Analiza swoistości metylotransferaz lizyny białkowej przy użyciu macierzy peptydowych SPOT

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie specyficzności substratowej metylotransferaz lizyny białkowej lub PK mts. Osiąga się to poprzez identyfikację początkowego substratu i przygotowanie macierzy peptydowych z kilkoma wariantami tego substratu zawierającymi pojedynczą wymianę aminokwasów w różnych pozycjach. W drugim etapie macierz peptydowa jest inkubowana z PKMT w obecności radioaktywnego donora grupy metylowej, co umożliwia wykrycie metylacji peptydów poprzez przeniesienie radioaktywności do odpowiedniego miejsca peptydowego.

Następnie matryca jest naświetlana folią rentgenowską i analizowana ilościowo w celu określenia aktywności metylacji w każdym z peptydów. Aby określić profil specyficzności PKMT, wyniki pokazują, które aminokwasy w peptydzie substratowym są krytyczne dla jego metylacji przez PKMT. Główną zaletą tej techniki lub istniejących metod, takich jak metylacja pojedynczych peptydów, jest to, że w jednym eksperymencie można przetestować wiele różnych peptydów w sposób opłacalny.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie metylacji białek, takie jak specyfikacja nieznanych wcześniej nowych substratów PK mtss. Tak więc ta metoda może zapewnić wgląd w specyfikę PK mts. Może być również stosowany do innych systemów, takich jak kinazy białkowe, inne metody białkowe, transferazy lub dodawanie do transferaz.

Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, gdy zapoznałem się z możliwością przygotowania dużych niestandardowych macierzy peptydowych przy rozsądnych kosztach przy użyciu syntezy plamek peptydowych Aby rozpocząć tę procedurę, zaprojektuj sekwencje peptydowe do syntezy za pomocą oprogramowania multi pep spotter. Wprowadź sekwencje peptydowe jako jednoliterowy kod, przy czym każda litera określa konkretny aminokwas po tym wstępnym pęcznieniu, na końcu membrany punktowej funkcjonalizowanej przez aminowy kołek, na końcu dimetyloformamidu lub DMF przez 10 minut. Po zakończeniu umieść mokrą membranę na ramie syntezatora punktowego bez pęcherzyków powietrza i zmarszczek.

Całkowicie wysuszyć membranę przez co najmniej 10 minut przed rozpoczęciem programu syntezy. Umyj membranę trzykrotnie 100% etanolem, aby wytworzyć wiązanie amidowe z wolną grupą aminową na membranie. Aktywuj grupę karboksylową przychodzącego aminokwasu, dodając DIC i octan etylohydroksyaminosynosy do pochodnej aminokwasu.

Po aktywacji znajdź żądane objętości aktywowanych aminokwasów na funkcjonalizowanej membranie amino peg za pomocą programowalnego robota. Powtórz poprzedni krok trzy razy, aby zapewnić lepsze sprzężenie pierwszego aktywowanego aminokwasu. Po inkubacji membrany przez 20 minut, przemyj ją DMF w celu usunięcia rozłączonych aminokwasów po wysuszeniu i zablokowaniu wolnych grup aminowych.

Przemyć membranę czterokrotnym DMF, a następnie inkubować z 20% piperyną w DMF przez 20 minut, aby usunąć grupę ochronną FM. Po umyciu i wysuszeniu membrany powtórz etapy plamienia i usuwania F MOC, aż do uzyskania pożądanej długości peptydu. Po ostatnim zabezpieczeniu F MOC grupy D należy umyć membranę DMF i 100% etanolem.

Następnie potraktuj membranę 0,02% błękitem fenolowym brom w DMF przez co najmniej pięć minut, aż całkowicie zmieni kolor na niebieski. Po umyciu i wysuszeniu membrany wyjmij ją z syntezatora i umieść w pudełku odpornym na chemikalia. Potraktuj go 20 do 25 mililitrami mieszaniny ochronnej łańcucha bocznego D, składającej się z 95% kwasu trichlorooctowego do rozszczepienia grup ochronnych łańcucha bocznego i odczynników zmiatających, aby chronić łańcuchy boczne aminokwasów przed modyfikacją.

Po upewnieniu się, że mieszanina głębokiej ochrony pokrywa membranę, całkowicie zamknij pudełko i inkubuj je przez jedną do dwóch godzin, delikatnie wstrząsając po inkubacji. Przemyj membranę sześć razy 20 do 25 mililitrami di chlorometanu przez dwie minuty każdy. Po dwukrotnym umyciu 100% etanolem wysuszyć membranę w osuszaczu przez noc.

Następnie wstępnie inkubować membranę macierzy peptydowej w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie zawierającej odpowiedni bufor metylacyjny bez enzymu i amet z radioaktywnie znakowaną grupą metylową Przez 10 minut wyrzucić bufor do wstępnej inkubacji i inkubować błonę w ośmiu mililitrach buforu metylacyjnego zawierającego odpowiedni PKMT przez jedną do dwóch godzin. Następnie wyrzucić bufor metylacyjny do pojemnika na odpady radioaktywne i przemyć macierze peptydowe pięć razy 20 mililitrami buforu zawierającego 100 milimolowy wodorowęglan amonu i 1% STS przez pięć minut w celu usunięcia związanego białka. Po wyrzuceniu ostatniego buforu płuczącego do pojemnika na odpady promieniotwórcze, inkubować membranę przez pięć minut w 10 mililitrach roztworu amplifikacyjnego.

Następnie wyrzucić roztwór amplifikacyjny do pojemnika na odpady radioaktywne na rozpuszczalniki organiczne. Zamknij matrycę peptydową w plastikowej torbie i włóż ją do kasety do automatycznej radiografii. Umieść film z automatycznej radiografii na peptydzie w ciemnym pomieszczeniu.

Następnie ostrożnie zamknij kasetę. Po naświetleniu filmu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza wywołaj go, aby przeanalizować wyniki. Na koniec uchwyć obraz kilka razy z różnymi czasami naświetlania, aby uniknąć nasycenia silnie metylowanych substratów peptydowych.

Przykład reakcji metylacji macierzy peptydowej z NSD przedstawiono tutaj. Oś pozioma reprezentuje sekwencję peptydu i w kierunku pionowym. Zmieniony aminokwas jest wskazany metylacja za pomocą nsd, jeden pokazuje, że specyficznie działa na H trzy K 36 i rozpoznaje trzy do czterech reszt aminokwasowych po obu stronach docelowej konsolidacji lizyny trzech eksperymentów z macierzą peptydów NSD, jeden jest pokazany tutaj.

Około 85% peptydów wykazuje odchylenia standardowe mniejsze niż plus lub minus 20%, a ponad 97% peptydów wykazuje odchylenia standardowe mniejsze niż plus lub minus 30%Obliczone dane dotyczące współczynnika dyskryminacji pokazują, że NSD jeden preferuje reszty aromatyczne w pozycji minus dwa. W miejscach minus jeden i plus dwa preferuje hydrofobowe pozostałości atyczne. A na plus jedno miejsce preferowana jest arginina, lizyna, glutamina lub asparagina.

Potencjalne nowe substraty peptydowe można znaleźć, przeszukując bazy danych ludzkiego proteomu. Silna metylacja niektórych z tych peptydów za pomocą omu potwierdza ich tożsamość jako nowych substratów peptydowych NSD. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby użyć najbardziej odpowiedniego podłoża początkowego Zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak metylacja odpowiednich białek in vitro i w komórkach, mogą być przeprowadzone w celu ustalenia, czy białka są akceptowane jako substraty, a także po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mesylacją lizyny białek w celu zdefiniowania specyficzności substratowej wielu farmakokinetycznych mts i zidentyfikowania kilku nowych substratów. Pomogło to zrozumieć ważną funkcję biologiczną farmakokinekiki

Nie zapominaj, że praca z radioaktywnością i rozpuszczalnikami organicznymi w syntezie peptydów może być zapewniona i zawsze należy podjąć odpowiednie środki ostrożności podczas wykonywania tej procedury.