Name: Protokół badania wygaszania uwarunkowanego strachu u naturalnie jeżdżących na rowerze samic szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Poznaj protokół badania wygaszania uwarunkowanego strachu u samic szczurów z monitorowaniem cyklu estralnego i podawaniem estradiolu. Ta metoda pozwala badać wpływ hormonów płciowych na pamięć i zachowanie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Mohammed R. Milad jest wspierany przez grant NIMH R01 MH097880 oraz fundusze instytucjonalne z Wydziału Psychiatrii MGH.

UWAGA: Wszystkie procedury w tym protokole zostały zatwierdzone przez Podkomitet ds. Badań nad Zwierzętami, który służy jako Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami (IACUC) dla Massachusetts General Hospital i są zgodne z wytycznymi National Institutes of Health.
1. Procedura trzymania i obchodzenia się ze zwierzętami
<ol>
	<li>Po przyjeździe dorosłe samice szczurów Sprague Dawley w wieku około 8-10 tygodni (o wadze 200-225 g) umieszcza się w grupach 3-4 calowych plastikowych pojemników z ściółką z wiórów drzewnych. Utrzymuj je na diecie z dostępem ad libitum do karmy i wody oraz 12-godzinnym cyklem światła/ciemności. Szczury należy pozostawić do zaaklimatyzowania się w warunkach utrzymania zwierząt i pomieszczeniach dla zwierząt przez co najmniej 1 tydzień. 
	UWAGA: Wszystkie procedury opisane w tym manuskrypcie są przeprowadzane w trakcie cyklu świetlnego.</li>
	<li>Po tym okresie aklimatyzacji należy obchodzić się ze wszystkimi zwierzętami przez 5 minut przez 2-3 dni. Prawidłowo podnoś szczury pojedynczo (podpierając się tułowiem, a nie ogonem), trzymaj je bezpiecznie i głaszcz w tym czasie. Zajmij się zwierzętami, które wydają się bardziej zestresowane, nerwowe lub niespokojne przez dłuższy czas. Zrób to, aby zminimalizować stres związany z obsługą, który może mieć wpływ na następujące kroki w tym protokole. 
	UWAGA: Liczba dni i ilość czasu zajmowania się zwierzętami może się różnić w zależności od laboratorium; Powinny one jednak być spójne między eksperymentami w tym samym laboratorium.</li>
</ol>
2. Monitorowanie cyklu rujowego: procedura rozmazywania i barwienia wymazu z pochwy
<ol>
	<li>Przygotować 0,9% roztwór soli fizjologicznej (chlorek sodu rozpuszczony w wodzie destylowanej). Zwilż aplikator z bawełnianą końcówką w tym roztworze. Osusz końcówkę ręcznikiem papierowym, aby uniknąć przesycenia, które może prowadzić do nieodpowiedniego pobrania próbki lub utraty komórek. Trzymając ogon do góry, z dala od otworu pochwy, delikatnie włóż bawełnianą końcówkę do kanału pochwy i zwiń wokół ścian, aby uchwycić luźne komórki pochwy.</li>
	<li>Jeśli zwierzę oddaje mocz na bawełnianą końcówkę, wymień ją na nową, ponieważ zanieczyszczenie moczu utrudni identyfikację fazy. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie powodować niepokoju u zwierzęcia podczas tej procedury, ponieważ narażenie na stres zakłóci cykl rujowy. Podczas pobierania wymazu staraj się osiągnąć szybkie wprowadzanie i wyjmowanie, które nie jest zbyt głębokie, aby zminimalizować dodatkową stymulację szyjki macicy, co może wywołać ciążę rzekomą. 
	UWAGA: Ciążę rzekomą można zidentyfikować jako acykliczny cykl rujowy, który zwykle trwa około 12 dni, tj. kolejne dni diestrus25.</li>
	<li>Ostrożnie zdejmij końcówkę aplikatora i zwiń ją na wstępnie oznaczone szkiełko mikroskopowe. Unikaj zbyt mocnego dociskania, ponieważ zbyt duża ilość płynu na szkiełku może utrudnić identyfikację fazy po wyschnięciu. 
	UWAGA: Jedna szkiełko może zawierać kilka dni dla każdego zwierzęcia, chociaż można to zrobić zgodnie z indywidualnymi preferencjami.</li>
	<li>Upewnij się, że próbka została przeniesiona na szkiełko. Zbieraj próbki przez kilka kolejnych dni na jednym szkiełku, aby móc lepiej śledzić i identyfikować dzienne zmiany faz rujowych. 
	UWAGA: Jeśli to możliwe, idealnie byłoby, gdyby osoby pobierające próbki pozostały takie same dla wszystkich zwierząt.</li>
	<li>Po wyschnięciu szkiełka rozpocznij protokół barwienia w celu identyfikacji fazy. Korzystając z zestawu do barwienia (patrz tabela materiałów), zanurz szkiełka 10 razy w utrwalaczu (jasnoniebieski), 10 razy w roztworze bejcy (różowy) i 5 razy w roztworze przeciwplamiającym (fioletowy). Delikatnie spłucz szkiełka pod bieżącą wodą. Pozostaw szkiełka całkowicie do wyschnięcia na powietrzu przed obejrzeniem pod mikroskopem. 
	UWAGA: Typowy 4-5-dniowy cykl rujowy składa się z (w tej kolejności): rui (E), metestrus (M), diestrus (D) i proestrus (P)26. Ruja charakteryzuje się niebieskimi, zrogowaciałymi komórkami, metestrus leukocytami i kombinacją komórek rogowatych i jądrzastych, diestrus jest podobny do metestrus w obecności typów komórek, z wyjątkiem tego, że są one bardzo rzadkie, a proestrus przez fioletowo zabarwione agregaty komórek jądrzastych (ryc. 1). Istnieją różne procedury barwienia, oprócz tych opisanych powyżej, które są równie skuteczne w cytologii wymazu z pochwy.</li>
	<li>Pobieraj próbki przez co najmniej dwa pełne cykle (~ 8-10 dni), aby dokładnie monitorować fazy przed eksperymentem. Należy zachować spójność z porą dnia, w której pobierane są próbki. Pobieraj próbki wymazu z pochwy codziennie, przez cały czas trwania eksperymentu i do jego zakończenia.</li>
</ol>
3. Wstępna ekspozycja
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu należy wstępnie wystawić zwierzęta na działanie komór kondycjonujących, aby umożliwić zwierzętom zaaklimatyzowanie się w kontekście (komory kondycjonujące) przed jakimikolwiek testami behawioralnymi.
	<ol>
		<li>Przed przystąpieniem do jakichkolwiek eksperymentów należy wystawić samice w komorach kondycjonujących (znajdujących się w skrzynkach tłumiących dźwięk) przy włączonym świetle domowym przez 20-30 minut dziennie przez 3 dni. Przypisz pudełko, w którym są wstępnie wystawieni, jako ich komorę do badania. Dokładnie wyczyść pudełka (ściany i tace) między sesjami i zwierzętami, aby usunąć zapachy, ponieważ mogą one wpływać na zachowanie i cykl rujowy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Dzień 1: Habituacja/Warunkowanie strachu
<ol>
	<li>Po zweryfikowaniu, czy zwierzęta znajdują się w fazie rui ich cykli rujowych, rozpocznij fazę przyzwyczajania/kondycjonowania w 3-dniowym eksperymencie.
	<ol>
		<li>Wykonuj podstawowe pomiary zamrożenia przed tonem przed pierwszymi prezentacjami bodźca kondycjonowanego tonem (CS) w każdym dniu eksperymentu. W tym celu należy uzyskać procentowe wyniki zamrożenia (obliczone przez podzielenie sekund spędzonych w bezruchu przez czas trwania próby, pomnożony przez 100) w przedziale czasowym braku bodźca na początku pierwszej próby CS przed wystąpieniem CS. 
		UWAGA: Miary te można wykorzystać do oceny i porównania wyjściowych poziomów zamrażania z tymi podczas habituacji, kondycjonowania, wygaszania i przypominania.</li>
		<li>Aby przeprowadzić trening wymierania w fazie metestrus, kondycjonuj szczury w ostatnim dniu rui. Wymaz i zidentyfikuj fazę rujową (krok 2) każdego dnia przed rozpoczęciem protokołu eksperymentalnego (warunkowanie/wygaszanie/wycofanie). Ponieważ faza rui może trwać dłużej niż jeden dzień, użyj historii cyklu, aby przewidzieć długość faz, aby określić, kiedy zwierzęta są gotowe do rozpoczęcia treningu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W komorach kondycjonacyjnych podłącz podłogę z siatką przeciwwstrząsową do generatora stymulacji elektrycznej. Użyj poziomu stymulacji 0,5-0,6 mA jako bodźca bezwarunkowego (US). Użyj tonu 4 kHz, 80 dB jako bodźca kondycjonowanego (CS). 
	UWAGA: Parametry te mogą się różnić w zależności od laboratoriów i mogą być modyfikowane w celu optymalnego kondycjonowania.
	<ol>
		<li>Jeśli program do analizy zamrożenia wymaga wskazówek wizualnych (w przeciwieństwie do czasowych), należy współaktywować diodę LED z dźwiękiem. Umieść światło na zewnątrz komory operacyjnej, w ramce wideo. Na początku każdej próby włącz diodę LED i utrzymuj ją świecącą do końca próby. 
		UWAGA: Światło to nie jest widoczne dla zwierzęcia i służy jedynie jako znacznik rozpoczęcia i zakończenia próby w nagranych plikach wideo (do wykorzystania do pomiaru zachowania podczas zamarzania).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść zwierzęta w komorach kondycjonujących na 5 prób przyzwyczajenia się do nich samodzielnie. Bezpośrednio po sesji habituacji wykonaj 7 sparowanych prób warunkowania strachu CS-US. Upewnij się, że dźwięk CS trwa przez 30 sekund i kończy się z 0,5-sekundowym wstrząsem amerykańskim. Przeprowadź próby we wszystkich sesjach (habituacja, kondycjonowanie, wygaszanie i przypominanie) ze zmiennym interwałem międzypróbnym wynoszącym średnio 3 minuty.</li>
	<li>Pod koniec sesji kondycjonowania należy zwrócić zwierzęta do ich domowych klatek i do obiektu dla zwierząt do następnego dnia.</li>
</ol>
5. Dzień 2: Przygotowanie estradiolu
<ol>
	<li>Pobrać wymaz i zidentyfikować fazę rujową dla wszystkich zwierząt, które przeszły dzień 1 niniejszego protokołu. Przygotować estradiol (znany również jako E2, 17beta-estradiol lub beta-estradiol) do podskórnego wstrzyknięcia w dawce 15 μg/kg przy użyciu oleju sezamowego lub 0,9% soli fizjologicznej jako nośnika.</li>
	<li>Aby obliczyć ilość estradiolu w celu przygotowania się do wstrzyknięć, należy użyć masy ciała wszystkich zwierząt, które zostały zmierzone i zarejestrowane, gdy były kondycjonowane w dniu 1 niniejszego protokołu.</li>
	<li>Wykonaj obliczenia, aby ustandaryzować podawaną objętość estradiolu (tj. 0,2 ml) na szczura. Ponieważ estradiol jest trudny do rozpuszczenia ze względu na nierozpuszczalność w wodzie i wymaga dużej objętości rozpuszczalnika dla małej dawki, należy przygotować roztwór podstawowy, mieszając estradiol z olejem sezamowym na ogniu, aż do rozpuszczenia. Roztwór można następnie przepuścić przez filtr 0,22 μm w celu usunięcia zanieczyszczeń. Na przykład, należy dodać obliczoną objętość 3 000 μg estradiolu/1 ml roztworu podstawowego oleju sezamowego do całkowitej potrzebnej objętości oleju sezamowego, aby osiągnąć dawkę 15 μg/kg w objętości iniekcji 0,2 ml na zwierzę. 
	UWAGA: Alternatywnie, użyj innych form estrogenu, które są rozpuszczalne w wodzie i łatwiejsze do rozpuszczenia.</li>
</ol>
6. Dzień 2: Podawanie estradiolu/trening wygaszania
<ol>
	<li>Estradiol należy podawać podskórnie. Delikatnie unieś luźną skórę między łopatką przy szyi i włóż igłę strzykawki do trójkąta utworzonego przez fałdy skórne.</li>
	<li>30 minut po podskórnym wstrzyknięciu estradiolu ponownie umieść zwierzęta w komorach kondycjonujących i rozpocznij trening wygaszania. W tej sesji wygaszania wykonaj 20 prób z samym CS, z których każda składa się z tonu trwającego 30 sekund, 4 kHz, 80 dB, prezentowanego w zmiennym interwale międzypróbnym wynoszącym średnio 3 min. 
	UWAGA: Wpływ estradiolu na wycofanie występuje, gdy estradiol jest podawany przed treningiem wygaszania lub bezpośrednio po wygaśnięciu. Efekt nie jest obserwowany 4 godziny po wygaśnięciu, dlatego zaleca się wstrzykiwanie w czasie na początku lub na końcu sesji treningowej15.</li>
</ol>
7. Dzień 3: Przypomnienie o wyginięciu
<ol>
	<li>24 godziny po treningu wymierania pobierz wymaz od zwierząt, które ukończyły dzień 1 i 2 tego protokołu.</li>
	<li>Umieść zwierzęta w przydzielonych im komorach kondycjonujących (tak samo jak w dniu 1 i 2). Rozpocznij sesję przypominania o wygaszaniu od przedstawienia 3 prób z samym CS (trzy próby przypominania o wygaśnięciu po wygaśnięciu), które składają się tylko z prób z użyciem samego CS o wartości 3,80 dB z interwałami międzypróbnymi podobnymi do 20 prób podawanych do treningu wygaszania, jak opisano w kroku 6.2.</li>
	<li>Po zakończeniu sesji przywoławczej należy zwrócić zwierzęta do ich domowych klatek.</li>
</ol>
8. Analiza danych
<ol>
	<li>Zbieraj dane behawioralne za pomocą wideo i analizuj je za pomocą oprogramowania komputerowego. 
	UWAGA: Wyniki zamrożenia mogą być również ręcznie liczone przez eksperymentatora, który jest ślepy na leczenie farmakologiczne, poprzez synchronizację napadów zamrożenia podczas prezentacji CS każdej próby, wyrażoną jako procent czasu spędzonego na zamrożeniu podczas tonu. Zamrożenie definiuje się jako całkowity brak ruchu, z wyjątkiem oddychania podczas 30-sekundowych prób CS-US. Oblicz procent zamrożenia, dzieląc sekundy spędzone na zamrażaniu (nieruchomym) przez 30 sekund (czas trwania próby) pomnożony przez 100.</li>
</ol>

<ol><li>Baron-Cohen, S., Knickmeyer, R. C., Belmonte, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+the+brain%3A+implications+for+explaining+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sex differences in the brain: implications for explaining autism.</a> Science. 310 (5749), 819-823 (2005).</li>
<li>Voyer, D., Voyer, S., Bryden, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnitude+of+sex+differences+in+spatial+abilities%3A+a+meta-analysis+and+consideration+of+critical+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Psychological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Magnitude of sex differences in spatial abilities: a meta-analysis and consideration of critical variables.</a> Psychological Bulletin. 117 (2), 250-270 (1995).</li>
<li>Pinker, S., Spelke, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Conversation+with+Steven+Pinker+and+Elizabeth+Spelke%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+Gender+and+Science%22%5BJournal%5D)">A Conversation with Steven Pinker and Elizabeth Spelke.</a> The Science of Gender and Science. , Harvard University: Mind/Brain/Behavior Initiative. (2005).</li>
<li>Hampson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen-related+variations+in+human+spatial+and+articulatory-motor+skills%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogen-related variations in human spatial and articulatory-motor skills.</a> Psychoneuroendocrinology. 15, 97-111 (1990).</li>
<li>Hampson, E., Kimura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+effects+of+hormonal+fluctuations+on+human+motor+and+perceptual-spatial+skills%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reciprocal effects of hormonal fluctuations on human motor and perceptual-spatial skills.</a> Behavioral Neuroscience. 102, 456-459 (1988).</li>
<li>Hampson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+sex-related+cognitive+abilities+across+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Cognition%22%5BJournal%5D)">Variations in sex-related cognitive abilities across the menstrual cycle.</a> Brain and Cognition. 14 (1), 26-43 (1990).</li>
<li>Kilpatrick, D. G., Resnick, H. S., Milanak, M. E., Miller, M. W., Keyes, K. M., Friedman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+estimates+of+exposure+to+traumatic+events+and+PTSD+prevalence+using+DSM-IV+and+DSM-5+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Traumatic+Stress%22%5BJournal%5D)">National estimates of exposure to traumatic events and PTSD prevalence using DSM-IV and DSM-5 criteria.</a> Journal of Traumatic Stress. 26 (5), 537-547 (2013).</li>
<li>Breslau, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+differences+in+trauma+and+posttraumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gender-Specific+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gender differences in trauma and posttraumatic stress disorder.</a> Journal of Gender-Specific Medicine. 5 (1), 34-40 (2002).</li>
<li>Frans, O., Rimmo, P. A., Aberg, L., Fredrikson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trauma+exposure+and+post-traumatic+stress+disorder+in+the+general+population%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Psychiatrica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Trauma exposure and post-traumatic stress disorder in the general population.</a> Acta Psychiatrica Scandinavica. 111 (4), 291-299 (2005).</li>
<li>Breslau, N., Kessler, R. C., Chilcoat, H. D., Schultz, L. R., Davis, G. C., Andreski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trauma+and+posttraumatic+stress+disorder+in+the+community%3A+the+1996+Detroit+Area+Survey+of+Trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+General+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Trauma and posttraumatic stress disorder in the community: the 1996 Detroit Area Survey of Trauma.</a> Archives of General Psychiatry. 55 (7), 626-632 (1996).</li>
<li>Seedat, S., Stein, D. J., Carey, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-traumatic+stress+disorder+in+women%3A+epidemiological+and+treatment+issues%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Drugs%22%5BJournal%5D)">Post-traumatic stress disorder in women: epidemiological and treatment issues.</a> CNS Drugs. 19 (5), 411-427 (2005).</li>
<li>Holbrook, T. L., Hoyt, D. B., Stein, M. B., Sieber, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+differences+in+long-term+posttraumatic+stress+disorder+outcomes+after+major+trauma%3A+women+are+at+higher+risk+of+adverse+outcomes+than+men%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Trauma%22%5BJournal%5D)">Gender differences in long-term posttraumatic stress disorder outcomes after major trauma: women are at higher risk of adverse outcomes than men.</a> Journal of Trauma. 53 (5), 882-888 (2002).</li>
<li>Labad, J., Menchon, J. M., Alonso, P., Segalas, C., Jimenez, S., Jaurrieta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+differences+in+obsessive-compulsive+symptom+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Depression+and+Anxiety%22%5BJournal%5D)">Gender differences in obsessive-compulsive symptom dimensions.</a> Depression and Anxiety. 25 (10), 832-838 (2008).</li>
<li>Gupta, R. R., Sen, S., Diepenhorst, L. L., Rudick, C. N., Maren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+modulates+sexually+dimorphic+contextual+fear+conditioning+and+hippocampal+long-term+potentiation+%28LTP%29+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Estrogen modulates sexually dimorphic contextual fear conditioning and hippocampal long-term potentiation (LTP) in rats.</a> Brain Research. 888, 356-365 (2001).</li>
<li>Milad, M. R., Igoe, S. A., Lebron-Milad, K., Novales, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrous+cycle+phase+and+gonadal+hormones+influence+conditioned+fear+extinction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Estrous cycle phase and gonadal hormones influence conditioned fear extinction.</a> Neuroscience. 164 (3), 887-895 (2009).</li>
<li>Zeidan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+modulates+medial+prefrontal+cortex+and+amygdala+activity+during+fear+extinction+in+women+and+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Estradiol modulates medial prefrontal cortex and amygdala activity during fear extinction in women and female rats.</a> Biological Psychiatry. 70 (10), 920-927 (2011).</li>
<li>Lebron-Milad, K., Milad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences%2C+gonadal+hormones+and+the+fear+extinction+network%3A+implications+for+anxiety+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Mood+%26+Anxiety+Disorders%22%5BJournal%5D)">Sex differences, gonadal hormones and the fear extinction network: implications for anxiety disorders.</a> Biology of Mood & Anxiety Disorders. 2 (3), (2012).</li>
<li>Rey, C. D., Lipps, J., Shansky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+d1+receptor+activation+rescues+extinction+impairments+in+low-estrogen+female+rats+and+induces+cortical+layer-specific+activation+changes+in+prefrontal-amygdala+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Dopamine d1 receptor activation rescues extinction impairments in low-estrogen female rats and induces cortical layer-specific activation changes in prefrontal-amygdala circuits.</a> Neuropsychopharmacology. 39 (5), 1282-1289 (2013).</li>
<li>Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovariectomy+and+17%CE%B2-estradiol+Replacement+in+Rats+and+Mice%3A+A+Visual+Demonstration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration.</a> Journal of Visualized Experiments. , e4013(2012).</li>
<li>Markham, J. A., Pych, J. C., Juraska, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+hormone+replacement+to+aged+ovariectomized+female+rats+benefits+acquisition+of+the+morris+water+maze%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Ovarian hormone replacement to aged ovariectomized female rats benefits acquisition of the morris water maze.</a> Hormones & Behavior. 42 (3), 284-293 (2002).</li>
<li>Markowska, A. L., Savonenko, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+estrogen+replacement+in+restoration+of+cognitive+function+after+long-term+estrogen+withdrawal+in+aging+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of estrogen replacement in restoration of cognitive function after long-term estrogen withdrawal in aging rats.</a> Journal of Neuroscience. 22 (24), 10985-10995 (2002).</li>
<li>Bredemann, T. M., McMahon, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((17%CE%B2+Estradiol+Increases+Resilience+and+Improves+Hippocampal+Synaptic+Function+in+Helpless+Ovariectomized+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">17β Estradiol Increases Resilience and Improves Hippocampal Synaptic Function in Helpless Ovariectomized Rats.</a> Psychoneuroendocrinology. 42, 77-88 (2014).</li>
<li>Grueso, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early%2C+but+not+late+onset+estrogen+replacement+therapy+prevents+oxidative+stress+and+metabolic+alterations+caused+by+ovariectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Early, but not late onset estrogen replacement therapy prevents oxidative stress and metabolic alterations caused by ovariectomy.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 236-246 (2014).</li>
<li>Shughrue, P. J., Bushnell, C. D., Dorsa, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+messenger+ribonucleic+acid+in+female+rat+brain+during+the+estrous+cycle%3A+a+comparison+with+ovariectomized+females+and+intact+males%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor messenger ribonucleic acid in female rat brain during the estrous cycle: a comparison with ovariectomized females and intact males.</a> Endocrinology. 131 (1), 381-388 (1992).</li>
<li>Frye, C. A., Erskine, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+time+of+mating+and+paced+copulation+on+induction+of+pseudopregnancy+in+cyclic+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility%22%5BJournal%5D)">Influence of time of mating and paced copulation on induction of pseudopregnancy in cyclic female rats.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 90 (2), 375-385 (1990).</li>
<li>Becker, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+and+methods+for+research+on+sex+differences+in+brain+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Strategies and methods for research on sex differences in brain and behavior.</a> Endocrinology. 146, 1650-1673 (2005).</li>
<li>Westwood, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+female+rat+reproductive+cycle%3A+a+practical+histological+guide+to+staging%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">The female rat reproductive cycle: a practical histological guide to staging.</a> Toxicologic Pathology. 36 (3), 375-384 (2008).</li>
<li>Hurn, P. D., Macrae, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+as+a+Neuroprotectant+in+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Estrogen as a Neuroprotectant in Stroke.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 20, 631-652 (2000).</li>
<li>Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+sample+collection+in+small+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Pharmacotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Blood sample collection in small laboratory animals.</a> Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).</li>
<li>Gillies, G. E., McArthur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+actions+in+the+brain+and+the+basis+for+differential+action+in+men+and+women%3A+a+case+for+sex-specific+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Estrogen actions in the brain and the basis for differential action in men and women: a case for sex-specific medicines.</a> Pharmacological Reviews. 62 (2), 155-198 (2010).</li>
<li>Tolin, D. F., Foa, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+trauma+and+posttraumatic+stress+disorder%3A+a+quantitative+review+of+25+years+of+research%5BTitle%5D)+AND+%22Psychological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Sex differences in trauma and posttraumatic stress disorder: a quantitative review of 25 years of research.</a> Psychological Bulletin. 132, 959-992 (2006).</li>
</ol>

Autorzy tego manuskryptu nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Wygaszanie strachu było szeroko badane u samców szczurów, a mechanizmy neuronalne pośredniczące w warunkowym wygaszaniu strachu zostały zidentyfikowane i ocenione na podstawie różnych manipulacji. Stosunkowo niewiele badań dotyczyło samic szczurów lub roli hormonów gonad w wymieraniu strachu. Aby dokładnie zbadać wpływ estrogenu na wygaszanie strachu, naturalnie jeżdżące na rowerze samice szczurów są poddawane trzydniowemu paradygmatowi behawioralnemu. Procedura ta składa się z faz habituacji/warunkowania, wygaszania i p...

Wrodzone różnice płci są obserwowane w różnych zachowaniach poznawczych i paradygmatach uczenia się zarówno u ludzi, jak i u gryzoni. Na przykład doniesiono, że kobiety mają na ogół silniejsze zdolności werbalne i zorientowane na szczegóły, podczas gdy mężczyźni mają lepsze zdolności przestrzenne1-3. Te różnice między płciami mogą wynikać częściowo z wpływu hormonów gonadalnych. Wysoki poziom estradiolu poprawia wydajność w zadaniach, w których kobiety są lepsze, ale pogarsza wydajność w zadaniach, które mężczyźni zazwyczaj wykonują dobrze4-6. Chociaż dowody te są przekonujące, ograniczona zdolność do całkowitej kontroli środowisk eksperymentalnych w badaniach na ludziach utrudnia ustalenie, czy ten wpływ na zachowanie można przypisać konkretnie hormonom. Z kolei badania na zwierzętach pozwalają na w pełni kontrolowane okoliczności.
Chociaż podstawowe mechanizmy neuronalne wygaszania strachu zostały zidentyfikowane i są dobrze zbadane u mężczyzn, nie jest jasne, czy te systemy są takie same u kobiet, czy jak zmieniają się w cyklu rujowym. Warunkowanie i wygaszanie strachu są szeroko stosowanymi paradygmatami behawioralnymi u gryzoni i ludzi do prowadzenia badań związanych z zaburzeniami lękowymi. Biorąc pod uwagę, że kobiety mają większe ryzyko zaburzeń lękowych, a także dłuższy czas trwania i nasilenie objawów7-13, bardzo ważne jest, aby włączyć kobiety do tych badań. Niedostateczna reprezentacja kobiet w tym badaniu może być przypisana wyzwaniom związanym z monitorowaniem fazy rujowej i uwzględnianiem behawioralnych skutków hormonów płciowych. Laboratoria, które badają kobiety pod tym kątem, napotykają problemy, które często nie są zgłaszane lub nie są opisane w metodach ich badań.
Pojawiające się dowody u gryzoni sugerują, że różnice płci w wygaśnięciu strachu są modulowane przez hormony gonadalne14-18. W warunkowaniu strachu zwierzęta są szkolone, aby bać się określonego bodźca. Po wielu niewzmocnionych prezentacjach bodźca, zwierzęta uczą się nie bać sygnału, proces ten nazywa się wyginięciem. To, jak dobrze zwierzę uczy się i utrwala pamięć o uczeniu się tego zadania, można zaobserwować podczas testu przypominania o wyginięciu, który odbywa się jakiś czas po treningu wygaszania. Mniejsza ekspresja strachu podczas przypominania o wygaśnięciu świadczy o dobrej konsolidacji pamięci o wygaśnięciu. Ostatnie odkrycia z naszego laboratorium sugerują, że estrogen może modulować konsolidację pamięci wygaszania strachu i poprawiać przypominanie o wygaszaniu. W szczególności samice szczurów, które są wygaszone w rui, fazie cyklu rujowego, podczas której poziom krążącego estrogenu osiąga szczyt, wykazują zwiększoną zdolność do zapamiętywania wyginięcia. W przeciwieństwie do tego, samice, które są wygaszone w fazie metestrus o niskim poziomie estrogenu, wykazują stosunkowo słabą pamięć o wygaszaniu, którą można poprawić za pomocą egzogennego podania estradiolu przed lub bezpośrednio po treningu wygaszania15,16. Neuronalne mechanizmy konsolidacji pamięci wygaszania (w tym rola hormonów gonadalnych) u samic nie są jasne.
U zwierząt laboratoryjnych rola hormonów może być badana za pomocą inwazyjnych procedur chirurgicznego usuwania, takich jak kastracja i owariektomia. Po powrocie do zdrowia po operacji, hormony gonadalne są często egzogennie manipulowane podczas wykonywania zadania behawioralnego19. Takie podejście dostarczyło krytycznych informacji na temat hormonów płciowych i jest użyteczne, ponieważ pozwala na dobrze kontrolowane manipulacje hormonami gonadalnymi (pod względem czasu i dawki)20-23. Podejście to nie ocenia jednak wpływu naturalnie występujących fluktuacji, które występują w całym cyklu rujowym, ani nie reprezentują one "normalnych" zwierząt, ograniczając w ten sposób potencjał translacyjny do badań na ludziach. Zostało dobrze udokumentowane, że poziom żeńskich hormonów płciowych osiąga szczyt i spada w określonych fazach cyklu rujowego, a ekspresja receptora estrogenowego zmienia się w trakcie cyklu i po wycięciujajników. W związku z tym istnieje potrzeba przeprowadzenia badań na samicach z nienaruszonymi gonadami i udoskonalenia projektów eksperymentalnych, aby wiarygodnie zbadać wpływ, jaki wysoki i niski poziom estrogenów może mieć na samice przez całe ich życie.
Ten protokół skupia się na wpływie estrogenu na systemy neurobiologiczne zaangażowane w wygaszanie strachu. Opisuje, jak: 1) uważnie monitorować cykl rujowy, 2) przygotować skuteczne dawki estradiolu do podawania ogólnoustrojowego oraz 3) postępować zgodnie z paradygmatem behawioralnym, który obejmuje warunkowanie strachu, wygaszanie i przypominanie u naturalnie jeżdżących na rowerze samic szczurów. Protokół ten może być modyfikowany za pomocą innych manipulacji farmakologicznych oraz narzędzi komórkowych i molekularnych, aby pomóc w badaniach nad lepszym zrozumieniem różnic płciowych, które obserwuje się w uwarunkowanych zachowaniach związanych z wygaszaniem strachu. Należy pamiętać, że opisane poniżej procedury są procedurami stosowanymi w naszym laboratorium, a w literaturze istnieje wiele odmian tych procedur.

<table><tbody><tr><td>Komora kondycjonująca strach</td><td>Coulbourn Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphic State</td><td>Coulbourn Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skrzynka tłumiąca dźwięk</td><td>Med Associates, Inc.</td><td>NIR-022MD</td><td></td></tr><tr><td>Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1024</td><td>W oleju sezamowym do wstrzykiwań podskórnych</td></tr><tr><td>Olej sezamowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3547-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Freezescan</td><td>Cleversys, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zanurz szybkie barwienie</td><td>Jorgensen Laboratories, Inc.</td><td>J0322A1, J0322A2, J0322A3</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-114</td><td>6-calowe, sterylne</td></tr><tr><td>0,9% sól fizjologiczna</td><td>LabChem, Inc.</td><td>LC23460-2</td><td>Chlorek sodu ze</td></tr><tr><td>szkiełkami mikroskopowymi Selectfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-003</td><td></td></tr><tr><td>Virex II 256</td><td>Diversey, Inc.</td><td>5019317</td><td>Rozcieńczyć w stosunku 1:256 wodą</td></tr><tr><td>Luer-Lok Tip 1ml Strzykawki</td><td>Becton Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe igły podskórne</td><td>Exelint International, Co.</td><td>26402</td> w <td>rozmiarze 26</td></tr></tbody></table>

protokół badania wygaszania uwarunkowanego strachu u naturalnie jeżdżących na rowerze samic szczurów

Protocol for Studying Extinction of Conditioned Fear in Naturally Cycling Female Rats

Wygaśnięcie warunkowego strachu było szeroko badane u samców gryzoni. Ostatnio pojawia się coraz więcej badań wskazujących, że mechanizmy neuronalne dla niektórych zadań behawioralnych i zachowań reagowania są różne u kobiet i mężczyzn. Wykorzystanie kobiet w badaniach naukowych może stanowić wyzwanie ze względu na zmienność hormonów gonad podczas ich cyklu rujowego. Protokół ten opisuje dobrze ugruntowane procedury, które są przydatne w badaniu roli estrogenu w wygaszaniu strachu, konsolidacji pamięci u samic szczurów. Faza cyklu rujowego i podanie egzogennego estrogenu przed treningiem wygaszania może wpływać na wycofanie się z wygaszania 24 godziny później. Opisana tutaj technika pobierania wymazów z pochwy w celu identyfikacji fazy rujowej pomaga w badaniu i manipulacji naturalnie krążącymi hormonami gonadalnymi. Zastosowanie tego podstawowego modelu gryzoni może dodatkowo nakreślić mechanizmy, za pomocą których estrogen może modulować pamięć wygaszania strachu u samic.

W niniejszym protokole przypominania wygaszania lęku wskaźnikiem lęku był procentowy poziom zamrożenia (freezing). Zwierzęta, u których wygaszanie przebiegło pomyślnie i które zachowały pamięć o treningu wygaszania, wykazywały niski poziom lęku w ostatnim dniu testów behawioralnych podczas przypominania wygaszania. Samce i samice szczurów nie różnią się znacząco w ekspresji warunkowego lęku podczas faz kondycjonowania, wygaszania i przypominania (Rysunek 2). Jednakże różnica płciowa staje się widoczna, g...

Hormony gonadalne, takie jak estrogen, modulują tworzenie pamięci w wielu eksperymentalnych paradygmatach, w tym w pamięci wygaszania strachu. Protokół ten opisuje zestaw metod badania wpływu hormonów gonad, szczególnie podczas wymierania u naturalnie zmieniających się na cyklach samic, w tym monitorowanie cyklu rujowego i egzogenne podawanie estrogenów.

Protokół badania wygaszania uwarunkowanego strachu u naturalnie jeżdżących na rowerze samic szczurów

Extinction of conditioned fear has been extensively studied in male rodents. Recently, there have been an increasing number of studies indicating that ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie wpływu hormonów gonadalnych na zachowania związane z wygaszaniem strachu u kobiet podczas niskich i wysokich stanów hormonalnych cyklu Esra oraz rolę estradiolu, gdy jest on podawany egzogennie. Osiąga się to poprzez uprzednie monitorowanie cyklu ESRA dorosłych samic szczurów i określenie, w której fazie się znajdują przed eksperymentem. Następnie zwierzęta, które są w fazie rui, umieszcza się w przydzielonych im komorach w celu zamieszkania i warunkowania strachu.Następnego dnia, gdy zwierzęta są w rui, samicom wstrzykuje się estradiol lub nośnik i przechodzą trening wygaszania strachu. Wreszcie, trzeciego dnia, zwierzęta umieszcza się z powrotem w tej samej komorze, aby przetestować przypomnienie sobie sesji wymierania dzień wcześniej. Ostatecznie, wymaz z pochwy w celu identyfikacji EST strase pozwala badaczom manipulować naturalnymi wahaniami hormonów gonadalnych w celu zbadania ich wpływu na pamięć wygaszania strachu.Protokół ten może być wykorzystany do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie różnic płciowych, takie jak: czy procesy wygaszania strachu są różne u mężczyzn i kobiet? A jeśli tak, to jakie są mechanizmy hor

protocol-for-studying-extinction-conditioned-fear-naturally-cycling

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Modele zwierzęce nawrotów, znane jako procedury reinstalacji, są szeroko wykorzystywane do badania roli stresu w nawrotach poszukiwania narkotyków. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metodę indukowania reinstalacji poszukiwania kokainy u szczurów laboratoryjnych poprzez krótkotrwałą ekspozycję na łagodne, przerywane wstrząsy elektryczne stóp.

Procedura badania reinstatmentu poszukiwania kokainy indukowanego wstrząsem stopy u szczurów laboratoryjnych

Warunkowany lęk może zostać zredukowany poprzez proces hamowania nazywany wygaszaniem, jednak może on powrócić w określonych warunkach, takich jak upływ czasu lub ekspozycja na stres. Nasz protokół przedstawia nową metodę zapobiegania powrotowi lęku poprzez wprowadzenie wygaszania podczas okna rekonsolidacji (fazy ponownego utrwalania reaktywowanego wspomnienia).

Trening wygaszania w oknie rekonsolidacji zapobiega powrotowi lęku

Źródło: Childs, J. E., et al. Stymulacja nerwu błędnego jako narzędzie do indukowania plastyczności w szlakach istotnych dla uczenia się wymierania. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje metodę stymulacji nerwu błędnego (VNS) w modelu szczura w celu zmniejszenia zachowania związanego z zamarzaniem. Szczury uwarunkowane strachem otrzymują VNS podczas ponownej ekspozycji na dźwięk, co prowadzi do zmniejszenia zamrażania i ujawnia jego potencjał terapeutyczny.

Stymulacja nerwu błędnego w modelu szczura w celu zmniejszenia zachowania związanego z zamarzaniem

W poniższym eksperymencie opisujemy protokół warunkowania strachu śladowego u myszy. Ten rodzaj pamięci asocjacyjnej obejmuje okres śladowy, który oddziela bodziec neutralny od bodźca bezwarunkowego.

Warunkowanie strachu śladowego u myszy

Stymulacja nerwu błędnego (VNS) pojawiła się jako narzędzie do wywoływania ukierunkowanej plastyczności synaptycznej w przodomózgowiu w celu modyfikacji szeregu zachowań. Ten protokół opisuje, jak zaimplementować VNS, aby ułatwić konsolidację pamięci wygaszania strachu.

Stymulacja nerwu błędnego jako narzędzie do indukowania plastyczności w szlakach istotnych dla uczenia się wymierania

Tutaj opisujemy szczegółową metodologię wymaganą do przeprowadzenia eksperymentów z uczeniem się strachu wzmocnionego stresem (SEFL), przedklinicznego modelu zespołu stresu pourazowego, zarówno u szczurów, jak i myszy. Model wykorzystuje aspekty warunkowania i zamrażania strachu Pawłowa jako wskaźnik zwiększonego strachu u gryzoni.

Uczenie się strachu wzmocnione stresem, solidny model zespołu stresu pourazowego u gryzoni

Opisujemy rozszerzony protokół warunkowania strachu, który powoduje przetrenowanie i inkubację strachu u szczurów. Protokół ten obejmuje pojedynczą sesję treningową z 25 parami ton-shock (tj. przetrenowanie) i porównaniem reakcji warunkowego zamrażania podczas testów kontekstowych i cue 48 godzin (krótkoterminowo) i 6 tygodni (długoterminowo) po treningu.

Inkubacja strachu przy użyciu rozszerzonego protokołu warunkowania strachu dla szczurów

Defensywne reakcje behawioralne zależą od intensywności zagrożenia, bliskości i kontekstu ekspozycji. Opierając się na tych czynnikach, opracowaliśmy klasyczny paradygmat warunkowania, który wywołuje wyraźne przejścia między warunkowym zamrożeniem a zachowaniem podczas lotu u poszczególnych badanych. Model ten ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patologii związanych z zaburzeniami lękowymi, panikowymi i stresem pourazowym.

Nowy paradygmat warunkowania strachu Pawłowa do badania zachowań związanych z zamarzaniem i ucieczką

Aby badać zachowania związane z lotem w kontekście strachu, wprowadzamy zmodyfikowany protokół warunkowania strachu. Protokół ten zapewnia, że myszy konsekwentnie wykazują zachowania związane z lotem podczas prezentacji wskazówek w warunkowaniu strachu.

Zmodyfikowane warunkowanie strachu w celu wywołania zachowań związanych z lotem u myszy

Paradygmat strachu obserwacyjnego ocenia zastępcze zamrożenie u gryzoni jako model empatii afektywnej. Procedura ta polega na wystawieniu gryzoni-obserwatorów na działanie demonstrantów tego samego gatunku, którzy otrzymują awersyjne wstrząsy stopami w celu wywołania empatycznych reakcji zamrożenia. Stosując obserwacyjne testy strachu, naukowcy mogą zbadać mechanizmy neuronalne leżące u podstaw empatii afektywnej.

Strach obserwacyjny jako model empatii afektywnej u myszy

Poznaj protokół badania wygaszania uwarunkowanego strachu u samic szczurów z monitorowaniem cyklu estralnego i podawaniem estradiolu. Ta metoda pozwala badać wpływ hormonów płciowych na pamięć i zachowanie.

Protokół badania wygaszania uwarunkowanego strachu u naturalnie jeżdżących na rowerze samic szczurów

Przeglądaj więcej filmów