</li>
	<li>Umieść świeży mózg w małej foremce do odbioru i przykryj go roztworem agarozy schłodzonym do temperatury nieco powyżej RT. Następnie szybko schłodzić formę do 4 °C, umieszczając ją na lodzie. 
	UWAGA: Przetwarzaj plastry tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć utraty żywotności.</li>
	<li>Gdy agaroza stwardnieje (5 - 10 min), wyjmij mózg zatopiony w agarozie z formy (przytnij w razie potrzeby), a następnie przyklej go do platformy wibrokrajalnicy. Umieść go w komorze wibrokrajalnicy zawierającej sterylny, lodowaty PBS. Zdezynfekuj komorę wibroslicer przed użyciem 70% etanolem, aby zminimalizować późniejsze zanieczyszczenia.</li>
	<li>Wytnij mózg za pomocą specjalnie zbudowanego wibrokrajalnika lub komercyjnego odpowiednika. Koncepcja modelu polegała na zaprojektowaniu krajalnicy do tkanek, która mogłaby generować ruchy o dużej amplitudzie i wysokiej częstotliwości w poziomie do krawędzi ostrza, jednocześnie minimalizując drgania pionowe.</li>
	<li>Stosować częstotliwość oscylacji 90 Hz, amplitudę 1,5 - 2,0 mm, a ostrze tnące ustawić pod kątem 15° do płaszczyzny poziomej; ustawić blok montażowy przytrzymujący mózg osadzony w agarozie tak, aby poruszał się z prędkością 1,7 mm/min w kierunku ostrza. Zebrać skrawki (150 μm) do komory zawierającej lodowate pożywki hodowlane (DMEM Pen/Strep + 10% FCS). Zobacz wycinanie i manipulowanie wycinkami tkanek jako film uzupełniający w Arsenault i O'Brien13.</li>
	<li>Delikatnie umieścić plastry we wkładkach do hodowli komórkowych (0,4 μm, średnica 30 mm) w 6-dołkowej tacy z pożywką hodowlaną na zewnątrz wkładki i inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
	UWAGA: Aby zapewnić prawidłową żywotność tkanek, należy zachować szczególną delikatność podczas przenoszenia i manipulowania plastrami. Ponadto zbyt duża ilość płynu zapobiegnie przyleganiu plastrów organotypowych do membrany wkładu filtrującego. Jeśli tak się stanie, ponownie usuń nadmiar płynu lub płytki.</li>
	<li>Chociaż plastry organotypowe można hodować przez kilka tygodni, należy przystąpić do transfekcji nie później niż 4 dni po posiewie, aby uzyskać najlepsze plony transfekcji. 
	UWAGA: Aby uniknąć przerostu gleju w długotrwałych warunkach hodowli, użyj pożywki AraC lub pożywki wolnej od surowicy2.</li>
</ol>
3. Przygotowanie mikro i nano-pocisków pokrytych DNA
<ol>
	<li>Przygotuj nanopociski z użyciem cząsteczek złota o średnicy 40 nm. Na krótko dodać 50 μl 0,05 M spermidyny i 10 μl DNA o stężeniu 1 mg/ml (pEYFP-N1) do 10 mg cząstek złota.
	<ol>
		<li>Dodaj wapń i spermidynę do mieszaniny roztworu podczas przygotowywania mikrocząstek DNA-złota, aby pomóc w wiązaniu cząsteczek DNA z nanocząstkami złota. 
		UWAGA: Ilość zużytego DNA na mg nośników złota (DLR) powinna wynosić od 1 do 5 μg DNA na 1 mg złota. Co więcej, ilość cząstek nośnika złota, które zostaną wystrzelone na nabój (MLQ), powinna sama w sobie wynosić od 0,1 do 0,5 mg złota. DLR i MLQ powinny być wypróbowane i zoptymalizowane dla każdego użytkownika, w zależności od konkretnego badanego systemu, a także rodzaju używanego pistoletu cząsteczkowego i genowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymieszać za pomocą wiru, powoli dodając 50 μl 1 M CaCl2 we frakcjach 10 - 15 μl. Po 5 minutach sporadycznego wirowania, odwirować przy 1 000 x g przez 30 sekund, a następnie usunąć supernatant. Zawieś ponownie granulkę cząstek złota w 3,5 ml 0,075 M PVP.</li>
	<li>Narysować zawiesinę do rurki (o średnicy wewnętrznej 2,36 mm) za pomocą strzykawki. Umieść rurkę w stacji przygotowania przewodów. Pozwolić, aby cząsteczki złota opadły i usunąć supernatant przez aspirację za pomocą strzykawki. Obróć rurkę, aby równomiernie rozprowadzić cząsteczki złota, które następnie wysuszono przy stałym przepływie azotu w tempie 5 l na minutę.</li>
	<li>Aby stworzyć kule DNA, przetnij rurkę za pomocą obcinaka do rurek na 1 cm długości. Natychmiast włożyć do wkładu pistoletu genowego lub przechowywać w stanie wysuszonym (4 °C) do czasu, gdy będzie to wymagane.</li>
</ol>
4. Transfekcja biolistyczna na wycinkach organotypowych
<ol>
	<li>Wykonaj następujące czynności w sterylnym okapie z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Włóż baterię 9 V i pusty uchwyt na naboje do pistoletu genowego Helios.</li>
	<li>Przymocuj pistolet genowy do zbiornika helu za pomocą węża helowego. Wystrzel 2-3 ślepe naboje (puste sloty) pod ciśnieniem 50 psi, aby zwiększyć ciśnienie w wężu helowym i zbiornikach w pistolecie.</li>
	<li>Załaduj naboje zawierające złoto pokryte DNA do uchwytów nabojów i załaduj uchwyt do pistoletu genowego.</li>
	<li>Odkręć przekładkę pistoletu genowego i przymocuj zmodyfikowaną lufę pistoletu genowego do pistoletu genowego.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczyków umieść wkład filtrujący zawierający plasterek organotypowy w sterylnym plastikowym naczyniu.</li>
	<li>Usuń pożywkę z plasterków organotypowych.</li>
	<li>Ustaw ciśnienie gazu na 50 psi. 
	UWAGA: Ochrona oczu jest niezbędna i zalecana jest ochrona słuchu.</li>
	<li>Umieść pistolet genowy w odpowiednich odległościach, korzystając z mocowania mierzonego do 10 mm. Ostrożnie skieruj środek lufy na żądany obszar dostarczania genów.</li>
	<li>Po wypaleniu wkładki należy ponownie umieścić w naczyniu na świeżych pożywkach i przywrócić je do normalnych warunków wzrostu, tj. 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2</li>.
	<li>Po zakończeniu zamknij zbiornik helu, zwolnij ciśnienie z pistoletu genowego i odłącz pistolet genowy od zbiornika helu.</li>
	<li>Wyjmij uchwyt na naboje i wyrzuć wkłady, a następnie wyczyść pistolet genowy.</li>
	<li>Sprawdź tkankę pod kątem morfologii i udanej penetracji, wizualizując plastry za pomocą odwróconego mikroskopu. Jeśli używasz mikrocząstek, równomiernie rozprowadź złoto; Na plasterku nie powinny być widoczne żadne gęste obszary cząsteczek złota. Nanocząstki ze względu na swoje niewielkie rozmiary nie mogą być postrzegane jako pojedyncze jednostki za pomocą konwencjonalnych technik mikroskopowych.</li>
	<li>Po upływie odpowiedniego odstępu czasu (zwykle 1 - 2 dni) utrwalić plastry w 4% paraformaldehydzie (PFA) do obserwacji mikroskopowej. 
	UWAGA: Mocowanie w PFA nie zawsze jest pożądane. W przypadku obrazowania żywych komórek należy unikać tego kroku.</li>
</ol>
5. Naprawianie i wizualizacja wycinków mózgu
<ol>
	<li>Po transfekcji biolistycznej umyj plastry dwukrotnie w PBS przez 2 min.</li>
	<li>Utrwal plastry poprzez inkubację w świeżo przygotowanym, lodowatym 4% PFA w PBS przez 20 minut.</li>
	<li>Plastry myć dwukrotnie w PBS przez 2 minuty.</li>
	<li>Delikatnie przeciąć podpory membrany za pomocą skalpela, nie naruszając zamontowanych na nich plastrów. Użyj kleszczyków, aby umieścić każdą podporę/plasterek membrany na szkiełku mikroskopowym. Oprzyj plastry organotypowe na membranie na szkiełku podstawowym.</li>
	<li>Nałożyć jedną kroplę podłoża montażowego na plasterek i delikatnie nałożyć szkiełko nakrywkowe, bez użycia siły bezpośrednio stykającej się z plastrem organotypowym.</li>
	<li>Zabezpiecz szkiełko nakrywkowe cienką warstwą lakieru do paznokci.</li>
	<li>Zobacz plastry pod odpowiednim mikroskopem.</li>
</ol>
6. Zastosowania konfokalne
<ol>
	<li>Wizualizacja plastrów za pomocą pionowego skaningowego laserowego mikroskopu konfokalnego z soczewką obiektywową zanurzeniową z aperturą numeryczną 60x/1,4 (NA). 
	UWAGA: Najbardziej problematyczną cechą mikroskopu konfokalnego jest rozmiar otworka (ustawiony na 1 AU), który jest w stanie wyizolować i zebrać płaszczyznę ostrości, eliminując w ten sposób nieostre "zamglenie" zwykle widoczne w próbce fluorescencyjnej. Drobne szczegóły są często przesłonięte przez tę mgłę i nie można ich wykryć w mikroskopie niekonfokalnym.</li>
	<li>Ustaw laser argonowy na długość fali wzbudzenia 488 nm i zoptymalizuj pod kątem zbierania emitowanego światła w paśmie od 500 do 520 nm. Zazwyczaj zbiera się obrazy o wymiarach 1,024 x 1,024 pikseli i ze stosami przekrojów z w odstępach 0,5 μm, aby objąć pełną szerokość każdej analizowanej komórki nerwowej.
	<ol>
		<li>Aby zaobserwować morfologię jądra, przeciwdziałaj barwieniu tych komórek za pomocą DAPI (długość fali wzbudzenia ustawiona na 405 nm i światło emisyjne zebrane między 420 - 4 40 nm). Na koniec, aby zbadać czerwoną fluorescencję, ustaw laser na 561 nm dla wzbudzenia i 565 - 620 nm dla emisji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zazwyczaj obrazy pozyskiwano przy użyciu 4-krotnego zoomu skanowania, który obejmował obszar 57,6 μm2; rozmiary obrazów mieściły się w obszarze 1 024 x 1 024 pikseli. Rejestruj stosy przekrojów Z w odstępach 0,5 μm i projekcje 5 - 8 klatek łącznie.</li>
</ol>

<ol><li>Klein, R. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-velocity+microprojectiles+for+delivering+nucleic+acids+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells.</a> Biotechnology. 24, 384-386 (1987).</li>
<li>Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+hippocampal+slice+culture+from+the+adult+mouse+brain%3A+a+versatile+tool+for+translational+neuropsychopharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neuro-Psychopharmacolog.%2C+%26+Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacolog., & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).</li>
<li>Morin-Brureau, M., De Bock, F., Lerner-Natoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slices%3A+a+model+to+study+the+neurovascular+unit+micro-environment+in+epilepsies%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slices: a model to study the neurovascular unit micro-environment in epilepsies.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10, 11(2013).</li>
<li>Millet, L. J., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+a+century+of+neuron+culture%3A+from+the+hanging+drop+to+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22The+Yale+Journal+of+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices.</a> The Yale Journal of Biology and Medicine. 85, 501-521 (2012).</li>
<li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+evidence+of+apoptosis-mediated+ischemic+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neurochemistry International. 45, 117-127 (2004).</li>
<li>Daviaud, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+nigrostriatal+degeneration+in+organotypic+cultures%2C+a+new+ex+vivo+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 256, 10-22 (2013).</li>
<li>Drexler, B., Hentschke, H., Antkowiak, B., Grasshoff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+as+tools+for+testing+neuroactive+drugs+-+link+between+in-vitro+and+in-vivo+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures as tools for testing neuroactive drugs - link between in-vitro and in-vivo experiments.</a> Current Medicinal Chemistry. 17, 4538-4550 (2010).</li>
<li>Oishi, Y., Baratta, J., Robertson, R. T., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+factors+regulating+axon+growth+between+the+cortex+and+spinal+cord+in+organotypic+co-cultures%3A+effects+of+age+and+neurotrophic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Assessment of factors regulating axon growth between the cortex and spinal cord in organotypic co-cultures: effects of age and neurotrophic factors.</a> J Neurotrauma. 21, 339-356 (2004).</li>
<li>Baratta, J., Marienhagen, J. W., Ha, D., Yu, J., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+innervation+of+cerebral+cortex+in+organotypic+slice+cultures%3A+sustained+basal+forebrain+and+transient+striatal+cholinergic+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cholinergic innervation of cerebral cortex in organotypic slice cultures: sustained basal forebrain and transient striatal cholinergic projections.</a> Neuroscience. 72, 1117-1132 (1996).</li>
<li>Barateiro, A., Domingues, H. S., Fernandes, A., Relvas, J. B., Brites, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+Cerebellar+Slice+Cultures+Exposed+to+Bilirubin+Evidence+Reactive+Gliosis%2C+Excitotoxicity+and+Impaired+Myelinogenesis+that+Is+Prevented+by+AMPA+and+TNF-alpha+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Rat Cerebellar Slice Cultures Exposed to Bilirubin Evidence Reactive Gliosis, Excitotoxicity and Impaired Myelinogenesis that Is Prevented by AMPA and TNF-alpha Inhibitors.</a> Molecular Neurobiology. 49 (1), 424-439 (2013).</li>
<li>Franke, H., Schelhorn, N., Illes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neurons+develop+axonal+projections+to+their+target+areas+in+organotypic+co-cultures+of+the+ventral+mesencephalon+and+the+striatum%2Fprefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neurons develop axonal projections to their target areas in organotypic co-cultures of the ventral mesencephalon and the striatum/prefrontal cortex.</a> Neurochemistry International. 42, 431-439 (2003).</li>
<li>Mingorance, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Nogo+and+Nogo+receptor+during+the+development+of+the+entorhino-hippocampal+pathway+and+after+adult+hippocampal+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of Nogo and Nogo receptor during the development of the entorhino-hippocampal pathway and after adult hippocampal lesions.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 26, 34-49 (2004).</li>
<li>Arsenault, J., O'Brien, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+heterologous+transfection+of+viable+adult+organotypic+brain+slices+using+an+enhanced+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Optimized heterologous transfection of viable adult organotypic brain slices using an enhanced gene gun.</a> BMC Research Notes. 6, 544(2013).</li>
<li>De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices%3A+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> J Physiol. 550, 135-147 (2003).</li>
<li>Laywell, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-to-astrocyte+transition%3A+phenotypic+fluidity+and+the+formation+of+hybrid+asterons+in+differentiating+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuron-to-astrocyte transition: phenotypic fluidity and the formation of hybrid asterons in differentiating neurospheres.</a> J Comp Neurol. 493, 321-333 (2005).</li>
<li>Walder, S., Zhang, F., Ferretti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+neural+stem+cell+markers+suggests+the+occurrence+of+dedifferentiation+in+regenerating+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of neural stem cell markers suggests the occurrence of dedifferentiation in regenerating spinal cord.</a> Dev Genes Evol. 213, 625-630 (2003).</li>
<li>Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun%3A+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li>
<li>Brien, J., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+spines+on+the+dendrites+of+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Organization of spines on the dendrites of Purkinje cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1575-1580 (2006).</li>
<li>Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-biolistics%3A+a+method+of+biolistic+transfection+of+cells+and+tissues+using+a+gene+gun+with+novel+nanometer-sized+projectiles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nano-biolistics: a method of biolistic transfection of cells and tissues using a gene gun with novel nanometer-sized projectiles.</a> BMC Biotechnology. 11 (66), 1472-6750 (2011).</li>
<li>Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diolistic+labeling+of+neuronal+cultures+and+intact+tissue+using+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Diolistic labeling of neuronal cultures and intact tissue using a hand-held gene gun.</a> Nature Protocols. 1, 1517-1521 (2006).</li>
<li>Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diolistics%3A+incorporating+fluorescent+dyes+into+biological+samples+using+a+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun.</a> Trends in Biotechnology. 25, 530-534 (2007).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+an+LDH+assay+for+assessing+nanoparticle+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Validation of an LDH assay for assessing nanoparticle toxicity.</a> Toxicology. 287, 99-104 (2011).</li>
<li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445, 168-176 (2007).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 12, (2008).</li>
<li>Su, T., Paradiso, B., Long, Y. S., Liao, W. P., Simonato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cell+damage+in+organotypic+hippocampal+slice+culture+from+adult+mouse%3A+a+potential+model+system+to+study+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cell damage in organotypic hippocampal slice culture from adult mouse: a potential model system to study neuroprotection.</a> Brain Research. 1385, 68-76 (2011).</li>
<li>Mewes, A., Franke, H., Singer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures+of+adult+transgenic+P301S+mice--a+model+for+tauopathy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies.</a> PloS One. 7, 45017(2012).</li>
<li>Ito, T., Ibe, K., Uchino, T., Ohshima, H., Otsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+DNA%2FGold+Nanoparticle+Encapsulated+in+Calcium+Phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Preparation of DNA/Gold Nanoparticle Encapsulated in Calcium Phosphate.</a> Journal of Drug Delivery. 2011, 647631(2011).</li>
<li>Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumatic+capillary+gun+for+ballistic+delivery+of+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles.</a> Appl Phys Lett. 87, 014103(2005).</li>
<li>Meijering, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron+tracing+in+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+%3A+the+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Neuron tracing in perspective.</a> Cytometry. Part A : the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 693-704 (2010).</li>
<li>Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+axon-attached+recording+with+fluorescent+patch-clamp+pipettes+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Targeted axon-attached recording with fluorescent patch-clamp pipettes in brain slices.</a> Nature Protocols. 7, 1228-1234 (2012).</li>
<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+%27DiOlistic%27+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
<li>Gholizadeh, S., Tharmalingam, S., Macaldaz, M. E., Hampson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+the+central+nervous+system+after+intracerebroventricular+injection+of+adeno-associated+viral+vectors+in+neonatal+and+juvenile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Transduction of the central nervous system after intracerebroventricular injection of adeno-associated viral vectors in neonatal and juvenile mice.</a> Human Gene Therapy Methods. 24, 205-213 (2013).</li>
<li>Arsenault, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Botulinum+protease-cleaved+SNARE+fragments+induce+cytotoxicity+in+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Botulinum protease-cleaved SNARE fragments induce cytotoxicity in neuroblastoma cells.</a> Journal of Neurochemistry. 129, 781-791 (2014).</li>
<li>Arsenault, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stapling+of+the+botulinum+type+A+protease+to+growth+factors+and+neuropeptides+allows+selective+targeting+of+neuroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Stapling of the botulinum type A protease to growth factors and neuropeptides allows selective targeting of neuroendocrine cells.</a> Journal of Neurochemistry. 126, 223-233 (2013).</li>
</ol>

Dr John A. O'Brien posiada patenty na ulepszoną lufę pistoletu genowego. Patent amerykański o numerze 10/380,452 i patent europejski o numerze 01974517.3.

Protokół opisuje podejścia do dostarczania barwników i materiałów genetycznych do dorosłych wycinków organotypowych przy użyciu ulepszonego pistoletu genowego. Zasadniczo rodzaje barwników i różnorodność możliwych genów sprawiają, że metoda ta jest wieloaspektowa i może odpowiedzieć na szeroki zakres pytań biologicznych. Zastosowana metoda regioselektywnego dostarczania, w tym przypadku do określonego regionu mózgu, otwiera nowe możliwości eksperymentów, ponieważ heterologiczna modulacja genów zlokalizowanych obszarów w biologicznie istotnej architekturze nie była wcześniej łatwo wykonalna. Wcześniej ustaliliśmy, że metoda ta może być stosowana na dorosłych wycinkach organotypowych, w których dojrzałe synapsy są w pełni uformowane, ponieważ wykazała poprawę przeżywalności komórek i ekspresję genów heterologicznych przez wiele tygodni13. Wraz z pojawieniem się nowych i ulepszonych warunków hodowli mózgów ssaków, a także innych tkanek, zastosowanie regioselektywnych modulacji genetycznych stanie się coraz bardziej przydatne w szerokiej gamie analiz biochemicznych.
Jak podkreślimy w tym miejscu i jak już wcześniej wspomnieliśmyw innych 24 przypadkach, na dokładność i wiarygodność dostarczania danych biologicznych może mieć wpływ wiele różnych czynników. Po pierwsze, przygotowanie cząstki złota związanej z barwnikami lub DNA musi być odpowiednio zrównoważone, aby zapobiec agregacji i ułatwić wydalenie ładunku z naboju. Wapń i spermidyna w roztworze mikrocząstek DNA-złoto mogą wspomagać wiązanie cząsteczek DNA z nanocząstkami złota. Wcześniej określono zdolność nanocząstek do przenikania do komórek pod zmniejszonym ciśnieniem17. Po drugie, pistolet genowy musi być zamontowany tak stabilnie, jak to możliwe, pod odpowiednim kątem i w odpowiedniej odległości. Niezawodny manometr jest również niezbędny do odtwarzalności, utrzymania integralności tkanek i prawidłowego przyspieszenia cząsteczek złota do zamierzonych celów. Rzeczywiście, odległość, orientacja i stabilność sprzętu są również kluczowymi czynnikami dla celowania i precyzji dostarczania regioselektywnego. Ponieważ te struktury mózgu są bardzo małe, niewielkie zmiany kąta zapłonu mogą łatwo sprawić, że cała procedura będzie mniej wiarygodna. I wreszcie, przygotowanie i utrzymanie żywotnych plastrów organotypowych było najeżone trudnościami przez wiele dziesięcioleci, ale obecnie dostępne są liczne i wiarygodne protokoły dla różnych zwierząt, regionów mózgu, wieku i kokultur2,4,25,26. Procedury te powinny być zoptymalizowane pod kątem użytkownika przed poddaniem tkanek procedurom biolistycznym. Pozwoli to użytkownikowi na łatwiejsze bezstronne ustalenie wpływu cząstek biolistycznych i wpływu genu heterologicznego na jego własne hodowle. W tym celu wykorzystanie genów fluorescencyjnych, takich jak EYFP i EGFP, może zarówno umożliwić nowemu użytkownikowi przetestowanie precyzji celowania, jak i śledzenie żywotności komórek poprzez heterologiczną ekspresję genów przez dłuższy czas13. Wiele kluczowych kroków dla niezawodnego i powtarzalnego korzystania z tego protokołu zostało podkreślonych w poniższych trzech akapitach.
Aby transfekcja była skuteczna, stężenie DNA musi być odpowiednie. Zbyt niskie stężenia mogą utrudnić wydajność transfekcji, podczas gdy zbyt wysokie stężenia mogą powodować aglomerację nanocząstek. Agregaty złota mogą drastycznie zmniejszyć wydajność transfekcji, powodować nierównomierne rozkłady i mogą prowadzić do zwiększonej cytotoksyczności i stresu oksydacyjnego. Problemy z wydajnością powlekania są prawdopodobnie spowodowane wygaśnięciem roztworu spermidyny (należy go wymieniać co 2 do 3 miesięcy). Aby uzyskać odpowiedni rozkład biolistyczny, etykietowanie musi być równe. Niejednorodne znakowanie zawiesiny nanocząstki złota/DNA może być spowodowane roztworem PVP. Należy go również wymieniać co 2 do 3 miesięcy. Powlekanie nanocząstek złota można zaobserwować na elektroforezie w żelu agarozowym jako wyższe pasmo MW27.
Każdy badany system biologiczny, jak również każdy inny używany instrument, może wymagać niewielkich zmian ciśnienia gazu, aby osiągnąć zoptymalizowane poziomy transfekcji i rozprzestrzeniania się biologicznego. Krytycznym parametrem jest ciśnienie impulsu helu wymagane do usunięcia mikro- lub nanonośników z plastikowego wkładu i wprowadzenia ich do tkanki. Wysokie ciśnienie gazu wpłynie na przeżycie komórki, ponieważ wytworzy fale uderzeniowe w poprzek celu i przerwie lub oderwie tkankę od matrycy17. Wycelowanie w lufę pistoletu genowego i ustawienie aparatu dokładnie prostopadle do tkanki jest ważne dla dokładnego dostarczania biolistycznego. Wybrany obszar należy umieścić w bezpośrednim środku lufy, dokładnie w odległości 10 mm od zewnętrznego otworu. Powoduje to dostarczanie cząsteczek złota o średnicy 3 mm wokół epicentrum. Lufa pistoletu genowego powinna być czyszczona 70% etanolem po każdym użyciu. Aby chronić tkankę przed dużymi agregatami cząstek, lufa zawiera również nylonową siatkę, którą należy regularnie wymieniać, aby utrzymać optymalną wydajność. W celu wymiany siatki odkręć nakrętkę, a następnie włóż nową nylonową siatkę między nasadkę a O-ring.
Komórki znakowane fluorescencyjnie powinny być widoczne co najmniej 1 - 2 dni po transfekcji wokół epicentrum. Brak lub niewspółosiowość znakowania może wynikać z nieodpowiedniego przygotowania i niestabilności mocowania pistoletu genowego. Obserwacje komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej zależą od wielu czynników: długości fali światła wzbudzenia/emisji, wielkości otworka, NA soczewki obiektywu, współczynnika załamania światła składowych na drodze światła, głębokości tkanki i ustawienia instrumentu. Czynniki te powinny być zoptymalizowane dla każdego badanego systemu.
Niedawne postępy w dziedzinie biolistyki zostały wykorzystane do sukcesu tej metody. Lufa pistoletu genowego użyta w tym badaniu została zmodyfikowana w celu zmniejszenia niezbędnego ciśnienia, a także skierowania biolistycznego wzoru rozproszenia do bardziej ograniczonego i specyficznego obszaru17,19. Inne modyfikacje lufy próbowały ograniczyć rozprzestrzenianie się broni biologicznej i zmniejszyć ciśnienie odpływu28, ale ta specjalnie zaprojektowana lufa pistoletu genowego zaprojektowana przez dr O'Briena jest pojedynczym elementem zamontowanym w standardowym pistolecie Helios Gene. Następnie submikrometrowe cząstki złota zostały użyte w celu zmniejszenia inwazyjności cząstek mikrometrowych, które, jak wcześniej ustaliliśmy, powodowały uszkodzenie komórek i ostatecznie utratę trwałej heterologicznej ekspresji genów. Te zmiany w procedurze biolistycznej poprawiły ogólną wykonalność i odtwarzalność metody13. Inne ulepszenia w przygotowywaniu plastrów, takie jak dogłębne rozwiązywanie problemów z procedurą krojenia, użycie matrycy DMEM-Agaroza w celu zachowania mózgu oraz wiele innych przydatnych postępów w organotypowym przygotowywaniu wycinków mózgu, o których wcześniej informowano13, umożliwiły nam zbadanie zastosowania dorosłych plastrów, które rozwinęły dojrzałe sieci synaptyczne.
W naszym badaniu wykorzystaliśmy głównie barwniki i fluorescencyjne geny heterologiczne do wizualizacji morfologii komórek jako odczytu wydajności transfekcji i zdolności do obrazowania cech morfologicznych neuronów w tkankach mózgowych myszy. Stosunek sygnału do szumu dostawy stochastycznej w określonym promieniu pozwolił nam całkowicie wyizolować port dentrytyczny pojedynczej komórki w jej naturalnym kontekście. Ze względu na to, że podejmowane są liczne wysiłki w celu zbadania tych cech morfologicznych, mapowania "konektomiki" lub oznaczania pojedynczych komórek do różnych analiz, metodę tę można łatwo połączyć z istniejącymi protokołami, takimi jak elektrofizjologia i pomiary neurytów29,30. Oczywiście, kombinacje fluorescencyjnych genów heterologicznych mogą umożliwić znacznie dokładniejsze wyznaczenie pojedynczych komórek jako stochastycznego rozkładu białek fluorescencyjnych, a ich kombinacja określiłaby kolor poszczególnych komórek31,32. Zastosowanie specyficznych dla komórek promotorów, takich jak synapsyna i białko kwasu fibrylarnego glejowego przed heterologicznym eksonem genu, może również ograniczyć ekspresję do subpopulacji33. Rzeczywiście, nieskończona różnorodność materiału genetycznego może być również dostarczana w sposób regioselektywny przez nanocząstki złota przy użyciu tej samej procedury. Całkowite transfekowane regiony można zatem analizować tradycyjnymi metodami, takimi jak rozbiór i poddanie tego regionu zachodniemu immunoblottingowi w celu przeanalizowania zlokalizowanego efektu genu heterologicznego.
Udoskonalenia w procedurach organotypowego plastrowania umożliwią również szersze wykorzystanie tkanek mózgowych do długoterminowych eksperymentów, a także umożliwią wykorzystanie innych tkanek i kokultur oraz ułatwią procedury transfekcji. Wcześniej donoszono, że transfekcja lipidów i polimerów wpływa na homeostazę błony, internalizację, przepuszczalność białek34 i często wykazuje bardzo niską skuteczność transfekcji końcowo zróżnicowanych neuronów. Celowanie w ładunek specyficzny dla komórki jest również podatne tylko na komórki, które wyrażają receptory powierzchniowe komórki potrzebne do internalizacji, i chociaż ta metoda może być wysoce selektywna, może nie mieć ukierunkowanej regioselektywności35. Poza tym wektory wirusowe są często trudne i kosztowne do wyprodukowania, wymagają rygorystycznych przepisów i czasami wykazują obawy dotyczące bezpieczeństwa. Dostarczanie biolistyczne ma zatem niezrównaną zdolność do regioselektywnej transfekcji neuronów i innych typów komórek w żywotnych tkankach. Ponieważ złoto jest nietoksyczne, dalsze postępy w stosowaniu biolistyki mogą utorować drogę do zastosowań biomedycznych, takich jak transdermalne dostarczanie farmaceutyków, nieinwazyjne dostarczanie genów in vivo , a także zlokalizowane niewirusowe terapie genowe.

Pierwotnie technika biolistyczna, co jest zwrotem od "balistyki biologicznej", została stworzona do transferu genów do komórek roślinnych za pośrednictwem cząsteczek1. Ta fizyczna metoda transformacji komórek przyspiesza mikro- lub nanocząstki z dużą prędkością, aby pokonać fizyczne bariery nieprzepuszczalnych błon komórkowych w celu dostarczenia ładunków, takich jak DNA lub barwniki. Ponieważ nie zależy to od specyficznych receptorów ligandowych i/lub właściwości biochemicznych błon powierzchniowych komórek, transfer genów za pośrednictwem cząstek może być łatwo stosowany do różnych systemów biologicznych, takich jak organotypowe wycinki mózgu.
Używanie plastrów organotypowych ma przewagę nad innymi platformami in vitro, ponieważ zachowują wiele właściwości anatomicznych i biochemicznych, które są istotne dla biologii in vivo 2-4. Plastry w większości zachowują lokalne cechy architektoniczne, z których pochodzą, oraz zachowują aktywność neurochemiczną i łączność synaps. Wykorzystanie wycinków mózgu do badań podstawowych i w przedsięwzięciach farmaceutycznych wzrosło jednocześnie z liczbą możliwych manipulacji biotechnologicznych w celu pomiaru i monitorowania neurobiologicznych zachowań mózguw kontekście podobnym do in vivo. Główną zaletą stosowania organotypowych systemów oznaczania opartych na warstwach jest to, że zapewniają one łatwą kontrolę eksperymentalną i umożliwiają precyzyjne manipulacje środowiskami zewnątrzkomórkowymi.
Owocnie, organotypowe systemy hodowli plastrów zostały stworzone z różnych obszarów mózgu, takich jak, ale nie tylko, kora mózgowa, rdzeń kręgowy i móżdżek8-10. Ponadto wykazano szereg kokultur, które pozwalają na ocenę komunikacji międzykomórkowej w dystalnych obszarach mózgu, a także między neuronami a komórkami patologicznymi11,12. Ustanowiono już wiele protokołów, aby z powodzeniem hodować plastry organotypowe i mogą utrzymać długoterminową żywotność, a wiele ostatnich badań wykorzystuje obecnie metody interfejsu błonowego i różne modyfikacje go13. Zasada ta utrzymuje plastry organotypowe na granicy faz między pożywką a nawilżoną atmosferą inkubatora poprzez umieszczenie plastrów na porowatym filtrze membranowym. Pożywka może zatem dostarczyć wystarczającą ilość składników odżywczych, aby odżywić plastry organotypowe za pomocą ruchu kapilarnego. Zazwyczaj plastry przygotowywane są ze zwierząt we wczesnym okresie pourodzenia (w wieku 3 - 9 dni; P3 - 9). Jednak tkanki mózgowe z tych wycinków wykazują wysoki poziom plastyczności komórkowej i mają wrodzoną odporność na naprężenia mechaniczne, co jest pomocne w uzyskaniu żywotnych kultur, jednak dojrzałe synapsy i obwody neuroanatomiczne nie rozwinęły się w pełni in vivo do 2 do 3 tygodni w wieku14 lat. Na przykład wcześniejsze obserwacje wykazały, że wycinki hipokampa uzyskane od noworodków P0-1, choć wysoce żywotne po przygotowaniu, stopniowo traciły pewne cechy morfologiczne. Zasadniczo wykazano, że nie nadają się do długoterminowych hodowli, co sugeruje, że niedojrzałe komórki były bardziej skłonne do dedyferencjacji w porównaniu z kulturami organotypowymi od starszych zwierząt15,16. Z tego powodu nasza metoda została zoptymalizowana dla dorosłych organotypowych wycinków mózgu, w których dojrzewanie i rozwój architektoniczny osiągnęły swoje końcowe etapy13,17-21. Niemniej jednak metoda ta nadaje się również do plastrów organotypowych noworodków i młodocianych.
Po wyprodukowaniu żywych wycinków organotypowych, cała płytka zawierająca plastry może zostać przeniesiona do wierzchowca biolistycznego i poddana regioselektywnemu dostarczaniu i transfekcji. Prawidłowe zamontowanie pistoletu genowego (jak opisano na rysunku 1), ustawionego pod kątem 90° w odległości 10 mm bezpośrednio nad plastrami (od otworu do tkanki), pozwala na szybkie biolistyczne dostarczenie ładunku pokrytego cząstkami złota o długości 40 nm. Ładunki te, takie jak barwniki i fluorescencyjne wektory DNA, a także wszelkie interesujące geny, są łatwo dostarczane do żywotnych plastrów. Metoda ta opisuje zatem protokół niezbędny do dostarczenia, w sposób regioselektywny, nanocząstek złota pokrytych ładunkiem do żywotnych organotypowych wycinków mózgu. Lufę pistoletu genowego i optymalne mocowanie można zobaczyć na rysunku 1. Więcej informacji na temat ulepszonej balistyki luf i nanocząstek można znaleźć w O'Brien, et al.Rozdział 17.
Kolejne udoskonalenia są również wskazane dla użytkownika w celu optymalizacji warunków, takich jak odpowiednia ilość złota dostarczanego na obszar docelowy, zdefiniowana jako Ilość Obciążenia Mikronośnika (MLQ), oraz określenie ilości załadowanego DNA na mg złota, zdefiniowanej jako Współczynnik Obciążenia DNA (DLR). Przed wytrąceniem DNA na cząsteczki złota i załadowaniem ich do rurki Tefzel, która zawiera właściwe "wkłady" pistoletu genowego, konieczne jest obliczenie ilości DNA i złota wymaganej do każdej transfekcji, która może się nieznacznie różnić w zależności od tkanek i warunków (należy zachować stosunek 1 mg złota i 1 μg DNA do 1:5). Niezbędne jest przygotowanie odpowiedniej proporcji MLQ do DLR, ponieważ w przeciwnym razie cząsteczki złota pokryte DNA mogą przylegać do siebie, tworząc większą niż oczekiwano aglomerację, co może zmniejszyć ogólną jednorodność rozprzestrzeniania się biolistycznego, a także zwiększyć uszkodzenie tkanek i cytotoksyczność.
Ta metoda pokazuje ostatnie ulepszenia w dostarczaniu biolistycznym, które zostały przetestowane i uznane za podatne na organotypowe wycinki mózgu noworodków, młodych i dorosłych. Co więcej, wykorzystując zmniejszone rozprzestrzenianie się biolistyczne lufy pistoletu genowego, użytkownik jest teraz w stanie selektywnie transfekować punktowy obszar w mózgu. Po odpowiednim czasie inkubacji ekspresję białek fluorescencyjnych, która osiąga maksymalną szybkość między 24 a 48 godzin, można uwidocznić za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej i konfokalnej. Fluorofory te umożliwiają analizę morfologiczną i lokalizację poszczególnych komórek w biologicznie istotnych strukturach. Jednak regioselektywna modulacja wycinków organotypowych przez inne geny heterologiczne może być również monitorowana za pomocą wszelkich innych testów podatnych na te preparaty. Możliwe strategie pracy dla zlokalizowanego dostarczania genu przedstawiono na rycinie 2.

<table><tbody><tr><td>System pistoletów genowych Helios</td><td>Bio Rad</td><td>165-2431</td><td>Pistolet genowy i stacja przygotowania probówek</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>83264-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-250G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907-100G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791-100G</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &micro; m sterylna jednostka filtrująca</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>do mediów filtracyjnych</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Gibco</td><td>10270-098</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>p4333</td><td></td></tr><tr><td>Poliwinylopirolidon</td><td>Sigma</td><td>856568-100G</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>277649-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Spermidyna</td><td>Sigma</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Bio Rad</td><td>161-3100EDU</td><td></td></tr><tr><td>Wibrokrajalnica</td><td>Laica</td><td>VT1200</td><td>Użyliśmy niestandardowego projektu</td></tr><tr><td>Mocowanie</td><td></td><td></td> pistoletu genowego <td>Zbudowany w domu na Uniwersytecie T</td></tr><tr><td>Nawilżany inkubator</td><td></td><td></td><td></td>kultur komórkowych</tr><tr><td>Nanocząstki złota</td><td>cytodiagnostyka</td><td>G-40-20</td><td></td></tr><tr><td>pEYFP-N1</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obcinak do rurek</td><td>Bio Rad</td><td>165-2422</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Tefzel</td><td>Bio Rad</td><td>165-2441</td><td></td></tr><tr><td>Beczka</td><td></td><td></td><td>Wykonana na zamówienie przez LMB</td></tr><tr><td>Wkład do hodowli komórkowej</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>76240 Mikroskop</td> preparacyjny Fluka <td></td></tr><tr><td>dla wygody</td><td></td> Mikroskop konfokalny zdefiniowany przez użytkownika do użytku Szkiełko podstawowe VWR 2588-CA48323-185 Szkło Microcover VWR 2448-CA48366-067-1 Nośniki montażowe Vectashield Laboratoria wektorowe H-1400&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> &nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

regioselektywne celowanie biolistyczne w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu zmodyfikowanego pistoletu genowego

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Transfekcja DNA była nieoceniona dla nauk biologicznych, a dzięki niedawnym postępom w organotypowych preparatach do wycinania mózgu, wpływ różnych heterologicznych genów może być łatwo badany, zachowując wiele aspektów biologii in vivo. Rośnie zainteresowanie transfekcyjnie różnicowanymi kończnie zróżnicowanymi neuronami, w przypadku których konwencjonalne metody transfekcji były obarczone trudnościami, takimi jak niska wydajność i znaczne straty żywotności. Transfekcja biolistyczna może obejść wiele z tych trudności, ale dopiero niedawno technika ta została zmodyfikowana tak, aby można ją było stosować w tkankach ssaków.
Nowe modyfikacje komory akceleratora zwiększyły precyzję strzelania pistoletu genowego i zwiększyły jego głębokość penetracji, jednocześnie pozwalając na użycie niższego ciśnienia gazu (50 psi) bez utraty efektywności transfekcji, a także pozwoliły na skoncentrowane regioselektywne rozprzestrzenianie się cząstek z dokładnością do 3 mm. Ponadto technika ta jest prosta i szybsza do wykonania niż żmudne mikroiniekcje. Zarówno przejściowa, jak i stabilna ekspresja jest możliwa przy bombardowaniu nanocząstkami, gdzie ekspresję episomalną można wykryć w ciągu 24 godzin, a przeżycie komórek okazało się lepsze lub co najmniej równe konwencjonalnym metodom. Technika ta ma jednak jedną zasadniczą zaletę: pozwala na zlokalizowanie transfekcji w pojedynczym ograniczonym promieniu, umożliwiając w ten sposób użytkownikowi anatomiczną izolację efektów heterologicznego genu. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania żywotnych dorosłych plastrów organotypowych i poddania ich regioselektywnej transfekcji przy użyciu ulepszonego pistoletu genowego.

Żywotność plastrów organotypowych można monitorować za pomocą aktywności dehydrogenazy mleczanowej, znakowania jodkiem propidyny oraz barwienia dUTP, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami13,22. Ewidentnie, żywotność i integralność plastrów są kluczowe dla długotrwałej, utrzymującej się ekspresji dostarczonego ładunku genetycznego. Po dostarczeniu materiału metodą biolistyki do plastrów organotypowych, ekspresję fluorescencyjnego genu heterologicznego monitorowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Precyzję rozprzestrzenienia materiału metodą biolistyki przy użyciu zmodyfikowanej lufy można zobaczyć na Rysunku 3A. Rysunek 3B przedstawia reprezentatywny obraz przetransfekowanego obszaru hipokampa z wykorzystaniem nanocząsteczek złota powlekanych DNA. Rysunek 4 przedstawia reprezentatywne zdjęcia przetransfekowanych plastrów organotypowych dorosłej myszy. Jak widać na Rysunku 4A, neuron Purkinjego z wyraźnym drzewem dendrytycznym, znajdujący się na granicy warstwy komórek Purkinjego i warstwy ziarnistej móżdżku, wykazuje silne znakowanie po przejściowej transfekcji biolistycznej wektorem pEGFP-N1. Rysunek 4B przedstawia te dendryty w większym powiększeniu, gdzie można zaobserwować kolce dendrytyczne. Rysunek 4C pokazuje komórkę piramidową znajdującą się w obszarze CA1 hipokampa po dostarczeniu metodą biolistyki nanocząsteczek złota powlekanych pDSredFP.
W celu wizualizacji cech morfologicznych w skrawkach organotypowych, w podobny sposób można wykorzystać barwniki zamiast ładunków DNA kodowanych fluorescencyjnie. Barwnik DiO, który znakuje błony plazmatyczne, pozwala na szybsze wyodrębnienie morfologii poszczególnych komórek lub może być stosowany w połączeniu z DNA dostarczanym metodą biolistyki do tego samego obszaru w celu potwierdzenia regioselekcji. Jak widać na Rysunku 5A, neuron w hipokampie zabarwiony DiO wykazuje również długie dendryty z licznymi kolcami. Strzałka wskazuje akson, który został zidentyfikowany na podstawie obecności pęcherzyków synaptycznych w porównaniu do kolców dendrytycznych na pozostałych neurytach. Rysunek 5B przedstawia kolejny przykład obszaru CA1, uwypuklający liczne projekcje hipokampa z przeciwbarwieniem DAPI w celu oznakowania jądra. Rysunek 5C pokazuje większe powiększenie tego typu równoległych dendrytów z licznymi kolcami.
Klarownie obrazują one cechy morfologiczne po znakowaniu komórkowym. Nic nie stoi na przeszkodzie, aby tę samą metodologię zastosować w celu dostarczenia dowolnej liczby genów egzogennych naniesionych na nanocząsteczki złota. Aby umożliwić wizualne potwierdzenie udanej transfekcji, można skonstruować pojedynczy plazmid do koekspresji zarówno genu zainteresowania, jak i fluorescencyjnego białka reporterowego na tym samym wektorze.
<img alt="Układ wiercenia ultradźwiękowego; schemat i eksperyment; przetwarzanie próbek minerałów; wiercenie precyzyjne." src="/files/ftp_upload/52148/52148fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Lufa i mocowanie armatki genowej. (A) Udoskonalona lufa opracowana przez dr. O'Briena w MRC-LMB, która posiada ograniczony rozrzut biolistyczny, co minimalizuje uszkodzenia tkanek poprzez obniżenie ciśnienia wymaganego do przyspieszania cząsteczek. (B) Widok z boku zoptymalizowanego mocowania armatki genowej opracowanego przez dr. Hendersona i dr. Andrasa Nagy'ego na Uniwersytecie w Toronto. Mocowanie utrzymuje armatkę genową dokładnie pod kątem 90˚ prostopadle do skrawków organotypowych, umożliwiając użytkownikowi precyzyjną kontrolę odległości dostarczania biolistycznego. Dla optymalnych warunków biolistycznych otwór lufy powinien znajdować się bezpośrednio nad obszarem zainteresowania w odległości 10 mm od skrawków organotypowych. (C) Widok z tyłu mocowania armatki genowej. Obszar zainteresowania do transfekcji musi zostać umieszczony bezpośrednio pod otworem lufy. Celowanie można potwierdzić za pomocą barwnika (diolistyka) lub transfekcji białka fluorescencyjnego (biolistyka). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces klarowania tkanki mózgowej, konfiguracja obrazowania z mózgiem w hydrożelu, analiza schematu przekroju poprzecznego." src="/files/ftp_upload/52148/52148fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przygotowanie skrawków organotypowych i celowanie regioselektywne. (A) Mózg dorosłej myszy zatopiony w DMEM, gotowy do cięcia. (B) Forma została przyklejona do uchwytu wibroslicera z ostrzem gotowym do wycięcia skrawka. (C) Strategie regioselektywnej heterologicznej ekspresji genów dla dostarczania biolistycznego do koronalnych skrawków organotypowych mózgu. Obrazy przygotowane na podstawie zdjęć pochodzących z anatomicznego atlasu referencyjnego Allen Brain Atlas23. Panel lewy pokazuje dwa różne obszary mózgu wybrane jako przykład. (1) Ograniczenie ekspresji genu do obszaru kory lewej półkuli. (2) Ograniczenie heterologicznej ekspresji genu do obszaru podwzgórza w mózgu. Panel środkowy pokazuje, że ekspresja dwóch heterologicznych genów (3 i 4) może być izolowana i porównuje hipokamp dwóch półkul w tym samym skrawku organotypowym, co w zasadzie eliminuje błędy wynikające z użycia różnych sekcji i/lub daje możliwość analizy dystalnego crosstalku wynikającego z działania tych genów. Panel prawy pokazuje możliwy nakład dostarczania transgenicznego w celu ekspresji pierwszego genu (5) w precyzyjnym regionie kory przy jednoczesnej ekspresji innego genu (6) w odrębnym, lecz nakładającym się obszarze kory. Pozwala to na analizę efektu modulacji genetycznej każdego heterologicznego genu z osobna, a także w kombinacji w obrębie tego samego skrawka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia różnicowania neuronalnego; panel A: stadia komórek, panel B: immunofluorescencja, sieć neuronalna." src="/files/ftp_upload/52148/52148fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Wzorzec rozproszenia biolistycznego widoczny na papierze filtrującym oraz obraz przy niskim powiększeniu. (A) Ulepszoną lufę wystrzelono na papier filtrujący, aby określić zasięg rozprzestrzeniania się cząsteczek złota. Lewa strona pokazuje rozkład dla ulepszonej lufy, natomiast prawy panel przedstawia lufę standardową. Czarny pasek: 1 cm. Obraz zaczerpnięty z O'Brien, et al.17. (B) Obraz przy niskim powiększeniu pokazujący stochastyczny wzorzec transfekcji w obrębie 3 mm rozproszenia biolistycznego w regionie hipokampa u 6-tygodniowych myszy. Biały pasek: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Morfologia neuronów, dendryty oznakowane na obrazach mikroskopowych, wizualizacja struktur neuronalnych." src="/files/ftp_upload/52148/52148fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Dostarczenie DNA kodującego białko fluorescencyjne metodą biolistyki do organotypowych skrawków mózgu 6-tygodniowych myszy. (A) Odwrócone obrazy konfokalne utrwalonego organotypowego skrawka móżdżku z komórką Purkinjego przetransfekowaną za pomocą cząsteczek złota powleczonych pEGFP-N1. Obraz wykonany przy powiększeniu 40X. Czarny pasek: 30 µm. (B) Powiększenie 60x fragmentu dendrytów innej komórki Purkinjego w celu uwidocznienia kolców dendrytycznych. Czarny pasek: 5 µm. (C) Obraz konfokalny utrwalonych skrawków pobranych z obszaru hipokampa przy powiększeniu 60x, przedstawiający cztery przetransfekowane DSredFP komórki piramidalne. Czarny pasek: 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Struktura dendrytów neuronalnych, obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, podkreślający połączenia i rozgałęzienia neuronów." src="/files/ftp_upload/52148/52148fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Dostarczanie fluorescencyjnych barwników do znakowania błon za pomocą metody diolistycznej do skrawków organotypowych. (A) przedstawia obrazowanie na żywo neuronu hipokampa znakowanego DiO przy powiększeniu 20X. Wyraźnie widoczne są kolce dendrytyczne, a także akson, zidentyfikowany na podstawie braku kolców dendrytycznych i obecności pęcherzyków synaptycznych wskazanych białą strzałką. Biały pasek: 30 µm. (B) Wyraźne barwienie obszaru hipokampa znakowanego DiO i kontrastowanego DAPI. Biały pasek: 30 µm. (C) Większe powiększenie (60x) kolców dendrytycznych znajdujących się w obszarze CA1 hipokampa. Biały pasek: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ostatnie ulepszenia w organotypowych preparatach do wycinania mózgu pozwoliły na ich wykorzystanie do zastosowań biotechnologicznych. Plastry organotypowe zachowują lokalne cechy strukturalne biologii in vivo, w tym funkcjonalne połączenia synaptyczne. Tutaj przedstawiamy regioselektywną biolistyczną metodę dostarczania do znakowania i genetycznej manipulacji tymi wycinkami.

Regioselektywne celowanie biolistyczne w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu zmodyfikowanego pistoletu genowego

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Celem tej procedury jest szybkie i skuteczne transfekowanie lub znakowanie odrębnych regionów wycinków organotypowych za pomocą pistoletu genowego. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw żywotnych organotypowych wycinków mózgu lub innych tkanek. Drugim krokiem jest wyprodukowanie DNA lub zdekodowanych cząsteczek złota w celu dostarczenia biotycznego.Następnie wycinek organotypowy umieszcza się pod ustabilizowanym uchwytem pistoletu genowego, a powlekane cząstki są wystrzeliwane do tkanki lub transformacji episomalnej lub znakowania. Ostatnim krokiem jest obserwacja lub analiza wpływu heterologicznych genów dostarczanych do izolowanych regionów. Ostatecznie takie podejście pozwala użytkownikowi na precyzyjną transfekcję różnych regionów wycinków narządu z różnymi heterologicznymi genami.Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że biologistyka pozwala na transfekcję terminalnie różnicujących się komórek, a także ogranicza promień działania do małej średnicy. Metoda ta może pomóc w zrozumieniu kluczowych zagadnień neurobiologicznych, takich jak zrozumienie regionalnego wkładu pojedynczego genu. Rozpocznij tę procedurę od umieszczenia świeżego mózgu w małej foremce biorcy.Przykryj go roztworem ARO, który został wezwany do temperatury nieco wyższej niż pokojowa. Następnie szybko schłodzić formę do czterech stopni Celsjusza, umieszczając ją na lodzie. Gdy aros zostanie ustawiony.Po pięciu do 10 minutach wyjmij osadzony mózg aros z formy. Następnie przyklej go do platformy krajalnicy fibro. Następnie przenieś platformę do komory krajalnicy Vibra zawierającej sterylny, lodowaty PBS.Po pokrojeniu w plastry delikatnie umieść plastry na wkładkach do hodowli komórkowych na sześciodołkowej tacy z pożywką hodowlaną na zewnątrz wkładki. Inkubuj je w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. W tej procedurze przygotuj nano pociski przy użyciu cząstek złota o średnicy 40 nanometrów, dodając najpierw 50 mikrolitrów 0,05 molowej spermy i 10 mikrolitrów DNA w ilości jednego miligrama na mililitr do 10 miligramów cząstek złota.Następnie dodaj chlorek wapnia do mieszaniny roztworów, aby wspomóc wiązanie cząsteczek DNA z nanocząstkami złota. Następnie pobrać roztwór do rurki za pomocą strzykawki. Umieść rurkę w stacji przygotowania przewodów.Pozwól, aby cząsteczki złota opadły. Następnie usuń supinat przez aspirację Za pomocą strzykawki. Obróć rurkę, aby równomiernie rozprowadzić cząsteczki złota.Następnie wysusz cząstki przy stałym przepływie azotu z prędkością pięciu litrów na minutę. Aby stworzyć kulki DNA, pokrój rurkę na jednocentymetrowe kawałki za pomocą obcinaka do rurek. Następnie albo włóż je natychmiast do wkładu z genem wyhodowanym, albo trzymaj je wysuszone w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia w sterylnym kapturze z przepływem blaszki, załaduj wkład zawierający złoto pokryte DNA do uchwytu wkładu.Następnie załaduj uchwyt do pistoletu genowego. Przymocuj do niego zmodyfikowaną lufę pistoletu genowego za pomocą sterylnych kleszczy. Umieść wkład filtrujący zawierający plasterek organotypowy w sterylnym plastikowym naczyniu.Usunąć pożywkę z plastra organotypowego. Następnie ustaw ciśnienie gazu na 50 PSI za pomocą uchwytu. Umieść pistolet genowy w odległości 10 milimetrów powyżej żądanego obszaru plasterka w celu dostarczenia genetyki.Następnie ostrożnie wyceluj w środek lufy i wystrzel powlekane cząstki w tkankę. Po transfekcji biotycznej delikatnie umyj plasterek dwa razy za pomocą PBS. Następnie utrwal plasterek, inkubując w 4% lodowatym PFA w PBS przez 20 minut.Następnie umyj plasterek dwukrotnie w PBS. Ponownie delikatnie odetnij membranę od wkładu za pomocą skalpela, nie naruszając plastra. Następnie umieść wspornik membrany na szkiełku mikroskopowym z kleszczami i pozwól, aby plasterek organotypowy spoczęł na nim.Następnie dodaj jedną kroplę nośnika montażowego na plasterek. Umieść szkiełko nakrywkowe delikatnie, bez użycia siły, bezpośrednio stykając się z tkanką. Następnie zabezpiecz szkiełko nakrywkowe cienką warstwą lakieru do paznokci.Rysunek ten pokazuje biotyczne dostarczanie fluorescencyjnego DNA zakodowanego w białku do organotypowego wycinka sześciotygodniowej myszy. Jak widać tutaj, neuron bikini z niezwykłym portem dendrytycznym znajdującym się na styku warstwy bikini i warstwy molekularnej móżdżku wykazuje wyraźne znakowanie po przejściowej transfekcji biotycznej z P-E-G-F-P-N one. Tutaj jest większe powiększenie dendrytów z kolcami, a tutaj jest komórka parametaliczna znajdująca się w regionie hipokampa.Po biotycznym dostarczeniu nanocząstki złota pokrytej czerwoną powłoką PDS FP Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu zaledwie kilku godzin w ciągu trzech do czterech dni po tej procedurze. Inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna, mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób niektóre neurony są połączone z sąsiednimi regionami.

regioselective-biolistic-targeting-organotypic-brain-slices-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy artykuł przedstawia metodę preparowania i inkubacji siatkówki królika oraz zapośredniczony przez cząsteczki transfer genów plazmidów kodujących GFP lub różne markery subkomórkowe do komórek zwojowych siatkówki.

Organotypowa hodowla siatkówki dorosłego królika

Opisujemy metodę przygotowania złotych mikrocząsteczek (tzw. „bullets”) powlekanych DNA oraz demonstrujemy wykorzystanie tych cząsteczek do biolistycznej transfekcji neuronów w hodowanych plastrach hipokampa.

Przygotowanie mikropocisków do armatki genowej oraz transfekcja biolistyczna neuronów w kulturze plastrów tkankowych

Kontrola i analiza obwodów neuronalnych in vivo zostałyby ułatwione dzięki technologii dostarczania wirusów i innych odczynników do wybranych trójwymiarowych zestawów obszarów mózgu. Prezentujemy wykonanie zindywidualizowanej macierzy wtryskiwaczy płynowych oraz dostarczanie kodowanych wirusowo sensybilizatorów optycznych, co umożliwia optyczną manipulację złożonymi obwodami mózgowymi.

Skalowalne macierze wtryskiwaczy płynowych do wirusowego targetowania nienaruszonych trójwymiarowych obwodów mózgowych

Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania i utrzymania preparatu przekroju nowokory w kulturze organotypowej w celu wykonania rejestracji elektrycznej z neuronów piramidowych.

Rejestracja całokomórkowa z organotypowego preparatu skrawka neokory

W celu przeprowadzenia szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgu opisujemy metody obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów koekspresujących inhibicyjne RNA (RNAi) i GFP w zarodkowej korze mysiej. Protokół ten nadaje się do badania różnych aspektów neurorozwoju, takich jak neurogeneza, migracja neuronów oraz morfogeneza neuronów, w tym wzrost dendrytów i aksonów.

Metody badania morfogenezy neuronalnej: Elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy

Opisujemy technikę oznaczania neuronów i ich procesów poprzez iniekcje śladowe do jąder mózgowych za pomocą preparatu in vitro. Zmodyfikowaliśmy istniejącą metodę elektroporacji znaczników invitro, wykorzystując znakowane fluorescencyjnie mutanty myszy i podstawowy sprzęt optyczny w celu zwiększenia dokładności znakowania.

Laserowe śledzenie neuronów w eksplantatach mózgu

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Ten protokół opisuje zestaw metod do identyfikacji specyficznej dla typu komórki funkcjonalnej łączności sygnałów dalekiego zasięgu z odległych obszarów mózgu za pomocą stymulacji optogenetycznej w wycinkach mózgu ex vivo.

Wewnątrzmózgowe zastrzyki stereotaktyczne in vivo do optogenetycznej stymulacji sygnałów wejściowych dalekiego zasięgu w wycinkach mózgu myszy

Tutaj prezentujemy protokół, zaprojektowany do wykorzystania narzędzi chemogenetycznych do manipulowania aktywnością komórek progenitorowych interneuronów korowych przeszczepionych do kory mózgowej myszy po urodzeniu.

Przeszczepienie chemogenetycznie zmodyfikowanych progenitorów interneuronów korowych do wczesnych postnatalnych mózgów myszy

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Tutaj prezentujemy ostrą manipulację genetyczną pokrojonych ludzkich organoidów korowych za pomocą elektroporacji. Te korowe modele organoidów są szczególnie podatne na wstrzykiwanie, ponieważ struktury podobne do komór można łatwo zidentyfikować po pokrojeniu, co umożliwia funkcjonalne badanie rozwoju kory mózgowej człowieka, zaburzeń neurorozwojowych i ewolucji kory mózgowej.

Elektroporacja pokrojonych w plasterki organoidów korowych człowieka do badań funkcji genów

Poznaj regioselektywną biolistykę w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu zmodyfikowanego pistoletu genowego. Ta metoda umożliwia precyzyjną transfekcję określonych regionów przy zachowaniu cech in vivo.

Regioselektywne celowanie biolistyczne w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu zmodyfikowanego pistoletu genowego

Przeglądaj więcej filmów