Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Celem tej procedury jest internalizacja i wizualizacja biomolekuł, takich jak DNA lub białka znakowane organicznym fluorem, wewnątrz żywych mikroorganizmów przy użyciu metody opartej na elektroporacji. Osiąga się to poprzez najpierw inkubację elektrokompetentnych komórek z fluorescencyjnie znakowanymi biomolekułami przed przeniesieniem ich do elektroporacji. Poprzez przyłożenie wysokiego napięcia do wete, przejściowe formacje porów zarówno na ścianie komórkowej, jak i błonie komórkowej umożliwią dyfuzję biomolekularną do komórek.

Następnie komórki są inkubowane w bogatym pożywce, aby umożliwić im regenerację przed usunięciem nadmiaru niezinternalizowanych biomolekuł. Na koniec komórki są przenoszone na podkładkę z minimalną ilością składników odżywczych o niskiej fluorescencji, a następnie na wierzch nakłada się szklane szkiełko nakrywkowe, tworząc szklaną kanapkę agro. Ostatecznie mikroskopia esencji służy do analizy lokalizacji, wzoru dyfuzji i właściwości dynamicznych znakowanych biomolekuł wewnątrz żywych komórek.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę z ograniczeń w obrazowaniu żywych komórek. Ze względu na szybkie zacinanie się białek fotofluorescencyjnych, takich jak GFP, doszliśmy do wniosku, że ładując żywe komórki biomolekułami znakowanymi organiczną siłą fluoru, przeszczepimy żywe mikroorganizmy. Główne zalety tej siły to jasność, stabilność zdjęcia i niewielkie rozmiary.

Mamy nadzieję, że uda nam się śledzić lokalizację i dyfuzję DNA lub białek w ich rodzimym środowisku w znacznie dłuższych skalach czasowych, co pasowałoby do wielu ważnych procesów biologicznych. Główną przewagą tych technik nad istniejącymi metodami, takimi jak mikroiniekcja, jest to, że można ją również stosować do mikroorganizmów, które są mniejsze niż średnica typowej igły do mikroiniekcji. Dodatkową zaletą elektroporacji jest to, że duża liczba komórek może być jednocześnie załadowana fluorescencyjnymi biomolekułami i równolegle wizualizować te, które sprawiają, że elektroporacja jest szczególnie ocznym technikiem przepustowości.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w dyfuzję i dynamikę biomolekuł znakowanych fluorescencyjnie in vivo, może być również stosowana w innych kontekstach, takich jak biomolekuły elektrod, które nie są znakowane, ale może na przykład wywołać reakcję fizjologiczną, gdy zostaną zinternalizowane przez komórkę Aby skonstruować podkładki aros do mikroskopii fluorescencyjnej bakterii lub drożdży, zacznij od przygotowania około dwóch pożywek o niskiej fluorescencji, Następnie natychmiast rozpuść roztwór 2%aros w wodzie destylowanej za pomocą laboratoryjnej kuchenki mikrofalowej. Dodaj jedną pasującą objętość gorącego róży kwasu hialuronowego do podłoża i delikatnie pipetuj mieszaninę w górę iw dół. Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, należy natychmiast odpipetować około 200 mikrolitrów powstałej mieszaniny na szkiełko nakrywkowe mikroskopu o standardowym rozmiarze.

Pozostaw szkiełko nakrywkowe na stole na minutę w temperaturze pokojowej, aż żel zestali się lub tymczasowo przechowuje, umieść drugi oczyszczony szkiełko nakrywkowe na świeżej podkładce i delikatnie dociśnij od góry, aby rozpłysnąć się w róży jajowej, zaczynając od zapasu fluorescencyjnych biomolekuł przygotowanych w buforze o niskiej sile jonowej. Przenieś do pięciu mikrolitrów biomolekuł do 20 mikrolitrów podwielokrotności kompetentnych bakterii lub 50 mikrolitrów kompetentnych komórek drożdży. Ilość biomolekuł fluorescencyjnych inkubowanych z komórkami jest bezpośrednio skorelowana z ilością biomolekuł zinternalizowanych na komórkę.

Po elektroporacji inkubować mieszaninę na lodzie przez maksymalnie 10 minut. W tym samym czasie należy dobrać akumulator do elektroporacji o odpowiednim rozstawie elektrod i schłodzić na lodzie. Przenieś mieszaninę komórek do wstępnie schłodzonego vete.

Delikatnie postukaj w vete kilka razy, aby usunąć wszelkie pęcherzyki z roztworu. Usuń wilgoć z weterynarza ręcznikiem papierowym i umieść weterynarza w elektroatorze. Zastosuj impuls wysokiego napięcia do ogniw zaraz po tym procesie.

Sprawdź, czy stała czasowa wyświetlana na elektroatorze wynosi od czterech do sześciu milisekund. Niższe stałe czasowe są często spowodowane obecnością nadmiaru soli lub pęcherzyków w qve, co może zmniejszyć lub całkowicie zahamować wchłanianie biomolekuł do komórek. Impulsy o wyższym napięciu poprawiają obciążenie ogniwa, ale mogą również wpływać na żywotność ogniwa bezpośrednio po elektroporacji.

Dodaj 500 mikrolitrów multimediów i przenieś komórki do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Pozwól błonie komórkowej zregenerować się, inkubując bakterie w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub drożdże w temperaturze 29 stopni Celsjusza przez dwie do 10 minut. Po włączeniu biomolekuły i przywróceniu wzrostu, wiruj komórki przez jedną minutę w wirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzuć środek Reese.

Zawiesić osad w buforze o pojemności 500 mikrolitrów i powtórzyć procesy odkręcania i usuwania oraz zawieszania rezu buforowego. Jeszcze trzy razy. Te etapy płukania usuną wszelkie ślady niezinternalizowanych biomolekuł z zawiesiny komórkowej.

W przypadku znakowanego białka internalizacja i dodatkowe oczyszczanie etap odbywa się poprzez pipetowanie zawiesiny komórkowej do 1,5-mililitrowej rurki wyposażonej w filtr membranowy 0,22 mikrona na górze. Oddziel komórki od buforu przez odwirowanie, upewniając się, że nad filtrem pozostała wystarczająca ilość płynu, aby uniknąć wysychania komórek i odrzucenia przepływu przez frakcję. Poniżej filtra dodaj 500 mikrolitrów świeżego PBS na komórki i powtórz kombinację wirowania, a następnie świeżej edycji PBS.

Jeszcze dwa razy. Wykonaj ostatnie wirowanie w dół przy 3 300 G przez jedną minutę. Aby usunąć poprzednie płukanie PBS, ponownie zawieś ogniwa za pomocą 150 mikrolitrów PBS.

Na koniec zdejmij górną szkiełko nakrywkowe z wcześniej wykonanej podkładki aros. Załaduj komórki na podkładkę, pipetując kroplami 10 mikrolitrów zawiesiny komórek. Po umieszczeniu nowego, oczyszczonego szkiełka nakrywkowego na wierzchu podkładki rozsianej, komórki warstwowe są teraz gotowe do mikroskopii fluorescencyjnej.

Kontrole ujemne, takie jak kontrole nieocenione, które były inkubowane z oznakowanymi biomolekułami lub pustymi komórkami, które nie zostały poddane ocenie elektrycznej ani inkubacji, powinny być również przygotowywane równolegle z dowolnymi załadowanymi próbkami, załadowane komórki można obrazować pod dowolnym odpowiednim mikroskopem fluorescencyjnym. Natomiast tryb obrazowania szerokokątnego umożliwia obrazowanie i analizę na poziomie komórek, przy wysokim oświetleniu lub optymalnym do obserwacji i śledzenia pojedynczych cząsteczek. Aby zapobiec nadmiernemu fotowybielaniu biomolekuł, przed załadowaniem próbki należy upewnić się, że wszystkie oświetlenie laserowe na scenie jest wyłączone lub zablokowane nieprzezroczystym filtrem.

Ponadto wyłącz wzmocnienie aparatu E-M-C-C-G, aby zapobiec uszkodzeniu aparatu przez nadmierną ekspozycję. W przypadku mikroskopu odwróconego umieść kanapkę z podkładką Aris na stoliku mikroskopu stroną zakrytą komórką skierowaną w dół w kierunku dolnego obiektywu. Następnie włącz górne światło halogenowe i ustaw ostrość komórek w trybie mikroskopii światła przechodzącego białego przed włączeniem lasera, zrób zdjęcie komórek w trybie transmisji światła białego.

Zdjęcie to zostanie wykorzystane jako pozycyjna mapa referencyjna, która będzie korelować regiony fluorescencji biomolekularnej z rzeczywistymi lokalizacjami komórek w tym samym polu widzenia. Do pomiaru żywotności należy użyć grzałki obiektywowej ustawionej na optymalną temperaturę i rejestrować sekwencyjne obrazy tego samego pola widzenia przy oświetleniu światłem białym co 30 minut bez przesuwania stolika, wyłączyć górne oświetlenie górne i chronić próbkę przed wszystkimi innymi źródłami światła otoczenia w laboratorium. Następnie włącz kamerę CCD i rozpocznij akwizycję danych.

Rozpocznij rejestrację jonu fluorescencyjnego tuż przed włączeniem oświetlenia laserowego. Po wykonaniu mikroskopii fluorescencyjnej rozpocznij analizę danych, otwierając wszystkie zdjęcia za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu, takiego jak Image J, aby rozpocząć normalizację wszystkich podstawowych parametrów obrazu, takich jak jasność lub kontrast na wszystkich obrazach, naciskając przycisk set i wybierz propagację do wszystkich innych obrazów. Opcja pierwsza może jakościowo ustalić, czy ładowanie ogniw się powiodło, ponieważ załadowane ogniwa powinny być znacznie jaśniejsze niż ogniwa nieelektroporowane użyte jako kontrola negatywna dla danego obrazu.

Użyj narzędzia do zaznaczania odręcznego i okrąż różne obszary fluorescencji ręcznie rysowanymi wielokątami. Porównaj intensywność fluorescencji między wszystkimi istotnymi wielokątami, wybierając opcję pomiaru z menu analizy. Powtórz ten proces ręcznie lub za pomocą automatycznego skryptu, aby wyodrębnić intensywność na piksel wszystkich komórek w każdej próbce i kontrolach ujemnych.

Gdy ogniwo o mocy znamionowej jest załadowane jedną lub kilkoma biomolekułami fluorescencyjnymi, jego średnia intensywność emisji będzie większa niż średnia intensywność ujemnej próbki kontrolnej. Aby ręcznie ocenić żywotność komórek, należy ręcznie policzyć procent podziału nienaruszonych przez niedzielące się i uszkodzone komórki. W tym samym polu widzenia, dla którego dane były rejestrowane co 30 minut w kilku podziałach, nie zawsze jest możliwe bezpośrednie policzenie liczby biomolekuł zinternalizowanych na komórkę, szczególnie gdy biomolekuły szybko dyfundują lub gdy komórki są załadowane więcej niż pięcioma znakowanymi biomolekułami.

Analiza fotowybielania na podstawie komórek pozwala na ocenę liczby znakowanych biomolekuł na komórkę w takich warunkach. Za pomocą przycisku wyboru odręcznego prześledź kontur danej komórki fluorescencyjnej oraz wyodrębnij i wykreśl fluorescencję surowej komórki w funkcji czasu spowodowanej efektami fotowybielania. Wykres intensywności w funkcji czasu będzie wykładniczo malejącą krzywą, mocno obciążonymi komórkami, ale w przypadku komórek zawierających mniej niż 10 biomolekuł powinny być widoczne wyraźne kroki.

Oblicz średnią autofluorescencję po fotowybielaniu, uśredniając wartości surowej intensywności fluorescencji w pobliżu płaskiego końca eksperymentu, która może pochodzić na przykład z ostatnich 50 do 100 klatek obrazu w serii poklatkowej. Po określeniu intensywności linii bazowej należy obliczyć intensywność fotowybielania zależną od czasu, odejmując bazową autofluorescencję od surowych danych fluorescencji, a następnie zablokować wynikowe dane dotyczące intensywności fotowybielania i określić wysokość każdego kroku ręcznie lub za pomocą algorytmu. Proces ten należy powtórzyć dla kilku komórek wykazujących łącznie więcej niż 100 kroków, aby uzyskać dokładne oszacowanie średniej wysokości stopnia, wartość ta odpowiada jednostkowej intensywności fluoro four spowodowanej bieleniem pojedynczego fluoro four.

Wreszcie, liczbę zinternalizowanych cząsteczek na komórkę można obliczyć, dzieląc podstawową odjętą intensywność komórek w czasie równym zero przez unitarny fluor. Cztery intensywności dla tego protokołu elektroporacji. Ilość znakowanego fluorescencyjnie DNA lub białka, które można zinternalizować w bakteriach lub drożdżach, można kontrolować, dostosowując ilość sond DNA obecnych w buforze do elektroporacji.

Gdy szybkość internalizacji biomolekularnej jest wysoka, czas życia fotowybielania znakowanej biocząsteczki, który można znaleźć, najpierw wykreślając intensywność fluorescencji w funkcji czasu, a następnie wyodrębniając jej wykładniczą stałą czasową, daje informacje o fotostabilności barwników in vivo. W przypadku niskich wskaźników inkorporacji, kwantyzacja intensywności fluorescencji zapewni środki do przybliżenia całkowitej liczby biomolekuł w danej komórce. Elektroporacja może być również stosowana do włączania białek do bakterii lub drożdży.

W przypadku białka znakowanego fluorescencyjnie. Ponieważ wolne fluorofory same w sobie mogą być bardzo skutecznie internalizowane, ważne jest, aby usunąć cały nadmiar wolnych i niekowalencyjnie przyłączonych fluoroforów z zapasu białka. Wreszcie, podwójnie znakowane przez nasze cząsteczki mogą być również internalizowane za pomocą naszej metody, aby umożliwić obserwację progów pojedynczej cząsteczki w żywych komórkach przez kilka sekund.

Próbując tej procedury, należy pamiętać o przygotowaniu i analizie próbek kontrolnych, takich jak komórki nieelektrokomórkowe, które są inkubowane ze znakowaną biomolekułą lub puste komórki, które nie są ani elektroporowane, ani inkubowane ze znakowaną cząsteczką. Te kontrole pozwalają nam ocenić poziom autofluorescencji komórek i niedobór etapów mycia, a jako takie są niezbędne do oceny, czy eksperyment z elektroporacją zakończył się sukcesem po jego rozwoju. Technika ta otworzyła nowe możliwości naukowcom zajmującym się biofizyką i trzecią biologią w celu zbadania dyfuzji i dynamicznego zachowania biomolekuły etykietowej w żywych mikroorganizmach.

I to w skali czasowej o jeden do dwóch rzędów wielkości dłużej niż w przypadku białek autofluorescencyjnych, takich jak GFP. Przyczyniło się to do zwiększenia elastyczności znakowania organicznego d in vivo, dzięki czemu eksperymenty z zagrożeniami pojedynczymi cząsteczkami stały się znacznie bardziej wykonalne w badaniu dynamiki wewnątrz- i międzycząsteczkowej w żywych komórkach.