Protokół badania wygaszania uwarunkowanego strachu u naturalnie jeżdżących na rowerze samic szczurów

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie wpływu hormonów gonadalnych na zachowania związane z wygaszaniem strachu u kobiet podczas niskich i wysokich stanów hormonalnych cyklu Esra oraz rolę estradiolu, gdy jest on podawany egzogennie. Osiąga się to poprzez uprzednie monitorowanie cyklu ESRA dorosłych samic szczurów i określenie, w której fazie się znajdują przed eksperymentem. Następnie zwierzęta, które są w fazie rui, umieszcza się w przydzielonych im komorach w celu zamieszkania i warunkowania strachu.

Następnego dnia, gdy zwierzęta są w rui, samicom wstrzykuje się estradiol lub nośnik i przechodzą trening wygaszania strachu. Wreszcie, trzeciego dnia, zwierzęta umieszcza się z powrotem w tej samej komorze, aby przetestować przypomnienie sobie sesji wymierania dzień wcześniej. Ostatecznie, wymaz z pochwy w celu identyfikacji EST strase pozwala badaczom manipulować naturalnymi wahaniami hormonów gonadalnych w celu zbadania ich wpływu na pamięć wygaszania strachu.

Protokół ten może być wykorzystany do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie różnic płciowych, takie jak: czy procesy wygaszania strachu są różne u mężczyzn i kobiet? A jeśli tak, to jakie są mechanizmy hormonalne i neurobiologiczne spełniające te różnice? Główną zaletą tego protokołu jest to, że może on pomóc w promowaniu badań nad samicami w wymieraniu strachu poprzez dzielenie się metodami, aby to zrobić.

Badacze, którzy nie mają doświadczenia w tych metodach, często mają trudności z wiarygodnym monitorowaniem cyklu esera, ponieważ procedura może być czasochłonna i w dużym stopniu zależeć od właściwej techniki. Implikacje tych badań mogą przyczynić się do opracowania specyficznych dla płci opcji leczenia zaburzeń związanych ze strachem i lękiem. Może to być ważne, biorąc pod uwagę, że kobiety są dwa razy bardziej narażone na rozwój tych psychopatologii niż mężczyźni.

Lisa man, postdoc w laboratorium, a także tajny opiekun. Asystent naukowy w laboratorium pokaże procedurę pobierania próbek w celu monitorowania cyklu rui. Po przygotowaniu 0,9% roztworu soli fizjologicznej zanurz aplikator z bawełnianą końcówką w płynie i użyj ręcznika papierowego, aby osuszyć końcówkę nadmiaru roztworu, trzymając ogon szczura do góry i uważając, aby nie powodować niepokoju.

Delikatnie włóż bawełnianą końcówkę do niezbyt głębokiego kanału pochwy i zwiń ją wokół ścian, aby szybko uchwycić luźne komórki pochwy. Wyjmując końcówkę, nie przenosząc zbyt dużej ilości płynu, delikatnie przetocz końcówkę aplikatora na wstępnie oznaczone szkiełko mikroskopowe, upewniając się, że próbka przenosi się na szkiełko. Pobieraj próbki przez co najmniej dwa pełne cykle i przenoś je przez kilka kolejnych dni na jednym szkiełku, aby móc lepiej śledzić i identyfikować dzienne dodatki EST.

Zmiany faz Po wyschnięciu szkiełek zanurz je 10 razy w utrwalaczu, a następnie 10 razy w roztworze barwiącym. I na koniec pięć razy w roztworze przeciwbarwiącym. Delikatnie spłucz wodą.

Pozwól szkiełkom całkowicie wyschnąć na powietrzu przed obejrzeniem pod mikroskopem przed rozpoczęciem eksperymentu kondycjonowania, wstępnie wystawij samice na działanie komór kondycjonujących przy włączonym świetle domowym przez 20 do 30 minut dziennie przez trzy dni, aby umożliwić im aklimatyzację w środowisku. Przypisz pudełko, w którym są wstępnie wystawieni, jako ich komorę do badania. Dokładnie wyczyść pudełka między sesjami i zwierzętami, aby usunąć zapachy, ponieważ mogą one wpływać na zachowanie i cykl stresu EST.

Po sprawdzeniu, że zwierzęta znajdują się w fazie rui dodatkowego cyklu EST, rozpocznij fazę kondycjonowania habituacji. Wykonaj podstawowe pomiary zamrożenia w kolorze pret tone przed pierwszym bodźcem tonalnym, mierząc sekundy, w których zwierzę spędza telefon komórkowy podczas bodźca. W przedziale czasu nieobecności oblicz procentowy wynik zamrożenia, dzieląc sekundę spędzoną w bezruchu przez czas trwania próby.

Aby przeprowadzić trening wymierania podczas fazy rui ME, należy kondycjonować szczury w ostatnim dniu ESTRO, zgodnie z wymazem. Umieścić zwierzęta w komorze kondycjonującej i przeprowadzić samodzielną próbę przyzwyczajenia się do CS. Wywołuje sygnał CS na 30 sekund.

Po odczekaniu średnio trzech minut przed następną próbą, powtórz próbę samego CS jeszcze cztery razy, w sumie pięć prób przed kondycjonowaniem. Podłącz podłogę z siatką przeciwwstrząsową stopy do generatora stymulacji elektrycznej. Użyj poziomu stymulacji od 0,5 do 0,6 miliampera jako bodźca bezwarunkowego lub US i tonu czterech kiloherców 80 decybeli jako CS bezpośrednio po sesji habituacji.

Rozpocznij sparowane amerykańskie próby warunkowania strachu CS od przedstawienia 32. tonu CS, po którym następuje 0,5-sekundowy wstrząs amerykański oddzielony około trzyminutowym interwałem między próbami. Powtórz sparowaną próbę jeszcze sześć razy pod koniec sesji kondycjonowania. Zwierzęta należy umieścić w ich domowych klatkach i w obiekcie dla zwierząt do następnego dnia drugiego dnia.

Po pobraniu wymazu i zidentyfikowaniu fazy rujowej ME dla wszystkich zwierząt, które przeszły pierwszy dzień protokołu, przygotuj wystarczającą ilość estradiolu w oleju sezamowym lub 0,9% soli fizjologicznej dla każdego zwierzęcia, aby otrzymać dawkę 15 mikrogramów na kilogram w celu podania hormonu podskórnie. Delikatnie unieść luźną skórę między łopatką przy szyi i włożyć strzykawkę do trójkąta utworzonego przez fałdy skórne. 30 minut po otrzymaniu zastrzyków należy umieścić zwierzęta w komorach kondycjonujących i rozpocząć trening wygaszania, wykonując samodzielnie 20 CS.

Próby, z których każda składała się z 32. tonu o natężeniu 40 kiloherców, 80 decybeli, z około trzyminutową przerwą między próbami 24 godziny później. Trzeciego dnia pobierz wymaz od zwierząt, które ukończyły sesje w pierwszym i drugim dniu po umieszczeniu zwierząt w przydzielonych im komorach kondycjonacyjnych. Rozpocznij sesję przypominania o wyginięciu od przeprowadzenia trzech prób samych Cs z około trzyminutową przerwą między próbami po zakończeniu sesji przywoławczej, wróć zwierzęta do ich domowych klatek i przeanalizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym w tym protokole wygaszania strachu.

Zwierzęta, które dobrze wygasły i zachowały pamięć o treningu wymierania, wykazywały niski poziom strachu w ostatnim dniu testów behawioralnych podczas przypominania o wyginięciu. Jak wykazano tutaj, samce i samice szczurów nie różnią się znacząco pod względem ekspresji uwarunkowanego strachu. Podczas każdej fazy różnica płci staje się widoczna, gdy zwierzęta są analizowane oddzielnie jako grupy fazy ES o wysokim i niskim poziomie estrogenu.

Ten wykres pokazuje wpływ fazy estro na pamięć wygaszania strachu, samice szczurów, które przechodzą trening wymierania podczas fazy niskiego poziomu estrogenu w dodatkowym cyklu EST. Nie przypominaj sobie wspomnień wyginięcia z trzeciego dnia, tak samo jak tych wyszkolonych w PROE. Jednakże, gdy samicom metri wstrzykuje się podskórnie dawkę 15 mikrogramów na kilogram estradiolu przed wyginięciem, uczenie się konsolidacji strachu, pamięć wygaszania wydaje się być wzmocniona, o czym świadczy niskie zamrożenie podczas przypominania o wyginięciu.

Dlatego dane te wskazują, że hormony gonadalne mogą modulować przypominanie o wygaszaniu strachu, a także pośredniczyć w różnicach płci w uwarunkowanych zachowaniach związanych z wygaszaniem strachu. Dodatkowe procedury, takie jak chirurgia kaniulacji i immunohistochemia, mogą być wykonywane w połączeniu z opisaną tutaj metodą, aby odpowiedzieć na pytania takie jak, gdzie estradiol działa w mózgu, aby modulować strach, wygaszanie, konsolidację pamięci i jak estradiol zmienia aktywność neuronów w tych regionach? Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć jasne zrozumienie, jak badać naturalny recykling samic szczurów i wpływ estradiolu w wyraźnym rozszerzeniu.