Name: Metoda chirurgiczna dostarczania genów za pośrednictwem wirusa do ucha wewnętrznego myszy przez błonę okrągłego okienka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj metodę chirurgiczną dostarczania wirusa do ślimaka myszy przez błonę okrągłego okienka. Technika minimalnie inwazyjna umożliwia terapię genową przy niskiej śmiertelności zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez grant R21 z National Institutes of Health oraz przez grant z Hearing Research, Incorporated.

UWAGA: Wszystkie procedury i obchodzenie się ze zwierzętami były zgodne z wytycznymi etycznymi NIH i zatwierdzonymi wymaganiami protokołu Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco.
1. Przygotowanie zwierzęcia do operacji
<ol>
	<li>Wykonuj zabiegi chirurgiczne w czystej, przeznaczonej do tego przestrzeni. Wszystkie narzędzia chirurgiczne należy sterylizować w autoklawie, przed zabiegiem wysterylizować sterylizatorem z kulkami szklanymi. 
	UWAGA: W tym protokole użyj myszy FVB w dniu poporodowym 10-12 (P10-12). Różne grupy wiekowe i szczepy myszy mogą być wykorzystane do zaspokojenia potrzeb konkretnego projektu. Myszy starsze niż P40 mogą być trudne, ponieważ kość bulla staje się twardsza.</li>
	<li>Znieczulenie myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny chlorowodorku ketaminy (100 mg / kg), chlorowodorku ksylazyny (10 mg / kg) i acepromazyny (2 mg / kg). Przygotowanie chirurgiczne należy rozpocząć dopiero wtedy, gdy zwierzę przestanie reagować na bolesne bodźce, takie jak szczypanie palców. W razie potrzeby podać dawkę przypominającą (jedną piątą pierwotnej dawki) koktajlu znieczulającego, aby przywrócić pierwotną płaszczyznę znieczulającą. 
	UWAGA: Zachowaj ostrożność na tym etapie, ponieważ większość śmiertelności obserwowanej w tym wieku jest spowodowana przedawkowaniem środka znieczulającego.</li>
	<li>Zakryj oczy zwierzęcia ochronną maścią okulistyczną, aby oczy były wilgotne podczas znieczulenia, tłumiąc odruch mrugania zwierzęcia.</li>
	<li>Umieść mysz z wyciągniętą szyją na poduszce grzewczej przez cały zabieg, aż mysz całkowicie się obudzi, aby zapobiec hipotermii po znieczuleniu.</li>
	<li>Ogol lewą okolicę zauszną maszynką do strzyżenia i zdezynfekuj 70% etanolem i jodowidonem przed manipulacją chirurgiczną.</li>
</ol>
2. Zabieg chirurgiczny i iniekcja wektorowa
<ol>
	<li>Użyj podejścia zausznego, aby odsłonić pęcherz bębenkowy. Naciąć tkankę podskórną małymi nożyczkami, aby odsłonić mięsień zauszny. Po cofnięciu tkanki tłuszczowej do tylnej strony nacięcia należy rozdzielić mięśnie po prawej i lewej stronie prostopadle do nacięcia, aby odsłonić kość skroniową. Upewnij się, że to nacięcie jest wystarczająco długie, aby wygodnie pracować z odpowiednią wizualizacją.</li>
	<li>Przedziurawić błonę bębenkową za pomocą igły 25 G i w razie potrzeby rozszerzyć otwór za pomocą kleszczy, odrywając kość do tyłu, aby umożliwić dostęp do podstawnego zwoju ślimaka, a następnie poszerzyć na tyle, aby uwidocznić tętnicę strzemiączkową i okrągłą błonę okienną (RWM).</li>
	<li>Delikatnie nakłuj RWM w środku za pomocą bokrzemianowej pipety kapilarnej. W tym momencie obserwuj wypływ płynu przez RWM; To normalne. Poczekaj, aż wypływ się ustabilizuje (wypływ płynu ze ślimaka osusza się sterylną bibułą filtracyjną). 
	UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas trzymania i przesuwania szklanej igły, aby perforacja RWM była jak najmniejsza. W zależności od używanego mikroskopu pipety należy trzymać za pomocą mikromanipulatora lub ręcznie za pomocą uchwytu na pipety.</li>
	<li>Przygotować pipety do wstrzykiwań za pomocą ściągacza do pipet w taki sam sposób, w jaki przygotowuje się pipety z zaciskiem krosowym. Upewnij się, że średnica końcówki jest duża (około 15 μm średnicy), aby pipetowanie wirusa było łatwe.</li>
	<li>Pobrać 1 do 2 μl AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP lub AAV2-GFP do pipety iniekcyjnej. Po ustabilizowaniu wypływu (5 do 10 minut), należy wstrzyknąć tę stałą objętość do błony bębenkowej scala przez ten sam otwór, który wcześniej wykonano w RWM.</li>
	<li>Po wyciągnięciu pipety szybko uszczelnij wnękę RW małym korkiem mięśniowym i zabezpiecz ją niewielką kroplą kleju tkankowego umieszczonego na mięśniu, aby uniknąć wycieku z okrągłego okienka. 
	UWAGA: Bardzo dobrze uszczelnij ten otwór po wyjęciu igły małym zatyczką mięśniową, aby zapobiec wyciekowi perylimfy ze ślimaka - ten krok ma kluczowe znaczenie dla zachowania słuchu. Brak całkowitego uszczelnienia RWM spowoduje z czasem utratę słuchu.</li>
	<li>Po iniekcji należy zakryć otwór w pęcherzu słuchowym tkanką tłuszczową, przywrócić mięśnie zauszne i tkankę tłuszczową do normalnego położenia oraz zszyć ranę warstwami szwem chromowym wchłanialnym 6-0 lub mniejszym.</li>
	<li>Zdezynfekuj ranę jodonem powidonu.</li>
</ol>
3. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Umieść myszy w ciepłej klatce i nie zostawiaj ich bez opieki, dopóki w pełni nie wyzdrowieją, a następnie przenieś je z powrotem z matką. Zaleca się wyjęcie samca z klatki przed umieszczeniem szczeniąt z powrotem z matką.</li>
	<li>Karprofen należy podawać podskórnie (2 mg/kg) w celu znieczulenia pooperacyjnego, a następnie co 24 godziny przez 3 dni, w celu opanowania stanu zapalnego i bólu. Codziennie monitoruj zwierzęta pod kątem oznak niepokoju, nieprawidłowej utraty wagi, bólu lub infekcji. Ogólnie rzecz biorąc, do 3dnia po operacji wszystkie myszy powinny zachowywać się normalnie. Jeśli po 3dniu u myszy pojawią się jakiekolwiek oznaki niepokoju lub choroby, rozważ eutanazję myszy zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.</li>
</ol>
4. Ocena funkcji ślimaka po dostarczeniu wirusa za pomocą nagrań słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (ABR)
UWAGA: Słuchowa reakcja pnia mózgu (ABR) to słuchowy potencjał wywołany wyodrębniony z trwającej aktywności elektrycznej w mózgu i rejestrowany przez elektrody umieszczone pod skórą głowy. Zwierzę jest stymulowane dźwiękiem. Uzyskany zapis składa się z pięciu fal, które odbijają aktywność elektryczną kolejnych punktów w szlaku słuchowym w ciągu pierwszych 10 ms po wystąpieniu bodźca słuchowego.
<ol>
	<li>Znieczulenie myszy należy przeprowadzić przez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny chlorowodorku ketaminy i chlorowodorku ksylazyny, jak opisano w punkcie 1.2 niniejszego protokołu, z wyjątkiem acepromazyny.</li>
	<li>Umieść mysz na poduszce grzewczej przez cały czas trwania badania słuchu, aż mysz całkowicie się obudzi, aby zapobiec hipotermii po znieczuleniu. 
	UWAGA: W tym eksperymencie użyj następujących bodźców dźwiękowych: klik (czas trwania 5 ms; częstotliwość prezentacji 31 Hz).</li>
	<li>Umieścić podskórne elektrody igłowe w wierzchołku, poniżej małżowiny usznej ucha lewego (odniesienie) i poniżej ucha przeciwległego (uziemienie) i rozpocząć rejestrację ABR zgodnie z wcześniejszym opisem w komorze dźwiękoszczelnej27,28. Nagrywaj przebiegi ABR w odstępach 5 dB od maksymalnej amplitudy.</li>
	<li>Progi ABR należy określić już po 4 dniach od dostarczenia wirusa 
	UWAGA: Próg definiuje się jako najniższy poziom bodźca, przy którym szczyty odpowiedzi dla fal I–V były wyraźnie i wielokrotnie obecne podczas oględzin.</li>
	<li>Zmierz falę I, aby przeanalizować aktywność nerwu ślimakowego. Najniższy poziom bodźca, który daje wykrywalny przebieg ABR, jest zdefiniowany jako próg.</li>
</ol>
5. Ekspresja białka transgenu ślimaka za pomocą immunofluorescencji
<ol>
	<li>Znieczulić myszy poprzez przedawkowanie dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszaniny chlorowodorku ketaminy i chlorowodorku ksylazyny, jak opisano w punkcie 1.2 niniejszego protokołu, z wyjątkiem przypadków braku acepromazyny.</li>
	<li>Odetnij głowę dopiero wtedy, gdy zwierzę nie będzie już reagować na bolesne bodźce, takie jak szczypanie palca.</li>
	<li>Wypreparuj ślimak i przeprowadź proces w celu uzyskania immunofluorescencji całej góry, jak opisano26. Szczegółowy protokół immunofluorescencji całego wierzchowca ślimaka przy użyciu przeciwciał anty-VGLUT3 i anty-miozyny 7a opisano w Akil i wsp., 201329.</li>
	<li>W przypadku znakowania GFP należy inkubować całe mocowania ślimaka przez noc w temperaturze 4 °C z króliczym przeciwciałem anty-GFP w rozcieńczeniu 1:250.</li>
	<li>Przepłukać ślimak dwukrotnie przez 10 minut za pomocą PBS, a następnie inkubować przez 2 godziny w koziej anty-króliczej IgG sprzężonej z Cy2 rozcieńczonej w stosunku 1:4,000 w PBS.</li>
	<li>Przepłucz ślimaki PBS dwa razy przez 10 minut i inkubuj je z DAPI przez 15 minut.</li>
	<li>Zamontuj ślimaki na szkiełkach podstawowych i obserwuj pod mikroskopem z konfokalną immunofluorescencją.</li>
</ol>

<ol><li>Jero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+delivery+through+an+intact+round+window+membrane+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse.</a> Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).</li>
<li>Nam, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+adeno-associated+virus+serotype+8%2C+a+gene+therapy+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector.</a> J. Virol. 81 (22), 12260-12271 (2007).</li>
<li>Ryan, A. F., Mullen, L. M., Doherty, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+targeting+for+cochlear+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Cellular targeting for cochlear gene therapy.</a> Adv Otorhinolaryngol. 66, 99-115 (2009).</li>
<li>Xia, L., Yin, S., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+ear+gene+trasfection+in+neonatal+mice+using+adeno-associate+viral+vwctor%3A+a+comparison+of+two+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inner ear gene trasfection in neonatal mice using adeno-associate viral vwctor: a comparison of two approaches.</a> PLoS One. 7 (8), e43218(2012).</li>
<li>Husseman, J., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+in+the+inner+ear+using+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22AdvOtorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors.</a> AdvOtorhinolaryngol. 66, 37-51 (2009).</li>
<li>Ballana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+specific+transduction+of+cochlear+supporting+cells+by+adeno-associated+virus+serotype+5%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Efficient and specific transduction of cochlear supporting cells by adeno-associated virus serotype 5.</a> Neurosci. Lett. 442 (2), 134-139 (2008).</li>
<li>Praetorius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+vectors+for+improved+gene+delivery+to+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Re%22%5BJournal%5D)">Adenoviral vectors for improved gene delivery to the inner ear.</a> Hear. Re. 248 (1-2), 31-38 (2009).</li>
<li>Kay, M. A., Glorioso, C. G., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+therapy%3A+the+art+of+turning+infectious+agents+into+vehicles+of+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics.</a> Nature Medicine. 7 (1), 33-40 (2001).</li>
<li>Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+and+Stem+Cell+Transplantation%3A+Strategies+for+Hearing+Restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy and Stem Cell Transplantation: Strategies for Hearing Restoration.</a> Adv Otorhinolaryngol. 66, Karger. Basel. 64-86 (2009).</li>
<li>Cooper, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+delivery+of+the+caspase+inhibitor+XIAP+protects+against+cisplatin+ototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Otol.+Neurotol%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated delivery of the caspase inhibitor XIAP protects against cisplatin ototoxicity.</a> Otol. Neurotol. 27 (4), 484-490 (2006).</li>
<li>Gratton, M. A., Salvi, R. J., Kamen, B. A., Saunders, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+cisplatin+and+noise+on+the+peripheral+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Interaction of cisplatin and noise on the peripheral auditory system.</a> Hear. Res. 50 (1-2), 211-223 (1990).</li>
<li>Lalwani, A. K., Walsh, B. J., Reilly, P. G., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+in+vivo+gene+therapy+for+hearing+disorders%3A+introduction+of+adeno-associated+virus+into+the+cochlea+of+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig.</a> Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).</li>
<li>Kesser, B. W., Hashisaki, G. T., Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Transfer+in+Human+Vestibular+Epithelia+and+the+Prospects+for+Inner+Ear+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Gene Transfer in Human Vestibular Epithelia and the Prospects for Inner Ear Gene Therapy.</a> Laryngoscope. 118 (5), 821-831 (2008).</li>
<li>Izumikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+hair+cell+replacement+and+hearing+improvement+by+Atoh1+gene+therapy+in+deaf+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals.</a> Nat. Med. 11 (3), 271-276 (2005).</li>
<li>Praetorius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovector-mediated+hair+cell+regeneration+is+affected%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Adenovector-mediated hair cell regeneration is affected.</a> Acta Otolaryngol. 130 (2), 215-222 (2009).</li>
<li>Friedman, L. M., Dror, A. A., Avraham, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+to+study+inner+ear+development+and+hereditary+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models to study inner ear development and hereditary hearing loss.</a> Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 609-631 (2007).</li>
<li>Chang, E. H., Van Camp, G., Smith, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+connexins+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ear+Hear%22%5BJournal%5D)">The role of connexins in human disease.</a> Ear Hear. 24 (4), 314-323 (2003).</li>
<li>Cohen-Salmon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation+of+connexin26+in+the+inner+ear+epithelial+gap+junction+network+causes+hearing+impairment+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death.</a> Curr. Biol. 12 (13), 1106-1111 (2002).</li>
<li>Nickel, R., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+and+connexins+in+the+inner+ear%3A+their+roles+in+homeostasis+and+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Otolaryngol.+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness.</a> Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 16 (5), 452-457 (2008).</li>
<li>Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv7-type+channel+currents+in+spiral+ganglion+neurons%3A+involvement+in+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss.</a> J. Biol. Chem. 285 (45), 34699-34707 (2010).</li>
<li>Leibovici, M., Safieddine, S., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+human+hereditary+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for human hereditary deafness.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 84, 385-429 (2008).</li>
<li>Dror, A. A., Avraham, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+loss%3A+mechanisms+revealed+by+genetics+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Hearing loss: mechanisms revealed by genetics and cell biology.</a> Annu. Rev. Genet. 43, 411-437 (2009).</li>
<li>Richardson, G. P., de Monvel, J. B., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+genetics+of+deafness+illuminates+auditory+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">How the genetics of deafness illuminates auditory physiology.</a> Annu. Rev. Physiol. 73, 311-334 (2011).</li>
<li>Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surgical+approach+appropriate+for+targeted+cochlear+gene+therapy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse.</a> Hearing Research. 151 (1-2), 106-114 (2001).</li>
<li>Seal, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorineural+deafness+and+seizures+in+mice+lacking+vesicular+glutamate+transporter+3%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3.</a> Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).</li>
<li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+hearing+in+the+VGLUT3+knockout+mouse+using+virally+mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy.</a> Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).</li>
<li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+deafness+and+altered+cochlear+innervation+in+knock-out+mice+lacking+prosaposin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Progressive deafness and altered cochlear innervation in knock-out mice lacking prosaposin.</a> J. Neurosci. 26 (5), 13076-13088 (2006).</li>
<li>Fremeau, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+glutamate+transporters+1+and+2+target+to+functionally+distinct+synaptic+release+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites.</a> Science. 304 (5678), 1815-1819 (2004).</li>
<li>Akil, O., Lustig, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Cochlear+Whole+Mount+Immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Mouse Cochlear Whole Mount Immunofluorescence.</a> Bio-protocol. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.bio-protocol.org/wenzhang.aspx?id=332">http://www.bio-protocol.org/wenzhang.aspx?id=332</a> (2013).</li>
<li>Kho, S. T., Pettis, R. M., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlea+microinjection+and+its+effects+upon+auditory+function+in+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Arch+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Cochlea microinjection and its effects upon auditory function in guinea pig.</a> Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).</li>
<li>Iizuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+in+vivo+delivery+of+transgene+via+adeno-associated+virus+into+supporting+cells+of+the+neonatal+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea.</a> Hum. Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).</li>
<li>Kilpatrick, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-mediated+gene+delivery+into+the+scala+media+of+the+normal+and+deafened+adult+mouse+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear.</a> Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).</li>
<li>Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+Ear+Transgene+Expressionafter+Adenoviral+Vector+Inoculation+in+the+Endolymphatic+Sac+Hum%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Inner Ear Transgene Expressionafter Adenoviral Vector Inoculation in the Endolymphatic Sac Hum.</a> Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).</li>
<li>Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+preservation+after+inner+ear+gene+therapy%3A+the+effect+of+vector+and+surgical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22ORL+J.+Otorhinolaryngol.+Relat.+Spec%22%5BJournal%5D)">Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach.</a> ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 65 (4), 211-214 (2003).</li>
<li>Carvalho, G. J., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cochleaostomy+and+intracochlear+infusion+on+auditory+brain+stem+response+threshold+in+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Otol%22%5BJournal%5D)">The effect of cochleaostomy and intracochlear infusion on auditory brain stem response threshold in the guinea pig.</a> Am. J. Otol. 20 (1), 87-90 (1999).</li>
<li>Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Functional+and+Structural+Outcome+of+Inner+Ear+Gene+Transfer+via+the+Vestibular+and+Cochlear+Fluids+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">The Functional and Structural Outcome of Inner Ear Gene Transfer via the Vestibular and Cochlear Fluids in Mice.</a> Mol. Ther. 4 (6), 575-585 (2001).</li>
<li>Lalwani, A. K., Han, J. J., Walsh, B. J., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+reporter+for+gene+transfer+studies+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a reporter for gene transfer studies in the cochlea.</a> Hear Res. 114 (1-2), 139-147 (1997).</li>
<li>Lalwani, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+cochlear+transgene+expression+mediated+by+recombinant+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus.</a> Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).</li>
<li>Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral-mediated+gene+transfer+into+guinea+pig+cochlear+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo.</a> Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).</li>
<li>Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+mediated+gene+transfer+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral mediated gene transfer in the cochlea.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).</li>
<li>Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracochlear+infusion+of+recombinant+adeno+associated+virus%3A+Analysis+of+its+dissemination+to+near+and+distant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Assoc.+Res.+Otolaryngol.+Abstr%22%5BJournal%5D)">Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues.</a> Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673(1998).</li>
<li>Konish, iM., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+guinea+pig+cochlea+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors.</a> J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).</li>
<li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy technikę, którą można zastosować w ślimakowej terapii genowej w celu przywrócenia lub uratowania prawidłowych funkcji słuchowych, które są upośledzone przez wadę genetyczną. Ponieważ jest to zazwyczaj atraumatyczne, takie podejście jest bezpieczne dla transferu genów ślimaka lub innych potencjalnych terapii molekularnych30. Opisano inne podejścia do terapii ślimakowej, w tym podejście brzuszne24, ślimakomię31,32 i wydalanie worka endolimfatycznego<...

Terapia genowa od dawna była sugerowana jako potencjalna metoda leczenia genetycznego ubytku słuchu, ale sukces w tej dziedzinie pozostał nieuchwytny1. Do tej pory dominowały metodologie oparte na wirusach ze względu na teoretyczną zdolność do celowania w określone typy komórek w stosunkowo niedostępnym ślimaku. Zarówno adenowirus (AV), jak i wirus związany z adenowirusem (AAV) były wykorzystywane do dostarczania genów ślimakowych. AAV są korzystne w ślimaku z wielu powodów. Są to wirusy z niedoborem replikacji i mogą skutecznie przenosić cząsteczki transgeniczne do różnych typów komórek, w tym neuronów, które są ważnym celem dla wielu przyczyn ubytku słuchu. Wnikanie AAV do komórki odbywa się za pośrednictwem specyficznych receptorów2; W związku z tym wybór konkretnego serotypu musi być zgodny z typami komórek, które mają być transdukowane. AAV mogą skutecznie transfekować komórki rzęsate3 i włączać się do genomu gospodarza, co skutkuje stabilną, długotrwałą ekspresją białka transgenicznego i zmianą fenotypową w komórce4. Chociaż niekoniecznie jest to korzystne w przypadku krótkoterminowych zastosowań, takich jak regeneracja komórek rzęsatych, długoterminowa ekspresja jest bardzo ważna dla stabilnego ratowania wad genetycznych. Ponieważ AAV nie są związane z żadną chorobą ani infekcją u ludzi i nie wykazują ototoksyczności5,6,7, są idealnym kandydatem do stosowania w terapii genowej w dziedzicznych formach ubytku słuchu8.
Transfer egzogennego materiału genetycznego do ucha wewnętrznego ssaków za pomocą wektorów wirusowych był badany w ciągu ostatniej dekady i wyłania się jako obiecująca technika leczenia zarówno genetycznych, jak i nabytych form ubytku słuchu9. Ślimak jest potencjalnie idealnym celem terapii genowej z kilku powodów: 1) jego mała objętość wymaga ograniczonej ilości potrzebnego wirusa; 2) jego względna izolacja od innych układów narządów ogranicza skutki uboczne; oraz 3) jego wypełnione płynem komory ułatwiają dostarczanie wirusa w całym labiryncie 10,11,12,13,14,15.
Mysie modele wrodzonej głuchoty pozwalają na wykorzystanie wielu metod badawczych do monitorowania rozwoju ucha wewnętrznego w systematyczny, powtarzalny sposób. Chociaż mały rozmiar ślimaka myszy stwarza pewne trudności chirurgiczne, mysz służy jako niezwykle ważny model w badaniach nad genetycznym ubytkiem słuchu, z kilkoma eksperymentalnymi zaletami w porównaniu zinnymi gatunkami. Modele mysie umożliwiają ocenę szeregu cech poprzez analizę powiązań genetycznych, gromadzenie szczegółowych obserwacji morfologicznych i symulację scenariuszy patogennych; W związku z tym są dobrymi kandydatami do terapii genowej za pośrednictwem wirusa. Szeroko zakrojone badania genetyczne na myszach w połączeniu z postępem technologicznym umożliwiły generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy w powtarzalny sposób w różnych laboratoriach17,18,19,20,21. Co więcej, istnieje wiele modeli zarówno nabytych, jak i dziedzicznych fenotypów ubytku słuchu u myszy, co pozwala na rygorystyczne testy w tym modelu zwierzęcym 22,23,24. Tak więc korekcja słuchu za pomocą terapii genowej za pośrednictwem wirusa w modelu mysim jest odpowiednim pierwszym krokiem w poszukiwaniu lekarstwa na choroby u ludzi.
Wcześniej pokazaliśmy, że transgeniczne myszy pozbawione pęcherzykowego transportera glutaminianu 3 (VGLUT3) rodzą się głuche z powodu braku uwalniania glutaminianu w synapsiewstęgowej IHC 25. Ponieważ mutacja ta nie prowadzi do pierwotnej degeneracji czuciowych komórek rzęsatych, te zmutowane myszy są potencjalnie doskonałym modelem do testowania ślimakowej terapii genowej pod kątem wrodzonego ubytku słuchu.
Do tej pory opisano wiele technik dostarczania wirusa w terapii genowej ślimaka, w tym dyfuzję przez błonę z okrągłym okienkiem, iniekcję przez błonę z okrągłym okienkiem i dostarczanie przez ślimakotomię. Istnieją potencjalne zalety i wady każdego z tych podejść9.
Tutaj opisujemy metodę chirurgiczną dostarczania genu za pośrednictwem wirusa do ucha wewnętrznego myszy VGLUT3 KO przez okrągłą błonę okienną (RWM). Metoda iniekcji RWM po usznych jest mało inwazyjna z doskonałym zachowaniem słuchu i jest stosunkowo szybka. Jak już wcześniej publikowaliśmy, w celu przywrócenia słuchu w tym modelu mysim, wektor AAV1 przenoszący gen VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) został wprowadzony do ślimaka tych głuchych myszy w 12 dniu po urodzeniu (P!@), co spowodowało przywrócenie słuchu26. Słuch u myszy VGLUT3 KO zweryfikowano za pomocą słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (ABR), podczas gdy ekspresję białka transgenu zweryfikowano za pomocą immunofluorescencji (IF). Metodologia ta pokazuje zatem, że terapia genowa za pośrednictwem wirusa może skorygować wadę genetyczną, która w przeciwnym razie skutkowałaby głuchotą.

<table><tbody><tr><td>Ketamina</td><td>Butler Schein</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>AnaSed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acepromazyna</td><td>Dostarczane przez UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwbólowe karprofen</td><td>Dostarczane przez UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Betadine Puredue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>deksametazon maść okulistyczna (TobraDex)</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Braintree scientific, inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igła 25G</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>borokrzemianowa pipeta kapilarna</td><td>World precision instruments, inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Szew PDS*plus Antybakteryjny</td><td>Ethicon</td><td>PDP149</td><td></td></tr><tr><td>Klej tkankowy (Vetcode)</td><td>Butler Schein</td><td>31477</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Mikropipeta Leica</td><td></td><td>MZ95</td></tr><tr><td>płonąca/brązowa&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Ściągacz Sutter Instrument Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Model P-97&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>System TDT BioSig III&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; Technologie</td><td></td><td></td> Tuckera-Davisa</tr></tbody></table>

metoda chirurgiczna dostarczania genów za pośrednictwem wirusa do ucha wewnętrznego myszy przez błonę okrągłego okienka

Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

Terapia genowa, stosowana w celu odzyskania funkcjonalności po głuchocie odbiorczej, obiecuje lepsze zrozumienie leżących u podstaw molekularnych i genetycznych mechanizmów, które przyczyniają się do utraty słuchu. Wprowadzenie wektorów do ucha wewnętrznego musi odbywać się w taki sposób, aby czynnik był szeroko rozprowadzany w całym ślimaku, jednocześnie minimalizując uszkodzenia istniejących struktur. Ten manuskrypt opisuje pouszne podejście chirurgiczne, które można zastosować w terapii ślimakowej myszy przy użyciu dostarczania molekularnego, farmakologicznego i wirusowego myszom po urodzeniu w 10. dniu i starszym przez błonę okrągłego okienka (RWM). To chirurgiczne podejście umożliwia szybkie i bezpośrednie dostarczenie do błony bębenkowej scala, jednocześnie minimalizując utratę krwi i unikając śmiertelności zwierząt. Technika ta wiąże się z nieznacznym lub żadnym uszkodzeniem podstawowych struktur ucha wewnętrznego i środkowego, a także mięśni szyi, przy jednoczesnym całkowitym zachowaniu słuchu. Aby zademonstrować skuteczność tej techniki chirurgicznej, myszy z nokautem pęcherzykowego transportera glutaminianu 3 (VGLUT3 KO) zostaną wykorzystane jako przykład mysiego modelu wrodzonej głuchoty, który odzyskuje słuch po dostarczeniu VGLUT3 do ucha wewnętrznego za pomocą wirusa związanego z adenowirusem (AAV-1).

Aby zweryfikować cechy techniczne i użyteczność podejścia zausznego w molekularnej terapii ślimaka, do ucha wewnętrznego myszy w wieku P10-12 podano AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP oraz AAV2-GFP poprzez błonę okrągłą (RWM). Podejście to wykazuje skuteczną ekspresję transgenu w wewnętrznych komórkach słuchowych (IHC) (VGLUT3 Rysunek 1 oraz GFP Rysunek 2 i GFP Rysunek 3A), zewnętrznych komórkach słuchowych (OHC) (GFP Rysunek 2) oraz komórkach podporowych (GFP <stron...

Opisane podejście chirurgiczne po usznym pozwala na szybkie i bezpośrednie dostarczenie do błony bębenkowej ślimaka myszy, jednocześnie minimalizując utratę krwi i śmiertelność zwierząt. Metoda ta może być stosowana w terapii ślimakowej z wykorzystaniem podawania molekularnego, farmakologicznego i wirusowego myszom po urodzeniu przez błonę okienną okrągłą.

Metoda chirurgiczna dostarczania genów za pośrednictwem wirusa do ucha wewnętrznego myszy przez błonę okrągłego okienka

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...

Ogólnym celem tej procedury jest opisanie pousznego podejścia chirurgicznego, które umożliwia szybkie i bezpośrednie dostarczenie wirusa do myszy Cochlear Scale S timi przez okrągłą błonę okienną. Osiąga się to poprzez uprzednie odsłonięcie pęcherza bębenkowego. W drugim kroku tkanka jest perforowana i wizualizowane są tętnice edia i błona okienna okrągła.Okrągła membrana okienna jest następnie nakłuwana, a wirus jest wstrzykiwany do sponu. W ostatnim kroku otwór jest uszczelniany. Ostatecznie ekspresję białka transgenu i odzyskanie słuchu zwierzęcia można ocenić odpowiednio za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej i pomiaru słuchowej odpowiedzi pnia mózgu.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak coch, stomia i podejście brzuszne, jest to, że wstrzyknięcie błony z okrągłym okienkiem jest minimalnie inwazyjne, stosunkowo szybkie, pozwala na wstrzyknięcia o większej objętości i ułatwia szeroką transfekcję różnych komórek w całym ślimaku. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej techniki, będą miały trudności, ponieważ procedura jest w dużym stopniu zależna od dokładnego zrozumienia anatomii ślimaka. Po potwierdzeniu znieczulenia palcem u nogi, uszczypnij ogolić lewy obszar pouszny i zdezynfekuj skórę dnia poporodowego, 10 do 12 myszy 70% etanolem i jodopowidonem.Następnie zakryj oczy ochronną maścią okulistyczną i ustaw zwierzę z wyciągniętą szyją na poduszce grzewczej. Po zakończeniu przygotowania chirurgicznego naciąć tkankę podskórną małymi nożyczkami, aby odsłonić mięsień zauszny. Po cofnięciu tkanki tłuszczowej do tylnej strony nacięcia należy oddzielić mięśnie po prawej i lewej stronie prostopadłej do nacięcia.Aby odsłonić kość skroniową, użyj igły o rozmiarze 25 do perforacji pęcherza bębenkowego, odrywając kość z powrotem kleszczami, jeśli to konieczne, aby rozszerzyć otwór i umożliwić dostęp do podstawnego zwoju ślimaka. Następnie poszerz otwór na tyle, aby umożliwić wizualizację tętnicy stożkowej i okrągłej błony okiennej. Delikatnie nakłuć okrągłą membranę okienną pośrodku pipetą kapilarną z krzemianu zadzioru.Osuszyć okrągłą membranę okienną sterylną bibułą filtracyjną. Następnie odczekaj od pięciu do 10 minut, aż płyn e strumień ustabilizuje się Na tym etapie. Należy zachować ostrożność podczas trzymania i przesuwania pipety, aby perforacja membrany z okrągłym okienkiem była jak najmniejsza.W zależności od zastosowania mikroskopu, pipeta może być trzymana w ręku lub za pomocą manipulatora mikromów. Jak widać tutaj, pipetę trzymamy ręcznie, ponieważ mikroskop znajduje się zbyt blisko myszy, aby umożliwić zastosowanie mikromanipulatora. Teraz należy pobrać od jednego do dwóch mikrolitrów wirusa do wyciągniętej szklanej pipety z końcówką o średnicy 15 mikrometrów i wprowadzić wirusa do skali tymonu przez ten sam otwór, który wcześniej wykonano w okrągłej membranie okiennej.Następnie wyciągnij pipetę i szybko uszczelnij okrągłą wnękę okienną małą zatyczką mięśniową, zabezpieczając ją niewielką kroplą kleju tkankowego. Zakryj otwór w pęcherzu słuchowym tkanką tłuszczową i przywróć mięśnie postuszne i tkankę tłuszczową do ich normalnej pozycji. Następnie, za pomocą wchłanialnego szwu chromowego 6,0 lub mniejszego, zamknij ranę i zdezynfekuj miejsce nacięcia jodowidonem.Następnie umieść mysz w ciepłej klatce, zwracając pop matce po pełnym wyzdrowieniu z codziennym monitorowaniem. Aby ocenić czynność ślimaka już cztery dni po dostarczeniu wirusa, umieść transfekowane zwierzę w sedacji na poduszce grzewczej, a następnie umieść podskórne elektrody igłowe w wierzchołku poniżej małżowiny usznej lewego ucha i poniżej ucha przeciwległego. Na koniec zacznij rejestrować słuchowe reakcje pnia mózgu lub BR w dźwiękoszczelnej komorze, jak opisano wcześniej, mierząc falę pierwszą, aby przeanalizować aktywność nerwu ślimakowego, jak widać w mocowaniu otworu ślimakowego.Podejście to wykazuje udaną ekspresję transgenu w wewnętrznych komórkach rzęsatych, zewnętrznych komórkach rzęsatych i komórkach podporowych bez znaczącego uszkodzenia narządu OR T, że w otworze ślimaka można zaobserwować różne typy komórek wyrażających GFP. Mount wykazuje, że wybór serotypu wirusa związanego z adenowirusem musi być zgodny z typami komórek, które mają być transdukowane. Liczba transfekowanych komórek różni się w zależności od stężenia i objętości wstrzykniętego wirusa.W tym przypadku wzrost z 0,6 do jednego mikrolitra spowodował wzrost liczby komórek transfekowanych do poziomu porównywalnego z dziką ekspresją transgenu pośladków typu V przywrócono u myszy KO, którym wstrzyknięto KO, jak widać na tych obrazach tutaj, wykazano wpływ dostarczania wirusa V GL 3 przez błonę okienną zauszną do ucha wewnętrznego myszy z nokautem V gl three na ratunek słuchowy, jak widać w wykresu. Ślady A BR zostały przywrócone u trzech uratowanych myszy nokautujących VLU, osiągając progi porównywalne do tych obserwowanych u myszy typu dzikiego. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby nie spieszyć się na każdym kroku, aby zapobiec uszkodzeniu struktur ucha wewnętrznego i środkowego, a także mięśni szyi.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać podejście pooperacyjne w celu dostarczenia eksperymentalnych terapii wirusowych farmakologicznych farmakologicznych do miski szkieletu MAs przez okrągłą błonę wiatrową.

surgical-method-for-virally-mediated-gene-delivery-to-mouse-inner-ear

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wewnętrzne ucho myszy jest organem zmysłowym pochodzącym z placody, którego program rozwojowy realizowany jest podczas ciąży. Opisujemy technikę transferu genu in utero, składającą się z trzech etapów: brzusznej laparotomii myszy, mikrowstrzyknięcia do macicy oraz elektroporacji in vivo. Wykorzystujemy cyfrową mikroskopię wideo, aby zademonstrować kluczowe eksperymentalne techniki embriologiczne.

Transfer genów do rozwijającego się ucha wewnętrznego myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Źródło: Kozin, E. D., et.al. Bezpośrednia wizualizacja mysiego grzbietowego jądra ślimaka w celu optogenetycznej stymulacji szlaku słuchowego. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje transfer genów za pośrednictwem wirusa do grzbietowego jądra ślimakowego myszy (DCN) w celu umożliwienia stymulacji słuchowej wywołanej światłem. Wektor wirusowy kodujący opsynę, światłoczuły kanał jonowy, jest wstrzykiwany do DCN po kraniotomii i aspiracji móżdżku w celu uzyskania bezpośredniego dostępu. Ekspresja...

Transfer genów za pośrednictwem wirusa do grzbietowego jądra ślimaka myszy w celu stymulacji słuchowej wywołanej światłem

Ten film prezentuje kantostomię, procedurę, która umożliwia miejscowe dostarczanie leku do ucha wewnętrznego myszy przez kanał półkolisty przy minimalnym uszkodzeniu słuchu i funkcji przedsionkowej. Metoda ta umożliwia inokulację wektorów wirusowych, farmaceutyków i małych cząsteczek do ucha wewnętrznego myszy.

Kanatotomia do miejscowego dostarczania leku do ucha wewnętrznego dorosłej myszy

Źródło: Akil, O., et al., Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje procedurę dostarczania genu terapeutycznego do ucha wewnętrznego szczeniaka myszy z genetycznie wywołanym ubytkiem słuchu. Za pomocą wektora wirusowego związanego z adenowirusem (AAV), gen jest wstrzykiwany przez okrągłą błonę okienną, umożliwiając cząsteczkom wirusa wniknięcie do komórek rzęsatych, przywrócenie produkcji...

Terapia genowa oparta na wektorach wirusowych w celu przywrócenia słuchu w modelu mysim

Istnieją różne metody wprowadzania czynników ototoksycznych do ślimaków modeli zwierzęcych. Przedstawiono protokół chirurgiczny dostarczania środków ototoksycznych do wnęki okrągłego okna. Procedura jest niezawodna, tworzy ukierunkowane zmiany wewnątrzślimakowe i pozwala uniknąć mechanicznych uszkodzeń mikroarchitektury. Możliwe jest badanie samonaprawy/regeneracji ślimaka.

Mysie podejście oparte na okrągłym oknie do dostarczania czynników ototoksycznych: szybka i niezawodna technika indukowania zwyrodnienia komórek ślimakowych

Opisano tutaj i porównano dwa podejścia mikrochirurgiczne do miejscowego dostarczania leków do ucha wewnętrznego pod względem wpływu na parametry słuchu, cytoarchitekturę ślimaka i ekspresję markerów stanu zapalnego.

Badanie porównawcze metod dostarczania leków ukierunkowanych do ucha wewnętrznego myszy: pęcherzyk a wstrzyknięcie przezbębenkowe

Opisujemy metodę chirurgiczną polegającą na podawaniu leków do ucha wewnętrznego naczelnego, marmozety zwyczajnej (Callithrix jacchus), przez okrągłą błonę okienną.

Zabieg chirurgiczny polegający na podawaniu leków do ucha wewnętrznego u marmozety zwyczajnej (Callithrix jacchus) z rzędu naczelnych (Callithrix jacchus)

W tym badaniu opisujemy dostęp do tylnego kanału półkolistego jako niezawodną metodę dostarczania genów do ucha wewnętrznego u noworodków myszy. Pokazujemy, że dostarczenie genu przez tylny kanał półkolisty jest w stanie przeniknąć do całego ucha wewnętrznego.

Dostęp do tylnego kanału półkolistego do dostarczania genów do ucha wewnętrznego u nowonarodzonych myszy

Tutaj opisujemy procedurę kanasitomii, która umożliwia miejscowe dostarczanie leku do uszu wewnętrznych dorosłych i noworodków myszy przez kanał półkolisty przy minimalnym uszkodzeniu słuchu i funkcji przedsionkowej. Ta metoda może być stosowana do inokulacji wektorów wirusowych, farmaceutyków i małych cząsteczek w uchu wewnętrznym myszy.

Kanostomia jako chirurgiczne podejście do miejscowego dostarczania leków do uszu wewnętrznego myszy dorosłych i noworodków

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Poznaj metodę chirurgiczną dostarczania wirusa do ślimaka myszy przez błonę okrągłego okienka. Technika minimalnie inwazyjna umożliwia terapię genową przy niskiej śmiertelności zwierząt.

Metoda chirurgiczna dostarczania genów za pośrednictwem wirusa do ucha wewnętrznego myszy przez błonę okrągłego okienka

Przeglądaj więcej filmów