Name: Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji do wprowadzania fluorescencyjnych biomolekuł do żywych mikroorganizmów. Technika umożliwia wizualizację DNA i białek w komórkach, badanie ich dynamiki i lokalizacji w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Stephanowi Uphoffowi za dyskusje. 
R.C. był wspierany przez Linacre College, Oxford University. A.P. był wspierany przez Niemiecką Centralę Wymiany Akademickiej (DAAD), Niemiecką Narodową Fundację Akademicką i EPSRC. M.S. był wspierany przez Wellcome Trust. A.N.K. był wspierany przez brytyjski grant BBSRC (BB/H01795X/1) oraz grant Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych Starter (261227).

<ol><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Leake, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+and+turnover+in+single%2C+functioning+membrane+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li>
<li>Taniguchi, Y., Kawakami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+HaloTag+protein+to+covalent+immobilization+of+recombinant+proteins+for+single+molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Application of HaloTag protein to covalent immobilization of recombinant proteins for single molecule force spectroscopy.</a> Langmuir. 26, 10433-10436 (2010).</li>
<li>Xie, X. S., Choi, P. J., Li, G. W., Lee, N. K., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+approach+to+molecular+biology+in+living+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biophysics%22%5BJournal%5D)">Single-molecule approach to molecular biology in living bacterial cells.</a> Annual review of biophysics. 37, 417-444 (2008).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+subcellular+RNA+sequencing+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed subcellular RNA sequencing in situ.</a> Science. 343, 1360-1363 (2014).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+microscopy+coming+of+age%3A+from+concepts+to+biological+impact%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Localization microscopy coming of age: from concepts to biological impact.</a> J Cell Sci. 126, 3505-3513 (2013).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Hao Chen, K., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localizationbased+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localizationbased super-resolution imaging.</a> Nat Meth. 8, 1027-1041 (2011).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Meth. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+molecules+at+cell+division+reveals+native+protein+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization.</a> Nat. Methods. 9, 480-482 (2012).</li>
<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+Parallel+Single-Cell+RNA-Seq+for+Marker-Free+Decomposition+of+Tissues+into+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Massively Parallel Single-Cell RNA-Seq for Marker-Free Decomposition of Tissues into Cell Types.</a> Science. 343, 776-779 (2014).</li>
<li>Aldridge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHT-ChIP-seq%3A+a+completely+automated+robotic+protocol+for+high-throughput+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation.</a> Genome Biol. 14, R124(2013).</li>
<li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).</li>
<li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nat. Methods. 7, 717-719 (2010).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+the+site-specific+modification+of+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo.</a> Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+incorporating+macromolecules+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A method for incorporating macromolecules into adherent cells.</a> J Cell Biol. 98, 1556-1564 (1984).</li>
<li>Clarke, M. S., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syringe+loading+introduces+macromolecules+into+living+mammalian+cell+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Syringe loading introduces macromolecules into living mammalian cell cytosol.</a> J Cell Sci. 102, 533-541 (1992).</li>
<li>Sakon, J. J., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+the+conformation+of+individual+proteins+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting the conformation of individual proteins in live cells.</a> Nat. Methods. 7, 203-205 (2010).</li>
<li>Taylor, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromagnetic+syringe%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Electromagnetic syringe.</a> IEEE Trans. Biomed. Eng. 25, 303-304 (1978).</li>
<li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16, 6127-6145 (1988).</li>
<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li>
<li>Sustarsic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+delivery+of+fluorescently+labeled+proteins+in+live+bacteria+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimized delivery of fluorescently labeled proteins in live bacteria using electroporation.</a> Histochem Cell Biol. , (2014).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat. Methods. 5, 159-161 (2008).</li>
<li>Sinha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+DNA-binding+proteins+for+sexual+commitment+and+development+in+Plasmodium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium.</a> Nature. 000, 1-5 (2014).</li>
<li>English, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+investigations+of+the+stringent+response+machinery+in+living+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E365-E373 (2011).</li>
<li>Crawford, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+intracellular+single-molecule+fluorescence+using+electroporated+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Long-lived intracellular single-molecule fluorescence using electroporated molecules.</a> Biophys J. 105, 2439-2450 (2013).</li>
<li>Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+DNA+repair+in+live+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule DNA repair in live bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 8063-8068 (2013).</li>
<li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Protein-DNA+Interactions+in+Live+Bacterial+Cells+Using+Photoactivated+Single-molecule+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Hohlbein, J., Gryte, K., Heilemann, M., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+on+a+new+wave+of+single-molecule+fluorescence+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Surfing on a new wave of single-molecule fluorescence methods.</a> Phys Biol. 7, 031001(2010).</li>
<li>Xie, X. S., Yu, J., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective+-+Living+cells+as+test+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Perspective - Living cells as test tubes.</a> Science. 312, 228-230 (2006).</li>
<li>Santoso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+transitions+in+DNA+polymerase+I+revealed+by+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 715-720 (2010).</li>
<li>Hohlbein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+landscapes+of+DNA+polymerase+I+and+mutator+derivatives+establish+fidelity+checkpoints+for+nucleotide+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Conformational landscapes of DNA polymerase I and mutator derivatives establish fidelity checkpoints for nucleotide insertion.</a> Nature communications. 4, 2131(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wiele parametrów może być zmienianych podczas elektroporacji ogniw i pozyskiwania danych w zależności od systemu biologicznego będącego przedmiotem zainteresowania i dokładnego charakteru eksperymentu (analiza na poziomie komórki lub pojedynczej cząsteczki). Na przykład, podczas elektroporacji DNA do bakterii, 0,25 do 5 pmol znakowanych fragmentów dsDNA prowadzi do niskiej wydajności internalizacji, umożliwiając bezpośrednie wykrywanie pojedynczych cząsteczek (tj. bez konieczności wcześniejszego fotowybielania). Powyżej 5 pmol dsDNA komórki są zwykle mocno obciążone, co lepiej nadaje się do analizy pojedynczych komórek. Wszystkie znakowane DNA powinny być również uprzednio oczyszczone żelem w celu usunięcia wszelkich śladów wolnego barwnika (nieprzereagowanego fluoroforu) z roztworu podstawowego DNA. Poza tym potencjalne problemy z degradacją DNA, szczególnie w przypadku eksperymentów smFRET, można rozwiązać, stosując DNA z nienaturalnymi kwasami nukleinowymi lub motywami, które chronią końcówki dostępne dla egzonukleazy, takie jak pętle spinki do włosów.
Kolejnym regulowanym parametrem w elektroporacji jest natężenie pola przyłożone podczas elektroporacji. Niskie natężenie pola (~1 kV/cm) doprowadzi do niskiej wydajności obciążenia odpowiedniej dla badań pojedynczych cząsteczek. Wyższe natężenie pola (do 1,8 kV/cm) zwiększy wydajność obciążenia; jednak istnieje odwrotna korelacja między natężeniem pola a żywotnością ogniwa po elektroporacji (patrz rysunek 4). Dla porównania, normalne natężenie pola stosowane do elektroporacji bakterii i drożdży wynosi ~1,5 kV/cm. Stała czasowa, reprezentująca długość tego rozpadu, jest wygodnym parametrem do naśladowania, ponieważ stała czasowa spada, gdy tylko w kuwecie wystąpi jakiekolwiek zjawisko łukowe. Przy normalnych ustawieniach stała czasowa powinna być większa niż 4 ms; Niższe wartości doprowadzą do niskiej wydajności ładowania, a nawet do nieobciążonych uszkodzonych ogniw. Większość elektroporatorów oferuje inne stopnie swobody (takie jak "obcinanie impulsów" lub "kształt impulsu"), które można modyfikować w celu dostrojenia zarówno obciążenia ogniwa, jak i żywotności. Zastosowaliśmy tę metodę zarówno do bakterii, jak i drożdży, jednak podobne procedury powinny również umożliwić internalizację znakowanych biomolekuł w komórkach ssaków przy użyciu odpowiednich ustawień elektroporatora, ponieważ ich błona jest w rzeczywistości mniej złożona (pojedyncza dwuwarstwa lipidowa) i ponieważ elektroporacja była już stosowana w takich komórkach 21.
Podczas internalizacji znakowanych białek cały wolny barwnik musi zostać usunięty ze znakowanego roztworu podstawowego białka przed elektroporacją. Wolne cząsteczki barwnika, ze względu na swój mniejszy rozmiar, mogą być internalizowane preferencyjnie w stosunku do białek będących przedmiotem zainteresowania i są trudne do odróżnienia podczas analizy danych (pomimo ich oczekiwanej szybszej dyfuzji). Orientacyjnie, aby próbka białka znakowanego organicznie nadawała się do elektroporacji, ilość pozostałego wolnego barwnika powinna wynosić poniżej 2% (wykryta za pomocą skanowania fluorescencyjnego SDS-PAGE)22. Proces ten jest szczególnie ważny, ponieważ niektóre cząsteczki mogą przyklejać się do zewnętrznych błon elektroporowanych bakterii lub drożdży. W związku z tym ujemna próbka kontrolna powinna wykazywać intensywność fluorescencji na komórkę wyraźnie niższą niż w przypadku komórek poddanych elektroporacji, najlepiej tak niską, jak poziom autofluorescencji pustych komórek (komórek, które nie były inkubowane z żadnymi biomolekułami znakowanymi fluorescencyjnie ani elektroporowane, rysunek 2).
Podobnie jak w przypadku dsDNA, skuteczność internalizacji znakowanych białek jest związana z ilością biomolekuł dodanych do komórek przed elektroporacją. Jednak inne parametry, takie jak rozmiar i ładunek, odgrywają rolę w internalizacji. Małe białka wykazują wysoką wydajność internalizacji, podczas gdy większe białka (do 98 kDa) mogą być z powodzeniem internalizowane, ale z niższą wydajnością (ryc. 5)26. Izoloelektryczny punkt białka, potencjalne interakcje z błoną komórkową i inne parametry fizykochemiczne również wpływają na obciążenie komórki podczas elektroporacji. W rezultacie, użytkownicy muszą zoptymalizować eksperymenty dla własnego systemu, wiedząc, że wysokie początkowe stężenie znakowanego białka (>50 μM) da największą szansę na pomyślne załadowanie. Elektroporacja oferuje również nowe narzędzie do zaburzania i analizowania funkcji komórkowych poprzez wprowadzanie białek i innych biomolekuł do komórek (znakowanych lub nieznakowanych). Eksperymenty z polimerazą RNA T7 (ryc. 5C) stanowią taki przykład eksperymentu, w którym możemy wprowadzić biomolekułę, która może zmienić ekspresję genów in vivo za pomocą elektroporacji.
Podczas wykonywania eksperymentów z fluorescencją pojedynczych cząsteczek, oświetlenie TIR jest zwykle preferowane w stosunku do innych trybów oświetlenia, ponieważ oferuje najlepszy stosunek sygnału do szumu poprzez wzbudzanie tylko fluoroforów w cienkim odcinku nad powierzchnią szkiełka nakrywkowego (~100 nm). Jednak obrazowanie znakowanych biomolekuł dyfundujących wewnątrz żywych mikroorganizmów może wymagać głębszego oświetlenia (do 0,8 μm w przypadku E. coli). Głębsze oświetlenie uzyskuje się w trybie HILO, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiego stosunku sygnału do szumu. Z drugiej strony, obrazowanie szerokokątne jest szczególnie ważne w krokowej analizie fotowybielania, w której użytkownik szacuje liczbę zinternalizowanych cząsteczek poprzez fotowybielanie całej załadowanej komórki za pomocą dużej mocy lasera i podzielenie początkowej intensywności fluorescencji komórki przez jednostkową intensywność wytwarzaną przez pojedynczą cząsteczkę (pojedynczy etap fotowybielania, rysunek 3). Obrazowanie szerokokątne jest również wymagane do długoterminowego śledzenia cząsteczek w celu zlokalizowania dyfuzyjnych cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania, nawet jeśli ich trajektorie obejmują całą objętość komórki.
W tym protokole przedstawiamy, w jaki sposób elektroporacja, standardowa technika dostarczania kwasów nukleinowych do komórek stosowana przez biologów i biochemików, stanowi prostą metodę dostarczania fluorescencyjnych biomolekuł w różnych typach komórek. Ta nowatorska, wysokoprzepustowa technika oferuje unikalne narzędzie do obserwacji znakowanych cząsteczek w ich naturalnym środowisku. Oprócz biomolekuł znakowanych fluoroforami obejmującymi szeroki zakres długości fal, elektroporacja może dostarczać cząsteczki zmodyfikowane wieloma grupami chemicznymi, takimi jak nienaturalne nukleotydy i aminokwasy, chelatory metali, środki sieciujące i grupy klatkowe. Jeśli interesujący nas system biologiczny nie jest niezbędny do rozwoju komórki, gen kodujący białko docelowe może również zostać usunięty (lub powalony), zapewniając, że białka obserwowane po internalizacji reprezentują całość (lub większość) wewnątrzkomórkowej puli białkowej. Zasadniczo elektroporacja może "przeszczepić" elastyczność biokoniugatów in vitro do żywych komórek, a tym samym przynieść korzyści wysiłkom w dziedzinie biologii syntetycznej, biologii systemowej i wykrywania pojedynczych cząsteczek in vivo .

Większość badań fluorescencyjnych wewnątrz żywych komórek opiera się na fuzjach białek z białkami fluorescencyjnymi (FP), takimi jak GFP1. Znaczniki fluorescencyjne te umożliwiają badanie liczby kopii, wzorca dyfuzji lub lokalizacji białek zaangażowanych w procesy takie jak ekspresja genów lub transport błonowy2-7. Białka FP oferują wysoką specyficzność znakowania, łatwość implementacji i są dostępne w szerokim zakresie wariantów o różnych właściwościach fotofizycznych i chemicznych1. Jednak organiczne fluorofory pozostają głównym wyborem w eksperymentach in vitro ze względu na ich większą fotostabilność (do 100-krotnie większą niż w przypadku FP)8,9, niewielki rozmiar (do 100-krotnie mniejsza objętość niż FP) i łatwość znakowania wewnątrzmolekularnego (głównie poprzez wykorzystanie reszt cysteiny). Wszystkie te czynniki są szczególnie istotne w badaniach fluorescencji pojedynczych cząsteczek oraz w badaniach FRET10.
W ciągu ostatniej dekady wprowadzono kilka metod internalizacji łączących zalety znakowania organicznego i detekcji in vivo; jednak metody te albo wykorzystują stosunkowo duże znaczniki polipeptydowe (np. TMP, HALO lub znaczniki SNAP o masie 20 kDa)11-14, wymagają zastosowania nienaturalnych aminokwasów15, albo są ograniczone do dużych, jednobłonowych komórek eukariotycznych (np. ładowanie przez zdrapywanie, ładowanie strzykawką, mikroiniekcja)16-19.
Niniejszy protokół opisuje nową, prostą i wysokoprzepustową metodę internalizacji, która łączy zalety organicznych fluoroforów z obserwacją in vivo. Aby opracować tę technikę, dostosowaliśmy procedurę elektroporacji powszechnie stosowaną do transformacji komórek plazmidowym DNA20,21, w celu wprowadzenia do mikroorganizmów, takich jak E. coli lub S. cerevisiæ, biomolekuł znakowanych organicznie. Protokół składa się z 4 prostych kroków: inkubacji komórek ze znakowanymi biomolekułami, elektroporacji, regeneracji komórek oraz płukania komórek w celu usunięcia biomolekuł niezinternalizowanych. Przedstawiamy tutaj ten protokół elektroporacji, a także procesy obrazowania komórek i analizy danych w celu badania sygnałów fluorescencji i FRET na poziomie pojedynczych cząsteczek oraz w obrębie komórek.
Elektroporacja opiera się na rozładowaniu pola elektrycznego o wysokim napięciu w zawiesinie komórkowej o niskiej sile jonowej, co prowadzi do powstania przejściowych porów w błonie, przez które biomolekuły mogą wnikać do wnętrza komórek (Rysunek 1)20,21. Podobnie jak w przypadku transformacji bakterii lub drożdży za pomocą plazmidowego DNA, komórki muszą zostać odpowiednio przygotowane przed elektroporacją, aby zapewnić ich elektrokompetencję. Procedura ta, składająca się z kilku etapów płukania wodą, zwiększa przepuszczalność błony i obniża siłę jonową roztworu komórkowego, co pozwala uniknąć powstawania łuku elektrycznego w kuwecie do elektroporacji. W niniejszym protokole komórki można przygotować zgodnie z opisem poniżej (patrz PROTOKÓŁ: 1.1) lub nabyć od dostawców komercyjnych.
<img alt="Schemat elektroporacji bakterii; inkubacja, zestaw do elektroporacji; przygotowanie do mikroskopii." src="/files/ftp_upload/52208/52208fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny przedstawienie protokołu internalizacji. Od lewej do prawej: dodanie kilku mikrolitrów znakowanych biomolekuł do aلیکwoty komórek elektrokompetentnych (w tym przykładzie podwójnie znakowane fragmenty DNA i bakterie); inkubacja od 1 do 10 min w lodzie i przeniesienie do schłodzonej wcześniej kuwety do elektroporacji; elektroporacja, a następnie natychmiastowe dodanie 0,5-1 ml pożywki bogatej do komórek; inkubacja w 37 °C (lub w temperaturze wymaganej przez organizm, np. 29 °C dla drożdży) w celu regeneracji komórek; wykonanie 5 etapów przemywania w celu usunięcia nadmiaru niezinternalizowanych cząsteczek znakowanych; resuspensja końcowego osadu w 100-200 μl buforu PBS i nanieśnienie 10 μl na podkładkę agarozową; przykrycie podkładki oczyszczoną lamelką i obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (w trybie wide field lub trybie HILO).
Komórki elektrokompetentne inkubuje się z znakowanymi biomolekułami bezpośrednio przed elektroporacją, którą można przeprowadzić przy użyciu standardowych elektroporatorów dostępnych w większości laboratoriów biochemicznych. Bezpośrednio po elektroporacji komórki inkubuje się w bogatym podłożu, aby umożliwić ich regenerację przed płukaniem (Rysunek 1). Nadmiar niezinternalizowanych znakowanych biomolekuł jest najpierw usuwany poprzez płukanie w buforze zawierającym dość wysokie stężenie soli oraz detergent (zob. PROTOKÓŁ: 3.3). Obecność soli zaburza niespecyficzne oddziaływania elektrostatyczne tworzone przez niezinternalizowane znakowane biomolekuły, które w przeciwnym razie mogłyby przylegać do błony zewnętrznej. Podobnie obecność detergentu w buforze do płukania zaburza niespecyficzne oddziaływania hydrofobowe.
Podczas gdy internalizacja DNA jest prostym procesem (Rycina 2), przy internalizacji znakowanych białek za pomocą elektroporacji należy zachować ostrożność. Po pierwsze, roztwór zapasowy organicznie znakowanego białka może wciąż zawierać niewielki odsetek wolnego barwnika. Cząsteczki wolnego barwnika są znacznie mniejsze od białek i mogą być zatem internalizowane preferencyjnie. Aby upewnić się, że zdecydowana większość obserwowanych zinternalizowanych cząsteczek fluorescencyjnych odpowiada badanemu białku, początkowa próbka białka powinna zawierać mniej niż ~2% wolnego barwnika (Rycina 5)22. Nadmiar niezinternalizowanych znakowanych białek może również przylegać do zewnętrznej błony komórkowej po elektroporacji; zjawisko to jest specyficzne dla danego białka i musi być sprawdzane dla każdego nowego białka. Proponujemy kilka opcji umożliwiających usunięcie niezinternalizowanych białek z obciążonej próbki komórek (Patrz PROTOKÓŁ: 3.3.3).
Na koniec komórki resuspensuje się w niewielkiej objętości buforu fosforanowego i nanosi pipetą na podkładkę agarozową, co umożliwia ich obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Immobilizacja na podkładkach agarozowych jest prostym i wydajnym sposobem obrazowania komórek na szkiełku nakrywkowym bez naruszania ich integralności. Podkładka powinna zawierać ośrodek hodowlany o niskiej fluorescencji.
Obrazowanie komórek można przeprowadzić w szerokim polu, przy użyciu fluorescencji całkownego wewnętrznego odbicia (TIRF) lub mikroskopii HILO (Highly Inclined and Laminated Optical Sheet). W konfiguracji HILO wiązka laserowa wnika głębiej w preparat niż w TIRF, jednak nie oświetla całej próbki tak jak w przypadku szerokiego pola, co pozwala na uzyskanie wyższego stosunku sygnału do szumu23. W zależności od zastosowanej mocy lasera i rozdzielczości czasowej, można zliczać zinternalizowane biomolekuły (wykorzystując analizę stopniowego fotoblaknięcia, Rysunek 3), lokalizować je lub śledzić ich ruch24-28. Internalizacja dwukrotnie znakowanych konstruktów z parą fluoroforów FRET umożliwia ilościowe określenie FRET zarówno na poziomie pojedynczych komórek, jak i pojedynczych cząsteczek (Rysunek 6).
Różne parametry można modyfikować w zależności od pożądanego efektu oraz badanego systemu biologicznego. Po pierwsze, ilość zinternalizowanego materiału na komórkę można dostosować poprzez zmianę stężenia znakowanych biomolekuł dodawanych do komórek przed elektroporacją (Rycina 2). Natężenie pola elektroporacyjnego wpływa również zarówno na wydajność wprowadzania, jak i na żywotność komórek; zgodnie z oczekiwaniami, podczas gdy wydajność wprowadzania rośnie wraz ze wzrostem natężenia pola, żywotność elektroporowanych komórek maleje (Rycina 4A). Oba parametry można określić ilościowo, rejestrując procent komórek z wprowadzonym materiałem oraz komórek dzielących się po elektroporacji. Test żywotności połączony z obrazowaniem fluorescencyjnym pozwala również potwierdzić obecność zinternalizowanych biomolekuł w żywych komórkach i umożliwia ciągłą obserwację przez kilka pokoleń (Rycina 4B).
Podsumowując, niniejszy protokół umożliwia internalizację znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek DNA i białek do E.coli lub S. cerevisiæ26. Pojedyncze cząsteczki znakowane organicznymi fluoroforami mogą być śledzone z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną w skalach czasowych o rząd wielkości dłuższych niż w przypadku białek fluorescencyjnych (FP). Wreszcie, metoda ta jest kompatybilna z detekcją szerokopolową, TIRF i konfokalną, a także ze schematami wzbudzania impulsowego, takimi jak ALEX (naprzemienne wzbudzanie laserowe28,29).

<table><tbody><tr><td>ElectroMax DH5-alfa Comptent ogniwa</td><td>Invitrogen</td><td>11319-019</td><td>lub inne komercyjne lub laboratoryjne bakterie elektrokompetentne lub drożdże.</td></tr><tr><td>EZ Rich Defined Madia</td><td>Teknova</td><td>M2105</td><td>niskofluorescencyjny</td></tr><tr><td>aparat do elektroporacji MicroPulser rich media&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>165-2100</td><td>lub dowolny klasyczny elektroporator do transformacji mikroorganizmów</td></tr><tr><td>Certyfikowany Biologia Molekularna agaroza</td><td>Biorad</td><td>161-3100</td><td>agaroza niskofluorescencyjna do podkładki agarozowej</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe mikroskopowe nr 1,5 grubości</td><td>Menzel</td><td>BB024060SC</td><td>usuwa cząstki tła poprzez podgrzewanie szkiełek w piecu w temperaturze 500 &; C for 1h</td></tr><tr><td>Jednocząsteczkowy mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zbudowany</td><td></td><td>w domu opisany w REFs</td></tr><tr><td>Oprogramowanie lokalizacyjne</td><td>Specjalnie napisany, dostępny online</td><td></td><td>pakiet oprogramowania MATLAB i C++, który można dostosować do analizy lokalizacji.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie śledzące</td><td>Dostępne online</td><td></td><td>wdrożenie MATLAB przez Blair i Dufresne.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

Możliwość badania biomolekuł in vivo jest kluczowa dla zrozumienia ich funkcji w kontekście biologicznym. Jedno z zaawansowanych podejść polega na fuzji cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania z białkami fluorescencyjnymi, takimi jak GFP, w celu zbadania ich ekspresji, lokalizacji i funkcji. Jednak GFP i jego pochodne są znacznie większe i mniej fotostabilne niż fluorofory organiczne zwykle stosowane w eksperymentach in vitro, co może ograniczać zakres badań. 
Niedawno wprowadziliśmy prostą, wszechstronną i wysokowydajną metodę opartą na elektroporacji, pozwalającą na internalizację biomolekuł znakowanych organicznymi fluoroforami w żywych mikroorganizmach. Tutaj opisujemy, jak używać elektroporacji do internalizacji znakowanych fragmentów DNA lub białek do Escherichia coli i Saccharomyces cerevisiæ, jak określić ilościowo liczbę zinternalizowanych cząsteczek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz jak określić ilościowo żywotność komórek poddanych elektroporacji. Dane można uzyskać na poziomie pojedynczej komórki lub pojedynczej cząsteczki za pomocą fluorescencji lub FRET. Przedstawiono również możliwość internalizacji nieznakowanych cząsteczek, które wywołują fizjologicznie obserwowalną odpowiedź in vivo. Na koniec omówiono strategie optymalizacji protokołu dla określonych systemów biologicznych.

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

Celem tej procedury jest internalizacja i wizualizacja biomolekuł, takich jak DNA lub białka znakowane organicznym fluorem, wewnątrz żywych mikroorganizmów przy użyciu metody opartej na elektroporacji. Osiąga się to poprzez najpierw inkubację elektrokompetentnych komórek z fluorescencyjnie znakowanymi biomolekułami przed przeniesieniem ich do elektroporacji. Poprzez przyłożenie wysokiego napięcia do wete, przejściowe formacje porów zarówno na ścianie komórkowej, jak i błonie komórkowej umożliwią dyfuzję biomolekularną do komórek.Następnie komórki są inkubowane w bogatym pożywce, aby umożliwić im regenerację przed usunięciem nadmiaru niezinternalizowanych biomolekuł. Na koniec komórki są przenoszone na podkładkę z minimalną ilością składników odżywczych o niskiej fluorescencji, a następnie na wierzch nakłada się szklane szkiełko nakrywkowe, tworząc szklaną kanapkę agro. Ostatecznie mikroskopia esencji służy do analizy lokalizacji, wzoru dyfuzji i właściwości dynamicznych znakowanych biomolekuł wewnątrz żywych komórek.Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę z ograniczeń w obrazowaniu żywych komórek. Ze względu na szybkie zacinanie się białek fotofluorescencyjnych, takich jak GFP, doszliśmy do wniosku, że ładując żywe komórki biomolekułami znakowanymi organiczną siłą fluoru, przeszczepimy żywe mikroorganizmy. Główne zalety tej siły to jasność, stabilność zdjęcia i niewielkie rozmiary.Mamy nadzieję, że uda nam się śledzić lokalizację i dyfuzję DNA lub białek w ich rodzimym środowisku w znacznie dłuższych skalach czasowych, co pasowałoby do wielu ważnych procesów biologicznych. Główną przewagą tych technik nad istniejącymi metodami, takimi jak mikroiniekcja, jest to, że można ją również stosować do mikroorganizmów, które są mniejsze niż średnica typowej igły do mikroiniekcji. Dodatkową zaletą elektroporacji jest to, że duża liczba komórek może być jednocześnie załadowana fluorescencyjnymi biomolekułami i równolegle wizualizować te, które sprawiają, że elektroporacja jest szczególnie ocznym technikiem przepustowości.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w dyfuzję i dynamikę biomolekuł znakowanych fluorescencyjnie in vivo, może być również stosowana w innych kontekstach, takich jak biomolekuły elektrod, które nie są znakowane, ale może na przykład wywołać reakcję fizjologiczną, gdy zostaną zinternalizowane przez komórkę Aby skonstruować podkładki aros do mikroskopii fluorescencyjnej bakterii lub drożdży, zacznij od przygotowania około dwóch pożywek o niskiej fluorescencji, Następnie natychmiast rozpuść roztwór 2%aros w wodzie destylowanej za pomocą laboratoryjnej kuchenki mikrofalowej. Dodaj jedną pasującą objętość gorącego róży kwasu hialuronowego do podłoża i delikatnie pipetuj mieszaninę w górę iw dół. Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, należy natychmiast odpipetować około 200 mikrolitrów powstałej mieszaniny na szkiełko nakrywkowe mikroskopu o standardowym rozmiarze.Pozostaw szkiełko nakrywkowe na stole na minutę w temperaturze pokojowej, aż żel zestali się lub tymczasowo przechowuje, umieść drugi oczyszczony szkiełko nakrywkowe na świeżej podkładce i delikatnie dociśnij od góry, aby rozpłysnąć się w róży jajowej, zaczynając od zapasu fluorescencyjnych biomolekuł przygotowanych w buforze o niskiej sile jonowej. Przenieś do pięciu mikrolitrów biomolekuł do 20 mikrolitrów podwielokrotności kompetentnych bakterii lub 50 mikrolitrów kompetentnych komórek drożdży. Ilość biomolekuł fluorescencyjnych inkubowanych z komórkami jest bezpośrednio skorelowana z ilością biomolekuł zinternalizowanych na komórkę.Po elektroporacji inkubować mieszaninę na lodzie przez maksymalnie 10 minut. W tym samym czasie należy dobrać akumulator do elektroporacji o odpowiednim rozstawie elektrod i schłodzić na lodzie. Przenieś mieszaninę komórek do wstępnie schłodzonego vete.Delikatnie postukaj w vete kilka razy, aby usunąć wszelkie pęcherzyki z roztworu. Usuń wilgoć z weterynarza ręcznikiem papierowym i umieść weterynarza w elektroatorze. Zastosuj impuls wysokiego napięcia do ogniw zaraz po tym procesie.Sprawdź, czy stała czasowa wyświetlana na elektroatorze wynosi od czterech do sześciu milisekund. Niższe stałe czasowe są często spowodowane obecnością nadmiaru soli lub pęcherzyków w qve, co może zmniejszyć lub całkowicie zahamować wchłanianie biomolekuł do komórek. Impulsy o wyższym napięciu poprawiają obciążenie ogniwa, ale mogą również wpływać na żywotność ogniwa bezpośrednio po elektroporacji.Dodaj 500 mikrolitrów multimediów i przenieś komórki do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Pozwól błonie komórkowej zregenerować się, inkubując bakterie w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub drożdże w temperaturze 29 stopni Celsjusza przez dwie do 10 minut. Po włączeniu biomolekuły i przywróceniu wzrostu, wiruj komórki przez jedną minutę w wirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzuć środek Reese.Zawiesić osad w buforze o pojemności 500 mikrolitrów i powtórzyć procesy odkręcania i usuwania oraz zawieszania rezu buforowego. Jeszcze trzy razy. Te etapy płukania usuną wszelkie ślady niezinternalizowanych biomolekuł z zawiesiny komórkowej.W przypadku znakowanego białka internalizacja i dodatkowe oczyszczanie etap odbywa się poprzez pipetowanie zawiesiny komórkowej do 1,5-mililitrowej rurki wyposażonej w filtr membranowy 0,22 mikrona na górze. Oddziel komórki od buforu przez odwirowanie, upewniając się, że nad filtrem pozostała wystarczająca ilość płynu, aby uniknąć wysychania komórek i odrzucenia przepływu przez frakcję. Poniżej filtra dodaj 500 mikrolitrów świeżego PBS na komórki i powtórz kombinację wirowania, a następnie świeżej edycji PBS.Jeszcze dwa razy. Wykonaj ostatnie wirowanie w dół przy 3 300 G przez jedną minutę. Aby usunąć poprzednie płukanie PBS, ponownie zawieś ogniwa za pomocą 150 mikrolitrów PBS.Na koniec zdejmij górną szkiełko nakrywkowe z wcześniej wykonanej podkładki aros. Załaduj komórki na podkładkę, pipetując kroplami 10 mikrolitrów zawiesiny komórek. Po umieszczeniu nowego, oczyszczonego szkiełka nakrywkowego na wierzchu podkładki rozsianej, komórki warstwowe są teraz gotowe do mikroskopii fluorescencyjnej.Kontrole ujemne, takie jak kontrole nieocenione, które były inkubowane z oznakowanymi biomolekułami lub pustymi komórkami, które nie zostały poddane ocenie elektrycznej ani inkubacji, powinny być również przygotowywane równolegle z dowolnymi załadowanymi próbkami, załadowane komórki można obrazować pod dowolnym odpowiednim mikroskopem fluorescencyjnym. Natomiast tryb obrazowania szerokokątnego umożliwia obrazowanie i analizę na poziomie komórek, przy wysokim oświetleniu lub optymalnym do obserwacji i śledzenia pojedynczych cząsteczek. Aby zapobiec nadmiernemu fotowybielaniu biomolekuł, przed załadowaniem próbki należy upewnić się, że wszystkie oświetlenie laserowe na scenie jest wyłączone lub zablokowane nieprzezroczystym filtrem.Ponadto wyłącz wzmocnienie aparatu E-M-C-C-G, aby zapobiec uszkodzeniu aparatu przez nadmierną ekspozycję. W przypadku mikroskopu odwróconego umieść kanapkę z podkładką Aris na stoliku mikroskopu stroną zakrytą komórką skierowaną w dół w kierunku dolnego obiektywu. Następnie włącz górne światło halogenowe i ustaw ostrość komórek w trybie mikroskopii światła przechodzącego białego przed włączeniem lasera, zrób zdjęcie komórek w trybie transmisji światła białego.Zdjęcie to zostanie wykorzystane jako pozycyjna mapa referencyjna, która będzie korelować regiony fluorescencji biomolekularnej z rzeczywistymi lokalizacjami komórek w tym samym polu widzenia. Do pomiaru żywotności należy użyć grzałki obiektywowej ustawionej na optymalną temperaturę i rejestrować sekwencyjne obrazy tego samego pola widzenia przy oświetleniu światłem białym co 30 minut bez przesuwania stolika, wyłączyć górne oświetlenie górne i chronić próbkę przed wszystkimi innymi źródłami światła otoczenia w laboratorium. Następnie włącz kamerę CCD i rozpocznij akwizycję danych.Rozpocznij rejestrację jonu fluorescencyjnego tuż przed włączeniem oświetlenia laserowego. Po wykonaniu mikroskopii fluorescencyjnej rozpocznij analizę danych, otwierając wszystkie zdjęcia za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu, takiego jak Image J, aby rozpocząć normalizację wszystkich podstawowych parametrów obrazu, takich jak jasność lub kontrast na wszystkich obrazach, naciskając przycisk set i wybierz propagację do wszystkich innych obrazów. Opcja pierwsza może jakościowo ustalić, czy ładowanie ogniw się powiodło, ponieważ załadowane ogniwa powinny być znacznie jaśniejsze niż ogniwa nieelektroporowane użyte jako kontrola negatywna dla danego obrazu.Użyj narzędzia do zaznaczania odręcznego i okrąż różne obszary fluorescencji ręcznie rysowanymi wielokątami. Porównaj intensywność fluorescencji między wszystkimi istotnymi wielokątami, wybierając opcję pomiaru z menu analizy. Powtórz ten proces ręcznie lub za pomocą automatycznego skryptu, aby wyodrębnić intensywność na piksel wszystkich komórek w każdej próbce i kontrolach ujemnych.Gdy ogniwo o mocy znamionowej jest załadowane jedną lub kilkoma biomolekułami fluorescencyjnymi, jego średnia intensywność emisji będzie większa niż średnia intensywność ujemnej próbki kontrolnej. Aby ręcznie ocenić żywotność komórek, należy ręcznie policzyć procent podziału nienaruszonych przez niedzielące się i uszkodzone komórki. W tym samym polu widzenia, dla którego dane były rejestrowane co 30 minut w kilku podziałach, nie zawsze jest możliwe bezpośrednie policzenie liczby biomolekuł zinternalizowanych na komórkę, szczególnie gdy biomolekuły szybko dyfundują lub gdy komórki są załadowane więcej niż pięcioma znakowanymi biomolekułami.Analiza fotowybielania na podstawie komórek pozwala na ocenę liczby znakowanych biomolekuł na komórkę w takich warunkach. Za pomocą przycisku wyboru odręcznego prześledź kontur danej komórki fluorescencyjnej oraz wyodrębnij i wykreśl fluorescencję surowej komórki w funkcji czasu spowodowanej efektami fotowybielania. Wykres intensywności w funkcji czasu będzie wykładniczo malejącą krzywą, mocno obciążonymi komórkami, ale w przypadku komórek zawierających mniej niż 10 biomolekuł powinny być widoczne wyraźne kroki.Oblicz średnią autofluorescencję po fotowybielaniu, uśredniając wartości surowej intensywności fluorescencji w pobliżu płaskiego końca eksperymentu, która może pochodzić na przykład z ostatnich 50 do 100 klatek obrazu w serii poklatkowej. Po określeniu intensywności linii bazowej należy obliczyć intensywność fotowybielania zależną od czasu, odejmując bazową autofluorescencję od surowych danych fluorescencji, a następnie zablokować wynikowe dane dotyczące intensywności fotowybielania i określić wysokość każdego kroku ręcznie lub za pomocą algorytmu. Proces ten należy powtórzyć dla kilku komórek wykazujących łącznie więcej niż 100 kroków, aby uzyskać dokładne oszacowanie średniej wysokości stopnia, wartość ta odpowiada jednostkowej intensywności fluoro four spowodowanej bieleniem pojedynczego fluoro four.Wreszcie, liczbę zinternalizowanych cząsteczek na komórkę można obliczyć, dzieląc podstawową odjętą intensywność komórek w czasie równym zero przez unitarny fluor. Cztery intensywności dla tego protokołu elektroporacji. Ilość znakowanego fluorescencyjnie DNA lub białka, które można zinternalizować w bakteriach lub drożdżach, można kontrolować, dostosowując ilość sond DNA obecnych w buforze do elektroporacji.Gdy szybkość internalizacji biomolekularnej jest wysoka, czas życia fotowybielania znakowanej biocząsteczki, który można znaleźć, najpierw wykreślając intensywność fluorescencji w funkcji czasu, a następnie wyodrębniając jej wykładniczą stałą czasową, daje informacje o fotostabilności barwników in vivo. W przypadku niskich wskaźników inkorporacji, kwantyzacja intensywności fluorescencji zapewni środki do przybliżenia całkowitej liczby biomolekuł w danej komórce. Elektroporacja może być również stosowana do włączania białek do bakterii lub drożdży.W przypadku białka znakowanego fluorescencyjnie. Ponieważ wolne fluorofory same w sobie mogą być bardzo skutecznie internalizowane, ważne jest, aby usunąć cały nadmiar wolnych i niekowalencyjnie przyłączonych fluoroforów z zapasu białka. Wreszcie, podwójnie znakowane przez nasze cząsteczki mogą być również internalizowane za pomocą naszej metody, aby umożliwić obserwację progów pojedynczej cząsteczki w żywych komórkach przez kilka sekund.Próbując tej procedury, należy pamiętać o przygotowaniu i analizie próbek kontrolnych, takich jak komórki nieelektrokomórkowe, które są inkubowane ze znakowaną biomolekułą lub puste komórki, które nie są ani elektroporowane, ani inkubowane ze znakowaną cząsteczką. Te kontrole pozwalają nam ocenić poziom autofluorescencji komórek i niedobór etapów mycia, a jako takie są niezbędne do oceny, czy eksperyment z elektroporacją zakończył się sukcesem po jego rozwoju. Technika ta otworzyła nowe możliwości naukowcom zajmującym się biofizyką i trzecią biologią w celu zbadania dyfuzji i dynamicznego zachowania biomolekuły etykietowej w żywych mikroorganizmach.I to w skali czasowej o jeden do dwóch rzędów wielkości dłużej niż w przypadku białek autofluorescencyjnych, takich jak GFP. Przyczyniło się to do zwiększenia elastyczności znakowania organicznego d in vivo, dzięki czemu eksperymenty z zagrożeniami pojedynczymi cząsteczkami stały się znacznie bardziej wykonalne w badaniu dynamiki wewnątrz- i międzycząsteczkowej w żywych komórkach.

internalization-observation-fluorescent-biomolecules-living

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym materiale prezentujemy protokoły przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek na żywych komórkach bakteryjnych, co umożliwia wykrywanie, śledzenie i kwantyfikację funkcjonalnych kompleksów molekularnych.

Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych In vivo Wykorzystanie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

W niniejszym filmie prezentujemy efektywną elektrofuzję komórek in vitro za pomocą zmodyfikowanej metody adhezyjnej z wykorzystaniem elektroporacji oraz późniejszą detekcję i wizualizację sfuzowanych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Wizualizacja elektrofuzyjnej fuzji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Źródło: Aigrain, L. i in. Internalizacja i obserwacja fluorescencyjnych biomolekuł w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji.  J. Vis. Exp. (2015)Film pokazuje dostarczanie fluorescencyjnych biomolekuł do elektrokompetentnych komórek mikrobiologicznych za pomocą elektroporacji. Proces rozpoczyna się od wprowadzenia DNA lub białek oznaczonych fluoroforem do schłodzonej zawiesiny komórkowej. Następnie stosuje się impuls wysokiego napięcia, aby utworzyć tymczasowe pory błonowe,...

Dostarczanie biomolekuł fluorescencyjnej do komórek bakteryjnych za pomocą elektroporacji

Ten film demonstruje technikę elektroporacji, która wprowadza plazmidowe DNA kodujące białka fluorescencyjne do prekursorów pierwotnych komórek ziarnistych móżdżku myszy.

Dostarczanie genów in vitro za pośrednictwem elektroporacji: technika impulsów elektrycznych do wprowadzania fluorescencyjnych plazmidów kodujących białko reporterowe do hodowanych komórek

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Rozszerzanie podstaw i możliwości zastosowania Fluorescencji przez Niezwiązane Wzbudzenie z Luminescencji (FUEL) poprzez badanie odpowiednich zasad i wykazanie jej zgodności z wieloma fluoroforami i warunkami ukierunkowanymi na przeciwciała.

Krok dalej niż BRET: Fluorescencja przez niezwiązane wzbudzenie z luminescencji (FUEL)

Transformacja biolistyczna to metoda używana do generowania stabilnej integracji DNA z genomem oportunistycznego patogenu Cryptococcus neoformans poprzez rekombinację homologiczną. Zademonstrujemy biolistyczną transformację konstruktu, który ma gen kodujący kinazę octanową połączony ze znacznikiem fluorescencyjnym mCherry w C. neoformans.

Biolistyczna transformacja genu znakowanego fluorescencyjnie w oportunistyczny patogen grzybowy Cryptococcus neoformans

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Zrozumienie funkcji podstawowych procesów zachodzących w bakteriach jest wyzwaniem. Mikroskopia fluorescencyjna z barwnikami specyficznymi dla celu może dostarczyć kluczowych informacji na temat wzrostu komórek drobnoustrojów i progresji cyklu komórkowego. W tym przypadku Agrobacterium tumefaciens jest używany jako bakteria modelowa w celu podkreślenia metod obrazowania żywych komórek w celu scharakteryzowania podstawowych procesów.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu obserwacji podstawowych procesów podczas wzrostu komórek drobnoustrojów

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Elektroporacja to użycie impulsowych pól elektrycznych (PEF) do tworzenia przejściowych porów w hodowlach komórkowych w celu wprowadzenia ładunku molekularnego. Technika ta stała się ostatnio szeroko stosowana w warunkach badawczych i klinicznych. W tym miejscu opisujemy techniki elektroporacji z wykorzystaniem niedawno opracowanego "systemu cytometrii elektroporacyjnej" do wykonywania mikroskopii fluorescencyjnej na żywych komórkach.

Protokół cytometrii elektroporacyjnej do mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek z wykorzystaniem hodowli komórkowej U2 OS

Poznaj metodę elektroporacji do wprowadzania fluorescencyjnych biomolekuł do żywych mikroorganizmów. Technika umożliwia wizualizację DNA i białek w komórkach, badanie ich dynamiki i lokalizacji w czasie rzeczywistym.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Przeglądaj więcej filmów