Wykrywanie i analiza uszkodzeń DNA w mięśniach szkieletowych myszy in situ metodą TUNEL
16 grudnia 2014
Ten film opisuje preparację, przetwarzanie tkanek, cięcie i fluorescencyjne znakowanie TUNEL mięśni szkieletowych myszy. Opisano w nim również metodę półautomatycznej analizy etykietowania TUNEL.
Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie pęknięć DNA i śmierci komórki w C dwa. Osiąga się to poprzez pierwsze skrawki tkanki do trwałej ondulacji, aby umożliwić odczynnikom tunelowym wejście do jądra komórkowego. Następnie enzym TDT jest używany do kowalencyjnego przyłączania DTP do trzech głównych końców pęknięć DNA w tych komórkach.
Następnie DUTP jest oznaczany sondą fluorescencyjną. Ostatecznie dodatni sygnał tunelowy jest oznaczany ilościowo w skrawkach tkanki, co odzwierciedla względną częstotliwość pęknięć DNA w komórkach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak southern blotting lub immunohistochemia, jest to, że jest stosunkowo szybko specyficzna i zapewnia sposób na wyeliminowanie szumu i autofluorescencji.
Zacznij od zamocowania izolowanych tylnych kończyn w 4% paraformaldehydzie w PBS w 15-mililitrowej tubce, pozwól na utrwalenie przez cztery do maksymalnie 24 godzin w czterech stopniach Celsjusza. Potrzebne są tylko dwie godziny, jeśli tkanka jest embrionalna. Jednak po utrwaleniu zastąp roztwór 10% sacharozą, aby chronić tkankę przed kriogeniczną substancją i inkubować ją przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnego dnia zmień roztwór na sterylny, przefiltrowany 30% sacharozę i kontynuuj inkubację przez noc lub do momentu, gdy tylne kończyny opadną na dno probówki. Podczas osadzania ważne jest, aby tylne kończyny były całkowicie zanurzone w podłożu do zatapiania. Formy do zatapiania można umieścić bezpośrednio na suchym lodzie lub w izop pentanie na suchym lodzie w celu zamrożenia podłoża.
Podczas kriosekcji. Bloki wycinają sekcje transferowe o grubości 10 mikronów lub cieńsze, grubsze odcinki nie zostaną przeniknięte przez odczynniki do etykietowania tunelowego. Zebrać te cienkie skrawki na szkiełka podstawowe pokryte żelatyną lub wiązaniem wektorowym w temperaturze pokojowej.
Bardzo szybko przenieś szkiełka do suchego lodu w celu przechowywania. Najpierw rozmrozić szkiełko zamrożonego wycinka tkanki do temperatury pokojowej i pozostawić do wyschnięcia na 16 do 64 godzin. Gdy szkiełko osiągnie temperaturę pokojową, ponownie nawodnij sekcję w słoiku łączącym wypełnionym PBS przez 10 minut.
Powtórz ten etap nawadniania raz, a następnie ostrożnie osusz szkiełko chusteczką laboratoryjną, nie naruszając sekcji tkanki, aby przeniknąć do sekcji, umieść szkiełko w komorze wilgotnościowej i odpipetuj 50 mikrolitrów komercyjnych odczynników na bazie saponin proteolitycznych na sekcję. Nie pipetować bezpośrednio na sekcje, ponieważ może to spowodować odłączenie lub uszkodzenie. Następnie umieść mały kawałek folii para, aby rozprowadzić odczynnik.
Jeśli utworzą się bąbelki, ponownie nałóż folię para. Po godzinie pozwól szkiełku inkubować przez godzinę. Usuń odczynniki, przeprowadzając dwa pięciominutowe płukania w PBS i ostrożnie wytrzyj je do sucha.
Obok oznaczania pęknięć DNA metodą TDT użyj dostępnego na rynku zestawu. Najpierw utwórz jeden bufor XTDT i pipetuj na sekcję. Następnie inkubuj szkiełko przez pięć minut w komorze nawilżania.
Po drugie, przygotuj mieszankę do etykietowania TDT zgodnie z instrukcją zestawu lub szkiełkiem kontroli pozytywnej. Dodaj DNA do mieszanki do znakowania TDT. W przypadku szkiełka kontrolnego należy pominąć enzym TDT w mieszance.
Teraz za pomocą chusteczki usuń jak najwięcej buforu ze szkiełka i odpipetuj go na mieszance do etykietowania. 50 mikrolitrów powinno wystarczyć. Ponownie rozprowadź roztwór za pomocą paraformu, nie robiąc pęcherzyków.
Pozostaw szkiełko do inkubacji w komorze przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po trzecie, utwórz bufor jeden x stop zgodnie z instrukcjami zestawu. Po usunięciu mieszanki do etykietowania za pomocą chusteczki laboratoryjnej dodaj od dwóch do 300 mikrolitrów mieszanki zatrzymującej, aby całkowicie pokryć sekcję.
Następnie inkubować szkiełko przez pięć minut w komorze. Na tym etapie nie jest używany żaden film para. Aby usunąć bufor zatrzymujący, użyj dwóch dwuminutowych płukań w PBS.
Teraz odpipetuj 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu do znakowania fluoresceiny. Na szkiełko nałóż perfil i inkubuj przez 20 minut w komorze, ale teraz w ciemności. Usuń roztwór do etykietowania podczas jednorazowego dwuminutowego mycia w PBS, podczas mycia rozcieńczyć kilka haczyków.
3, 3, 2, 5, 8 do jednego mikrograma na mililitr w PBS. Po umyciu przykryj sekcje jednym do 200 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu haczyków. Następnie inkubuj szkiełko przez pięć minut, osłonięte przed światłem, aby usunąć haczyki do zabarwienia, użyj trzech pięciominutowych płukań w PBS.
Następnie ostrożnie osusz szkiełko chusteczką laboratoryjną i nałóż szkiełko nakrywkowe do obrazowania. Zobrazuj sekcję za pomocą filtrów dpi, fitzy i Texas red, aby oddzielić sygnały plam haczykowych, plam tunelowych i autofluorescencji na trzy fałszywe kanały kolorów na jednym obrazie. Ustandaryzuj i utrzymuj te same ustawienia obrazowania między wszystkimi slajdami, aby można je było łatwo porównać.
Nie używaj żadnych automatycznych ustawień ekspozycji lub wzmocnienia do odniesienia anatomicznego. Użyj jasnego obrazu w jasnym polu sąsiedniego odcinka kończyny tylnej zabarwionego kolorami h i e w oprogramowaniu do analizy obrazu. Wyłącz kanał tunelu.
Następnie ręcznie prześledź kontur obszaru mięśniowego, który ma zostać określony ilościowo, za pomocą innych kanałów. Przekształć obrysowany obszar w maskę. Następnie ponownie włącz kanał tunelowy i dostosuj minimalny próg natężenia, aby wykluczyć sygnał autofluorescencyjny.
Zastosuj ten sam limit progowy dla wszystkich odcinków analizowanych w badaniu. Następnie przekształć piksele progowe w maskę. Na każdym obrazie połącz maskę obszaru mięśniowego i maskę tunelu progowego.
Tworzy to reprezentację sygnału tunelowego w śledzonym obszarze mięśniowym. Teraz określ ilościowo połączoną maskę, aby określić liczbę obiektów tunelowych dodatnich i całkowitą powierzchnię pikseli sygnału tunelowego w mięśniach. Wartości te służą do analizy statystycznej.
Tunelowe obiekty dodatnie, które mają małe powiększenie, mogą wyglądać jak jasne, nieregularne fragmenty w mięśniach szkieletowych. Jednak przy większym powiększeniu należy obserwować niektóre obiekty tunelowo-dodatnie o klasycznej morfologii apoptotycznej, jeśli typ śmierci komórki obejmował tę apoptozę. Kontrola pozytywna z dodanymi DNA D powinna wykazywać obfity tunelowy sygnał dodatni rozmieszczony równomiernie we wszystkich tkankach.
W sekcji. Kontrola ujemna bez enzymu TDT powinna mieć tło o niskiej intensywności i wykazywać tylko autofluorescencję. Dzięki opisanemu protokołowi stwierdzono, że komórki kości i śródbłonka krwinek czerwonych przyczyniają się do sygnału autofluorescencyjnego w przygotowanych odcinkach kończyn wysokich.
Prawdziwy tunelowy sygnał dodatni był znacznie bardziej intensywny. Można go odizolować od sygnału autofluorescencyjnego za pomocą progu intensywności pikseli. Inną opcją wyizolowania sygnału tunelowego było cyfrowe odjęcie czerwonego kanału autofluorescencji od kanału tunelowego.
Za pomocą tej techniki dochodzi do śmierci komórek mięśni szkieletowych. W mysim modelu SMA, który oceniano, znakowanie tunelowe ujawniło więcej komórek apoptotycznych u pięciodniowych myszy SMA niż w kontrolnych. Określając ilościowo barwienie tunelu, wykazano, że obserwacja ta jest statystycznie istotna dla wielu grup mięśni w obrębie kończyny tylnej.
Po opanowaniu technikę tunelową można wykonać w ciągu około czterech godzin, aby uzyskać wiarygodne wyniki ilościowe.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym filmie przedstawiono metodę wykrywania pęknięć DNA i śmierci komórek w mięśniach szkieletowych myszy za pomocą znakowania TUNEL. Szczegółowo opisano proces sekcji, obróbki tkanek oraz półautomatycznej analizy wykorzystywanej w tej technice.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Histologia
Wstęp
- Zrozumienie pęknięć DNA jest kluczowe dla badania śmierci komórki.
- Metoda TUNEL jest specyficzną techniką wykrywania tych pęknięć.
- Tradycyjne metody mogą być wolniejsze i mniej specyficzne.
- Niniejsza technika ma na celu zwiększenie szybkości i dokładności detekcji.
Cel badania
- Zapewnienie wiarygodnej metody ilościowego oznaczania pęknięć DNA w przekrojach tkanek.
- Pogłębienie zrozumienia mechanizmów śmierci komórkowej.
- Zaoferowanie szybszej alternatywy dla istniejących metod.
Zastosowane metody
- Disekcja mięśnia szkieletowego myszy.
- Obróbka tkanki w celu przygotowania próbek do analizy.
- fluorescentne znakowanie metodą TUNEL w celu wykrycia pęknięć DNA.
- Półautomatyczna analiza w celu kwantyfikacji sygnałów dodatnich w teście TUNEL.
Główne wyniki
- Skuteczne wykrywanie pęknięć DNA w tkance mięśniowej.
- Ilościowe określenie sygnałów dodatnich w metodzie TUNEL odzwierciedlających śmierć komórek.
- Demonstracja szybkości i swoistości metody.
- Porównanie z metodami tradycyjnymi z uwzględnieniem zalet.
Wnioski
- Metoda znakowania TUNEL jest skuteczna w badaniu śmierci komórek.
- Podejście to może usprawnić badania w dziedzinie biologii mięśni.
- Stanowi ono cenne narzędzie dla przyszłych badań nad uszkodzeniami DNA.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Wykrywanie uszkodzeń DNA w mięśniach szkieletowych dostarcza mechanistycznego wglądu w szlaki śmierci komórkowej istotne dla modeli chorób nerwowo-mięśniowych oraz oceny skuteczności terapeutycznej. Metoda TUNEL umożliwia ilościowy, powtarzalny pomiar apoptozy w przekrojach tkanek, wspierając walidację punktów uchwytu oraz identyfikację cząsteczek wiodących w badaniach przedklinicznych. Dzięki izolacji rzeczywistego sygnału z autofluorescencji poprzez cyfrowe odejmowanie kanałów, test ten zwiększa pewność prognostyczną w potwierdzaniu mechanizmów patologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez potwierdzenie uszkodzeń DNA jako mechanizmu patologicznego w modelach chorób.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośredni pomiar śmierci komórek w odpowiednich tkankach.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów z portfolio poprzez ilościową ocenę skuteczności interwencji terapeutycznych w indukowaniu apoptozy in vivo.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Umożliwia uzyskanie standaryzowanych, ilościowych pomiarów sygnału pozytywnego w metodzie TUNEL dla kampanii przesiewowych związków.
- Powtarzalność: Półautomatyczna kwantyfikacja zapewnia spójne wykrywanie sygnału w przekrojach i grupach eksperymentalnych.
- Redukcja szumów: Cyfrowe odejmowanie kanałów eliminuje autofluorescencję, co zwiększa czułość i wiarygodność analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Zastosowanie w modelach mysich SMA w celu oceny śmierci komórek mięśni szkieletowych, co wykazuje użyteczność translacyjną.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Potwierdzenie udziału apoptozy w śmierci komórek, co zmniejsza niejednoznaczność w analizie szlaków sygnałowych.
- Ciągłość przedkliniczna: Wspieranie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez powiązanie modulacji celu z efektami fenotypowymi.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu, przez identyfikację wiodących związków, aż po przedkliniczne testy skuteczności, dostarczając ilościowe odczyty apoptozy, które stanowią podstawę do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go).
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez wykrywanie pęknięć DNA i wyjaśnianie mechanizmów śmierci komórek w mięśniach szkieletowych.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, ilościowych wyników niezbędnych do oceny wpływu związków na apoptozę na poziomie tkanki.
- Analityka: Generuje maski sygnałów oparte na progach oraz liczbę obiektów, co umożliwia porównania statystyczne między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną poprzez modelowanie apoptozy istotnej dla danej choroby w mięśniach myszy.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę opartą na fluorescencji do wykrywania apoptozy w wielu typach tkanek i modelach chorób.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w zakresie szlaków śmierci komórkowej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki stałym ustawieniom obrazowania oraz półautomatycznej kwantyfikacji.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne, oparte na danych decyzje go/no-go w zależności od skuteczności apoptozy.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez kwantyfikację wpływu terapeutycznego na uszkodzenia DNA i śmierć komórek.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie histologii, skrawania tkanek oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Zależność od kriostatu, mikroskopu fluorescencyjnego oraz oprogramowania do analizy obrazu z możliwością separacji kanałów.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów fiksacji, zatapiania i skrawania pomiędzy zespołami.
- Należy uwzględnić autofluorescencję specyficzną dla tkanek, pochodzącą z takich źródeł jak RBCs, kości i komórki śródbłonka.
- Ograniczenie przez artefakty wynikające z procesowania tkanek, które mogą wpływać na wydajność enzymu TdT oraz stosunek sygnału do szumu.
