Name: Pomiar reakcji żywieniowej indukowanej glutationem u Hydry (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Poznaj metodę pomiaru reakcji żywieniowej u Hydry indukowanej glutationem. Technika mierzy odległość między czubkiem macki a gębą, oferując wiarygodne i łatwe do powtórzenia wyniki w badaniach nad neurobiologią zachowań.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni K. P. Madhu, Nicie Beliappie i pracownikom Centrum Medialnego Indyjskiego Instytutu Edukacji i Badań Naukowych w Pune za pomoc w produkcji filmu. Prace zostały wsparte przez finansowanie w ramach programu Centrum Doskonałości Departamentu Biotechnologii Rządu Indii dla SG oraz stypendium podoktorskie przez Departament Nauki i Technologii Rządu Indii dla RK.

1. Hodowla Hydra i pomiar reakcji żerowania
<ol>
	<li>Utrzymuj polipy hydry w kulturze, karmiąc je codziennie artemią i przetrzymując w medium (bufor Tris-HCl 1 mM, pH 7.6, NaCl 1 mM, CaCl2 1 mM, KCl 0,1 mM oraz MgSO4 0,1 mM) w szklanej misie w temperaturze 18 °C w cyklach 12 h światła / 12 h ciemności, zgodnie z wcześniejszym opisem12.</li>
	<li>W celu pomiaru reakcji żerowania przenieś jeden dojrzały polip hydry posiadający od 5 do 6 czułków do pojedynczego dołka płytki 24-dołkowej. Usuń pozostałe medium z dołka poprzez przechylenie płytki, a następnie niezwłocznie dodaj 500 µl świeżego medium.</li>
	<li>Przygotuj 9 µM roztwór glutationu w medium dla hydry. Ponieważ roztwór glutationu jest podatny na utlenianie, do każdego eksperymentu zawsze używaj świeżo przygotowanego roztworu glutationu.</li>
	<li>Przenieś płytkę na platformę obrazującą mikroskopu wyposażonego w funkcję rejestracji obrazu. Użyj ciemnego tła, aby zachowanie polipa hydry można było wyraźnie obrazować na kontrastowym tle.</li>
	<li>Pomieszczenie wykorzystywane do obserwacji i obrazowania zachowania hydry musi być wolne od światła o zmiennym natężeniu, przeciągów i hałasu. Takie zakłócenia mogą również spowodować kurczenie się czułków polipa hydry – nawet w przypadku braku glutationu.</li>
	<li>Pozostaw polip do rozluźnienia na 5 min.</li>
	<li>Upewnij się, że polip znajduje się w centralnej części dołka, tak aby jego zachowanie można było wyraźnie obrazować. Jeśli polip znajduje się przy krawędzi dołka, przesuń go do środka, przepłukując medium za pomocą pipety, a następnie ponownie pozostaw do rozluźnienia.</li>
	<li>Wykonaj zdjęcie hydry w stanie rozluźnienia. Będzie to obserwacja w punkcie czasowym zero.</li>
	<li>Szybko dodaj roztwór glutationu 9 µM, aby osiągnąć stężenie końcowe 3 µM w dołku. W zależności od celu eksperymentu i reakcji wykazanej przez hydrę, przetestuj zakres różnych stężeń glutationu i wybierz odpowiednie wymagane stężenie.</li>
	<li>Uruchom stoper natychmiast po dodaniu roztworu glutationu i wykonuj zdjęcia co 15-30 s przez 4-5 min. Nie zmieniaj ustawień powiększenia podczas obrazowania time-lapse.</li>
	<li>Dodawaj roztwór glutationu delikatnie i równomiernym strumieniem, tak aby pozycja zwierzęcia w dołku w polu widzenia mikroskopu była w minimalnym stopniu zaburzona. Jeśli jednak polip przemieści się znacząco po dodaniu roztworu glutationu, bardzo delikatnie przesuń płytkę, aby wprowadzić polip w pole widzenia w celu wykonania zdjęcia.</li>
	<li>W eksperymencie kontrolnym użyj medium pozbawionego glutationu, utrzymując wszystkie pozostałe parametry identycznie.</li>
	<li>Pamiętaj, aby wszystkie powyższe kroki eksperymentalne przeprowadzić w pierwszej połowie dnia – przed godziną 13:00, aby uniknąć możliwego wpływu rytmu okołodobowego na zakres reakcji żerowania.</li>
	<li>Otwórz każde z wykonanych zdjęć za pomocą programu GNU Image Manipulation Program (GIMP).</li>
	<li>Użyj narzędzia „Pomiar” (Measure) dostępnego w Menu &gt; Narzędzia &gt; Pomiar, aby wyznaczyć odległość między końcem apikalnym każdego z czułków a hypostomem. Jeśli na którymkolwiek z obrazów widoczny jest otwór gębowy, wyznacz odległość między środkiem otwartego otworu gębowego a końcem apikalnym czułka. Odległość tę określ jako rozpiętość czułka.</li>
	<li>Oblicz średnią rozpiętość czułków dla każdego polipa przed i po ekspozycji na glutation. Oblicz stosunek średniej rozpiętości czułków w punkcie czasowym zero do rozpiętości w każdym z kolejnych punktów czasowych. Stosunek ten zostanie nazwany względną rozpiętością czułków.</li>
	<li>Powtórz pomiary dla co najmniej 20 polipów.</li>
</ol>
<img alt="Równanie do obliczenia średniego rozłożenia macek; wzór reprezentujący stosunek całkowitego rozłożenia do liczby macek." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq1.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"> 
<img alt="Równanie dla względnego rozłożenia macek; stosunek zmiany rozłożenia macek, eksperyment biologiczny." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq2.jpg" width="450" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 2">
2. Walidacja metody z wykorzystaniem modelu głodzenia
<ol>
	<li>W celu przeprowadzenia głodzenia przenieś kilka polipów hydry do oddzielnej szklanej miski i nie karm ich przez 5 dni. Grupę kontrolną składającą się z kilku polipów karm codziennie artemią w misce o podobnej wielkości. Codziennie wymieniaj medium w obu miskach eksperymentalnych, aby zapobiec wzrostowi grzybów w pożywce.</li>
	<li>W dniu eksperymentu karm grupę kontrolną hydr artemią przez 1 hr, a następnie wykorzystaj te hydry do kolejnych doświadczeń po usunięciu z medium całej niezjedzonej i martwej artemii.</li>
	<li>Zmierz reakcję żerową głodzących hydr w porównaniu z hydrami z grupy kontrolnej metodą opisaną wcześniej w kroku 1. Aby uniknąć błędu wynikającego z czasu obserwacji, pomiary każdego z głodzących i kontrolnych polipów hydry wykonuj naprzemiennie.</li>
</ol>

<ol><li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+control+of+the+specific+feeding+reactions+of+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Ny.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra.</a> Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).</li>
<li>Beckmann, A., Ozbek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nematocyst%3A+a+molecular+map+of+the+Cnidarian+stinging+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle.</a> Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).</li>
<li>Venturini, G., Carolei, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+receptors+in+Hydra.+Pharmacological+and+biochemical+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Phys.+C%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).</li>
<li>Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+and+GABAnergic+control+in+the+tentacle+effector+systems+of+Hydra+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiologia%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris.</a> Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).</li>
<li>Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+roles+of+GABA+and+glycine+in+the+modulation+of+chemosensory+responses+in+Hydra+vulgaris+%28Cnidaria%2C+Hydrozoa%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiology%22%5BJournal%5D)">Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa).</a> Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).</li>
<li>Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+NMDA+receptors+in+Hydra%3A+a+biochemical+and+functional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study.</a> Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).</li>
<li>Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allatotropin%3A+An+ancestral+myotropic+neuropeptide+involved+in+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+Hydra+glutathione+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins.</a> FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).</li>
<li>Lenhoff, H. M. The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Glutathione+in+the+Nervous+System%22">Glutathione in the Nervous System</a>. Shaw, C. A. , Taylor&Francis. Bristol. 25-43 (1998).</li>
<li>Venturini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hydra+GSH+receptor.+Pharmacological+and+radioligand+binding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Phys.+C%22%5BJournal%5D)">The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).</li>
<li>Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+and+phylogenetic+characterization+of+common+hydra+from+India%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Sci%22%5BJournal%5D)">Description and phylogenetic characterization of common hydra from India.</a> Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).</li>
<li>Horibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+catabolic+pathway+of+glycosphingolipids+in+a+hydrozoan%2C+Hydra+magnipapillata.+Involving+endoglycoceramidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase.</a> J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).</li>
<li>Koizumi, O., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rise+of+feeding+threshold+in+satiated+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rise of feeding threshold in satiated Hydra.</a> J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).</li>
<li>Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+characterization+and+detergent+solubilization+of+the+putative+glutathione+chemoreceptor+from+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra.</a> Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).</li>
<li>Morita, H., Hanai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+receptor+proteins+in+invertebrates+-+with+special+reference+to+glutathione+receptor+of+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra.</a> Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).</li>
<li>Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+involvement+in+Hydra+vulgaris+very+primitive+olfactory-+like+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system.</a> Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).</li>
<li>Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gründer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+homologous+subunits+form+a+high+affinity+peptide-gated+ion+channel+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra.</a> J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).</li>
<li>Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+family+C+G-protein-coupled+receptors+by+the+tripeptide+glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione.</a> J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).</li>
<li>Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+activity+in+hydra+is+modulated+by+glycine+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Phys.+C%22%5BJournal%5D)">Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).</li>
<li>Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+automated+movement+detection+for+the+analysis+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Computer automated movement detection for the analysis of behavior.</a> J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Zachowania żywieniowe u hydry reprezentują jeden z najbardziej pradawnych systemów chemosensorycznych u metazoanów. Chociaż obecność GSH w płynie skorupiaków uwolnionym po schwytaniu zdobyczy wspomaganej nematocystami została wykrytadawno temu1, ani białko GSHR, ani przypuszczalne geny kodujące nie zostały do tej pory scharakteryzowane na podstawie hydry. Podjęto niewiele prób scharakteryzowania białek wiążących GSH w hydrze8, 14, 15. Jednak tożsamość tych domniemanych białek receptorowych pozostaje...

Hydra to najbardziej prymitywny organizm posiadający układ nerwowy i chemosensację do wykrywania zredukowanego glutationu (GSH) do chwytania zdobyczy1. Żywi się różnymi zwierzętami, takimi jak nicienie, skorupiaki, larwy owadów, kijanki i nowo wyklute ryby1. Ruch tych organizmów drapieżnych powoduje mechanosensoryczne wydzielanie z hydry parzących kapsułek zwanych nematocystami, które są wprowadzane do ofiary2. GSH obecny w płynie uwolnionym z rannej ofiary aktywuje następnie reakcję żywieniową w hydrze, która obejmuje zwijanie macek, aby sprowadzić ofiarę w kierunku ust, otwarcie ust i w konsekwencji pochłonięcie ofiary. Wykazano, że wiele cząsteczek, takich jak dopamina3, glutaminian4, GABA, glicyna5, receptory NMDA6 i allatotropina7, jest zaangażowanych w odpowiedź na karmienie u hydry. Wykazano również, że odpowiedź chemosensoryczna indukowana przez GSH jest modulowana przez stan żywienia zwierzęcia w taki sposób, że wygłodzona hydra wykazywała zwiększoną reakcję na karmienie1. Taki wzrost wrażliwości GSH jest biologicznie istotny, ponieważ w warunkach głodu hydra musi znaleźć swoją zdobycz z większą czułością. 
Chociaż reakcja na karmienie wywołana przez GSH może być wyraźnie obserwowana pod mikroskopem, metody zazwyczaj używane do pomiaru obserwacji reakcji na karmienie są nieilościowe. W większości przypadków czas, w którym ujście hydry pozostaje otwarte, został przyjęty jako miara reakcji na karmienie8,9; podczas gdy w innym przypadku kwantyfikacja opierała się na liczbie hydr w populacji wykazującej reakcję na żerowanie10. Jednak obserwacja czasu otwierania ust polipów hydry jest uciążliwa i podlega wahaniom wywołanym niekontrolowanymi parametrami, takimi jak kierunek orientacji ust podczas obserwacji. Podobnie, ponieważ reakcja na karmienie jest parametrem ilościowym, podejścia populacyjne podlegają zmianom/błędom spowodowanym opinią lub błędem obserwacyjnym indywidualnego obserwatora. Aby obejść te problemy, opracowaliśmy metodę względnego oznaczania ilościowego reakcji na karmienie u hydry (Hydra vulgaris Ind-Pune11) w oparciu o odległość wierzchołkowego końca macki od ujścia polipa hydry.

<table><tbody><tr><td>Inkubator z chłodzeniem</td><td>Panasonic&nbsp;</td><td>Mikroskop MIR-254-PE</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>S8AP0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kamera do mikroskopu</td><td>Leica&nbsp;</td><td>EC3</td><td></td></tr><tr><td>Zredukowany glutation</td><td>Sigma</td><td>G4251</td><td>Przechowywany w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przed otwarciem doprowadź butelkę do temperatury pokojowej, aby uniknąć utleniania</td></tr><tr><td>Program do edycji obrazu</td><td>GIMP</td><td>w wersji 2.8</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar reakcji żywieniowej indukowanej glutationem u hydry

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra jest jednym z najbardziej prymitywnych organizmów posiadających układ nerwowy i chemosensację do wykrywania zredukowanego glutationu (GSH) do chwytania zdobyczy. Ruch organizmów drapieżnych powoduje mechanosensoryczne wyładowanie komórek parzących zwanych nematocystami z hydry, które są wprowadzane do ofiary. Reakcja żywieniowa u hydry, która obejmuje zwijanie macek w celu sprowadzenia ofiary w kierunku ust, otwieranie ust i w konsekwencji pochłanianie ofiary, jest wywoływana przez GSH obecny w płynie uwalnianym z rannej ofiary. Aby móc zidentyfikować molekularny mechanizm reakcji na karmienie u hydry, który jest do tej pory nieznany, konieczne jest ustanowienie testu do pomiaru reakcji na karmienie. W tym miejscu opisujemy prostą metodę ilościowego oznaczania reakcji na karmienie, w której mierzy się odległość między wierzchołkowym końcem macki a ustami hydry i określa się stosunek takiej odległości przed i po dodaniu GSH. Stwierdzono, że stosunek, zwany względnym rozpiętością macek, jest miarą reakcji na karmienie. Test ten został zweryfikowany przy użyciu modelu głodu, w którym wygłodzone hydry wykazują zwiększoną reakcję na karmienie w porównaniu z hydrą karmioną codziennie.

Glutation powoduje u hydry zwijanie się czułków w kierunku otworu gębowego w celu pochwycenia zdobyczy. Takie zwijanie czułków przybliża ich końce apikalne do hypostomu. Skutkuje to zmniejszeniem rozpiętości czułków, czyli odległości liniowej między końcem apikalnym czułka a hypostomem (Rysunek 1). Względna rozpiętość czułków, czyli stosunek średniej rozpiętości czułków przed i po dodaniu glutationu, uśredniony dla wielu polipów, zmniejsza się w czasie. Względna rozpiętość czułków po dodaniu medium pozba...

Tutaj opisujemy prosty test do ilościowego określenia reakcji na karmienie w hydrze wywołanej przez zredukowaną formę glutationu. Ten test polega na zmierzeniu odległości między wierzchołkowym końcem macki a ustami hydry.

Pomiar reakcji żywieniowej indukowanej glutationem u Hydry

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

W tym filmie opisujemy metodę pomiaru zachowań żywieniowych w Hydrze. W odpowiedzi na zredukowaną formę glutationu, Hydra żywi się różnymi zwierzętami, nicieniami, skorupami i nowo wyklutymi rybami. Na zewnętrznej warstwie tego dwukomórkowego zwierzęcia znajdują się wyspecjalizowane komórki zwane nematocystami.Nematocysty mają wyzwalacze, które po aktywacji przez ruch ofiary w otaczającym płynie powodują rozładowanie nici naciągających. Kłujące nici są wkładane w zdobycz. Ranna ofiara uwalnia nadmiar glukozy.Ion hydro ma działanie chemiczne do wykrywania glutationu w otaczającej cieczy. To wyzwala zachowanie żywieniowe angażujące jego układ nerwowy. Zachowanie żywieniowe u Hydry obejmuje zwijanie macek, aby sprowadzić ofiarę w kierunku hiperskopu, otwarcia ust i pochłonięcia ofiary.W rzeczywistości dodanie przesytu jonów do otoczenia powoduje reakcję żerowania u hydry, nawet przy braku zdobyczy. Aby zrozumieć wzajemne oddziaływanie między odczuciami po chemii a układem nerwowym, musimy określić ilościowo zachowanie i stworzyć dokładne i wiarygodne pomiary. W kilku wcześniejszych doniesieniach czas, w którym usta pozostają otwarte w wodzie, jest traktowany jako miara reakcji na karmienie, ale obserwowanie czasu otwierania ust w polipach wodnych jest żmudne i podlega wahaniom wywołanym niekontrolowanymi parametrami, takimi jak orientacja jamy ustnej w wyniku obserwacji.Inna metoda kwantyfikacji zachowania opiera się na liczbie hydr w populacji wykazującej reakcję na karmienie. Ponieważ jednak reakcja na karmienie jest indywidualnym parametrem ilościowym, podejścia populacyjne są subiektywnymi zmianami spowodowanymi opinią indywidualnego obserwatora. Główną zaletą alternatywnej metody, którą tutaj opisujemy, jest to, że jest bardzo łatwa do wykonania i wysoce powtarzalna.Utrzymuj hydrę w temperaturze 18 stopni Celsjusza w świetle 12 godzin. 12-godzinne cykle ciemności w pożywce zamknij w szklanej misce i karm je codziennie emią w celu pomiaru reakcji na karmienie. Przenieś jeden dojrzały polip wodny do studzienki z 24-dołkową płytą, usuwając resztki pożywki ze studni za pomocą czopowa.Ułatwia to przechylenie płytki, wyrzucenie nadmiaru pożywki, a następnie natychmiastowe dodanie 500 mikrolitrów świeżej pożywki Przygotowanie roztworu glutationu. Dziewięciomikromolowy roztwór glutationu przygotowuje się przy użyciu pożywki wodnej. Pamiętaj, że roztwór glutationu jest podatny na utlenianie, więc zawsze używaj świeżo przygotowanego roztworu glutationu.Dla każdego eksperymentu przenieś płytkę na platformę obrazowania mikroskopu. Mając możliwość nagrywania obrazu, użyj ciemnego tła, tak aby zachowanie hydropolipa można było wyraźnie zobrazować na kontrastowym tle. Upewnij się, że polip znajduje się wzdłuż środkowej części studni, uchwycony obraz hydry w stanie zrelaksowanym.Będzie to obserwacja z zerowym punktem czasowym. Szybko dodaj dziewięć mikromolowych roztworów glutationu, aby osiągnąć końcowe stężenie trzech mikromolowych w studzience. Uruchom minutnik natychmiast po dodaniu roztworu glutationu i rób obrazy co 15 lub 30 sekund przez cztery do pięciu minut bez zmiany ustawień powiększenia.Do pomiarów używamy gim wersja druga, gim. Program do manipulacji obrazami GNU to oprogramowanie, które można bezpłatnie pobrać z Internetu. Otwórz każdy z przechwyconych obrazów w gim.Ten program ma narzędzie do pomiaru dostępne z narzędzi menu. Za pomocą tego narzędzia można zmierzyć odległość między hipers, stomią, wierzchołkowym końcem każdej z macek. Ta odległość nazywa się rozprzestrzenianiem się macek.Oblicz średni rozpiętość macek dla każdego polipa przed i po glutationie. Oblicz stosunek średniego rozrzutu macek w czasie zerowym. Wskaż to w każdym z kolejnych punktów czasowych.Nazwijmy to względnym rozpiętością macek. Wykonaj takie pomiary dla co najmniej 20 polipów na głód. Przenieś kilka polipów wodnych do osobnej szklanej miski i nie karm ich przez pięć dni.Polipy kontrolne należy karmić codziennie artią w dniu eksperymentu. Nakarm grupę kontrolną Hydry artią dla jednego R i użyj tej hydry do kolejnych eksperymentów. Zmierz reakcję żywieniową zagłodzonej hydry w porównaniu z hydrą z grupy kontrolnej metodą opisaną wcześniej w tym filmie, aby uniknąć jakiegokolwiek odchylenia spowodowanego czasem naprzemienności, pomiarów każdego z zagłodzonych i kontrolowanych polipów wodnych.Glutation powoduje, że hydra wykazuje zwijanie się macek w kierunku ust. Takie zwijanie się zbliża wierzchołkowe końce macek do burzy hipo. Powoduje to zmniejszenie odległości liniowej między wierzchołkowymi końcami macki a hiperburzą lub rozprzestrzenianiem się macek.Względna macka rozprzestrzeniła się po dodaniu pożywki. Brak glutationu zmniejsza się tylko przejściowo. Odbija się z powrotem do jednego po około minucie.Wiadomo, że głód powoduje poprawę zachowań żywieniowych indukowanych przez glutation. Rozprzestrzenianie się macki po minucie od dodania glutationu było znacznie niższe w grupie personelu w porównaniu z grupą nasyconą. Wszystkie zwierzęta używają czucia chemii do wykrywania pokarmu.Hydra wykorzystuje sygnał chemiczny w postaci glutationu uwalnianego od zranionej ofiary, ma prosty układ nerwowy bez żadnej struktury podobnej do mózgu, więc molekularny mechanizm odczuwania chemii i modulacja zależna od stanu karmienia również mogą być proste. Zrozumienie tego mechanizmu może rzucić światło na ewolucję regulacji żywienia u zwierząt wyższych. Jednak do tej pory w Haida nie opisano ani receptora, który może wiązać glutation, ani żadnych innych składników kaskady sygnalizacyjnej.Farmakologiczne inhibitory powszechnych szlaków sygnalizacji czuciowej chemos oraz zastosowanie zaawansowanych technik biologii molekularnej w celu zmiany ekspresji takich białek sygnałowych i receptora glutationowego mogą okazać się potężnymi narzędziami do zrozumienia molekularnego mechanizmu karmienia. Jednak w przypadku Hydry potrzebna jest wiarygodna miara zmienionych zachowań żywieniowych, aby zrozumieć zakres wszelkich modyfikacji spowodowanych takimi badaniami eksperymentalnymi. Tutaj przedstawiliśmy metodę, która jest nie tylko niezawodna, ale także łatwa do wykonania i wysoce powtarzalna.

measuring-glutathione-induced-feeding-response-in-hydra

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje metodę oceny neurotoksycznych efektów nanocząsteczek za pomocą mikrogleju. Przedstawiono w nim etapy aktywacji mikrogleju za pomocą nanocząstek, filtrowania kondycjonowanych pożywek w celu wyizolowania cytokin prozapalnych pochodzących z mikrogleju oraz testowania toksyczności neuronów podwzgórza za pomocą kondycjonowanych pożywek.

Określanie toksyczności neuronów wywołanej przez nanocząstki przy użyciu mikrogleju jako zastępczego bioczujnika

Ten artykuł pokaże, jak monitorować dynamikę glutaminy w żywych komórkach za pomocą FRET. Genetycznie kodowane czujniki umożliwiają monitorowanie cząsteczek biologicznych w czasie rzeczywistym w rozdzielczości subkomórkowej. Omówiony zostanie projekt eksperymentu, szczegóły techniczne warunków eksperymentalnych oraz rozważania dotyczące analiz poeksperymentalnych dla genetycznie kodowanych czujników glutaminy.

Obrazowanie strumienia glutaminy za pomocą genetycznie kodowanych czujników

Poprzez podwójne leczenie kolchicyną, toksyną pochodzenia roślinnego, która zabija dzielące się komórki, można wytworzyć wolną od nerwów Hydrę pospolitą. Te Hydry nie mogą się same odżywiać ani egzystować. W artykule opisano ulepszoną metodę długoterminowego utrzymania wolnej od nerwów Hydra vulgaris w laboratorium.

Wytwarzanie i długotrwałe utrzymywanie hydry wolnej od nerwów

Ilościowe testy spożycia żywności z farbowaną żywnością dostarczają solidnych i wydajnych środków do oceny motywacji do karmienia. Połączenie testu spożycia żywności z termogenetycznymi i optogenetycznymi badaniami przesiewowymi jest skutecznym podejściem do badania obwodów neuronalnych leżących u podstaw apetytu u dorosłych Drosophila melanogaster.

Połączenie ilościowych testów spożycia pokarmu i wymuszonej aktywacji neuronów w celu zbadania apetytu u Drosophila

Ten manuskrypt opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów fluorogenicznych w zastosowaniu obrazowania żywych komórek do badania stresu oksydacyjnego wywołanego ksenobiotykami. To eksperymentalne podejście oferuje niezrównaną rozdzielczość czasoprzestrzenną, czułość i swoistość, unikając jednocześnie wielu niedociągnięć konwencjonalnych metod stosowanych do wykrywania toksykologicznego stresu oksydacyjnego.

Obrazowe podejścia do oceny toksykologicznego stresu oksydacyjnego przy użyciu genetycznie kodowanych czujników fluorogennych

Ten artykuł przedstawia metodę badania transportu receptora glutaminianu (GluR) w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa. Wykorzystując podejście oparte na podawaniu przeciwciał do znakowania endogennych lub nadmiernie eksprymowanych receptorów w połączeniu z podejściami farmakologicznymi, metoda ta pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych regulujących ekspresję powierzchniową GluR poprzez modulację procesów internalizacji lub recyklingu.

Podejście do karmienia przeciwciałami w celu zbadania transportu receptora glutaminianu w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa

Opisany tutaj jest protokół, który umożliwia kolorymetryczną kwantyfikację ilości jedzenia spożywanego w określonym przedziale czasu przez larwy Drosophila melanogaster wystawione na działanie diety o różnej jakości makroskładników. Testy te są przeprowadzane w kontekście neuronalnego badania termogenetycznego.

Kwantyfikacja spożycia makroskładników odżywczych w termogenetycznym badaniu przesiewowym neuronów przy użyciu larw Drosophila

Ten artykuł opisuje protokół do określania różnic w podstawowym stanie redoks i redoks odpowiedzi na ostre perturbacje w pierwotnych neuronach hipokampa i kory mózgowej za pomocą konfokalnej mikroskopii na żywo. Protokół może być stosowany do innych typów komórek i mikroskopów przy minimalnych modyfikacjach.

Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego

Kwantyfikacja zarówno utlenionych, jak i zredukowanych form glutationu (odpowiednio GSSG i GSH) została osiągnięta dzięki zastosowaniu aldehydu ortoftaldehydu (OPA). OPA staje się wysoce fluorescencyjny po sprzęgnięciu z GSH, ale nie jest w stanie sprzęgnąć GSSG, dopóki nie zostanie zredukowany. W tym miejscu opisujemy test wieloparametryczny do ilościowego określenia obu przy użyciu kwantyfikacji białka w celu normalizacji.

Szybkie oznaczanie ilościowe utlenionych i zredukowanych form glutationu przy użyciu orto-ftaldehydu w hodowanych komórkach ssaków in vitro

W protokole tym opisano test do ilościowego określenia szybkości karmienia Caenorhabditis elegans w oparciu o pomiar klirensu bakterii w płynnej kulturze.

Kwantyfikacja spożycia pokarmu w Caenorhabditis elegans poprzez pomiar klirensu bakteryjnego

Za pomocą obrazowania time-lapse można śledzić cały proces regeneracji sferoidów Hydra. Ten protokół opisuje wytwarzanie sferoidów Hydra, omawia różne strategie mocowania i szczegółowo opisuje, jak wykonywać długotrwałą obrazowanie na żywo za pomocą mikroskopi konfokalnej z krążącym dyskiem, jak również mikroskopi fluorescencyjnego z arkuszem świetlnym.

Przygotowanie i obrazowanie na żywo regenerujących się kulek Hydra

Poznaj metodę pomiaru reakcji żywieniowej u Hydry indukowanej glutationem. Technika mierzy odległość między czubkiem macki a gębą, oferując wiarygodne i łatwe do powtórzenia wyniki w badaniach nad neurobiologią zachowań.

Pomiar reakcji żywieniowej indukowanej glutationem u Hydry

Przeglądaj więcej filmów