Name: Subklonowanie plus insercja (SPI) - nowatorska metoda rekombinacji do szybkiej budowy wektorów celowania w geny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Poznaj metodę subklonowania plus insercji do szybkiej budowy wektorów celowania w geny w E. coli. Ta technika umożliwia konstrukcję wektorów w jednej reakcji, zwiększając efektywność inżynierii genetycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

T.R.R wymyślił projekt, zaprojektował i przeprowadził eksperymenty oraz przygotował rękopis. E.J.K i S.E.M przeprowadzali eksperymenty. Wszyscy autorzy wnieśli intelektualny wkład w powstanie ostatecznego rękopisu. Praca ta została sfinansowana przez University of Leicester Innovation Fellowship dla SEM oraz przez UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship dla S.M.C (MR/J009202/1). Sekwencjonowanie DNA zostało przeprowadzone przez Laboratorium Białek i Kwasów Nukleinowych (PNACL), Centrum Podstawowych Usług Biotechnologicznych, Uniwersytet w Leicester. Pragniemy podziękować A. Francisowi Stewartowi za dostarczenie plazmidów Rox i Dre. Plazmidy pL451 i pL452 uzyskano z National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.

1. Projekt celowania genowego
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Zamów odpowiedni klon BAC obejmujący interesujący nas region genomu. Upewnij się, że jest to izogeniczne w stosunku do typu komórek ES, które mają być modyfikowane, np. klonów BAC RPCI-23 i RPCI-24 do celowania w geny za pomocą komórek ES C57BL / 6.</li>
	<li>Zastosuj konwencjonalne kryteria celowania genów podczas projektowania wektora docelowego. Kluczowe parametry obejmują to, czy modyfikacja musi być konstytutywna czy warunkowa, definiowanie eksonów krytycznych (CE) dla delecji w strategii nokautu genów oraz odstępy i rozmieszczenie kaset intronowych. 
	UWAGA: Każdy z nich został szczegółowo omówiony w innym miejscu10.</li>
	<li>Wybierz regiony genomu, z których każdy ma rozmiar 5-6 kb po bokach docelowego miejsca modyfikacji. 
	UWAGA: Rozmiar subklonowanej wstawki wynosi zatem zwykle 10-12 kb, chociaż górna granica może wynosić nawet 80 kb w przypadku plazmidu subklonującego o niskiej kopii, takiego jak p15A, pBR322 itp., i do 200 kb w przypadku wektora BAC.</li>
</ol>
2. Multipleksowe Oligonukleotydy Rekombinujące
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Zaprojektuj oligonukleotydy dla szkieletu plazmidu (plazmid subklonujący) i markera wybieralnego (kaseta insercyjna). Zaprojektuj każdy oligo w taki sposób, aby zawierał 180 pz HA flankującego genomowe miejsce docelowe i 20 pz specyficznej sekwencji primingowej kasety insercyjnej lub plazmidu subklonującego (Figura 2). 
	UWAGA: Ramiona Homology nie powinny zawierać żadnych powtarzających się elementów, obecność powtarzających się elementów będzie skutkowała nieprawidłowym celowaniem i subklonowaniem. Powtarzające się elementy można wykryć za pomocą narzędzi internetowych, takich jak ''Repeat Masker''.</li>
	<li>Uwzględnij unikalne miejsce enzymu restrykcyjnego (RE) na jednym z oligonukleotydów wektorowych, aby zlinearyzować wektor ukierunkowany na gen do celowania w komórki ES (ryc. 2).</li>
	<li>Sprawdź parametry oligo za pomocą programu do analizatora oligo. Uważaj, aby uniknąć drugorzędnych struktur w regionach gruntowania.</li>
	<li>Krótszy kwas hialuronowy (50 pz) kasety insercyjnej jest tolerowany i daje mniejszą liczbę rekombinantów, ale zapewnia, że plazmid podklonujący HA jest zawsze dłuższy (180 pz).</li>
	<li>Określ orientację wstawki genomowego DNA konkretnego klonu BAC za pomocą narzędzi internetowych, takich jak ''cloneDB''. Ustal kierunek replikacji z OriS, sprawdzając mapę szkieletu plazmidu BAC użytego w konstrukcji biblioteki BAC. 
	UWAGA: OriS jest zwykle przeciwny do kierunku transkrypcji markera chloramfenikolu (Chl) dla wszystkich powszechnie stosowanych plazmidów BAC.</li>
	<li>Dodaj dwa końcowe wiązania fosforotionianu (PTO) do końca 5' oligo, który jest przeciwny do kierunku replikacji na klonie BAC. Dodać modyfikację 5' fosforanu do odwróconego oligo (rysunek 2). 
	UWAGA: Asymetryczna, fosforonowana kaseta PCR po trawieniu na czerwono generuje produkt pośredni ssDNA, który może przygotować opóźnioną nić widełka replikacyjnego. 
	UWAGA: Maksymalna częstotliwość rekombinacji multipleksu jest obserwowana w przypadku kaset zabezpieczonych opóźnionymi pasmami. Kasety zabezpieczone przed wiodącą nicią lub podwójnie zabezpieczone mogą nie wytwarzać równoważnej wydajności rekombinacji w niektórych loci.</li>
	<li>Zamów oligonukleotydy z oczyszczaniem PAGE lub HPLC.</li>
</ol>
3. Transformacja klonu BAC za pomocą plazmidu rekombinującego pSC101 BADgbaA.
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Aby szczep E. coli posiadający BAC był sprawny w rekombinacji, przekształć go za pomocą plazmidu pSC101 BADgbaA zawierającego geny Red16, 
	UWAGA: Plazmid pSC101 BADgbaA zawiera geny Red i RecA pod kontrolą indukowalnego arabinozą promotora araC-PBAD, markera selekcyjnego tetracykliny i wrażliwego na temperaturę replikonu pSC101.
	<ol>
		<li>Wbić sterylną końcówkę pipety do kultury agarowej BAC i zaszczepić 5,0 ml bulionu lizogenicznego (LB) o pH 8,0 zawierającego 12,5 μg ml-1 Chl. Rosnąć w temperaturze 37 °C przez 5 godzin, wstrząsając z prędkością 200 obr./min.</li>
		<li>Schłodzić 10% (v/v) roztwór glicerolu, probówki do mikrowirówek i kuwety do elektroporacji na lodzie. Schłodzić dużą wirówkę i mikrowirówkę z chłodzeniem do temperatury 4 °C.</li>
		<li>Oznaczyć gęstość optyczną (OD) kultury za pomocą spektrofotometru i zmierzyć absorbancję przy 600 nm. Przygotuj ogniwa elektrokompetentne (jak opisano poniżej), gdy zostanie osiągnięty odczyt OD600 od 0,3 do 0,8.</li>
		<li>Odwirowywać komórki w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml w dużej wirówce o sile 1,216 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przemyć komórki 1 ml schłodzonego 10% glicerolu i odwirować komórki w temperaturze 17,949 x g przez 20 sekund w temperaturze 4 °C. Wykonaj krok prania w sumie 3 razy.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w całkowitej objętości 50 μl 10% glicerolu i dodać 10-200 ng plazmidu rekombinującego pSC101 BADgbaA. Zawiesinę pojedynczej komórki należy uzyskać poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieść komórki do wstępnie schłodzonej kuwety elektroporacyjnej o szczelinie 1 mm.</li>
		<li>Elektroporuj ogniwa z ustawieniem 1,8 kv, 25 μF i 200 Ω, 
		UWAGA: Sprawdź prawidłowe ustawienia dla każdej marki elektroporatora. Stała czasowa elektroporacji mniejsza niż 4 wskazuje na obecność soli i innych zanieczyszczeń.</li>
		<li>Natychmiast odzyskać komórki w 1 ml LB i przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Hoduj kulturę BAC gbaA w temperaturze 30 °C przez 2 godziny wytrząsania z prędkością 200 obr./min. 
		UWAGA: Plazmid pSC101 BADgbaA jest tracony, gdy komórki są hodowane w temperaturze 37 °C z powodu inaktywacji wrażliwego na temperaturę czynnika replikacji RepE. Hoduj komórki gbaA w temperaturze 30 °C, aby utrzymać funkcje rekombinacji.</li>
		<li>Dodać 9 ml LB zawierającego 12,5 μg ml-1 Chl i 4 μg ml-1 tetracykliny (Tet) do odzyskanej kultury BAC gbaA. Hoduj kulturę BAC gbaA O/N w temperaturze 30 °C, wstrząsając przy 200 obr./min. 
		UWAGA: Wydajność przemiany elektroporacji superskręconego plazmidu gbaA jest wystarczająco wysoka, aby umożliwić wzrost nasycenia O/N w ciekłych ośrodkach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie kaset inseryjnych i plazmidów do subklonowania
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Aby włączyć kwas hialuronowy do kasety insercyjnej (kaset insercyjnych) i plazmidu subklonującego, należy przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przy użyciu długich zmodyfikowanych oligonukleotydów, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Opcjonalnie: aby zapobiec przenoszeniu plazmidu do reakcji rekombinacji, należy użyć matrycy plazmidu o pochodzeniu R6K lub podobnej wąskiej skali gospodarza do amplifikacji kasety insercyjnej.</li>
		<li>Alternatywnie, linearyzuj matrycę plazmidu za pomocą trawienia RE (Tabela 2). Wybierz RE, który wykracza poza obszar amplifikacji PCR i jest inaktywowany termicznie. Dezaktywuj RE na gorąco zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
		<li>Skonfiguruj reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przy użyciu systemu polimerazy DNA o wysokiej wierności w fazie gorącego startu. Przygotować wzorcową mieszankę PCR zgodnie z opisem (tabela 3). Wykonaj cykle termiczne, jak pokazano (Tabela 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj produkty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Załaduj 1-5 μl każdego PCR na 1% (w/v) żelu agarozowym zawierającym 0,5 mg ml-1 bromku etydyny (EtBR). 
	UWAGA: Obecność niespecyficznych produktów amplifikacji nie zakłóca reakcji rekombinacji. Jednak w niektórych przypadkach dimery starterów mogą zmniejszać wydajność rekombinacji.</li>
	<li>Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.
	<ol>
		<li>Opcjonalnie: usunąć matrycę plazmidu z PCR poprzez traktowanie DpnI, a następnie oczyszczanie PCR. Eluować DNA w minimalnej objętości sterylnej wody dejonizowanej (zgodnie z zaleceniami producenta). 
		UWAGA: Dodanie DpnI do nieoczyszczonych reakcji PCR powoduje zmniejszenie efektywności rozszczepienia matrycy metylowanego plazmidu DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określić ilościowo amplifikowane DNA metodą PCR za pomocą analizy w żelu agarozowym w porównaniu ze znanym zestawem wzorców DNA, np. trawienia λ HindIII lub przy użyciu spektrofotometru nanokropli.</li>
</ol>
5. Subklonowanie plus wstawianie
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Rozcieńczyć kulturę O/N BAC gbaA 50 razy, dodając 200 μl w 10 ml LB+Chl+Tet. Rosnąć w temperaturze 30 °C, wytrząsając z prędkością 200 obr./min przez 1 godzinę 50 min. Dołączyć próbkę, która ma być wykorzystana jako kontrola ujemna.</li>
	<li>Schłodzić wszystkie materiały i urządzenia do rekombinacji do temperatury 4 °C, jak opisano w kroku 3.1.2.</li>
	<li>Wlać płytki agaru LB o pH 8 zawierające odpowiednie stężenie odpowiedniego selektywnego antybiotyku (antybiotyków), który pozwoli na wybór wprowadzanego fragmentu DNA, jak również na wybór wektora subklonującego (Tabela 4). 
	UWAGA: Niektóre antybiotyki są wrażliwe na pH. Z reguły używaj agaru LB o pH 8.</li>
	<li>Przygotować 10% (w/v) roztwór L-arabinozy. Filtr sterylizować przez filtr strzykawkowy 0,2 μm. 
	UWAGA: Arabinoza indukuje ekspresję białek rekombinujących z plazmidu gbaA.</li>
	<li>Sprawdź OD kultury BAC gbaA za pomocą spektrofotometru. Po osiągnięciu OD600 0,25-0,3 indukuj białka rekombinujące zgodnie z opisem w następnym kroku.</li>
	<li>Dodać 200 μl 10% roztworu arabinozy do 10 ml kultury BAC, aby uzyskać końcowe stężenie arabinozy 0,2%. Obejmują nieindukowaną hodowlę (bez arabinozy), która ma być stosowana jako kontrola negatywna.</li>
	<li>Przenieść kulturę BAC do inkubatora z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i wywołać ekspresję czerwieni przez 45 minut wstrząsania przy 230 obr./min. 
	UWAGA: Ekspresja czerwonych białek jest nieefektywna w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Odkręć komórki i przemyj 10% glicerolem 3 razy, jak opisano w kroku 3.1.5.</li>
	<li>Dodaj 600-1,000 ng każdego z plazmidów subklonujących i kasety insercyjnej (kaset) insercyjnych do reakcji rekombinacji. Dołącz tylko wektor i wektor plus pojedyncze wstawki, aby sprawdzić sprawność i integralność rekombinacji wektora i kaset.</li>
	<li>Zawiesinę jednokomórkową można uzyskać, pipetując w górę i w dół. Przeprowadzić elektroporację zgodnie z opisem w kroku 3.1.7, a następnie odzysk w 1 ml LB w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w przypadku plazmidów wielokopijnych lub w 10 ml LB w temperaturze 37 °C przez 3 godziny w przypadku wektorów BAC.</li>
	<li>Na płytki agarowe z podwójnej selekcji rozcieńczyć różne roztwory, np. 90%, 10%, 1% i rosnąć w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.</li>
</ol>
6. Analiza rekombinantów
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Opcjonalnie: Wybierz od 6 do 12 kolonii i wykonaj PCR kolonii przy użyciu startera flankującego HA i startera specyficznego dla wkładki. Uwzględnij plazmid subklonujący i plazmid kasety insercyjnej, a także macierzysty klon BAC jako kontrole ujemne.
	<ol>
		<li>Wykonaj analizę PCR kolonii w żelu agarozowym. Zidentyfikuj dodatnie klony na podstawie obecności jasnego pasma o oczekiwanym rozmiarze. 
		UWAGA: Wysoka wydajność procesu klonowania SPI generuje w większości poprawne rekombinanty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać kolonie do 5 ml LB pH 8 zawierającego selektywny antybiotyk i wyhodować O/N w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotuj minipreparaty DNA za pomocą zestawu do oczyszczania kolumny zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przygotuj DNA miniprep BAC przy użyciu standardowej izolacji fenolu i chloroformu lub podobnego protokołu.</li>
	<li>Wykonaj trawienie RE na DNA miniprep. Oddziel DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Analizuj wzorce RE, aby zidentyfikować klony zawierające oczekiwane rozmiary fragmentów prawidłowego wektora docelowego. Wybierz RE, który wyraźnie rozróżnia wektor bez wstawień i wektor zawierający te wstawienia.</li>
	<li>Opcjonalnie: aby uzyskać komórki pozbawione BAC, który jest nadal obecny w E. coli po rekombinacji, użyj plazmidowego DNA miniprep do transformacji komórek E. coli DH5alpha lub DH10B. coli.</li>
	<li>Wykonaj sekwencjonowanie DNA w kasecie HA i insercyjnej, aby sprawdzić błędy syntezy oligo.</li>
</ol>

<ol><li>Dovey, O. M., Foster, C. T., Cowley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+1+%28HDAC1%29%2C+but+not+HDAC2%2C+controls+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 1 (HDAC1), but not HDAC2, controls embryonic stem cell differentiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 8242-8247 (2010).</li>
<li>Harvey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+and+carcinogen-induced+tumorigenesis+in+p53-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Spontaneous and carcinogen-induced tumorigenesis in p53-deficient mice.</a> Nat. Genet. 5, 225-229 (1993).</li>
<li>Waterhouse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoproliferative+disorders+with+early+lethality+in+mice+deficient+in+Ctla-4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4.</a> Science. 270, 985-988 (1995).</li>
<li>Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+by+gene+targeting+in+mouse+embryo-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells.</a> Cell. 51, 503-512 (1987).</li>
<li>Hasty, P., Rivera-Pérez, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+length+of+homology+required+for+gene+targeting+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The length of homology required for gene targeting in embryonic stem cells.</a> Mol. Cell. Biol. 11, 5586-5591 (1991).</li>
<li>Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+DNA+sequences+into+the+human+chromosomal+beta-globin+locus+by+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination.</a> Nature. 317, 230-234 (1985).</li>
<li>Hirata, R., Chamberlain, J., Dong, R., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+transgene+insertion+into+human+chromosomes+by+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted transgene insertion into human chromosomes by adeno-associated virus vectors.</a> Nat. Biotechnol. 20, 735-738 (2002).</li>
<li>Szostak, J. W., Orr-Weaver, T. L., Rothstein, R. J., Stahl, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+double-strand-break+repair+model+for+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The double-strand-break repair model for recombination.</a> Cell. 33, 25-35 (1983).</li>
<li>Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+germ-line+chimaeras+from+embryo-derived+teratocarcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.</a> Nature. 309, 255-256 (1984).</li>
<li>Fu, J., Teucher, M., Anastassiadis, K., Skarnes, W., Stewart, A. F. A recombineering pipeline to make conditional targeting constructs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFu%2C+J+%22Methods+Enzymol%22">Methods Enzymol</a>. Soriano, P. M., Wassarman, P. M. 477, Academic Press. 125-144 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+logic+for+DNA+engineering+using+recombination+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli.</a> Nat. Genet. 20, 123-128 (1998).</li>
<li>Copeland, N., Jenkins, N., Court, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering%3A+a+powerful+new+tool+for+mouse+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).</li>
<li>Muyrers, J., Zhang, Y., Testa, G., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+modification+of+bacterial+artificial+chromosomes+by+ET-recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination.</a> Nucleic Acids Res. 27, 1555-1557 (1999).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5978-5983 (2000).</li>
<li>Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering%3A+a+homologous+recombination-based+method+of+genetic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering.</a> Nature Protoc. 4, 206-223 (2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+recombineering+approach+by+adding+RecA+to+%CE%BB+red+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An improved recombineering approach by adding RecA to λ red recombination.</a> Mol. Biotechnol. 32, 43-53 (2006).</li>
<li>Datta, S., Costantino, N., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+recombineering+plasmids+for+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria.</a> Gene. 379, 109-115 (2006).</li>
<li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RecE+enhances+linear-linear+homologous+recombination+and+facilitates+direct+cloning+for+bioprospecting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting.</a> Nat. Biotechnol. 30, 440-446 (2012).</li>
<li>Muyrers, J., Zhang, Y., Buchholz, F., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecE%2FRecT+and+Redalpha%2FRedbeta+initiate+double-stranded+break+repair+by+specifically+interacting+with+their+respective+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Develop%22%5BJournal%5D)">RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners.</a> Genes Develop. 14, 1971-1982 (2000).</li>
<li>Maresca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+heteroduplex+intermediates+in+lambda+Red+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-stranded heteroduplex intermediates in lambda Red homologous recombination.</a> BMC Mol. Biol. 11, 54(2010).</li>
<li>Mosberg, J. A., Lajoie, M. J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambda+Red+recombineering+in+Escherichia+coli+occurs+through+a+fully+single-stranded+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Lambda Red recombineering in Escherichia coli occurs through a fully single-stranded intermediate.</a> Genetics. 186, 791-799 (2010).</li>
<li>Liu, P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+recombineering-based+method+for+generating+conditional+knockout+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations.</a> Genome Res. 13, 476-484 (2003).</li>
<li>Chan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombineering+based+approach+for+high-throughput+conditional+knockout+targeting+vector+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A recombineering based approach for high-throughput conditional knockout targeting vector construction.</a> Nucleic Acids Res. 35, e64(2007).</li>
<li>Zhang, Y., Muyrers, J. P. P., Testa, G., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cloning+by+homologous+recombination+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli.</a> Nat. Biotechnol. 18, 1314-1317 (2000).</li>
<li>Lee, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+Escherichia+coli-based+chromosome+engineering+system+adapted+for+recombinogenic+targeting+and+subcloning+of+BAC+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA.</a> Genomics. 73, 56-65 (2001).</li>
<li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li>
<li>Valenzuela, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+engineering+of+the+mouse+genome+coupled+with+high-resolution+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis.</a> Nat. Biotechnol. 21, 652-659 (2003).</li>
<li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoproteomics+profiling+of+HDAC+inhibitors+reveals+selective+targeting+of+HDAC+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chemoproteomics profiling of HDAC inhibitors reveals selective targeting of HDAC complexes.</a> Nat. Biotechnol. 29, 255-265 (2011).</li>
<li>Mulryan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+vas+deferens+contraction+and+male+infertility+in+mice+lacking+P2X1+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reduced vas deferens contraction and male infertility in mice lacking P2X1 receptors.</a> Nature. 403, 86-89 (2000).</li>
<li>Subramanian, K., Rutvisuttinunt, W., Scott, W., Myers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enzymatic+basis+of+processivity+in+lambda+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The enzymatic basis of processivity in lambda exonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 31, 1585-1596 (2003).</li>
<li>Antoch, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+of+the+mouse+circadian+Clock+gene+by+transgenic+BAC+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue.</a> Cell. 89, 655-667 (1997).</li>
<li>Rostovskaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells.</a> Nucleic Acids Res. 40, e150(2012).</li>
<li>Giraldo, P., Montoliu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+matters%3A+use+of+YACs%2C+BACs+and+PACs+in+transgenic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals.</a> Transgenic Res. 10, 83-103 (2001).</li>
<li>Hill, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+trimming%3A+minimizing+clone+overlaps%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">BAC trimming: minimizing clone overlaps.</a> Genomics. 64, 111-113 (2000).</li>
<li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36(2005).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR%2FCas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li>
</ol>

T.R.R jest wynalazcą brytyjskiego wniosku patentowego dotyczącego technologii rekombinowania multipleksów.

Budowa linii komórkowych ES i modeli mysich historycznie obejmowała celowanie w geny przy użyciu konstruktów plazmidowych, które zawierały zmodyfikowany allel4. Jednak budowa tych złożonych wektorów ukierunkowanych na geny okazała się znaczącym wąskim gardłem w terminowej produkcji takich modeli. Opracowanie strategii konstruowania wektorów opartych na rekombinacji umożliwiło ulepszenie projektów wektorów i bardziej wydajny montaż wektorów. Niemniej jednak obecne protokoły rekombinacji nadal obejmują wiele etapów, wymagają pośredniego oczyszczania plazmidu i wykorzystują różne szczepy bakterii. Subklonowanie plus insercja oferuje nowatorskie podejście do budowy wektorów, które można przeprowadzić w jednym zdarzeniu elektroporacji w rezydentnym odkształceniu gospodarza BAC. Użyteczność SPI w celowaniu genowym została przetestowana w różnych zastosowaniach budowy wektorów. We wszystkich badanych przypadkach SPI okazał się skuteczny i wyprodukowano prawidłowy rekombinowany plazmid. W większości przypadków wiele różnych kaset zostało prawidłowo umieszczonych w wektorze docelowym. Duże kasety i wektory DNA zostały z łatwością umieszczone w protokole SPI i zademonstrowały elastyczność tego systemu.
SPI opiera się na wykorzystaniu długich sekwencji homologicznych i ochronie fosforotionianów (WOM) liniowych kaset DNA. Modyfikacja WOM zapewnia ochronę przed egzonukleazami liniowemu DNA20,21 , a długi kwas hialuronowy zwiększa wydajność rekombinacji, umożliwiając multipleksowanie. Jednak synteza dłuższych sekwencji oligonukleotydów zwiększa szanse na akumulację błędów, zwłaszcza delecji. Mutacje w oligonugolakugigancie mogą być szczególnie szkodliwe, jeśli obejmują regiony kodujące białka. Sekwencjonowanie DNA w poprzek HA i pokrycie całej długości wstawionej kasety jest wysoce zalecane w celu wyeliminowania klonów z jakimikolwiek zmianami sekwencji. Sugeruje się również stosowanie systemu polimerazy DNA o wysokiej wierności, aby uniknąć wprowadzenia jakichkolwiek błędów PCR. Długość i skład HA plazmidu subklonującego jest bardziej krytyczna w stosunku do kasety insercyjnej (dane nie pokazane). W przypadku szczególnie wrażliwych zastosowań, takich jak budowa wektorów knockin, gdzie wszelkie mutacje w regionach eksonów nie są tolerowane, kwas hialuronowy kasety insercyjnej można skrócić (50-120 pz), aby uniknąć problemów związanych z długimi oligonukleotydami. Kaseta insercyjna może być również pozostawiona w stanie niezmodyfikowanym lub podwójnie fosforoniana (gdzie wiedza na temat kierunku replikacji nie jest dostępna). Ale multipleksowanie w tych przypadkach nadal wymaga długo chronionych plazmidów subklonujących HA. Zastrzeżeniem tej konkretnej strategii jest obniżenie wydajności multipleksowania, co może potencjalnie wpłynąć na klonowanie SPI w różnych loci.
Długość kasety insercyjnej i plazmidu subklonującego jest kolejnym ważnym parametrem w klonowaniu SPI. Większe cząsteczki DNA elektrorazują się mniej wydajnie, a efekt kumuluje się, biorąc pod uwagę wymóg wprowadzenia wszystkich kaset do tej samej komórki (dane nie pokazane). Multipleksowanie jest najbardziej wydajne w przypadku mniejszych kaset wsuwanych. Fragmenty DNA większe niż 3 kb również ograniczają przetwarzanie ssDNA za pośrednictwem czerwieni, które jest najbardziej efektywne do 3 kb30. Kasety insercyjne o objętości przekraczającej 3 kb są podwójnie recięte i rekombinowane mniej efektywnie za pośrednictwem ścieżki niezależnej od beta20. Dlatego w takich przypadkach ważne staje się badanie przesiewowe wystarczającej liczby kolonii w celu zidentyfikowania właściwego klonu. Dłuższy czas trwania rekombinacji po elektroporacji zwiększa również szanse na odzyskanie prawidłowego klonu w trudnych ćwiczeniach SPI. W procesie SPI można jednocześnie włożyć do czterech małych kaset (< 1,5 kb), chociaż wydajność multipleksowania spada z każdą dodatkową kasetą (dane nie pokazane). Odzwierciedla to jednak wynik optymalnego eksperymentu SPI i zaleca się rozważenie ograniczeń multipleksowania w przypadku korzystania z wielu dużych kaset.
Rozwój narzędzi do edycji genomu, takich jak system endonukleazy CRISPR-cas9 z regularnie rozmieszczonymi krótkimi powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR), umożliwił stworzenie nowatorskich modyfikacji genomu i doprowadził do bardziej wydajnej inżynierii genomu36. Jednak te nowsze technologie uzupełniły wektory ukierunkowane na geny, a nie je wyparły. Przewiduje się, że system CRISPR-cas może zastąpić selekcję antybiotyków i jeszcze bardziej udoskonalić protokół rekombinowania multipleksów.

Rozwój technologii celowania w geny umożliwił budowę linii komórkowych i modeli mysich do badania różnych systemów biologicznych1-3. Kluczowym pierwszym etapem modyfikacji sekwencji genomowej jest zaprojektowanie i skonstruowanie genu ukierunkowanego na wektor4. Wektory celujące to konstrukty plazmidowe, które przenoszą interesujący nas allel zawierający pożądane modyfikacje otoczone markerem selekcyjnym (np. neomycyną) oraz długie regiony genomowe wymagane do wydajnej rekombinacji homologicznej w komórkach ssaków5. Precyzyjną modyfikację genu uzyskuje się poprzez wprowadzenie wektora docelowego do embrionalnych komórek macierzystych (ES)6 lub komórek somatycznych7, przy czym rekombinacja homologiczna między identycznymi odcinkami sekwencji DNA na wektorze docelowym a locus genomu powoduje przeniesienie zamierzonej modyfikacji do genomu w drodze konwersji genu8. Takie zmodyfikowane komórki ES można wstrzyknąć do mysich blastocyst w celu wytworzenia potomstwa (chimer), które może następnie przenosić te zmodyfikowane allele przez linię zarodkową9. Alternatywna droga do produkcji myszy transgenicznych polega na mikrowstrzyknięciu wektora ekspresji genu do jednokomórkowych zygot myszy, co prowadzi do losowej integracji wektora w genomie myszy10. Tradycyjne metody konstruowania wektorów opierały się na konwencjonalnym klonowaniu metodą "wytnij i wklej" przy użyciu enzymów restrykcyjnych i ligaz DNA w celu sklonowania różnych markerów selekcyjnych i fragmentów genomu do szkieletu wektora. Jednak nieodłącznym czynnikiem ograniczającym tradycyjne klonowanie jest umiejscowienie i wybór miejsc restrykcyjnych, zwłaszcza w przypadku dłuższych sekwencji DNA. Często wymaga to wielu etapów subklonowania, a także wprowadza obce sekwencje DNA do wektora, co często prowadzi do niższej skuteczności celowania w geny.
Rekombinowanie (inżynieria rekombinogenna) to technologia inżynierii DNA, która pokonuje te ograniczenia poprzez zastosowanie rekombinacji homologicznej (HR) za pośrednictwem białek rekombinacji fagów w komórkach E. coli 11,12. Ponieważ każdy region sekwencji homologicznej może służyć jako substrat rekombinacji, ograniczenia dostępności miejsc restrykcyjnych są usuwane. Duże sekwencje DNA mogą być bezproblemowo modyfikowane bezpośrednio in vivo, zachowując w ten sposób również ich integralność strukturalną13. Rekombinacja jest bardzo wydajna w przypadku krótkich homologii (50 pz)14 i dlatego ramiona homologiczne (HA) mogą być wygodnie włączone do syntetycznych sekwencji oligo. W typowym eksperymencie rekombinacyjnym oligo lub fragment dwuniciowego DNA (dsDNA) zawierający HA jest elektroporyzowany do rekombinujących kompetentnych komórek E. coli zawierających cel zlokalizowany na chromosomie lub plazmidzie15. Potencjał rekombinacji jest nadawany przez indukowaną ekspresję czerwonych białek rekombinacyjnych faga16,17 lub białek RecET profagarac 18. Egzonukleaza Red/RecE przekształca liniowe dsDNA w pośredni jednoniciowy DNA (ssDNA), który jest następnie wiązany przez swojego partnera, Red/RecT, jednoniciowe białko wyżarzające (SSAP)19. Wyżarzanie długiego ssDNA lub krótkiego oligo do jego komplementarnej sekwencji docelowej zachodzi na opóźnionej nici widełek replikacyjnych i prowadzi do włączenia sekwencji w miejscu docelowym. Rekombinacja ssDNA o opóźnionej nici jest podstawą wysokiej efektywności rekombinacji i może być opisana przez model rekombinacji "beta"20,21.
Typowy proces rekombinacji w celu zbudowania wektora celowania w geny obejmuje jedną z dwóch następujących tras. Jedna droga polega na subklonowaniu pożądanego regionu genomowego z mysiego klonu BAC do plazmidu, a następnie sekwencyjnym wstawianiu miejsc rekombinacji LoxP, markera selekcyjnego22 itp., lub alternatywna droga polega na celowaniu w locus genomu BAC za pomocą różnych docelowych elementów wektorowych poprzez wiele rund rekombinacji10,23, a następnie subklonowanie zmodyfikowanego locus do plazmidu poprzez klonowanie naprawy luk24,25. Wariacje na ten temat zostały wykorzystane w różnych potokach rekombinowania o wysokiej przepustowości w ramach dużych programów produkcji myszy26,27. Jednak procedury te obejmują skomplikowane i długotrwałe etapy, wymagają użycia wyspecjalizowanych wektorów i szczepów E. coli (np. komórek eksprymujących Cre) oraz wykorzystują jeden lub więcej pośrednich etapów oczyszczania i retransformacji DNA wektora (Tabela 1). Subklonowanie plus insercja (SPI) to nowatorska technika rekombinacji, która łączy rekombinację beta i klonowanie naprawy luk w jednym procesie (ryc. 1). Montaż wektorów SPI jest prosty, szybki i elastyczny i oferuje znaczną poprawę w stosunku do standardowych podejść do rekombinowania (Tabela 1). W tym miejscu pokazujemy łatwość i użyteczność wykorzystania SPI do różnych zastosowań konstrukcji wektorowych, ze szczególnym naciskiem na konstruowanie niestandardowych i wymagających projektów wektorowych. Przypadki testowe obejmowały konstrukcję fluorescencyjnego reporterowego wektora knockin, podwójnie znakowanego wektora knockin ekspresji białka, fluorescencyjnego wektora reporterowego BAC i warunkowego wektora knockout. Badali oni w różny sposób wymóg lokalizacji receptora na powierzchni komórki, oczyszczenia kompleksu białek jądrowych lub warunkowej ablacji ekspresji genu.

<table><tbody><tr><td>Antybiotyki z wyjątkiem Zeocin</td><td>Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td><td>Ampicillin, A9518-5G; Chloramfenikol, C1919-5G; Blasticydyna, 15205-25MG; gentamycyna, G1264-50MG; Higromycyna, H3274-50MG; Kanamycyna,: K1876-1G; Chlorowodorek tetracykliny, T7660-5G; Trimetoprim, 92131-1G</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invivogen:&nbsp;</td><td>ant-zn-1</td><td>Zeocin jest również dostępny w klonach Life technologies/Fisher</td></tr><tr><td>C57BL/6 BAC</td><td>CHORI: https://bacpac.chori.org/&nbsp;</td><td>Biblioteki BAC RPCI-23 lub RPCI-24</td><td>Klony BAC 129/Sv można uzyskać z Invivogen lub Life technologies/</td></tr><tr><td>Fisher KOD hotstart DNA polymerase</td> system <td>Millipore: https://www.merckmillipore.com</td><td>71086-3</td><td></td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td><td>A3256-25G</td><td></td></tr><tr><td>Długie oligonukleotydy</td><td>IDT: https://www.idtdna.com; Połączenie genowe: https://www.genelink.com</td><td>IDT Ultramers lub Gene Link długie oligonukleotydy</td><td>WOM i fosforan dostępne jako niestandardowe modyfikacje. Oczyszczanie PAGE zdecydowanie zalecane dla długich oligonukleotydów.</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania MinElute PCR</td><td>Qiagen: http://www.qiagen.com&nbsp;</td><td>28004</td><td>Preferowane są zestawy do oczyszczania PCR z minimalną elucją.</td></tr><tr><td>Zestaw QIAPrep Spin Mini Prep</td><td>Qiagen: http://www.qiagen.com&nbsp;</td><td>27104</td><td>Preferowana jest kolumna krzemionkowa lub podobne zestawy matryc.</td></tr><tr><td>Enzymy restrykcyjne</td><td>NEB: https://www.neb.com</td><td>DpnI: R0176L</td><td>Wykaz RE znajduje się na stronie internetowej NEB.</td></tr></tbody></table>

subklonowanie plus insercja (spi) - nowatorska metoda rekombinacji do szybkiej budowy wektorów celowania w geny

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Targetowanie genów odnosi się do precyzyjnej modyfikacji locus genetycznego za pomocą rekombinacji homologicznej. Generowanie nowych linii komórkowych i transgenicznych modeli myszy przy użyciu tej metody wymaga budowy wektora "docelowego", który zawiera homologiczne sekwencje DNA do genu docelowego i przez wiele lat był etapem ograniczającym w tym procesie. Konstrukcję wektora można przeprowadzić in vivo w komórkach Escherichia coli przy użyciu rekombinacji homologicznej, w której pośredniczą rekombinacje fagowe, przy użyciu techniki zwanej rekombinacją. Rekombinacja jest preferowaną techniką subklonowania długich sekwencji homologii (>4kb) i różnych elementów docelowych, w tym markerów selekcyjnych, które są wymagane do pośredniczenia w efektywnej wymianie alleli między wektorem docelowym a pokrewnym locus genomowym. Typowe protokoły rekombinacji są zgodne z iteracyjnym schematem stopniowej integracji elementów docelowych i wymagają pośrednich etapów oczyszczania i transformacji. W tym miejscu przedstawiamy nowatorską metodologię rekombinacji składania wektorów przy użyciu podejścia multipleksowego. Naprawa luki plazmidowej odbywa się poprzez jednoczesne wychwycenie sekwencji genomowej z bibliotek sztucznych chromosomów bakteryjnych myszy i wprowadzenie podwójnych markerów selekcji bakteryjnej i ssaków. Ta metoda subklonowania i insercji jest bardzo wydajna i daje większość prawidłowych rekombinantów. Przedstawiamy dane do budowy różnych typów wektorów warunkowego nokautu genów lub knock-in oraz wektorów reporterowych BAC, które zostały skonstruowane tą metodą. Konstrukcja wektorów SPI znacznie rozszerza repertuar zestawu narzędzi do rekombinacji i zapewnia prostą, szybką i opłacalną metodę konstruowania tych wysoce złożonych wektorów.

Metodologie celowania w geny mogą być używane do generowania transgenicznych myszy z allelami knockout, knock-in i taged. W tym miejscu opisujemy ulepszoną metodę rekombinacji u E. coli, którą nazywamy "subklonowaniem plus insercją", która może być wykorzystana do szybkiego generowania niestandardowych wektorów docelowych genów.

Subklonowanie plus insercja (SPI) - nowatorska metoda rekombinacji do szybkiej budowy wektorów celowania w geny

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest skonstruowanie wektorów celowania w geny za pomocą subklonowania i insercji. Osiąga się to poprzez przekształcenie grzbietu zawierającego E. coli w rekombinujący plazmid. Drugi etap polega na generowaniu asymetrycznych fosforolicznych kaset insercyjnych i subklonowaniu plazmidów za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy.Po dodaniu arabinozy następuje ekspresja białek rekombinujących GBAA, a końcowa zmodyfikowana kaseta insercyjna i plazmid podklonujący są elektroporowane. Pożądana sekwencja DNA jest jednocześnie uwięziona od tyłu i modyfikowana za pomocą kasety insercyjnej do plazmidu subklonującego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak standardowa rekombinacja, jest to, że konstrukcja wektora ukierunkowanego na gen może być przeprowadzona w jednej reakcji.Aby rozpocząć projektowanie oligonukleotydów dla kasety insercyjnej i plazmidu do subklonowania, zaprojektuj każdy oligonus tak, aby zawierał 180 ramion homologii par zasad flankujących genomowe miejsce docelowe i 20 par zasad, określoną sekwencję primingową dla kasety insercyjnej lub plazmidu subklonującego. Następnie określ orientację wstawki genomowego DNA tylnego klonu za pomocą narzędzia internetowego, takiego jak clone db. Ustal kierunek replikacji z lub ES, sprawdzając mapę tylnego szkieletu plazmidowego używanego z tyłu.Konstrukcja biblioteki, dodaj dwa końcowe wiązania fosfo osiem, a więc pięć pierwszych końców oligo, który jest przeciwny do kierunku replikacji na tylnym klonie. Następnie dodaj modyfikację pięciu pierwszych fosforanów do odwróconego oligo. Najpierw wbij sterylną końcówkę pipety w tylną kulturę agarową i zaszczepij 5,0 mililitrów bulionu odynowego.Uprawiaj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć godzin, potrząsając przy 200 obr./min. Następnie schłodzenie, 10% roztwór glicerolu, mikrowirówka, probówki i elektroporacja, kuwety na chłodnicy lodu, duża wirówka z chłodzeniem i mikrowirówka do czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji określić gęstość optyczną kultury za pomocą spektrofotometru.Pomiar absorbancji. Przy 600 nanometrach. Przygotuj ogniwa elektrokompetentne, gdy zostanie osiągnięty odczyt OD 600 od 0,3 do 0,8.Gdy kultura będzie gotowa, odwiruj komórki w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Umyj komórki jednym mililitrem schłodzonego 10% glicerolu i ponownie odwiruj. Wykonaj te czynności prania w sumie trzy razy.Ponownie zawiesić komórki w łącznej objętości 50 mikrolitrów i dodać od 10 do 200 nanogramów plazmidu rekombinującego. Zawiesinę pojedynczej komórki należy uzyskać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść komórki do elektroporacji przed schłodzeniem. Vete. Następnie umieść vete w urządzeniu do elektroporacji i wykonaj elektrooperację ogniwa, natychmiast odzyskaj komórki w jednym mililitrze LB i przenieś komórki do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.Hoduj kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwie godziny, wstrząsając przy 200 obr./min. Po tym czasie dodaj dziewięć mililitrów LB do odzyskanej kultury. Hoduj przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 200 obr./min, aby włączyć ramiona homologii do kasety insercyjnej i plazmidu klonującego subc.Przeprowadzić PCR przy użyciu przygotowanych wcześniej długich zmodyfikowanych oligonukleotydów. Alternatywnie, linearyzuj matrycę plazmidu Używając enzymu restrykcyjnego, wybierz taki, który wykracza poza obszar amplifikacji PCR i jest aktywowany termicznie. Skonfiguruj PCR przy użyciu systemu polimerazy DNA o wysokiej wierności gorącego startu.Przygotuj główną mieszankę PCR i wykonaj cykle termiczne zgodnie z najlepszymi praktykami. Po reakcji przeanalizować produkty PCR za pomocą elektroforezy żelowej AROS. Załaduj od jednego do pięciu mikrolitrów każdego PCR na 1% żel aros.Następnie oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Określ ilościowo amplifikowane DNA PCR w stosunku do znanego zestawu wzorców DNA lub za pomocą spektrofotometru NanoDrop. Po całonocnej inkubacji rozcieńczyć tylną kulturę GBAA 50-krotnie i przygotować oddzielną kulturę do kontroli ujemnej.Hoduj rozcieńczone kultury w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wytrząsając przy 200 obr./min przez godzinę i 50 minut. Następnie schłodź wszystkie materiały i sprzęt do ponownego łączenia do czterech stopni Celsjusza, jak pokazano wcześniej. Przygotować 10% roztwór OSE o masie objętości i wysterylizować przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,2 mikrona.Gdy OD w tylnej hodowli osiągnie pożądany poziom, przystąp do indukcji białek rekombinujących. Dodaj 200 mikrolitrów 10% roztworu arabskiego do 10 mililitrów kultury tylnej, aby osiągnąć końcowe stężenie aose 0,2% Uwzględnij kulturę nieindukowaną do użycia jako kontrola negatywna. Przenieść kultury do inkubatora z wytrząsaniem o temperaturze 37 stopni Celsjusza i wywoływać czerwoną ekspresję przez 45 minut z wytrząsaniem przy 230 obr./min.Zakręć komórki i przemyj 10% glicerolem trzy razy, jak pokazano wcześniej, w ilości od 600 do 1000 nanogramów. Każda z kaset insercyjnych i plazmidu subklonującego do reakcji rekombinacji zawiera tylko wektor i kontrolę wektora oraz pojedynczej wstawki w celu sprawdzenia sprawności rekombinacji i integralności wektora. Następnie uzyskaj zawiesinę pojedynczego ogniwa i steruj elektrolitycznie ogniwami, jak pokazano wcześniej.Zezwól na odzysk w pożywce LB w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę dla plazmidów wielokopijnych lub w 10 funtach w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny dla wektorów wstecznych. Uzupełnij różne rozcieńczenia odzyskaną kulturą przy podwójnej selekcji. Agar proszę i rośnie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin.Gdy będziesz gotowy, zbierz kolonie do pięciu mililitrów LB zawierających selektywny antybiotyk i hoduj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie użyj zestawu do oczyszczania kolumny, aby przygotować mini preparację DNA, wprowadź odpowiedni enzym restrykcyjny, a następnie zidentyfikuj klony zawierające oczekiwane rozmiary fragmentów za pomocą elektroforezy żelowej. Na koniec wykonaj sekwencjonowanie DNA w ramionach homologii i kasecie insercyjnej, aby sprawdzić, czy nie ma błędów fotosyntezy oli.W tym przykładzie analiza trawienia restrykcyjnego P two RX jednej wkładki EYFP zawierającej klony wykazała oczekiwany wzorzec wskazujący, że zawierają one prawidłowo złożony wektor knockin. Ten schemat ilustruje koncepcję przycinania bact. Zastosowanie subklonowania oraz analizy insercyjnej produktów PCR potwierdziło, że kasety zostały prawidłowo wkomponowane.Ponadto, gdy analizowano dodatnie klony wsteczne po dodaniu odpowiedniego enzymu restrykcyjnego, uzyskano oczekiwany wzór. Analiza trawienia restrykcyjnego 12 stwierdzono, że dwa klony SBI R SR wykazały prawidłowe składanie wektorów u większości rekombinantów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak szybko konstruować wektory celowania w geny za pomocą subklonowania i insercji.

subcloning-plus-insertion-spi-novel-recombineering-method-for-rapid

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Techniki rekombinacji homologicznej znacznie rozwijają genetykę Drosophila, umożliwiając tworzenie molekularnie precyzyjnych mutacji.  Niedawne zastosowanie rekombinacji pozwala na manipulowanie dużymi fragmentami DNA i przekształcanie ich w Drosophila6. Przedstawione tutaj metody łączą te techniki w celu szybkiego generowania dużych wektorów rekombinacji homologicznej.

Rekombinowanie homologicznych konstruktów rekombinacji u Drosophila

Korzystając z montażu DNA, wiele wektorów CRISPR może być konstruowanych równolegle w jednej reakcji klonowania, co sprawia, że budowa dużej liczby wektorów CRISPR jest prostym zadaniem. Owłosione korzenie pomidora są doskonałym systemem modelowym do walidacji wektorów CRISPR i generowania zmutowanych materiałów.

Wysokoprzepustowa konstrukcja wektora CRISPR i charakterystyka modyfikacji DNA przez generowanie owłosionych korzeni pomidora

Tutaj przedstawiamy szybką i efektywną metodę edycji genów opartą na RMCE w locus AAVS1 ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), która ulepsza poprzednio opisane systemy. Korzystając z tej techniki, linie izogeniczne mogą być szybko i niezawodnie generowane dla prawidłowych badań porównawczych, ułatwiając badania za pośrednictwem transgenezy za pomocą hPSCs.

Szybkie i wydajne wytwarzanie rekombinowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymianę kasetową za pośrednictwem rekombinazy w locus AAVS1

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowego, krok po kroku przewodnika do tworzenia konstruktów wielogenowych za pomocą modułowego systemu klonowania opartego na klonowaniu Golden Gate. Zawiera również zalecenia dotyczące krytycznych kroków, aby zapewnić optymalny montaż w oparciu o nasze doświadczenia.

Szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate

Ten protokół wykorzystuje fluorescencyjne reportery i sortowanie komórek, aby uprościć eksperymenty z wykorzystaniem fagów i linii komórek T. Do tych uproszczonych eksperymentów knock-in stosuje się dwa plazmidy, a mianowicie plazmid z ekspresją CRISPR/Cas9 i DsRed2 oraz plazmid dawcy z ekspresją rekombinacji homologicznej EBFP2, który jest trwale zintegrowany w locus Rosa26 w komórkach odpornościowych.

Knock-in genu przez CRISPR/Cas9 i sortowanie komórek w liniach makrofagów i limfocytów T

Rekombinowany wirus związany z adenowirusem (rAAV) jest szeroko stosowany do klinicznego i przedklinicznego dostarczania genów. Niedocenianym zastosowaniem rAAV jest silna transdukcja hodowanych komórek bez konieczności oczyszczania. Dla badaczy, którzy są nowicjuszami w rAAV, udostępniamy protokół klonowania kaset transgenowych, produkcji prymitywnych wektorów i transdukcji kultur komórkowych.

Ekspresja transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskania wektora wyrażenia pVAX1-PRRSV poprzez wprowadzenie odpowiednich miejsc restrykcyjnych na końcu 3' wstawek. Możemy linearyzować wektor i łączyć fragmenty DNA z wektorem jeden po drugim za pomocą technologii rekombinacji homologicznej.

Bezproblemowe podejście do klonowania konstrukcji wektora ekspresji wirusa zespołu rozrodczo-oddechowego świń

Opisujemy protokół wysokoprzepustowej metody klonowania, klonowania wahadłowego opartego na CRISPR (klonowanie wahadłowe CRISPR), który umożliwia transfer interesujących fragmentów DNA między wektorami bez konieczności amplifikacji fragmentów DNA metodą PCR.

Klonowanie wahadłowe oparte na CRISPR: metoda klonowania o wysokiej przepustowości

Test w labiryncie z krzyżującym się ramieniem (elevated plus maze) jest jednym z najpowszechniej stosowanych testów do pomiaru zachowań lękowych u myszy. W niniejszym materiale prezentujemy film przedstawiający szczegółowe procedury przeprowadzania tego testu.

Labirynt w kształcie krzyża dla myszy

Zdolność do wytwarzania transgenów dla Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem DNA genomicznego przenoszonego przez fosmidy jest szczególnie korzystna, ponieważ wszystkie rodzime elementy regulacyjne zostają zachowane. Opisano prostą i niezawodną procedurę wytwarzania transgenów poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK.

Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK

Poznaj metodę subklonowania plus insercji do szybkiej budowy wektorów celowania w geny w E. coli. Ta technika umożliwia konstrukcję wektorów w jednej reakcji, zwiększając efektywność inżynierii genetycznej.

Subklonowanie plus insercja (SPI) - nowatorska metoda rekombinacji do szybkiej budowy wektorów celowania w geny

Przeglądaj więcej filmów