Name: Możliwy model wielotorbielowatości nerek u danio pręgowanego: knockdown wnt5a powoduje torbiele w nerkach danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-02T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Poznaj metodę tworzenia modelu wielotorbielowatości nerek u danio pręgowanego przez knockdown wnt5a. Technika wykorzystuje mikroiniekcję morfolino i fluorescencyjną mikroskopię do wizualizacji struktur nerkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH (DK093625 do L.H., oraz DK069909 i DK047757 do J.H.L.) oraz VA (Merit Award I01BX000820 do J.H.L.). Chcielibyśmy podziękować dr Michaelowi Packowi i dr Jie He z University of Pennsylvania Zebrafish Core za udzielenie niezbędnego wsparcia.

UWAGA: Oświadczenie etyczne: Wszystkie eksperymenty z danio pręgowanym zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania w Szkole Medycznej Wschodniej Wirginii.
1. Przygotowanie Morpholino
<ol>
	<li>Zaprojektuj i zsyntetyzuj oligonukleotydy anty-sensowne morfolino (MO) blokujące translację (AUG-) i hamujące splice (Splice-) dla genu będącego przedmiotem zainteresowania zgodnie z instrukcjami producenta (Figura 1A). Proszę zapoznać się z informacjami producenta w tabeli 1. 
	UWAGA: MO są wysyłane jako liofilizowane zapasy w szklanych butelkach.</li>
	<li>Dodaj sterylną wodę wysokiej jakości do szklanych butelek, aby ponownie zawiesić MO do końcowego stężenia 25 μg/μl. Upewnij się, że oligonukleotyd jest całkowicie rozpuszczony. Jeśli pozostanie jakaś substancja stała, podgrzać fiolkę zawierającą podstawowy roztwór oligonukleotydu w temperaturze 65 °C przez 5 do 10 minut i krótko</li> przeprowadzić.
	<li>Przechowywać roztwór podstawowy MO w temperaturze pokojowej. Nie przechowuj ich w temperaturze 4 °C lub -20 °C, ponieważ niższe temperatury mogą spowodować związanie oligonukleotydu MO ze ścianką pojemnika. Mierzyć stężenie roztworu podstawowego za pomocą spektrofotometru (patrz Tabela 1) za każdym razem, gdy sporządzany jest nowy roztwór podstawowy MO.</li>
	<li>Roztwór roboczy MO należy przygotować w dniu wstrzyknięcia, rozcieńczając roztwór podstawowy sterylną wodą o wysokiej jakości do pożądanej dawki. Dodaj 0,5% czerwieni fenolowej, aby osiągnąć stężenie 0,05%. Na przykład, aby przygotować 5 μl roztworu roboczego o stężeniu 15 ng/nL, dodaj 3 μl roztworu podstawowego MO i 0,5 μl 0,5% czerwieni fenolowej do 1,5 μl wody. 
	UWAGA: Przy tym stężeniu roboczym każda kropla (500 pl) iniekcji zawiera 7,5 ng MO, a dwie krople zawierają 15 ng MO.</li>
</ol>
2. Przygotowanie aparatu do iniekcji
<ol>
	<li>Kup szklane, wstępnie wyciągnięte igły (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 1). Alternatywnie należy pociągnąć szklaną igłę do wstrzykiwań za pomocą ściągacza do igieł.</li>
	<li>Włącz sprężarkę powietrza i ustaw ciśnienie na 50 psi. Włącz źródło światła mikroskopu preparacyjnego i pompę mikroiniekcji Pico i dostosuj ustawienia w następujący sposób: ciśnienie podtrzymania 20 psi, ciśnienie wyrzutu 10 psi, wartość okresu 2,5 i zakres bramkowania 100 μs.</li>
	<li>Na szklaną igłę naciągniętą napełnić 5 μl roztworu do wstrzykiwań i ustawić igłę w pozycji pionowej z końcówką skierowaną w dół. Poczekaj, aż cały roztwór dotrze do końcówki igły bez widocznych pęcherzyków powietrza. Umieść uchwyt igły w odpowiedniej pozycji obok mikroskopu i włóż szklaną igłę do uchwytu. Ustaw kąt wtrysku na 45 stopni.</li>
	<li>Umieść końcówkę igły w polu widzenia pod mikroskopem, wysoko nad sceną i skup się na najcieńszym obszarze końcówki. Odłam końcówkę igły pęsetą z cienkim czubkiem.</li>
	<li>Umieść linijkę i rurkę kapilarną o średnicy wewnętrznej 0,15 mm obok siebie pod mikroskopem; wstrzyknąć roztwór na jeden koniec rurki kapilarnej, aby utworzyć kolumnę cieczy. Dostosuj czas wyrzutu, aby osiągnąć co 17 kropli na kolumnę cieczy o długości 1 mm, wtedy objętość każdej kropli wynosi 1 nl (objętość kropli = π x promień2 x długość (kolumny cieczy) / liczba (kropli). 
	UWAGA: Kropla o średnicy 0,1 mm daje objętość wtrysku około 500 pl (objętość kropli = 4/3 x π x promień3).</li>
</ol>
3. Przygotowanie zapłodnionych zarodków danio pręgowanego i wstrzyknięcie Morpholinosem
<ol>
	<li>Skonfiguruj transgeniczne pary hodowlane danio pręgowanego Tg(wt1b:GFP) zgodnie z opublikowanymi protokołami standardowej hodowli i utrzymania danio pręgowanego. Zbierz zarodki po naturalnym zaszczepieniu i trzymaj je na 10 cm szalce Petriego wypełnionej wodą E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mMMgSO4). Natychmiast rozpocząć wstrzykiwanie MO 13. Monitoruj morfologię zarodka pod mikroskopem i upewnij się, że wstrzyknięcie MO następuje w stadium jednokomórkowym lub nie później niż w stadium czterokomórkowym.
	<ol>
		<li>Przenieś zarodki na 10-centymetrową szalkę Petriego z klinowymi korytami agarowymi. Odessaj nadmiar wody E3 i delikatnie wciśnij zarodki do koryt.</li>
		<li>Manipuluj zarodkami za pomocą mikropipety, aby uwidocznić zarodki w stadium 1-komórkowym pod mikroskopem preparacyjnym. Penetruj kosmówkę, a następnie żółtko, aby wstrzyknąć jedną lub dwie krople MO do żółtka (1 kropla = 500 pl). Przenieść wstrzyknięte zarodki na 10 cm szalkę Petriego z wodą E3 i inkubować w temperaturze 28,5 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wykonaniu wstrzyknięć należy usunąć martwe zarodki i zanotować liczbę wstrzykniętych zarodków. Wymieniaj wodę E3 w naczyniu co 24 do 48 godzin.</li>
</ol>
4. Eksperymenty z ratowaniem fenotypów
<ol>
	<li>Wybierz ortolog z innego gatunku, który ma inną strukturę pierwotnej pary zasad (zwykle 3-7 niezgodności par zasad) i dlatego jest odporny na MO, do ratunku. Na przykład w tym eksperymencie wybraliśmy mysz, ponieważ sekwencja mRNA myszy Wnt5a różni się od sekwencji danio pręgowanego.</li>
	<li>Zaprojektuj zestaw starterów z starterem do przodu zaczynającym się w miejscu translacji i starterem odwrotnym w pobliżu końca regionu kodującego mRNA. Dodaj sekwencję promotora T7 na końcu 5'- sekwencji startera do przodu. W tym eksperymencie użyliśmy następujących sekwencji starterów; Do przodu: 5'- TAA TAC GAC TCA CTA Tag gga CTA Tga TGA TGC TGA TGA TGA AGC TGA A- 3' i odwrotnie: 5'- TCA CTT GCA GAC GTA CTG GTC- 3'.</li>
	<li>Przeprowadzić 50 μl łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) z zestawem starterów (0,5 μM każdego startera) zaprojektowanym powyżej i 0,1 μg matrycy DNA zawierającej mysią sekwencję cDNA Wnt5a za pomocą następującego programu PCR: 1 cykl w temperaturze 95 °C przez 5 minut; 35 cykli w 95 °C (30 sek), 58,5 °C (30 sek), 72 °C (1 min); i końcowy stopień przedłużania w temperaturze 72 °C przez 7 min.</li>
	<li>Po zakończeniu cyklu nałóż 2 μl produktu PCR na 1% żel agarozowy, aby upewnić się, że opaska ma odpowiedni rozmiar. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Sprawdź stężenie DNA za pomocą spektrofotometru. Oczyszczony produkt PCR należy przechowywać w temperaturze -20 °C lub użyć bezpośrednio w transkrypcji RNA z czapeczką w następnym kroku.</li>
	<li>Zsyntetyzuj mRNA z czapeczką in vitro za pomocą zestawu do syntezy RNA z czapeczką zgodnie z instrukcjami producenta. Rozcieńczyć mRNA w 20 μl wody wolnej od RNaz i oznaczyć stężenie. Podwielokrotnić RNA i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>W dniu wstrzyknięcia należy przygotować roztwór roboczy mRNA ze sterylną wodą wolną od RNazy. Należy zauważyć, że 40 pg jest na ogół najwyższą dawką RNA, przy której nie występują niespecyficzne lub toksyczne działanie RNA. Utrzymuj roztwór roboczy na lodzie. Wstrzyknij zarodkowi MO, a następnie ratunkowe mRNA lub wstrzyknij oba razem. Na przykład, jeśli stężenie mRNA przygotowanego w kroku 4.5 wynosi 0,6 μg/μl, dodaj 0,67 μl mRNA (0,4 μg) do 4,33 μl wody wolnej od RNazy, aby uzyskać końcowe stężenie 0,08 μg/μl, to jedna kropla (500 pl) każdego wstrzyknięcia zawiera 40 pg mRNA. Przygotuj MO zgodnie z opisem w kroku 3.</li>
</ol>
5. Przygotowanie wstrzykniętych zarodków do obrazowania fluorescencyjnego
<ol>
	<li>Po inkubacji w temperaturze 28,5 °C O/N dodać 0,003% N-fenylotiomocznika (PTU) do wody E3, aby zapobiec melanizacji, co wpływa na obserwację struktury przedkrzewów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Nie należy jednak dodawać PTU przed gastrulacją, ponieważ wpływa to na wczesny rozwój zarodkowy.</li>
	<li>Przy 48 hpf ręcznie zdekorionuj zarodki za pomocą cienkiej pęsety. Zrób zdjęcia 48 i 72 zarodków hpf pod mikroskopem rozwarstwiającym światłem. 
	UWAGA: Te zdjęcia można robić bez znieczulenia.</li>
	<li>Około 10 minut przed obrazowaniem pod mikroskopem fluorescencyjnym należy znieczulić zarodki, umieszczając je na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej 160 μg/ml buforowanej trikainy. Odczekaj 5-10 minut, a następnie lekko dotknij danio pręgowanego, aby potwierdzić, że się nie porusza i dlatego znieczulenie działa.</li>
	<li>Po znieczuleniu zarodków należy je obsadzić w 3% metylocelulozie i ustawić w pozycji leżącej pod mikroskopem preparacyjnym (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Obserwuj strukturę przednercza pod mikroskopem fluorescencyjnym (patrz Tabela 1) i rób zdjęcia w różnych powiększeniach (10X i 20X).</li>
</ol>

<ol><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+deficiency+causes+ciliary+abnormalities+and+cystic+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys.</a> J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).</li>
<li>Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pronephros%3A+a+model+for+understanding+cystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease.</a> Dev Dyn. 228 (3), 514-522 (2003).</li>
<li>Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+number+and+size+in+relation+to+age%2C+kidney+weight%2C+and+body+surface+in+normal+man%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man.</a> Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).</li>
<li>Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+number+in+patients+with+primary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Nephron number in patients with primary hypertension.</a> N Engl J Med. 348 (2), 101-108 (2003).</li>
<li>Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+number%2C+renal+function%2C+and+arterial+pressure+in+aged+GDNF+heterozygous+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice.</a> Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).</li>
<li>Gerlach, G. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organogenesis+in+the+zebrafish%3A+insights+into+vertebrate+nephrogenesis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).</li>
<li>Igarashi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview%3A+nonmammalian+organisms+for+studies+of+kidney+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (2), 296-298 (2005).</li>
<li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defect+in+a+novel+Nek-family+kinase+causes+cystic+kidney+disease+in+the+mouse+and+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish.</a> Development. 129 (24), 5839-5846 (2002).</li>
<li>Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephrocystin-4+is+required+for+pronephric+duct-dependent+cloaca+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish.</a> Hum Mol Genet. 20 (16), 3119-3128 (2011).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Wnt5a+in+prostate+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of Wnt5a in prostate gland development.</a> Dev Biol. 328 (2), 188-199 (2009).</li>
<li>Andre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+coreceptor+Ryk+regulates+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+by+modulating+the+degradation+of+the+core+planar+cell+polarity+component+Vangl2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2.</a> J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Autosomal dominant polycystic kidney disease.</a> Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wielotorbielowatość nerek (PKD) jest jedną z głównych przyczyn schyłkowej niewydolności nerek u ludzi i charakteryzuje się postępującym tworzeniem torbieli, powiększeniem nerek i nieprawidłowym rozwojem kanalików 14. Autosomalna dominująca PKD (ADPKD) jest chorobą genetyczną, w której mutacja PKD1, kodującej policystynę-1 (PC1), lub PKD2, kodującej policystynę-2 (PC2), powoduje powstanie policystycznych nerek. Uważa się, że wiele innych genów, zwłaszcza tych kodujących białka znajdujące się w rzęsce pierwotnej...

Zarodki danio pręgowanego (Danio rerio) były powszechnie używane jako model do badania rozwoju nerek i wielotorbielowatości nerek. Wykorzystanie danio pręgowanego jako modelu zwierzęcego ma wiele zalet: możliwość badania interakcji genetycznych, możliwość wykorzystania antysensownych morfolinosów (MO) do knockdownu białek, możliwość szybkiego oznaczania dużej liczby zarodków oraz łatwość oglądania fenotypów narządów u żywych larw 1. Przednercze jest pierwszą nerką, która rozwija się u kręgowców i jest funkcjonalna u larw danio pręgowanego 2. Struktura przednercza danio pręgowanego jest stosunkowo prosta w porównaniu z metanephros ssaków, trzecią i ostatnią nerką, która rozwija się u ssaków. Nefron jest jednostką roboczą nerki, przy czym każda ludzka nerka zawiera od 500 000 do 1 000 000 nefronów3,4, a każda nerka myszy ma około 13 000 nefronów5, co utrudnia obserwację pojedynczej struktury nefronu w nerkach ludzkich lub mysich. Danio pręgowany ma tylko dwa nefrony, a każdy nefron danio pręgowanego zawiera wszystkie główne składniki znajdujące się w kłębuszkach nerkowych i kanalikach myszy i ludzi6oraz podobne wyspecjalizowane typy komórek nerkowych. W porównaniu z innymi modelami kręgowców, takimi jak Xenopus, nefron danio pręgowanego bardziej przypomina nefron ssaków, ponieważ ma zamknięty system7.
W ostatnich latach genom danio pręgowanego został zsekwencjonowany, co pozwoliło na szerokie wprowadzenie narzędzi genetycznych, obszernych zasobów mutantów i kolekcji transgenicznych linii reporterowych w modelach danio pręgowanego. Przednercze danio pręgowanego tworzy się między 12 a 72 godzinami po zapłodnieniu (hpf) i można je łatwo uwidocznić w przezroczystych zarodkach. Białko nowotworowe Wilma WT1 jest niezbędnym czynnikiem rozwoju nerek. Transgeniczne linie danio pręgowanego wykazujące ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) pod kontrolą promotora wt1b Tg (wt1b: GFP) wykazują ekspresję GFP specyficznie zlokalizowaną w regionach pronerkowych w zarodkach danio pręgowanego, począwszy od 17 hpf 8. Nefronooftoza (NPHP), autosomalna recesywna torbielowatość nerek, jest wywoływana przez mutacje genów NPHP 9. Powalenie NPHP4 przez morfolino spowodowało powstawanie cyst u ryb Tg(wt1b:GFP). 10 Dlatego ta transgeniczna ryba jest odpowiednim modelem do obserwacji struktur nerkowych i powstawania torbieli podczas rozwoju nerek. Co ważne, wpływ modulatorów na rozwój nerek można badać przy użyciu tego szczepu w sposób efektywny czasowo i pracochłonnie.
Nasz artykuł opisuje użycie ryb Tg(wt1b:GFP) jako modelu do wizualizacji powstawania torbieli nerki po modulacji genu. Użyliśmy MO antysensownych MO w miejscu startu i splicingu, aby powalić gen wnt5a u danio pręgowanego. Wnt5a jest niekanoniczną wydzielaną glikoproteiną z rodziny Wnt, która odgrywa ważną rolę w rozwoju różnych narządów i pourodzeniowych funkcjach komórkowych11. Wnt5a działa poprzez niekanoniczne szlaki Wnt, w tym szlak płaskiej polaryzacji komórek (PCP), który, jak stwierdzono, odgrywa rolę w zorientowanym podziale komórek podczas wydłużania kanalików nerkowych. Wnt5a reguluje szlak Wnt / PCP, tworząc kompleks z receptorem, takim jak kinaza tyrozynowa (Ryk), który dodatkowo transdukuje sygnalizację Wnt5a, tworząc kompleks z białkiem polarności komórek planarnych VANGL 2 (Vangl2), promując w ten sposób stabilność Vangl2 12. Wady szlaku PCP mogą powodować losowy podział komórek i powstawanie torbieli nerkowej. Użyliśmy linii zebry Tg(wt1b:GFP) do obserwacji powstawania torbieli nerki po knockdownie wnt5a. Model danio pręgowanego Tg(wt1b:GFP) umożliwia obrazowanie na żywo i obserwację struktury nerki w odpowiednim czasie. Po nokdaucie wnt5a stwierdzono tworzenie się torbieli nerki zaczynającej się od 24 hpf; Przy 72 hpf torbiele można znaleźć w kłębuszkach nerkowych i kanalikach proksymalnych. Metoda ta może być również wykorzystana do badań przesiewowych innych genów, które mogą powodować powstawanie torbieli nerki.

<table><tbody><tr><td>0,5% Phenol-Red</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Kolorowy wskaźnik do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Morpholino</td><td>Genn Tools, LLC</td> <td>(dostosowany)</td> <td>Dostosowane zaprojektowane do interesującego genu</td></tr><tr><td>Wstępnie ciągnięta igła</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-PP</td><td>Jeśli wymagana jest duża ilość igły, możesz również kupić ściągacz do igieł i przygotować igłę w laboratorium</td></tr><tr><td>T7 mMessage Kit</td><td>Ambion</td><td>1344</td><td>Do transkrypcji in vitro w celu wytworzenia zamkniętego mRNA do eksperymentu ratunkowego</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>Do zapobiegania melanizacji</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>Nazywany również 3-aminobenzoesanem etylu, do znieczulenia danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma</td><td>M-0387</td><td>Do pozycji danio pręgowanego&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Do oczyszczania produktu PCR do syntezy RNA czape.</td></tr><tr><td>Mieszanka dNTP</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td>Do PCR</td></tr><tr><td>Tag Polimeraza DNA</td><td>Invitrogen</td><td>10342-053</td><td>Do</td></tr><tr><td>spektrofotometru PCR NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td>Do pomiaru stężenia morfolina i RNA Sprężarka</td></tr><tr><td>powietrza</td><td>Werther International, Inc.</td><td>Panther Compact 106</td><td>Źródło powietrza do wtrysku Pompa</td></tr><tr><td>mikroiniekcyjna Pico</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>PV830 Pnematic PicoPump</td><td>Można stosować inne rodzaje systemów mikroiniekcji.</td></tr><tr><td>Mikroproducent</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>MMJR</td><td>Praworęczny (MMJL dla leworęcznych)</td></tr><tr><td>Uchwyt igły</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>5430-ALL</td><td>Do trzymania igły do mikromanipulacji</td></tr><tr><td>Pęseta Dumont</td><td>Drobne narzędzia chirurgiczne</td><td>11253-20</td><td>Do odłamywania końcówki igły</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica M205C&nbsp;</td><td></td><td>Do obserwacji i obrazowania zarodków danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss Axio Obserer D1m &nbsp;</td><td></td><td>Do obrazowania przednercza danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Rurka kapilarna (średnica wewnętrzna 0,15 mm)</td><td>VitroCom</td><td>CV1525Q-100</td><td>Do pomiaru objętości każdej wstrzykniętej kropli</td></tr></tbody></table>

możliwy model wielotorbielowatości nerek u danio pręgowanego: knockdown wnt5a powoduje torbiele w nerkach danio pręgowanego

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Wielotorbielowatość nerek (PKD) jest jedną z najczęstszych przyczyn schyłkowej choroby nerek, wyniszczającej choroby, na którą nie ma lekarstwa. Mechanizmy molekularne prowadzące do powstawania torbieli w PKD pozostają nieco niejasne, ale uważa się, że zaangażowanych jest wiele genów. Wnt5a jest niekanoniczną glikoproteiną, która reguluje szeroki zakres procesów rozwojowych. Wnt5a działa poprzez szlak płaskiej polaryzacji komórek (PCP), który reguluje zorientowany podział komórek podczas wydłużania komórek kanalików nerkowych. Stwierdzono, że wady szlaku PCP powodują powstawanie torbieli nerki. W pracy opisano metodę opracowania modelu torbielowatej choroby nerek danio pręgowanego poprzez knockdown genu wnt5a za pomocą oligonukleotydów antysensownych morfolino (MO) wnt5a. Transgeniczne danio pręgowane Tg (wt1b: GFP) wykorzystano do wizualizacji struktury nerek i torbieli nerek po knockdown wnt5a. Zastosowano dwa odrębne antysensowne MO (AUG - i miejsce splicingu) i oba spowodowały fenotyp kędzierzawego ogona w dół i tworzenie się torbieli po knockdown wnt5a. Wstrzyknięcie mysiego mRNA Wnt5a, opornego na MO ze względu na różnicę w strukturze pierwszorzędowej pary zasad, uratowało nieprawidłowy fenotyp, wykazując, że fenotyp nie był spowodowany "niedocelowymi" efektami morfolino. Praca ta potwierdza zasadność wykorzystania modelu danio pręgowanego do badania funkcji wnt5a w nerkach.

Wnt5a knock down osiągnięto poprzez wprowadzenie MO blokującego translację (AUG-MO) lub MO blokującego splicing na granicy eksonu i intronu (splice-MO) do embrionów danio pręgowanego w stadium jednej komórki. AUG-MO celuje w kodon startowy, przez co hamuje zarówno matczyne, jak i zygotyczne mRNA wnt5a . Splice-MO celuje w trzecią stronę donora splicingu i hamuje wyłącznie zygotyczny transkrypt wnt5a (Rycina 1A). Morfanty AUG- i splice- wykazały analogiczne fenotypy z licznymi wadami, w ...

Opisujemy metodę generowania możliwego modelu wielotorbielowatości nerek dla danio pręgowanego. Użyliśmy ryb Tg(wt1b:GFP) do wizualizacji struktury nerek. Knockdown wnt5a nastąpił przez wstrzyknięcie morfolino. Powstawanie torbieli pronefrycznej po knockdownie wnt5a zaobserwowano u tego transgenicznego danio pręgowanego GFP.

Możliwy model wielotorbielowatości nerek u danio pręgowanego: knockdown wnt5a powoduje torbiele w nerkach danio pręgowanego

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie możliwego modelu policystycznej choroby nerek u danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez wstrzyknięcie morfu przeciwko wiatrowi pięć A w transgenicznych zarodkach zebry zebry WT one BGFP na etapie jednej komórki. Następnie przeprowadza się eksperyment ratunkowy poprzez mikrowstrzyknięcie myszy Wint five A Mr.Nna, z Wint five a morpho.Następnie wstrzyknięte zarodki są znieczulane i osadzane po 48 i 72 godzinach od zapłodnienia w celu monitorowania struktury nerek i tworzenia się torbieli. Wyniki pokazują, że po knockdownie wiatru five A powoduje powstawanie torbieli nerki u transgenicznego zebrygenta WT one BG FP na podstawie mikroskopii fluorescencyjnej podatnych struktur nerkowych. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku zbudowania modelu choroby nerek, ponieważ przezroczystość embolu ryb pokrytego za pomocą transgenicznego białka fluorowego specyficznego dla nerek pozwala na bezpośredni wgląd w struktury nerek w organizmie AL.Ta metoda może zapewnić wgląd w powalanie pięciu win powodujące powstawanie torbieli nerki danio pręgowanej. Może być również stosowany do testowania wielu innych genów, co do których podejrzewa się, że powodują powstawanie torbieli nerkowej. Ten protokół jest prosty i mniej czasochłonny.Po zaprojektowaniu i zsyntetyzowaniu morphos zgodnie z instrukcjami producenta, do szklanych butelek dodaj sterylną wodę wysokiej jakości, aby dokładnie zawiesić do końcowego stężenia 25 mikrogramów na mikrolitr. Użyj spektrofotometru, aby zmierzyć stężenie i przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze pokojowej w dniu wstrzyknięcia, użyj sterylnej wody wysokiej jakości, aby rozcieńczyć morphos do pożądanego stężenia, a przy 0,5% czerwieni fenolowej do końcowego stężenia 0,05%Następnie włącz sprężarkę powietrza i ustaw ciśnienie na 50 si. Następnie włącz źródło światła mikroskopu preparacyjnego i pompę mikroiniekcji pico i dostosuj ustawienia w następujący sposób.Użyj pięciu mikrolitrów roztworu do wstrzykiwań, aby załadować wstępnie wyciągniętą szklaną igłę i umieść igłę w pozycji pionowej z końcówką skierowaną w dół, gdy nie ma widocznych pęcherzyków powietrza, włóż igłę do uchwytu. Ustaw kąt wtrysku na 45 stopni. Umieść końcówkę igły w polu widzenia pod mikroskopem, wysoko nad sceną i skup się na najcieńszym obszarze końcówki.Następnie użyj cienkiej pęsety, aby odłamać igłę. Końcówka, umieść rurkę kapilarną o średnicy wewnętrznej 0,15 milimetra pod mikroskopem. Wstrzyknąć roztwór na jeden koniec.Regulacja czasu wyrzucania na pompie mikroiniekcyjnej pico, aż 17 kropli utworzy kolumnę cieczy o długości jednego milimetra. To sprawia, że objętość każdej kropli jest równa jednemu nanolitrowi. Skonfiguruj transgeniczne pary hodowlane danio pręgowanego WT one BG FP zgodnie z opublikowanymi protokołami standardowej hodowli i utrzymania danio pręgowanego.Po naturalnym zaszczepianiu zbierz zarodki i przenieś je na szalkę Petriego z wodą E trzy. Używając zarodków między stadium od jednej do czterech komórek, przenieś je na 10-centymetrową szalkę Petriego z klinowymi korytami ślimakowymi. Po zassaniu pożywki delikatnie wciśnij zarodki do koryt Pod mikroskopem preparacyjnym zorientuj zarodki, aby uwidocznić komórkę.Następnie za pomocą igły do wstrzykiwań wbij się w corian, a następnie w żółtko, aby wstrzyknąć jedną lub dwie krople morpho do żółtka. Przenieś wstrzyknięte zarodki na 10-centymetrową szalkę Petriego z wodą E 3 i inkubuj w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza. Zapisz liczbę zdolnych do życia zarodków, którym wstrzyknięto zarodki, aby przeprowadzić eksperyment ratowania fenotypu.Wybierz ortolog z genu innego gatunku, który ma inną strukturę pierwszorzędowej pary zasad, która jest zatem odporna na morfo. W tym przykładzie mysz poszła piątka A została wybrana. Zaprojektuj zestaw starterów z starterem do przodu zaczynającym się w miejscu rozpoczęcia translacji i starterem odwrotnym w pobliżu końca obszaru kodu MR NA.Dodać sekwencję promotora T siedem na pięciu głównych końcach sekwencji startera do przodu ze starterami i jednym mikrogramem matrycowego DNA zawierającego wiatr myszy. Pięć sekwencji A-C-D-N-A. Ustaw reakcję PCR o pojemności 50 mikrolitrów i uruchom za pomocą pokazanego tutaj programu.Po zweryfikowaniu wielkości produktu PCR, oczyszczeniu go i sprawdzeniu stężenia, użyj zestawu do syntezy RNA z czapeczką do syntezy mRNA z czapeczką in vitro. Zgodnie z instrukcją producenta, do rozcieńczenia MR NA należy użyć 20 mikrolitrów wolnej od RNA wody i oznaczyć podwielokrotność stężenia i przechowywać RNA w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w dniu wstrzyknięcia. Przygotować roztwór roboczy MR NA, który dostarczy dawkę 40 pikogramów lub mniejszą, aby uniknąć niespecyficznych lub toksycznych skutków dla zarodka.Trzymanie roztworu MNA na lodzie polega na wstrzyknięciu morfoz, a następnie mRNA do zarodków lub współwstrzyknięciu roztworów. Następnego dnia usuń martwe zarodki i sprawdź, czy zarodki zostały poddane gazowi. Następnie dodaj 0,003% lub fenyl THREA lub PTU do wody E trzy, aby zapobiec melonowi w ciągu 48 godzin po zapłodnieniu.Użyj cienkiej pęsety, aby ręcznie pokryć zarodki przed użyciem mikroskopu preparacyjnego, aby natychmiast wykonać zdjęcia, a po 72 godzinach od zapłodnienia, około 10 minut przed obrazowaniem pod mikroskopem fluorescencyjnym, znieczulić zarodki, umieszczając je na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej 160 mikrogramów na mikrolitr buforowanej triki. Użyj 3% metylocelulozy do zamontowania zarodków i pod mikroskopem preparacyjnym ustaw je w pozycji leżącej. Następnie za pomocą obrazu w 10-krotnym i 20-krotnym powiększeniu.Zarodki pod mikroskopem fluorescencyjnym zostały osiągnięte przez wprowadzenie do zarodków danio pręgowanego morfo blokującego translację, zwanego również morfo UG lub morpho splicu granicy eksonu, zwanego również splice morpho. Na etapie jednej komórki morfo A UG celuje w kodon start i dlatego hamuje zarówno matczyną, jak i jarzynową ekspresję wygranej piątej. Morf splicingu jest ukierunkowany na trzecie miejsce dawcze splicingu i hamuje tylko zygotyczny transkrypt wygranej piątej A Jak wykazano tutaj, fenotyp morfiny A UG i splicingu kopiował się nawzajem z wieloma wadami, w tym kręconym ogonem, osią ciała w dół i obrzękiem osierdzia.Ten rysunek pokazuje, że mysz przeszła pięć mRNA częściowo ratuje fenotyp morfu, wykazując, że nie jest to spowodowane pokazanymi tutaj efektami off-target. Transgeniczna ryba WT one BGFP wykazuje ekspresję GFP napędzaną przez promotor WT one B i nakreśla strukturę proficzną. Ryba wykazała tworzenie się torbieli kłębuszkowej po piątym wietrze i powaleniu po 48 godzinach od zapłodnienia.Ryby kontrolne, którym wstrzyknięto tylko czerwień fenolową, wykazywały normalny podatny rozwój fric tworzących zrośnięte kłębuszki nerkowe w kształcie litery U z kanalikami, które rozciągają się na boki po 72 godzinach od zapłodnienia. Struktury kłębuszkowe dalej rozwijały się z pętlami naczyniowymi i zarówno zarodki z wstrzykniętymi morfami A UG, jak i splice morph, rozwinęły torbiele w kłębuszkach nerkowych i rurkach proksymalnych, jak widać na tym rysunku Zabarwienie HNE poprzecznych odcinków histologicznych 72 godziny po zapłodnieniu, zarodki moranta ujawniły tworzenie się torbieli, naruszone struktury kłębuszków nerkowych i poszerzone cewy nerkowe. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak opracować możliwy model fazy gery torbielowatej choroby nerek poprzez knockdown of wind aging i obserwować tworzenie się systemu za pomocą linii twarzy raportu o grypie.Po wykazaniu, że mutacja genu powoduje powstawanie torbieli nerki u danio pręgowanego, można przeprowadzić dalsze eksperymenty w celu zbadania szczegółowych mechanizmów powstawania torbieli nerki.

a-possible-zebrafish-model-polycystic-kidney-disease-knockdown-wnt5a

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Tutaj prezentujemy systematyczne podejście do opracowywania fizjologicznie istotnych, czułych i specyficznych testów in vivo do interpretacji zmienności w ludzkiej patologii. Przejściowa manipulacja genetyczna poprzez mikrowstrzyknięcie WT i zmutowanych ludzkich oligonukleotydów antysensownych mRNA i morfoliny (MO) wykorzystuje podatność rozwijającego się zarodka danio pręgowanego do szybkiego oznaczania mutacji patogennych, zwłaszcza, ale nie wyłącznie, w kontekście zaburzeń rozwojowych...

In vivo (in vivo) Modelowanie chorobliwego genomu ludzkiego przy użyciu Danio rerio

Dorosła nerka danio pręgowanego jest doskonałym systemem do regeneracji nerek i badań nad chorobami.  Istotnym aspektem takich badań jest ocena struktury i funkcji nefronu. Protokół ten opisuje kilka metodologii, które można zastosować do oceny składu kanalików nefronowych i oceny wchłaniania zwrotnego przez nerki.

Analiza składu i funkcji nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego

Danio pręgowany jest potężnym modelowym systemem do badań nad biologią rozwojową i chorobami ludzkimi ze względu na ich genetyczne podobieństwo do wyższych kręgowców. Protokół ten opisuje metodologię tworzenia haploidalnych zarodków danio pręgowanego, które można wykorzystać do strategii przesiewowych w celu identyfikacji recesywnych mutacji w genach niezbędnych do wczesnej embriogenezy.

Produkcja haploidalnych zarodków danio pręgowanego metodą zapłodnienia in vitro

Danio pręgowany jest doskonałym organizmem doświadczalnym do badania procesów rozwojowych kręgowców i modelowania chorób ludzkich. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób przeprowadzić ręczne, wysokoprzepustowe badanie chemiczne na zarodkach danio pręgowanego z odczytem hybrydyzacji in situ (WISH) w całości.

Ręczne badanie przesiewowe małych cząsteczek zbliżające się do wysokiej przepustowości przy użyciu zarodków danio pręgowanego

Danio pręgowany jest popularnym narzędziem do modelowania przewlekłej choroby nerek (PChN). Jednak ich niewielkie rozmiary uniemożliwiają ocenę funkcji nerek tradycyjnymi metodami. Opisujemy fluorescencyjny test usuwania nerekbarwnika 1, który umożliwia analizę ilościową funkcji nerek danio pręgowanego w PChN.

Ocena funkcji nerek danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego testu klirensu

Opisana tutaj metoda pozwala na analizę poklatkową rozwoju narządów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, zdolnego do wykonywania sekcji optycznych i prostych strategii dostosowania w celu skorygowania dryfu ogniskowego i płaskiego.

Analiza rozwoju nerek danio pręgowanego z obrazowaniem poklatkowym przy użyciu mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w sekcję optyczną

Uszkodzenia nerek spowodowane nefrotoksynami, które obejmują różne leki, od antybiotyków po chemioterapeutyki, mogą powodować złożone zaburzenia, których patogeneza pozostaje nie do końca poznana. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób danio pręgowany może być wykorzystany do modelowania chorób tych stanów, co można zastosować do identyfikacji środków renoprotekcyjnych.

Mikroiniekcja nefrotoksyny u danio pręgowanego w celu modelowania ostrego uszkodzenia nerek

Ta praca przedstawia nowy model in vivo segmentowego uszkodzenia nerek przy użyciu transgenicznego danio pręgowanego GFP. Model pozwala na indukcję celowanej ablacji komórek nabłonka nerek w celu ukazania komórkowych mechanizmów uszkodzenia i naprawy nefronów.

Precyzyjne podejście do ablacji komórkowej do modelowania ostrego uszkodzenia nerek u rozwijającego się danio pręgowanego

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki epilepsji u danio pręgowanego, wynikającej z przejściowego zahamowania genu DEPDC5.

Analiza behawioralna i fizjologiczna w modelu padaczki danio pręgowanego

Ten protokół opisuje procedury wywoływania ostrego uszkodzenia nerek (AKI) u dorosłych ryb pręgowanych przy użyciu cisplatyny jako środka nefrotoksycznego. Szczegółowo opisaliśmy etapy oceny odtwarzalności techniki oraz dwie techniki analizy stanu zapalnego i śmierci komórek w tkance nerkowej, odpowiednio cytometrię przepływową i TUNEL.

Model ostrego uszkodzenia nerek wywołanego cisplatyną u dorosłych danio pręgowanego

Poznaj metodę tworzenia modelu wielotorbielowatości nerek u danio pręgowanego przez knockdown wnt5a. Technika wykorzystuje mikroiniekcję morfolino i fluorescencyjną mikroskopię do wizualizacji struktur nerkowych.

Możliwy model wielotorbielowatości nerek u danio pręgowanego: knockdown wnt5a powoduje torbiele w nerkach danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów