Name: Lokalizacja, identyfikacja i wycięcie mysich magazynów tłuszczu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj metodę lokalizacji i wycięcia magazynów tłuszczu u myszy dorosłych. Technika umożliwia izolację tkanki tłuszczowej z minimalnym skażeniem do badań histologicznych i molekularnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

UWAGA: Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu w Cincinnati oraz zgodnie z Przewodnikiem po Opiece i Użytkowaniu Zwierząt Laboratoryjnych z National Institutes of Health (Publikacja NIH nr 85-23, poprawiona w 1996 roku).
1. Uśpij i wysterylizuj mysz
<ol>
	<li>Umieść mysz w pojemniku zawierającym supreparataputyczną dawkę izofluranu i pozwól jej wdychać do uzyskania efektu. Po uśpieniu myszy wyjmij ją z pudełka.</li>
	<li>Zwichnięcie szyjki macicy jako drugi sposób eutanazji.</li>
	<li>Wysterylizuj zewnętrzną powierzchnię myszy, oczyszczając zwierzę 70% etanolem.</li>
</ol>
2. Identyfikacja i izolacja trzech różnych składów tłuszczu
<ol>
	<li>Izolacja brunatnej tkanki tłuszczowej (BAT):
	<ol>
		<li>Upewnij się, że sierść jest mokra od oczyszczania alkoholowego, aby pomóc w przecięciu warstw naskórka i skóry właściwej.</li>
		<li>Ustaw mysz w pozycji leżącej, opierając się plecami o stół.</li>
		<li>Chwyć kleszczami skórę tuż pod przeponą, unieś i nacinaj nożyczkami.</li>
		<li>Przetnij poprzecznie na obwodzie myszy, aby odsłonić otrzewną.</li>
		<li>Odsłoń magazyn BAT w kształcie motyla, nakładając rękawice na górną połowę myszy. Trzymaj dolne kończyny i brzuch jedną ręką i pociągnij skórę w kierunku głowy.</li>
		<li>Ustaw mysz tak, aby leżała na stole na brzuchu. Uważaj, aby nie zanieczyścić odsłoniętego magazynu włosami.</li>
		<li>Wyczyść narzędzia chirurgiczne i zmień rękawice na nowe.</li>
		<li>Zlokalizuj łopatki i odpowiadający im magazyn. Ostrożnie usuń powierzchowną białą tkankę tłuszczową na wierzchu motyla, a następnie wypreparuj motyla z brązowego tłuszczu międzyłopatkowego. Uważaj, aby uniknąć mięśni ściśle związanych z brązowym tłuszczem. 
		UWAGA: Użycie mikroskopu preparacyjnego jest zalecane do usuwania białej tkanki tłuszczowej, a także do oddzielenia brązowej tkanki tłuszczowej od łopatek.</li>
		<li>Usuń magazyn tłuszczu i przenieś do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Jeżeli ma zostać wyekstrahowane RNA lub białko, należy zamrozić tkankę przez zanurzenie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Próbkę należy natychmiast zamrozić, aby zapobiec degradacji. W przypadku hodowli przykryj tkankę DMEF-12 i umieść na lodzie, aż wszystkie próbki zostaną pobrane do hodowli (informacje dodatkowe).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja podskórnej tkanki tłuszczowej (SQ), czyli magazynu białej tkanki tłuszczowej (WAT):
	<ol>
		<li>Załóż nową parę rękawiczek, aby nie zanieczyszczać krzyżowo między magazynami tłuszczu.</li>
		<li>Odsłoń pachwinowe, trójkątne magazyny SQ, zdejmując rękawiczki z dolnej połowy myszy. Trzymaj górne kończyny i klatkę piersiową w jednej ręce, a drugą ręką ciągnij skórę w dół w kierunku stóp.</li>
		<li>Ustaw mysz w pozycji leżącej, uważając, aby nie zanieczyścić odsłoniętego magazynu włosami.</li>
		<li>Wyczyść narzędzia chirurgiczne i zmień rękawice na nowe.</li>
		<li>Ostrożnie rozetnij trójkąty tłuszczu SQ. Należy uważać, aby nie zanieczyścić próbki mięśniami, sąsiednim tłuszczem, gruczołami sutkowymi ani nie przeciąć jakichkolwiek naczyń krwionośnych i nie zanieczyścić próbki krwią. 
		UWAGA: Użycie mikroskopu preparacyjnego jest zalecane, jeśli granice nie są wyraźnie określone.</li>
		<li>Usunąć magazyny tłuszczu i przenieść do probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Jeżeli ma zostać wyekstrahowane RNA lub białko, należy zamrozić tkankę przez zanurzenie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Próbkę należy natychmiast zamrozić, aby zapobiec degradacji.</li>
		<li>Do barwienia napraw lub osadź w OCT. W przypadku hodowli przykryj tkankę DMEF-12 i umieść na lodzie, aż wszystkie próbki zostaną pobrane do hodowli (informacje dodatkowe).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja tłuszczu gonadalnego trzewnej tkanki tłuszczowej (VAT) i białej tkanki tłuszczowej (WAT):
	<ol>
		<li>Załóż nową parę rękawiczek, aby nie zanieczyszczać krzyżowo między magazynami tłuszczu.</li>
		<li>Nożyczkami przetnij otrzewną poprzecznie, bezpośrednio pod przeponą. Przeciąć otrzewną od przepony do odbytnicy w połowie korony, aby odsłonić narządy jamy brzusznej.</li>
		<li>Zlokalizuj jądra lub jajniki i zidentyfikuj przyczepioną białą tkankę tłuszczową, znaną jako tkanka tłuszczowa najądrza u mężczyzn lub tkanka tłuszczowa gonad u kobiet.</li>
		<li>Wyczyść narzędzia chirurgiczne i zmień rękawice na nowe</li>
		<li>Ostrożnie wypreparuj oba najądrza magazyny tłuszczu z jąder, najądrzy i nasieniowodów. Lub jeśli jest kobietą, ostrożnie wypreparuj obie gonadalne poduszeczki tłuszczowe z jajników.</li>
		<li>Usuń magazyny tłuszczu i przenieś je do probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Jeżeli ma zostać wyekstrahowane RNA lub białko, należy zamrozić tkankę przez zanurzenie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Próbkę należy natychmiast zamrozić, aby zapobiec degradacji.</li>
		<li>Do barwienia napraw lub osadź w OCT. W przypadku hodowli przykryj tkankę DMEF-12 i umieść na lodzie, aż wszystkie próbki zostaną pobrane do hodowli (informacje dodatkowe).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Izolacja okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej (PVAT)
<ol>
	<li>Izolacja serca:
	<ol>
		<li>Połóż mysz w pozycji leżącej na plecach z górnymi i dolnymi wyrostkami wysuniętymi na zewnątrz.</li>
		<li>Zabezpiecz przydatki za pomocą taśmy chirurgicznej.</li>
		<li>Po ustawieniu myszy zgodnie z powyższym opisem, wytwórz napięcie, podnosząc wyrostek mieczykowaty za pomocą kleszczy. Przeciąć poziomo przez przeponę, odsłaniając dolną część klatki piersiowej.</li>
		<li>Utrzymując napięcie, unosząc się na wyrostku mieczykowatym, przeciąć klatkę piersiową wyżej w kierunku głowy, tuż przy boku mostka.</li>
		<li>Podnieś klatkę piersiową tuż poniżej obojczyka i przetnij wzdłuż dolnej długości obojczyka w kierunku pachy w obu kierunkach. Klatka piersiowa i jej zawartość (serce, płuca itp.) powinny być teraz wyraźnie widoczne.</li>
		<li>Oczyść klatkę piersiową z obcej krwi i płynu za pomocą sterylnej gazy do wchłonięcia płynu. Jeśli pobierasz narządy lub naczynia, upewnij się, że jest obfity (informacje uzupełniające).</li>
		<li>Gdy obszar zostanie oczyszczony z płynu, przetnij oskrzela i przyczepione naczynia, aby usunąć płuca, umożliwiając lepszą ekspozycję serca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lokalizacja i wycięcie okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej aorty (PVAT):
	<ol>
		<li>Usuń następujące narządy, aby lepiej zidentyfikować dolne części aorty: wątrobę, żołądek, śledzionę, trzustkę, jelita i okrężnicę.</li>
		<li>Najpierw zacznij od identyfikacji żołądka i przełyku. Przetnij przełyk na styku żołądkowo-przełykowym, aby uwolnić żołądek od ciała.</li>
		<li>Następnie zidentyfikuj jelita i otaczającą krezkę. Przeciąć powierzchownie przez krezkę, ponieważ leży ona bardzo blisko nerkowej części aorty, a następnie "przeprowadź jelito".</li>
		<li>Wytnij okrężnicę jak najbliżej odbytnicy. W ten sposób uwalniając żołądek, jelito i okrężnicę od myszy.</li>
		<li>Usuń żołądek, jelito, okrężnicę, trzustkę i śledzionę, przecinając przylegającą krezkę i naczynia. Trzustka i śledziona powinny być wolne wraz z żołądkiem, jelitami i okrężnicą.</li>
		<li>Usuń wątrobę, przecinając żyły wątrobowe i dołączając krezkę, usuń wszystkie płaty.</li>
		<li>Odetnij warstwę trzewną i tłuszcz otaczający nerki. Pozostaw nerki przyczepione do aorty in vivo, aby służyły jako markery geograficzne dla różnych segmentów aorty.</li>
		<li>Spłucz obszar sterylnym 1x PBS i usuń cały płyn przez wchłonięcie sterylną gazą.</li>
		<li>Za pomocą mikronożyczek i mikrokleszczyków oddziel aortę od jej grzbietowego przyczepu do kręgosłupa i brzusznego przyczepu do przełyku.</li>
		<li>Odizoluj aortę, podążając za aortą i odłączając ją na całej długości aorty zstępującej od początku w sercu do rozwidlenia w okolicy biodrowej.</li>
		<li>Zidentyfikuj i odizoluj naczynia podobojczykowe. Izoluj te naczynia od szyi do korzenia aorty, aby lepiej odsłonić połączenie aortalne i korzeń w sercu.</li>
		<li>Usuń grasicę, a następnie przetnij tętnicę ramienno-głowową, lewą tętnicę szyjną wspólną i lewą tętnicę podobojczykową, umożliwiając ruch serca.</li>
		<li>Za pomocą mikroskopu preparacyjnego obejrzyj warstwę okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej (PVAT) otaczającą aortę.</li>
		<li>Bardzo uważając, aby nie uszczypnąć ani nie ścisnąć PVAT, delikatnie wyciągnij PVAT z aorty za pomocą mikrokleszczyków. Delikatnie odetnij przyczep PVAT do aorty za pomocą mikronożyczek, zaczynając od okolicy klatki piersiowej tuż nad miejscem, w którym znajduje się przepona. 
		UWAGA: Zalecany jest mikroskop preparacyjny.</li>
		<li>Powtórz ten proces na całej długości aorty, kończąc na okolicy podnerkowej aorty, która znajduje się tuż nad rozwidleniem biodrowym naczynia aortalnego.</li>
		<li>Jeśli pożądany jest PVAT łuku aorty, użyj tej samej metody, aby usunąć PVAT z mniejszej krzywizny łuku.</li>
		<li>Umieścić próbki PVAT w probówce (probówkach) do mikrowirówek o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Jeżeli ma zostać wyekstrahowane RNA lub białko, należy zamrozić tkankę przez zanurzenie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Próbkę należy natychmiast zamrozić, aby zapobiec degradacji. W przypadku hodowli przykryj tkankę DMEF-12 i umieść na lodzie do momentu pobrania wszystkich próbek do hodowli (informacje dodatkowe). 
		UWAGA: Dodatkowe magazyny tłuszczu, które należy wziąć pod uwagę, jeśli są zainteresowane kompleksową analizą magazynu tłuszczowego, obejmują: zaotrzewnowe, krezkowe, onerowe, osierdziowe i podkolanowe.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ogden, C. L., Carroll, M. D., Kit, B. K., Flegal, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+obesity+in+the+United+States%2C+2009-2010%5BTitle%5D)+AND+%22NCHS+Data+Brief%22%5BJournal%5D)">Prevalence of obesity in the United States, 2009-2010.</a> NCHS Data Brief. 82, 1-8 (2012).</li>
<li>Flegal, K. M., Carroll, M. D., Kit, B. K., Ogden, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+obesity+and+trends+in+the+distribution+of+body+mass+index+among+US+adults%2C+1999-2010%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Prevalence of obesity and trends in the distribution of body mass index among US adults, 1999-2010.</a> 307 (5), 491-497 (2012).</li>
<li>Cawley, J., Meyerhoefer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medical+care+costs+of+obesity%3A+an+instrumental+variables+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Health+Economics%22%5BJournal%5D)">The medical care costs of obesity: an instrumental variables approach.</a> Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).</li>
<li>Obesity accounts for 21 percent of U.S. health care costs, study finds. , Cornell University. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.sciencedaily.com/releases/2012/04/120409103247.htm">http://www.sciencedaily.com/releases/2012/04/120409103247.htm</a> (2012).</li>
<li>Marder, W., Chang, S. Childhood Obesity: Costs, Treatment Patterns, Disparities in Care, and Prevalent Medical Conditions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarder%2C+W+%22Thomson+Medstat+Research+Brief%22">Thomson Medstat Research Brief</a>. , (2006).</li>
<li>Cortez, M., Carmo, L. S., Rogero, M. M., Borelli, P., Fock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-fat+diet+increases+IL-1%2C+IL-6%2C+and+TNF-%CE%B1+production+by+increasing+NF-%CE%BAB+and+attenuating+PPAR-%CE%B3+expression+in+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation%22%5BJournal%5D)">A high-fat diet increases IL-1, IL-6, and TNF-α production by increasing NF-κB and attenuating PPAR-γ expression in bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Inflammation. 36 (2), 379-386 (2013).</li>
<li>Sanchez-Gurmaches, J., Hung, C. M., Sparks, C. A., Tang, Y., Li, H., Guertin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+loss+in+the+Myf5+lineage+redistributes+body+fat+and+reveals+subsets+of+white+adipocytes+that+arise+from+Myf5+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">PTEN loss in the Myf5 lineage redistributes body fat and reveals subsets of white adipocytes that arise from Myf5 precursors.</a> Cell Metab. 16 (3), 348-362 (2012).</li>
<li>Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+adipocyte+biology.+Adipose+tissue+function+and+plasticity+orchestrate+nutritional+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation.</a> J Lipid Res. 48 (6), 1253-1262 (2007).</li>
<li>Aarsland, A., Chinkes, D., Wolfe, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+and+whole-body+fat+synthesis+in+humans+during+carbohydrate+overfeeding%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Hepatic and whole-body fat synthesis in humans during carbohydrate overfeeding.</a> Am J Clin Nutr. 65 (6), 1774-1782 (1997).</li>
<li>Park, A., Kim, W. K., Bae, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinction+of+white%2C+beige+and+brown+adipocytes+derived+from+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Distinction of white, beige and brown adipocytes derived from mesenchymal stem cells.</a> World J. Stem Cells. 6 (1), 33-42 (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and.</a> 150 (2), 366-376 (2012).</li>
<li>Giralt, M., Villarroya, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White%2C+brown%2C+beige%2Fbrite%3A+different+adipose+cells+for+different+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">White, brown, beige/brite: different adipose cells for different functions.</a> Endocrinology. 154 (9), 2992-3000 (2013).</li>
<li>Casteilla, L., Pénicaud, L., Cousin, B., Calise, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+an+adipose+tissue+depot+for+sampling%3A+factors+in+selection+and+depot+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity.</a> Methods Mol. Biol. 456, 23-38 (2008).</li>
<li>Grant, R., Youm, Y. H., Ravussin, A., Dixit, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+adipose+tissue+leukocytosis+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantification of adipose tissue leukocytosis in obesity.</a> Methods Mol. Biol. 1040, 195-209 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Otyłość może prowadzić do wielu chorób, a pełne zrozumienie roli, jaką odgrywa tłuszcz, nie jest w pełni zrozumiałe; W związku z tym konieczne jest kontynuowanie badań w dziedzinie tkanki tłuszczowej. Modele zwierzęce, w szczególności modele mysie, są idealne do wstępnych badań nad postępem chorób i testowania potencjalnych terapii farmaceutycznych. Przy zastosowaniu tych modeli, precyzyjna izolacja i wycięcie magazynów tłuszczowych jest niezwykle ważnym i niezbędnym narzędziem w badaniach patologii chorób dotkniętych tk...

Adipose pojawił się w centrum uwagi mediów, ze względu na dramatyczny wzrost otyłości w ciągu ostatnich kilku dekad XX wieku. Otyłość dotyka obecnie ponad jedną trzecią dorosłych oraz 17% dzieci i młodzieży w Stanach Zjednoczonych (USA)1. Badania statystyczne dotyczące epidemii otyłości, obejmujące wszystkie grupy etniczne, wykazały, że czarni niebędący Latynosami mają najwyższy wskaźnik otyłości skorygowany o wiek (49,5%) w porównaniu z Amerykanami pochodzenia meksykańskiego (40,4%), wszystkimi Latynosami (39,1%) i białymi nie-Latynosami (34,3%)2. Skutki ekonomiczne otyłości są również coraz większym problemem dla systemu opieki zdrowotnej. W 2012 roku oszacowano, że roczny koszt opieki medycznej nad osobami otyłymi w USA w 2005 roku wyniósł 190,2 miliarda dolarów, co stanowi prawie 21% całkowitego budżetu na wydatki medyczne. Niestety, szacuje się, że otyłość u dzieci jest odpowiedzialna za 14 miliardów dolarów samych bezpośrednich kosztów medycznych. Statystycznie ustalono, że średni koszt leczenia osób z otyłością był o 2741 dolarów rocznie wyższy niż osób bez tej chorobowości3-5.
Otyłość jest głównym czynnikiem ryzyka różnych schorzeń, takich jak: cukrzyca typu 2, dyslipidemia, choroby układu krążenia, rak, zaburzenia układu mięśniowo-szkieletowego i przewlekłe stany zapalne. Otyłość jest głęboko związana z patogenezą zespołu metabolicznego i innych chorób przewlekłych6-8. Przy tak drastycznych i negatywnych powiązaniach między otyłością a innymi chorobami współistniejącymi, badania naukowe skupiły uwagę na lepszym zrozumieniu obecnej epidemii oraz różnorodnych i kluczowych ról, jakie odgrywa tłuszcz.
Historycznie rzecz biorąc, tkanka tłuszczowa była uważana za nieistotną i była postrzegana jedynie jako zwykła tkanka wypełniająca. Obecnie wykazano, że tkanka tłuszczowa odgrywa wiele istotnych ról w funkcjonowaniu organizmu w: metabolizmie, regulacji hormonalnej, stanach zapalnych, ochronie i izolacji9. Tkanka tłuszczowa składa się głównie z adipocytów, ale zawiera również perycyty, komórki śródbłonka, monocyty, makrofagi i pluripotencjalne komórki macierzyste8. Tkanka tłuszczowa jest rozmieszczona w całym ciele w odrębnych magazynach. Główne magazyny można znaleźć podskórnie, podskórnie, domięśniowo i trzewnie10. Wykazano, że magazyny tłuszczowe mają specyficzne profile metaboliczne, które wykazały specyficzną podatność na otyłość i związane z nią zaburzenia8.
Tradycyjnie, tkanka tłuszczowa została podzielona na dwa główne typy: białą tkankę tłuszczową (WAT) i brązową tkankę tłuszczową (BAT); chociaż najnowsza literatura wskazuje na obecność trzeciej grupy ochrzczonej jako brite lub beżowa tkanka tłuszczowa11. Wykazano, że tkanka tłuszczowa ma różne kolory, morfologie, funkcje metaboliczne, cechy biochemiczne i genetyczne wzorce ekspresji10. Adipocyty w WAT mają pojedynczą, dużą kroplę lipidu i zmienne ilości mitochondriów. WAT występuje głównie w podskórnych i trzewnych miejscach ciała. WAT funkcjonuje przede wszystkim jako miejsce magazynowania energii i ochrony narządów. Adipocyty w BAT mają morfologię wielolotkową i obfite mitochondria. BAT znajduje się przede wszystkim w szyi i dużych naczyniach krwionośnych klatki piersiowej, a także w łopatkach12. BAT funkcjonuje przede wszystkim w zachowaniach wydatkujących energię, które regulują termogenezę7. Wykazano, że brite lub beżowa tkanka tłuszczowa ma podobną morfologię i ekspresję do BAT, ale stwierdzono, że pochodzi z białych adipocytów11.
Opisana metoda chirurgiczna w tym manuskrypcie daje badaczom możliwość analizy różnych skutków takich czynników jak: środowisko, farmaceutyki i genetyka, na tkankę tłuszczową; jak również korzystnej lub szkodliwej roli, jaką tkanka tłuszczowa odgrywa w chorobach i ogólnym zdrowiu. Zapewnienie również sposobu identyfikacji i izolacji różnych typów tkanki tłuszczowej, aby umożliwić lepsze zrozumienie relacji biochemicznych i różnic między magazynami. Może to pomóc w określeniu związku między lokalizacją, funkcją i rodzajami tłuszczu w organizmie. Ta opisana metoda osiąga to, dostarczając środków do ogólnej wizualizacji, analizy ekspresji genów, analizy ekspresji białek, badania histologicznego i izolacji pierwotnych linii komórkowych do badań in vitro. Obecnie istnieje wiele artykułów, które dają wgląd w zachowanie metaboliczne różnych magazynów tłuszczowych, a także ich lokalizacje anatomiczne; Nie podawaj jednak szczegółowej metody, jak konkretnie zlokalizować, zidentyfikować i odizolować te magazyny. Ta metoda chirurgiczna zapewnia precyzyjną technikę, która pozwala na odizolowanie wielu magazynów przy minimalnej ilości sekcji i zanieczyszczenia w porównaniu z innymi metodami przeznaczonymi do izolacji jednego lub dwóch magazynów13-14.
Celem tego protokołu jest dostarczenie precyzyjnej metody identyfikacji i izolacji różnych typów magazynów tłuszczu z wielu anatomicznych lokalizacji.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Med-Vet International</td><td>#RXISO-250</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Fisher</td><td>07-678-001</td><td></td></tr><tr><td>DMEF-12</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-6421</td><td>Ogrzać w kąpieli wodnej przed założeniem chusteczki.</td></tr><tr><td>2 ml Probówki do mikrowirówek</td><td>Midsci</td><td>MCT-200-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Solanka solankowa buforowana fosforanem</td><td>Sigma</td><td>Aldrich P5368-10PAK</td><td></td></tr></tbody></table>

lokalizacja, identyfikacja i wycięcie mysich magazynów tłuszczu

Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots

Otyłość dramatycznie wzrosła w ciągu ostatnich kilku dekad i dotyka ponad jedną trzecią dorosłej populacji USA. Ekonomiczne skutki otyłości w 2005 roku osiągnęły oszałamiającą sumę 190,2 miliarda dolarów w samych bezpośrednich kosztach medycznych. Otyłość jest głównym czynnikiem ryzyka wielu chorób. Historycznie niewiele było wiadomo na temat tkanki tłuszczowej oraz jej głównych i podstawowych funkcji w organizmie. Brązowa i biała tkanka tłuszczowa to dwa główne rodzaje tłuszczu, ale obecna literatura zidentyfikowała nowy rodzaj tłuszczu zwany brite lub beżową tkanką tłuszczową. Badania wykazały, że magazyny tłuszczu mają określone profile metaboliczne, a niektóre magazyny pozwalają na skłonność do otyłości i innych powiązanych zaburzeń. Celem tego protokołu jest zapewnienie naukowcom możliwości identyfikacji i wyodrębnienia magazynów tłuszczu, które pozwolą na analizę różnych efektów czynnikowych na tkankę tłuszczową; a także korzystną lub szkodliwą rolę, jaką tłuszcz odgrywa w chorobach i ogólnym stanie zdrowia. Izolacja i wycięcie magazynów tłuszczowych pozwala badaczom przyjrzeć się zarówno dużym zmianom morfologicznym, jak i zmianom histologicznym. Wyizolowany tłuszcz może być również wykorzystany do badań molekularnych w celu oceny zmian transkrypcyjnych i translacyjnych lub do eksperymentów in vitro w celu odkrycia celów zainteresowania i mechanizmów działania. Technika ta jest lepsza od innych opublikowanych technik ze względu na konstrukcję pozwalającą na odizolowanie wielu magazynów z prostotą i minimalnym zanieczyszczeniem.

Identyfikacja i lokalizacja podskórnej tkanki tłuszczowej pachwinowej, brunatnej tkanki tłuszczowej międzyłopatkowej, trzewnej tkanki tłuszczowej nadjądrzowej (Rysunek 1), a także okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej łuku aorty, tkanki tłuszczowej aorty piersiowej, tkanki tłuszczowej aorty nadnerczowej oraz tkanki tłuszczowej aorty podnerczowej (Rysunek 2>) zostały pomyślnie przeprowadzone przy użyciu opisanego метода chirurgicznego. Badanie histologiczne oraz rozróżnienie między próbkami...

Ze względu na drastyczny i negatywny związek między otyłością a innymi chorobami współistniejącymi, uzasadnione są badania nad rolą tłuszczu w chorobach i ogólnym zdrowiu. Przedstawiamy protokół izolacji i wycinania magazynów tłuszczowych pozwalający na badanie tkanki tłuszczowej metodami in situ i in vitro.

Lokalizacja, identyfikacja i wycięcie mysich magazynów tłuszczu

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykazanie identyfikacji i wycinania osadów tłuszczowych w celu analizy różnych efektów czynnikowych na tkankę tłuszczową i przez tkankę tłuszczową. Osiąga się to poprzez najpierw odsłonięcie narządów wewnętrznych i magazynów tłuszczowych dorosłej myszy. W drugim etapie usuwa się narządy i zbędne tkanki, aby lepiej wyeksponować magazyny, co pozwala na identyfikację magazynów w odpowiednich lokalizacjach.W ostatnim etapie tkanka tłuszczowa jest następnie ekstrahowana ze szczególną starannością, aby uniknąć zanieczyszczenia. Ostatecznie izolacja i wycięcie tych osadów dostarcza tkanki do analizy histologicznej, ekspresji białek, aktywności enzymów i analizy ekspresji genów, a także do badań in vitro. Główną zaletą tego konkretnego protokołu w porównaniu z istniejącymi metodologiami jest to, że pozwala on na wielokrotną izolację magazynu przy minimalnym rozwarstwieniu, a także minimalnym zanieczyszczeniu.Tak więc ta procedura może pomóc odpowiedzieć na pytania dotyczące otyłości. Na przykład szkodliwy, a nawet korzystny wpływ tkanki tłuszczowej na choroby człowieka. Aby wyizolować brązową tkankę tłuszczową, zacznij od umieszczenia oczyszczonej, poddanej eutanazji dorosłej myszy na etanolu w pozycji leżącej na plecach, plecami do stołu.Następnie za pomocą kleszczy podnieś skórę tuż pod przeponą i nacinaj skórę nożyczkami. Przetnij poprzecznie na obwodzie myszy, aby odsłonić otrzewną. Następnie, trzymając dolne kończyny i brzuch jedną ręką, drugą ręką pociągnij skórę w kierunku głowy, aby odciąć górną połowę myszy, odsłaniając brązowy magazyn tłuszczu lub nietoperza w kształcie motyla.Następnie zlokalizuj krajobraz i odpowiadający mu magazyn nietoperzy. Następnie użyj mikroskopu preparacyjnego, aby ostrożnie usunąć powierzchowną białą tkankę tłuszczową na szczycie motyla i wypreparuj brązowy tłuszcz między łopatkami, uważając, aby uniknąć powiązanych mięśni. Aby wyizolować tkankę tłuszczową podskórną lub podskórną, przytrzymaj górne przydatki i klatkę piersiową jedną ręką, a drugą ręką pociągnij skórę w dół w kierunku stóp, aby odgąbić dolną połowę myszy i odsłonić trójkątne złogi pachwinowe.Następnie umieść mysz z powrotem w pozycji leżącej na plecach i ostrożnie wypreparuj trójkąty tłuszczu subq, aby wyizolować tłuszcz gonadalny z jamy brzusznej. Za pomocą nożyczek przeciąć otrzewną poprzecznie bezpośrednio pod przeponą. Następnie przeciąć otrzewną od przepony do odbytnicy, w połowie korony, aby odsłonić narządy jamy brzusznej i dokładnie wypreparować oba naskórkowe magazyny tłuszczu z jąder epi i vasa deia.Aby wyizolować okołonaczyniową tkankę tłuszczową, utrzymuj zwierzę w pozycji leżącej na plecach i wyciągnij górne i dolne wyrostki na zewnątrz. Następnie podnieś wyrostek mieczykowaty za pomocą kleszczy, aby wytworzyć napięcie w górnej części ciała i przetnij poziomo przeponę, odsłaniając dolną część jamy klatki piersiowej. Przeciąć klatkę piersiową wyżej w kierunku głowy tuż po stronie mostka, a następnie podnieś klatkę piersiową tuż poniżej obojczyka.Cięcie wzdłuż dolnej długości obojczyka w kierunku pachy w obu kierunkach. Klatka piersiowa i jej zawartość powinny być teraz wyraźnie widoczne. Gdy obszar zostanie oczyszczony z płynu, przetnij oskrzela i naczynia łączące, aby usunąć płuca i odsłonić serce.Po zidentyfikowaniu żołądka i przełyku przetnij przełyk na skrzyżowaniu żołądkowo-przełykowym, aby uwolnić żołądek. Następnie zidentyfikuj jelita i otaczającą krezkę. Przetnij powierzchownie przez krezkę, a następnie przetnij okrężnicę jak najbliżej odbytnicy, aby uwolnić żołądek, jelito, okrężnicę, trzustkę i śledzionę.Po usunięciu narządów przeciąć żyły wątrobowe i łączącą krezkę i usunąć wszystkie płaty wątroby. Odetnij warstwę trzewną i tłuszcz otaczający nerki, pozostawiając nerki przyczepione do aorty in vivo, aby służyły jako markery geograficzne dla różnych segmentów aorty. Następnie, gdy obszar wokół nerek jest czysty, użyj mikronożyczek i mikrokleszczy, aby oddzielić aortę od jej grzbietowego przyczepu do kręgosłupa i jej brzusznego przyczepu do przełyku.W klatce piersiowej podążaj i odłącz aortę od jej początku w sercu do rozwidlenia w okolicy biodrowej. Aby wyizolować tkankę tłuszczową aorty, w tym momencie można zidentyfikować naczynia podobojczykowe. Izoluj te naczynia od szyi do korzenia aorty, aby lepiej odsłonić połączenie aortalne i korzeń w sercu.Następnie usuń grasicę i przetnij tętnicę ramienno-głowową, lewą tętnicę szyjną wspólną i lewą tętnicę podobojczykową, aby umożliwić ruch serca. Na koniec użyj mikroskopu preparacyjnego, aby zobaczyć okołonaczyniową tkankę tłuszczową lub warstwę P VVA T otaczającą aortę. Następnie użyj mikrokleszczyków, aby delikatnie odciągnąć tkankę od aorty i mikronożyczek, aby delikatnie przeciąć przyczep PVAT do aorty, zaczynając od okolicy klatki piersiowej, tuż nad miejscem, w którym znajduje się przepona.Następnie użyj mikrokleszczyków, aby delikatnie odciągnąć tkankę od aorty i mikronożyczek, aby delikatnie przeciąć przyczep PVAT do aorty, zaczynając od okolicy klatki piersiowej tuż nad miejscem, w którym znajduje się przepona. Powtórz ten proces na całej długości aorty kończącej się w okolicy podnerkowej aorty, położonej nieco powyżej rozwidlenia biodrowego naczynia aorty i poniżej gałęzi nerkowych nietoperza. Próbki wat można różnicować za pomocą analizy histologicznej z barwieniem h i e, pierwotnymi liniami komórkowymi adipocytów podskórnych i okołonaczyniowymi.Adipocyty można następnie hodować i różnicować od preadipocytów do adipocytów w celu analizy mikromacierzy. Na tych reprezentatywnych obrazach, na przykład, konwersja hodowanych preadipocytów do adipocytów została potwierdzona za pomocą adipocytów barwiących czerwień olejową O, wyizolowanych, hodowanych i różnicowanych tą metodą można wykorzystać do dalszych analiz in vitro. W tym reprezentatywnym eksperymencie zaobserwowano, że aktywność enzymatyczna MM P 2 zmniejsza się w izolowanych adipocytach okołonaczyniowych w odpowiedzi na eksperymentalne leczenie w porównaniu z nieleczonymi kontrolami.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zmianie rękawiczek, a także częstym czyszczeniu narzędzi, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Tak więc po pobraniu tych tkanek można na nich wykonać różne zabiegi. Na przykład hodowla komórkowa, analiza histologiczna, pomiar białek, a nawet ekspresja genów.A następnie wyniki te można wykorzystać, aby pomóc zrozumieć relacje oraz podobieństwa i różnice między różnymi magazynami.

localization-identification-and-excision-of-murine-adipose-depots

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W tym filmie pokazujemy procedurę chirurgiczną polegającą na izolowaniu podskórnej białej tkanki tłuszczowej i brązowej tkanki tłuszczowej między łopatkami od nowonarodzonej myszy.

Kolekcja White and Brown Adipose Depot od Mouse Pup: procedura chirurgiczna mająca na celu zebranie białej tkanki tłuszczowej i brązowej tkanki tłuszczowej od szczeniaka myszy

Tkanka tłuszczowa (AT) może wpływać na homeostazę całego organizmu, dlatego zrozumienie molekularnych mechanizmów różnicowania i funkcji adipocytów jest ważne. Udostępniamy protokół uzyskiwania nowych informacji na temat tych procesów poprzez analizę homeostazy, różnicowania i ekspozycji na niedotlenienie adipocytów jako modelu indukowanej apoptozy adipocytów.

Mechanizm regulacji liczby adipocytów w organizmach dorosłych poprzez różnicowanie i homeostazę apoptozy

Prezentujemy techniki wymagane do wyizolowania zrębowej frakcji naczyniowej (SVF) z mysich pachwinowych (podskórnych) i okołogonadalnych (trzewnych) magazynów tkanki tłuszczowej w celu oceny ich ekspresji genów i aktywności kolagenolitycznej. Metoda ta obejmuje wzbogacanie komórek macierzystych owysokiej zawartości tkanki tłuszczowej (ASC) Sca1 za pomocą immunomagnetycznej separacji komórek.

Immunomagnetyczna separacja komórek macierzystych owysokiej zawartości tkanki tłuszczowej (ASC) Sca1 specyficznych dla Fat Depot

Adipocyty istnieją w oddzielnych magazynach i pełnią różne role w swoich unikalnych mikrośrodowiskach. W miarę odkrywania regionalnych różnic w charakterze i funkcji adipocytów, ustandaryzowana identyfikacja i izolacja magazynów ma kluczowe znaczenie dla postępu w tej dziedzinie. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół wycinki różnych magazynów tłuszczu myszy.

Identyfikacja i sekcja różnorodnych mysich magazynów tłuszczowych

Celem tego protokołu jest synteza liposomów znakowanych fluorescencyjnie i wykorzystanie cytometrii przepływowej do identyfikacji lokalizacji liposomów in vivo na poziomie komórkowym.

Przygotowanie, podawanie i ocena specyficznego tkankowo wychwytu komórkowego in vivo liposomów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym

Ten protokół opisuje techniczne podejście do izolowania subpopulacji komórek zrębu adipogennych i włóknisto-zapalnych z mysich magazynów białej tkanki tłuszczowej (WAT) w jamie brzusznej poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub separację kulek immunomagnetycznych.

Izolacja adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysich wewnątrzbrzusznych magazynów tłuszczu

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę preparacji mysich magazynów tłuszczu oraz izolacji i trawienia odpowiednich tętnic w celu uwolnienia, a następnie zidentyfikowania populacji komórek śródbłonka. Świeżo wyizolowane komórki wykorzystywane w dalszych zastosowaniach przyczynią się do lepszego zrozumienia biologii komórek naczyniowych i mechanizmów dysfunkcji naczyń krwionośnych.

Izolacja i identyfikacja komórek śródbłonka naczyń krwionośnych z różnych magazynów tłuszczu do dalszych zastosowań

Ten protokół opisuje półautomatyczną izolację frakcji zrębu naczyniowego (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i osiągnięcia różnicowania adipocytów in vitro. Użycie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejsza zmienność eksperymentalną i zwiększa odtwarzalność.

Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

Tutaj oferujemy praktyczną procedurę preparowania i przeprowadzania analiz histologicznych oraz analiz ekspresji genów mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej.

Rozwarstwienie, przetwarzanie histologiczne i analiza ekspresji genów mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej

Rozmiar i kruchość dojrzałych adipocytów ograniczyły dostępne techniki i narzędzia do ich badania i izolacji. W tym miejscu opisano protokół izolacji dojrzałych mysich adipocytów, który można łatwo dostosować do różnych magazynów tłuszczowych i diety myszy.

Izolacja i hodowla pierwotnych mysich adipocytów od myszy chudych i otyłych

Poznaj metodę lokalizacji i wycięcia magazynów tłuszczu u myszy dorosłych. Technika umożliwia izolację tkanki tłuszczowej z minimalnym skażeniem do badań histologicznych i molekularnych.

Lokalizacja, identyfikacja i wycięcie mysich magazynów tłuszczu

Przeglądaj więcej filmów