Subklonowanie plus insercja (SPI) - nowatorska metoda rekombinacji do szybkiej budowy wektorów celowania w geny

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest skonstruowanie wektorów celowania w geny za pomocą subklonowania i insercji. Osiąga się to poprzez przekształcenie grzbietu zawierającego E. coli w rekombinujący plazmid. Drugi etap polega na generowaniu asymetrycznych fosforolicznych kaset insercyjnych i subklonowaniu plazmidów za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy.

Po dodaniu arabinozy następuje ekspresja białek rekombinujących GBAA, a końcowa zmodyfikowana kaseta insercyjna i plazmid podklonujący są elektroporowane. Pożądana sekwencja DNA jest jednocześnie uwięziona od tyłu i modyfikowana za pomocą kasety insercyjnej do plazmidu subklonującego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak standardowa rekombinacja, jest to, że konstrukcja wektora ukierunkowanego na gen może być przeprowadzona w jednej reakcji.

Aby rozpocząć projektowanie oligonukleotydów dla kasety insercyjnej i plazmidu do subklonowania, zaprojektuj każdy oligonus tak, aby zawierał 180 ramion homologii par zasad flankujących genomowe miejsce docelowe i 20 par zasad, określoną sekwencję primingową dla kasety insercyjnej lub plazmidu subklonującego. Następnie określ orientację wstawki genomowego DNA tylnego klonu za pomocą narzędzia internetowego, takiego jak clone db. Ustal kierunek replikacji z lub ES, sprawdzając mapę tylnego szkieletu plazmidowego używanego z tyłu.

Konstrukcja biblioteki, dodaj dwa końcowe wiązania fosfo osiem, a więc pięć pierwszych końców oligo, który jest przeciwny do kierunku replikacji na tylnym klonie. Następnie dodaj modyfikację pięciu pierwszych fosforanów do odwróconego oligo. Najpierw wbij sterylną końcówkę pipety w tylną kulturę agarową i zaszczepij 5,0 mililitrów bulionu odynowego.

Uprawiaj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć godzin, potrząsając przy 200 obr./min. Następnie schłodzenie, 10% roztwór glicerolu, mikrowirówka, probówki i elektroporacja, kuwety na chłodnicy lodu, duża wirówka z chłodzeniem i mikrowirówka do czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji określić gęstość optyczną kultury za pomocą spektrofotometru.

Pomiar absorbancji. Przy 600 nanometrach. Przygotuj ogniwa elektrokompetentne, gdy zostanie osiągnięty odczyt OD 600 od 0,3 do 0,8.

Gdy kultura będzie gotowa, odwiruj komórki w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Umyj komórki jednym mililitrem schłodzonego 10% glicerolu i ponownie odwiruj. Wykonaj te czynności prania w sumie trzy razy.

Ponownie zawiesić komórki w łącznej objętości 50 mikrolitrów i dodać od 10 do 200 nanogramów plazmidu rekombinującego. Zawiesinę pojedynczej komórki należy uzyskać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść komórki do elektroporacji przed schłodzeniem. Vete. Następnie umieść vete w urządzeniu do elektroporacji i wykonaj elektrooperację ogniwa, natychmiast odzyskaj komórki w jednym mililitrze LB i przenieś komórki do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.

Hoduj kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwie godziny, wstrząsając przy 200 obr./min. Po tym czasie dodaj dziewięć mililitrów LB do odzyskanej kultury. Hoduj przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 200 obr./min, aby włączyć ramiona homologii do kasety insercyjnej i plazmidu klonującego subc.

Przeprowadzić PCR przy użyciu przygotowanych wcześniej długich zmodyfikowanych oligonukleotydów. Alternatywnie, linearyzuj matrycę plazmidu Używając enzymu restrykcyjnego, wybierz taki, który wykracza poza obszar amplifikacji PCR i jest aktywowany termicznie. Skonfiguruj PCR przy użyciu systemu polimerazy DNA o wysokiej wierności gorącego startu.

Przygotuj główną mieszankę PCR i wykonaj cykle termiczne zgodnie z najlepszymi praktykami. Po reakcji przeanalizować produkty PCR za pomocą elektroforezy żelowej AROS. Załaduj od jednego do pięciu mikrolitrów każdego PCR na 1% żel aros.

Następnie oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Określ ilościowo amplifikowane DNA PCR w stosunku do znanego zestawu wzorców DNA lub za pomocą spektrofotometru NanoDrop. Po całonocnej inkubacji rozcieńczyć tylną kulturę GBAA 50-krotnie i przygotować oddzielną kulturę do kontroli ujemnej.

Hoduj rozcieńczone kultury w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wytrząsając przy 200 obr./min przez godzinę i 50 minut. Następnie schłodź wszystkie materiały i sprzęt do ponownego łączenia do czterech stopni Celsjusza, jak pokazano wcześniej. Przygotować 10% roztwór OSE o masie objętości i wysterylizować przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,2 mikrona.

Gdy OD w tylnej hodowli osiągnie pożądany poziom, przystąp do indukcji białek rekombinujących. Dodaj 200 mikrolitrów 10% roztworu arabskiego do 10 mililitrów kultury tylnej, aby osiągnąć końcowe stężenie aose 0,2% Uwzględnij kulturę nieindukowaną do użycia jako kontrola negatywna. Przenieść kultury do inkubatora z wytrząsaniem o temperaturze 37 stopni Celsjusza i wywoływać czerwoną ekspresję przez 45 minut z wytrząsaniem przy 230 obr./min.

Zakręć komórki i przemyj 10% glicerolem trzy razy, jak pokazano wcześniej, w ilości od 600 do 1000 nanogramów. Każda z kaset insercyjnych i plazmidu subklonującego do reakcji rekombinacji zawiera tylko wektor i kontrolę wektora oraz pojedynczej wstawki w celu sprawdzenia sprawności rekombinacji i integralności wektora. Następnie uzyskaj zawiesinę pojedynczego ogniwa i steruj elektrolitycznie ogniwami, jak pokazano wcześniej.

Zezwól na odzysk w pożywce LB w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę dla plazmidów wielokopijnych lub w 10 funtach w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny dla wektorów wstecznych. Uzupełnij różne rozcieńczenia odzyskaną kulturą przy podwójnej selekcji. Agar proszę i rośnie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin.

Gdy będziesz gotowy, zbierz kolonie do pięciu mililitrów LB zawierających selektywny antybiotyk i hoduj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie użyj zestawu do oczyszczania kolumny, aby przygotować mini preparację DNA, wprowadź odpowiedni enzym restrykcyjny, a następnie zidentyfikuj klony zawierające oczekiwane rozmiary fragmentów za pomocą elektroforezy żelowej. Na koniec wykonaj sekwencjonowanie DNA w ramionach homologii i kasecie insercyjnej, aby sprawdzić, czy nie ma błędów fotosyntezy oli.

W tym przykładzie analiza trawienia restrykcyjnego P two RX jednej wkładki EYFP zawierającej klony wykazała oczekiwany wzorzec wskazujący, że zawierają one prawidłowo złożony wektor knockin. Ten schemat ilustruje koncepcję przycinania bact. Zastosowanie subklonowania oraz analizy insercyjnej produktów PCR potwierdziło, że kasety zostały prawidłowo wkomponowane.

Ponadto, gdy analizowano dodatnie klony wsteczne po dodaniu odpowiedniego enzymu restrykcyjnego, uzyskano oczekiwany wzór. Analiza trawienia restrykcyjnego 12 stwierdzono, że dwa klony SBI R SR wykazały prawidłowe składanie wektorów u większości rekombinantów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak szybko konstruować wektory celowania w geny za pomocą subklonowania i insercji.