Name: Wykrywanie i analiza uszkodzeń DNA w mięśniach szkieletowych myszy in situ metodą TUNEL (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Poznaj metodę TUNEL do wykrywania uszkodzeń DNA i śmierci komórkowej w mięśniach szkieletowych myszy. Technika ta umożliwia szybką, specyficzną analizę z półautomatyczną kwantyfikacją sygnałów fluorescencyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant NIH-NINDS RO1-NS065895 oraz grant NIH-NINDS 5-F31-NS076250-02. 
Dziękujemy JHU SOM Microscope Facility za korzystanie z kriostatu.

UWAGA: Wszystkie procedury na zwierzętach opisane w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health26. Protokół (MO13M391) został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.
1. Ofiara, sekcja i fiksacja noworodków myszy
<ol>
	<li>Złożyć w ofierze nowonarodzoną mysz przez wdychanie CO2 .</li>
	<li>Natychmiast odetnij tylną kończynę powyżej kolana. Do około 7 dnia po urodzeniu kości nóg są wystarczająco miękkie, aby przeciąć je dużymi nożyczkami laboratoryjnymi lub ostrym ostrzem, a następnie przeciąć na kriostacie.</li>
	<li>Umieść tylną kończynę w 10 ml lodowatego 4% paraformaldehydu w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Zanurzenie tylnej kończyny w paraformaldehydzie na 4-24 godziny w temperaturze 4 °C. Tkanka embrionalna wymaga tylko kilku godzin utrwalenia.
	<ol>
		<li>Unikaj fiksacji dłuższej niż 24 godziny, ponieważ może to zmniejszyć skuteczność testu TUNEL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krioprotekcjonalna kończyna tylna poprzez zanurzenie jej w roztworze sacharozy.
	<ol>
		<li>Zamień paraformaldehyd na 10% sacharozy w PBS w tej samej probówce o pojemności 15 ml, inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zmienić na 30% sacharozy w PBS, inkubować przez noc w temperaturze 4 °C lub do momentu, gdy tylna kończyna opadnie na dno probówki. Tkanka może być pozostawiona w 30% sacharozie przez dłuższy czas, pod warunkiem, że sacharoza została sterylnie przefiltrowana.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Osadzanie tkanek
<ol>
	<li>Napełnij oznaczoną formę do zatapiania do połowy środkiem do zatapiania.</li>
	<li>Umieść tylną kończynę na podłożu do zatapiania, stroną ciętą jak najbliżej jednej ścianki formy. Zaznacz orientację tylnej kończyny na zewnątrz formy.
	<ol>
		<li>Osadź kilka tylnych kończyn i wytnij w tym samym bloku. Jednak ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie tylne kończyny w bloku są zorientowane równolegle do siebie, aby uzyskać odcinki na pasujących poziomach wzdłuż osi kończyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przykryj tylne kończyny podłożem do zatapiania. Jeśli tylne kończyny przesuwają się podczas nalewania pożywki, zmień ich orientację za pomocą kleszczy z końcówkami lub wykałaczki.</li>
	<li>Pozwól, aby podłoże osadzające przeniknęło do tkanki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut.</li>
	<li>Umieść foremki bezpośrednio na suchym lodzie lub w izopentanie na suchym lodzie, aby zamrozić medium do zatapiania. Upewnij się, że formy są zawsze wypoziomowane i unikaj przesuwania się osadzonej tkanki.</li>
	<li>Zamrożone foremki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do krojenia, przez okres do kilku miesięcy.</li>
</ol>
3. Kriosekcja osadzonych kończyn
<ol>
	<li>Ustaw temperaturę komory kriostatu na -20 °C, temperaturę obiektu na -18 °C; w razie potrzeby zmniejsz temperaturę obiektu.</li>
	<li>Utrzymuj równowagę bloku tkankowego w komorze kriostatu przez co najmniej 30 minut. Prawidłowa temperatura bloku ma kluczowe znaczenie dla jakości sekcji.</li>
	<li>Ciąć przekroje poprzeczne o grubości 10 μm lub mniejszej. Grubsze odcinki nie zostaną w pełni przeniknięte przez odczynniki TUNEL. Użyj płyty zapobiegającej przechylaniu się, ostrzy i kąta nachylenia ostrza (zwykle 5°) zalecanego dla kriostatu.</li>
	<li>Zebrać skrawki na szkiełka pokryte żelatyną lub wektabondem w temperaturze pokojowej. Natychmiast umieścić w pudełku na suwak na suchym lodzie. Pudełko ze szkiełkami należy przechowywać w osobnym pojemniku z suchym lodem umieszczonym w pobliżu kriostatu w zasięgu ręki.
	<ol>
		<li>Przetnij poprzeczne odcinki szeregowe przez długą oś kończyny, pomijając 100-200 μm. Zbierz co najmniej 3 sąsiednie sekcje na każdym poziomie szeregowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Test TUNEL na odcinkach kończyn tylnych przy użyciu dostępnego na rynku zestawu (wszystkie kroki w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej)
<ol>
	<li>Rozmrozić zjeżdżalnie z sekcjami do temperatury pokojowej i wysuszyć przez noc lub w weekend.</li>
	<li>Nawadniaj sekcje, zanurzając szkiełka w PBS na 2 x 10 minut w słoiku Coplin. Osuszyć chusteczką laboratoryjną, usuwając jak najwięcej płynu wokół sekcji.</li>
	<li>Sekcje przepuszczalności
	<ol>
		<li>Użyj komercyjnego odczynnika na bazie saponiny lub 0,5% Tween20 i 0,05% Triton X100 w PBS.</li>
		<li>Umieść szkiełko w komorze wilgotnościowej. Prosta komora wilgotnościowa to puste pudełko na końcówki do pipet ze szczelną pokrywą, z dodatkiem wystarczającej ilości wody, aby przykryć dno pudełka.</li>
		<li>Odpipetować odczynnik w ilości wystarczającej do pokrycia przekroju (50 μl wystarcza na kończyny nowonarodzonych myszy). Nie pipetować bezpośrednio na sekcję, ponieważ powtarzające się mieszanie może spowodować oderwanie się sekcji od szkiełka.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy z końcówkami umieść mały prostokąt parafilmu na górze sekcji, aby rozprowadzić kroplę odczynnika i całkowicie zakryć sekcję. Jeśli pod parafilmem utworzą się bąbelki, delikatnie go zdejmij, wysusz i ponownie nałóż.</li>
		<li>Inkubować szkiełka z odczynnikiem do przepuszczalności przez 1 godzinę w zakrytej komorze wilgotnościowej. Jeśli sekcje zaczną odrywać się od zjeżdżalni, czas przepuszczalności może zostać skrócony do 30 minut.</li>
		<li>Umyj szkiełka w PBS w słoiku Coplin 2 x 5 min. Prostokąty parafilmu powinny unosić się do góry, a następnie można je usunąć i wyrzucić.</li>
		<li>Za pomocą chusteczki laboratoryjnej osusz jak najwięcej płynu wokół sekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znakowanie pęknięć DNA za pośrednictwem TdT
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu, aby zrobić 1x bufor do etykietowania TdT, odpipetować wystarczającą ilość buforu do etykietowania na szkiełku, aby pokryć przekrój tkanki (50 μl jest wystarczające dla kończyn noworodków myszy). Inkubować w komorze wilgotnościowej przez 5 minut. Alternatywnie, zanurz szkiełko w buforze do etykietowania TdT w słoiku z koplinem.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu, aby przygotować mieszankę do etykietowania TdT. Zestaw zawiera kationy kobaltu, magnezu i manganu; Kation manganu działa dobrze na różne tkanki, w tym mięśnie szkieletowe, tkanki układu nerwowego, wątrobę, skórę i kości.</li>
		<li>W celu uzyskania kontroli dodatniej dodać DNazę (oznaczoną jako "nukleaza" w zestawie) do mieszaniny znakującej TdT. Alternatywnie, należy wstępnie potraktować sekcję kontroli dodatniej DNazą w buforze nukleazy przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, zgodnie z instrukcją zestawu. Trzymaj roztwór DNazy i sekcje poddane działaniu DNazy z dala od innych sekcji eksperymentalnych, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.</li>
		<li>W przypadku kontroli ujemnej należy pominąć enzym TdT w mieszaninie znakującej.</li>
		<li>Użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć jak najwięcej bufora etykietowania TdT ze szkiełka. Odpipetować mieszaninę do etykietowania TdT na szkiełku (50 μl na sekcję), przykryć nowym prostokątem parafilmu i inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu, aby utworzyć bufor 1x stop. Użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć mieszaninę do znakowania TdT ze szkiełka i dodaj 200-300 μl buforu zatrzymującego, aby pokryć przekrój tkanki i inkubować w komorze wilgotnościowej przez 5 minut. Alternatywnie, zanurz szkiełko w buforze zatrzymującym w słoiku Coplin.</li>
		<li>Umyj szkiełko 2 x 2 minuty w PBS. Użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć jak najwięcej PBS ze szkiełka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Etykietowanie fluorescencyjne
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu, aby przygotować roztwór do znakowania fluoresceiny do znakowania dNTP w przerwach DNA. Odpipetować roztwór na szkiełko podstawowe (50 μl na sekcję), przykryć nowym prostokątem parafilmu i inkubować w komorze wilgotnościowej przez 20 minut.</li>
		<li>Myj szkiełko przez 2 minuty w PBS w słoiku Coplin. Użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć jak najwięcej PBS ze szkiełka.</li>
		<li>Rozcieńczyć barwnik jądrowy Hoechst 33258 do 1 μg/ml w PBS i odpipetować na szkiełko (100-200 μl wystarcza do pokrycia przekroju). Inkubować w komorze wilgotnościowej przez 5 minut.</li>
		<li>Prać 3x przez 5 min w PBS.</li>
		<li>Szkiełko nakrywkowe z fluorescencyjnymi środkami montażowymi zapobiegającymi blaknięciu i krawędziami uszczelniającymi z lakierem do paznokci.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Akwizycja obrazu cyfrowego
<ol>
	<li>Uzyskuj obrazy za pomocą konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego z filtrami DAPI, FITC i Texas Red (lub ich odpowiednikami). Użyj obiektywu o większym powiększeniu (20X lub 40X), aby sprawdzić, czy znakowanie się powiodło, a jądra (nienaruszone lub fragmentaryczne) zostały oznaczone. Obiektyw 10X jest wystarczający do ilościowego określenia punktacji TUNEL-dodatniej.</li>
	<li>Zbierz obrazy barwienia Hoechsta, barwienia TUNEL i sygnału autofluorescencyjnego jako trzy oddzielne kanały sztucznych barw połączone na jednym obrazie. Jeśli etykieta fluoroforowa TUNEL jest zielona, zobrazuj sygnał autofluorescencyjny w czerwonym filtrze i odwrotnie.
	<ol>
		<li>Zachowaj równoważność wszystkich ustawień obrazowania między szkiełkami w celu późniejszego progowania i oceny ilościowej. Dla każdego filtra zaprogramuj i zapisz czasy ekspozycji, wzmocnienie i binning (brak binningu jest najlepszy); Nie używaj automatycznych ustawień ekspozycji ani wzmocnienia.</li>
		<li>Użyj metody prób i błędów, aby znaleźć ustawienia ekspozycji i wzmocnienia, które najlepiej uchwycą zakres intensywności na wszystkich zabarwionych slajdach. Upewnij się, że na uzyskanych obrazach nie ma nasyconych pikseli, ponieważ spowoduje to odchylenie w ocenie ilościowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rób zdjęcia całej grupy mięśni, która Cię interesuje. Może to wymagać "zszycia" ze sobą wielu obrazów.</li>
</ol>
6. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Korzystaj z dostępnych na rynku programów do analizy obrazu, aby analizować cyfrowe obrazy barwienia TUNEL. Analiza przy użyciu komercyjnego oprogramowania jest pokazana tutaj. Alternatywnie, do analizy barwienia TUNEL można użyć bezpłatnego oprogramowania ImageJ firmy NIH.</li>
	<li>Zabarwić przekrój przylegający do odcinka wybarwionego TUNEL hematoksyliną i eozyną (H&E) i wykonać pełny obraz cyfrowy przekroju za pomocą konwencjonalnego mikroskopu jasnego pola. Użyj tego obrazu H&E w połączeniu z atlasem anatomicznym5,18,19, aby prześledzić struktury anatomiczne, które mają zostać określone ilościowo.</li>
	<li>Przy wyłączonym kanale TUNEL ręcznie prześledź kontur obszaru, który ma być określony ilościowo, korzystając z kanałów Hoechsta i autofluorescencji jako wskazówek. Przekształć obrysowany obszar w maskę (zestaw wybranych współrzędnych pikseli, które mają być analizowane).</li>
	<li>Włącz kanał TUNEL. Korzystając z funkcji progowania intensywności w programie do analizy obrazu, ustaw dolny próg, aby wykluczyć cały sygnał autofluorescencji.</li>
	<li>Zastosuj te same ustawienia progowe do wszystkich obrazów w zestawie do nauki. Konwertowanie zaznaczeń z progami na maski.</li>
	<li>Dla każdego obrazu połącz maskę obszaru mięśniowego i maskę TUNEL. Nowa maska kombinowana będzie reprezentować sygnał TUNEL tylko w obrębie śledzonego obszaru mięśniowego.</li>
	<li>Wykonaj kwantyfikację maski na masce złożonej, aby określić liczbę obiektów i obszar obiektu sygnału TUNEL w śledzonym obszarze mięśniowym. W tym celu należy użyć funkcji Particle Analyzer (Analizator cząstek) w programie ImageJ.</li>
</ol>

<ol><li>Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+end-labelling+detects+DNA+strand+breaks+in+apoptosis+and+other+physiological+and+pathological+states%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states.</a> 170 (1), 1-8 (1993).</li>
<li>Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TUNEL+as+a+tumor+marker+of+tongue+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">TUNEL as a tumor marker of tongue cancer.</a> Anticancer Res. 28 (5B), 2981-2986 (2008).</li>
<li>Colecchia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+apoptosis+by+the+TUNEL+technique+in+clinically+localised+prostatic+cancer+before+and+after+combined+endocrine+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Detection of apoptosis by the TUNEL technique in clinically localised prostatic cancer before and after combined endocrine therapy.</a> 50 (5), 384-388 (1997).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%3A+principles%2C+applications%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol. Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li>
<li>Delaurier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mouse+Limb+Anatomy+Atlas%3A+an+interactive+3D+tool+for+studying+embryonic+limb+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Mouse Limb Anatomy Atlas: an interactive 3D tool for studying embryonic limb patterning.</a> 8, 83(2008).</li>
<li>Torres, C., Munell, F., Ferrer, I., Reventos, J., Macaya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+necrotic+cell+death+by+the+TUNEL+assay+in+the+hypoxic-ischemic+neonatal+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of necrotic cell death by the TUNEL assay in the hypoxic-ischemic neonatal rat brain.</a> Neurosci. Lett. 230 (1), 1-4 (1997).</li>
<li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDidenko%2C+VV+%22In+Situ+Detection+of+DNA+Damage+%3A+Methods+and+Protocols%22">In Situ Detection of DNA Damage : Methods and Protocols</a>. , Humana Press. 978-970 (2002).</li>
<li>Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle nuclei.</a> J. Cell Biol. 27 (2), 365-378 (1965).</li>
<li>Facchinetti, A., Tessarollo, L., Mazzocchi, M., Kingston, R., Collavo, D., Biasi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+the+detection+of+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for the detection of DNA fragmentation.</a> J. Immunol. Methods. 136 (1), 125-131 (1991).</li>
<li>Fayzullina, S., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+DNA+damage+precedes+spinal+motor+neuron+DNA+damage+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy+%28SMA%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.One%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle DNA damage precedes spinal motor neuron DNA damage in a mouse model of spinal muscular atrophy (SMA).</a> PLoS.One. 9 (3), e93329(2014).</li>
<li>Ferrer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+cell+death+in+the+developing+cerebral+cortex+of+the+rat.+Evidence+of+apoptosis-associated+internucleosomal+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring cell death in the developing cerebral cortex of the rat. Evidence of apoptosis-associated internucleosomal DNA fragmentation.</a> Neurosci. Lett. 182 (1), 77-79 (1994).</li>
<li>Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+programmed+cell+death+in+situ+via+specific+labeling+of+nuclear+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.</a> J. Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).</li>
<li>Gown, A. M., Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+apoptotic+cells+in+archival+paraffin+sections%3A+immunohistochemistry+using+antibodies+to+cleaved+caspase+3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Improved detection of apoptotic cells in archival paraffin sections: immunohistochemistry using antibodies to cleaved caspase 3.</a> J. Histochem. Cytochem. 50 (4), 449-454 (2002).</li>
<li>Hara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+apoptosis+studied+by+a+sequential+TUNEL+technique%3A+a+method+for+tract-tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Neuronal apoptosis studied by a sequential TUNEL technique: a method for tract-tracing.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 4 (2), 140-146 (1999).</li>
<li>Harn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+occurs+more+frequently+in+intraductal+carcinoma+than+in+infiltrating+duct+carcinoma+of+human+breast+cancer+and+correlates+with+altered+p53+expression%3A+detected+by+terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated+dUTP-FITC+nick+end+labelling+%28TUNEL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis occurs more frequently in intraductal carcinoma than in infiltrating duct carcinoma of human breast cancer and correlates with altered p53 expression: detected by terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-FITC nick end labelling (TUNEL).</a> Histopathology. 31 (6), 534-539 (1997).</li>
<li>Hsieh-Li, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A mouse model for spinal muscular atrophy.</a> Nat. Genet. 24 (1), 66-70 (2000).</li>
<li>Huerta, S., Goulet, E. J., Huerta-Yepez, S., Livingston, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+detection+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Screening and detection of apoptosis.</a> J. Surg. Res. 139 (1), 143-156 (2007).</li>
<li>Iwaki, T., Yamashita, H., Hayakawa, T. A color atlas of sectional anatomy of the mouse. 1, 1st edn, Braintree Scientific. Japan. (2001).</li>
<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+atlas+of+mouse+development%22">The atlas of mouse development</a>. , 1st edn, Academic Press. London. (1992).</li>
<li>Koppen, G., Angelis, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+X-ray+induced+DNA+damage+measured+by+the+comet+assay+in+roots+of+Vicia+faba%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Repair of X-ray induced DNA damage measured by the comet assay in roots of Vicia faba.</a> Environ. Mol. Mutagen. 32 (2), 281-285 (1998).</li>
<li>Kuehl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle nuclei.</a> Methods Cell Biol. 15, 79-88 (1977).</li>
<li>Kuo, L. J., Yang, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX+-+a+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).</li>
<li>Labat-Moleur, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TUNEL+apoptotic+cell+detection+in+tissue+sections%3A+critical+evaluation+and+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement.</a> J. Histochem. Cytochem. 46 (3), 327-334 (1998).</li>
<li>Modak, S. P., Bollum, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+measurement+of+single-strand+breaks+in+nuclear+DNA+in+fixed+lens+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Detection and measurement of single-strand breaks in nuclear DNA in fixed lens sections.</a> Exp. Cell Res. 75 (2), 307-313 (1972).</li>
<li>Naruse, I., Keino, H., Kawarada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+against+single-stranded+DNA+detects+both+programmed+cell+death+and+drug-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Antibody against single-stranded DNA detects both programmed cell death and drug-induced apoptosis.</a> Histochemistry. 101 (1), 73-78 (1994).</li>
<li>National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , 8th edn, National Research Council. Washington, D.C.. (2011).</li>
<li>Negoescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+apoptotic+cell+labeling+by+the+TUNEL+method%3A+improvement+and+evaluation+on+cell+preparations%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations).</a> J. Histochem. Cytochem. 44 (9), 959-968 (1996).</li>
<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Phanithi, P. B., Yoshida, Y., Santana, A., Su, M., Kawamura, S., Yasui, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+hypothermia+mitigates+post-ischemic+neuronal+death+following+focal+cerebral+ischemia+in+rat+brain%3A+immunohistochemical+study+of+Fas%2C+caspase-3+and+TUNEL%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Mild hypothermia mitigates post-ischemic neuronal death following focal cerebral ischemia in rat brain: immunohistochemical study of Fas, caspase-3 and TUNEL.</a> Neuropathology. 20 (4), 273-282 (2000).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+neuronal+death+in+the+immature+brain+is+an+apoptosis-necrosis+morphological+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic neuronal death in the immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum.</a> J. Comp Neurol. 378 (1), 70-87 (1997).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-NMDA+and+NMDA+receptor-mediated+excitotoxic+neuronal+deaths+in+adult+brain+are+morphologically+distinct%3A+further+evidence+for+an+apoptosis-necrosis+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Non-NMDA and NMDA receptor-mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct: further evidence for an apoptosis-necrosis continuum.</a> J. Comp Neurol. 378 (1), 88-104 (1997).</li>
<li>Ravi, D., Ramadas, K., Mathew, B. S., Nalinakumari, K. R., Nair, M. K., Pillai, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+programmed+cell+death+in+oral+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">De novo programmed cell death in oral cancer.</a> Histopathology. 34 (3), 241-249 (1999).</li>
<li>Sakaki, T., Kohmura, E., Kishiguchi, T., Yuguchi, T., Yamashita, T., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+and+apoptosis+of+smooth+muscle+cells+in+intracranial+aneurysms.+Studies+with+in+situ+DNA+end+labeling+and+antibody+against+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir.%28Wien%29%22%5BJournal%5D)">Loss and apoptosis of smooth muscle cells in intracranial aneurysms. Studies with in situ DNA end labeling and antibody against single-stranded DNA.</a> Acta Neurochir.(Wien). 139 (5), 469-474 (1997).</li>
<li>Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+immunohistochemistry%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future.</a> J. Histochem. Cytochem. 45 (3), 327-343 (1997).</li>
<li>Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+immunohistochemistry+under+the+influence+of+pH+using+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies.</a> J. Histochem. Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp. Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Sirvent, J. J., Aguilar, M. C., Olona, M., Pelegri, A., Blazquez, S., Gutierrez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+apoptosis+in+breast+cancer+pT1-pT2%29.+A+TUNEL%2C+p53%2C+bcl-2%2C+bag-1+and+Bax+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.Histopathol%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of apoptosis in breast cancer pT1-pT2). A TUNEL, p53, bcl-2, bag-1 and Bax immunohistochemical study.</a> Histol.Histopathol. 19 (3), 759-770 (2004).</li>
<li>Skyrlas, A., Hantschke, M., Passa, V., Gaitanis, G., Malamou-Mitsi, V., Bassukas, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+apoptosis-inducing+factor+%28AIF%29+in+keratoacanthomas+and+squamous+cell+carcinomas+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Expression of apoptosis-inducing factor (AIF) in keratoacanthomas and squamous cell carcinomas of the skin.</a> Exp. Dermatol. 20 (8), 674-676 (2011).</li>
<li>Smith, M. D., Weedon, H., Papangelis, V., Walker, J., Roberts-Thomson, P. J., Ahern, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+rheumatoid+arthritis+synovial+membrane%3A+modulation+by+disease-modifying+anti-rheumatic+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology.%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the rheumatoid arthritis synovial membrane: modulation by disease-modifying anti-rheumatic drug treatment.</a> Rheumatology.(Oxford). 49 (5), 862-875 (2010).</li>
<li>Stadelmann, C., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+apoptosis+in+tissue+sections%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of apoptosis in tissue sections).</a> Cell Tissue Res. 301 (1), 19-31 (2000).</li>
<li>Schans, G. P., van Loon, A. A., Groenendijk, R. H., Baan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+damage+in+cells+exposed+to+ionizing+radiation+by+use+of+anti-single-stranded+DNA+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA damage in cells exposed to ionizing radiation by use of anti-single-stranded DNA monoclonal antibody.</a> Int. J. Radiat. Biol. 55 (5), 747-760 (1989).</li>
<li>Watanabe, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+apoptotic+cells+in+human+colorectal+cancer+by+two+different+in+situ+methods%3A+antibody+against+single-stranded+DNA+and+terminal+deoxynucleotidyl+transferase-mediated+dUTP-biotin+nick+end-labeling+%28TUNEL%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of apoptotic cells in human colorectal cancer by two different in situ methods: antibody against single-stranded DNA and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL) methods.</a> Jpn. J. Cancer Res. 90 (2), 188-193 (1999).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+signal-regulating+kinase+1+is+involved+not+only+in+apoptosis+but+also+in+non-apoptotic+cardiomyocyte+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Apoptosis signal-regulating kinase 1 is involved not only in apoptosis but also in non-apoptotic cardiomyocyte death.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 333 (2), 562-567 (2005).</li>
<li>Yaoita, H., Ogawa, K., Maehara, K., Maruyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+ischemia%2Freperfusion+injury+in+rats+by+a+caspase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Attenuation of ischemia/reperfusion injury in rats by a caspase inhibitor.</a> Circulation. 97 (3), 276-281 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisano metodę wykrywania i ilościowej analizy apoptozy związanej z uszkodzeniem DNA w mięśniach szkieletowych myszy. Procedura obejmuje pobranie tkanek, barwienie TUNEL, cyfrową akwizycję obrazu i analizę obrazu. Potrzebne są zwykłe materiały i narzędzia histologiczne, a także specjalny komercyjny zestaw TUNEL. Niezbędnymi elementami wyposażenia są kriostat, mikroskop epifluorescencyjny z funkcją cyfrowego obrazowania oraz system komputerowy do analizy obrazu.
Eksperymentator powinien zdawać ...

Końcowe znakowanie końca deoksynukleotydylu (TdT) dUTP (TUNEL) to proces polegający na użyciu enzymu TdT do przyłączania dUTP do 3' końców dwu- i jednoniciowych pęknięć DNA12,23. Metoda TUNEL do wykrywania apoptozy i uszkodzeń DNA została po raz pierwszy opisana ponad 20 lat temu przez Gavrieli i wsp.1,12,24. Od tego czasu został oceniony i zoptymalizowany w różnych preparatach tkankowych7,23,27,40. TUNEL został wykorzystany do badania indukowanej niedokrwieniem śmierci komórek neuronów6,14,29 i kardiomiocytów43,44, ekscytotoksycznej śmierci komórek neuronalnych30,31 oraz jako biomarker w leczeniu zapalenia stawów39. Jest również stosowany jako czynnik prognostyczny i marker komórek nowotworowych w różnych nowotworach u ludzi2,3,15,32,37,38,42.
Istnieją alternatywne metody wykrywania uszkodzeń DNA i śmierci komórek, ale mają one techniczne wyzwania i zastrzeżenia. Southern blot może być stosowany do ilościowego określania uszkodzeń DNA w całych tkankach lizatów7,9-11, ale ta metoda nie zapewnia rozdzielczości na poziomie komórkowym i jest trudna do ilościowego określenia. Test kometarny jest alternatywną metodą opartą na komórkach, która wymaga ekstrakcji zachowanych jąder z komórek4,20,28,36. Chociaż test kometarny działa dobrze na hodowanych izolowanych komórkach, znacznie trudniej jest przygotować nienaruszone jądra z tkanki mięśni szkieletowych8,21. Podobnie jak w przypadku Southern blot, test komety nie dostarcza informacji specyficznych dla typu komórki z homogenatu całej tkanki mięśniowej. Inną alternatywą dla metody TUNEL jest immunohistochemia z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko jednoniciowemu DNA25,33,41 lub przeciwko białkom uczestniczącym w odpowiedzi na uszkodzenie DNA i szlakach śmierci komórki (np. p53, H2AX i kaspazy)13,17,22,40. Takie metody oparte na przeciwciałach wymagają dokładnej charakterystyki przeciwciał i doskonałej swoistości przeciwciał, aby uzyskać wysoki stosunek sygnału do tła. Nawet jeśli istnieją specyficzne przeciwciała, mogą one wymagać denaturacji białka docelowego poprzez procedury pobierania antygenu34,35. Jak omówimy tutaj, pobieranie antygenu w tkance mięśniowej powoduje niedopuszczalnie wysoką autofluorescencję. W przeciwieństwie do metod alternatywnych, TUNEL osiąga wykrywanie uszkodzeń DNA z wysokim sygnałem i niskim tłem, doskonałą specyficznością, którą można testować za pomocą prostych kontroli pozytywnych i negatywnych, dobrą penetracją tkanek, która nie wymaga pobierania antygenu, oraz rozdzielczością na poziomie komórkowym. Ponadto metoda TUNEL trwa około 4 godzin, podczas gdy metody alternatywne zazwyczaj wymagają inkubacji przez noc.
Badamy śmierć komórek mięśni szkieletowych w mysim modelu rdzeniowego zaniku mięśni (SMA)10, który został wygenerowany przez Hsieh-Li i współpracowników16. Aby określić ilościowo komórki apoptotyczne w mięśniach, opracowaliśmy metodę przygotowania, barwienia i oznaczania ilościowego tkanek, która działa solidnie w różnych grupach mięśni szkieletowych w różnych punktach rozwojowych u myszy. Korzystamy z dostępnego na rynku zestawu do etykietowania TUNEL oraz dostępnego na rynku oprogramowania do analizy obrazu. Z powodzeniem zastosowaliśmy również test TUNEL w połączeniu z barwieniem immunofluorescencyjnym w rdzeniu kręgowym10.
Opisane tutaj metody są przydatne dla badaczy, którzy chcą ocenić patologię tkanek, mechanizmy choroby, mechanizmy starzenia się oraz rozwojową (przed- i pourodzeniową) śmierć komórek w mięśniach szkieletowych. Technika TUNEL jest szczególnie przydatna w badaniach nad uszkodzeniem i naprawą DNA oraz śmiercią komórki w systemach modelowych, w których dotyczy to tylko podzbioru komórek i konieczna jest rozdzielczość na poziomie komórkowym.
Ten film opisuje sekcję, przetwarzanie tkanek, cięcie i fluorescencyjne znakowanie TUNEL mięśni szkieletowych myszy. Opisano w nim również metodę półautomatycznego oznaczania ilościowego sygnału TUNEL.

<table><tbody><tr><td>4% paraformaldehyd w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>19202</td><td>Do opisanych tutaj procedur 4% roztwór przygotowano świeżo z proszku. Można stosować paraformaldehyd od dowolnego dostawcy. Przygotowany roztwór formaldehydu należy przechowywać w temperaturze 4 & deg; C i nie należy go stosować po upływie terminu ważności (do kilku miesięcy). Paraformaldehyd jest czynnikiem rakotwórczym i toksyną powodowaną przez drogi oddechowe i kontakt ze skórą. Należy przestrzegać środków ostrożności określonych w karcie charakterystyki podczas obchodzenia się z paraformaldehydem.</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Służy do krioochrony tkanek przed zamrożeniem. Można użyć sacharozy od dowolnego dostawcy.</td></tr><tr><td>Związek O.C.T.</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Podłoże do zatapiania do kriosekcji.</td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td>Do opisywanych tutaj preparatów użyto kriostatu Leica CM3050S. dowolny kriostat zdolny do cięcia 10 &mu; Można stosować przekroje m.</td></tr><tr><td>Można stosować szkiełka szklane, 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td>Można stosować prowadnice od dowolnego dostawcy.</td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma</td><td>G-9391</td><td>Żelatyna służy do wspomagania przylegania przekroju tkanki do szkiełek podstawowych. Aby pokryć szkiełka żelatyną, rozpuść 2,75 g żelatyny i 0,275 g ałunu chromowego w 500 ml wody destylowanej, podgrzanej do temperatury 60 °; C, zanurz szkiełka na kilka sekund i pozostaw do wyschnięcia. Można użyć żelatyny od dowolnego dostawcy. Alternatywnie można zakupić szkiełka z żelatyną.</td></tr><tr><td>Dwunastowodny siarczan potasu chromu(III) (ałun chromowy)</td><td>Ałun chromowy</td><td>243361</td><td>chromowy dodaje się do roztworu żelatyny w celu zwiększenia przyczepności tkanek na szkiełkach podstawowych. Jest to potencjalny czynnik rakotwórczy i toksyna powodowana przez drogi oddechowe i kontakt ze skórą. Należy przestrzegać środków ostrożności określonych w karcie charakterystyki podczas obchodzenia się z ałunem chromowym.</td></tr><tr><td>Odczynnik do adhezji tkanek Vectabond</td><td>Vector Labs</td><td>SP-1800</td><td>Opcjonalne podłoże dla lepszej przyczepności tkanek do szkiełek podstawowych; zamiast tego można zastosować szkiełka powlekane żelatyną.</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>Detergent stosowany do przepuszczalności tkanek. Można użyć Tween20 od dowolnego dostawcy.</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Detergent służący do przepuszczalności tkanek. Można stosować Triton X100 od dowolnego dostawcy.</td></tr><tr><td>TACS 2 TdT fluoresceina in situ zestaw do wykrywania apoptozy</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>Komercyjny zestaw do znakowania TUNEL na bazie fluorescencji.</td></tr><tr><td>DNaza/nukleaza</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(w zestawie)</td></tr><tr><td>Bufor DNazy/nukleazy</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(w zestawie)</td></tr><tr><td>10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4</td><td>Amresco</td><td>780</td><td>Przygotuj 1x PBS do płukania i rozcieńczania. Można stosować PBS od dowolnego dostawcy.</td></tr><tr><td>Woda wolna od DNaz</td><td>Quality Biologicals</td><td>351-029-131</td><td>Można używać wody od dowolnego dostawcy.</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>94403</td><td>Barwnik jądrowy. Można użyć dowolnego niebieskiego fluorescencyjnego barwnika jądrowego. Jako barwnik wiążący DNA, Hoechst jest podejrzewany o działanie rakotwórcze i powinien być traktowany przy użyciu sprzętu ochronnego, aby zminimalizować kontakt ze skórą.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>M multiple</td><td>807</td><td>Można stosować dowolną inną folię hydrofobową lub szkiełko nakrywkowe. Dostępne od wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny z kamerą cyfrową</td><td>&nbsp;--</td><td>&nbsp;--</td><td>Można użyć dowolnego mikroskopu fluorescencyjnego zdolnego do cyfrowego rejestrowania fluorescencji czerwonej, zielonej i niebieskiej w oddzielnych kanałach.</td></tr><tr><td>Można stosować media przeciwblaknięcia Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>Antifade od dowolnego dostawcy.</td></tr><tr><td>szkiełka nakrywkowe szklane o grubości nr 1</td><td>Brain Research Labs</td><td>2222-1</td><td>Można stosować szkiełka nakrywkowe od dowolnego dostawcy. Najmniejszy rozmiar 22 x 22 mm jest wystarczający dla sekcji nóg noworodków myszy.</td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>Ted Pella</td><td>114-8</td><td>Służy do uszczelniania szkiełek nakrywkowych. Można używać lakieru do paznokci od dowolnego dostawcy (w tym stałych sprzedawców). Unikaj używania lakieru do paznokci z kolorem lub dodatkami, które mogą odbijać światło podczas obrazowania fluorescencyjnego.</td></tr></tbody></table>

wykrywanie i analiza uszkodzeń dna w mięśniach szkieletowych myszy in situ metodą tunel

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Końcowe znakowanie końca deoksynukleotydylotransferazy (TdT) deoksyurydynotrifosforanu (dUTP) (TUNEL) to metoda użycia enzymu TdT do kowalencyjnego dołączania oznakowanej formy dUTP do 3' końców dwu- i jednoniciowych pęknięć DNA w komórkach. Jest to niezawodna i użyteczna metoda wykrywania uszkodzeń DNA i śmierci komórek in situ. Ten film opisuje preparację, przetwarzanie tkanek, cięcie i fluorescencyjne znakowanie TUNEL mięśni szkieletowych myszy. Opisano w nim również metodę półautomatycznego oznaczania ilościowego sygnału TUNEL. Wrodzone normalne cechy tkanek i warunki przetwarzania tkanek wpływają na zdolność enzymu TdT do skutecznego znakowania DNA. Przetwarzanie tkanek może również dodać niepożądaną autofluorescencję, która będzie zakłócać wykrywanie sygnału TUNEL. Dlatego ważne jest, aby empirycznie określić metody przetwarzania tkanek i znakowania TUNEL, które zapewnią optymalny stosunek sygnału do szumu do późniejszej oceny ilościowej. Opisany tutaj test oparty na fluorescencji umożliwia wykluczenie sygnału autofluorescencyjnego przez odejmowanie kanałów cyfrowych. Test TUNEL, stosowany z odpowiednimi technikami przetwarzania tkanek i kontrolami, jest stosunkowo szybką, powtarzalną, ilościową metodą wykrywania apoptozy w tkankach. Może być stosowany do potwierdzania uszkodzeń DNA i apoptozy jako mechanizmów patologicznych, do identyfikacji dotkniętych typów komórek oraz do oceny skuteczności leczenia in vivo.

W przypadku poprawnego barwienia sygnał TUNEL-dodatni powinien być wystarczająco jasny, aby można było go oddzielić od autofluorescencji poprzez ustawienie progów intensywności. Obiekty TUNEL-dodatnie przy małym powiększeniu mogą wyglądać jak jasne, nieregularne fragmenty w mięśniach szkieletowych (Rysunek 1A). Jednak przy większym powiększeniu, w przypadku gdy mechanizmem śmierci komórkowej jest apoptoza, powinny być widoczne niektóre obiekty TUNEL-dodatnie o klasycznej morfologii apoptotycznej (<strong...

Ten film opisuje preparację, przetwarzanie tkanek, cięcie i fluorescencyjne znakowanie TUNEL mięśni szkieletowych myszy. Opisano w nim również metodę półautomatycznej analizy etykietowania TUNEL.

Wykrywanie i analiza uszkodzeń DNA w mięśniach szkieletowych myszy in situ metodą TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie pęknięć DNA i śmierci komórki w C dwa. Osiąga się to poprzez pierwsze skrawki tkanki do trwałej ondulacji, aby umożliwić odczynnikom tunelowym wejście do jądra komórkowego. Następnie enzym TDT jest używany do kowalencyjnego przyłączania DTP do trzech głównych końców pęknięć DNA w tych komórkach.Następnie DUTP jest oznaczany sondą fluorescencyjną. Ostatecznie dodatni sygnał tunelowy jest oznaczany ilościowo w skrawkach tkanki, co odzwierciedla względną częstotliwość pęknięć DNA w komórkach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak southern blotting lub immunohistochemia, jest to, że jest stosunkowo szybko specyficzna i zapewnia sposób na wyeliminowanie szumu i autofluorescencji.Zacznij od zamocowania izolowanych tylnych kończyn w 4% paraformaldehydzie w PBS w 15-mililitrowej tubce, pozwól na utrwalenie przez cztery do maksymalnie 24 godzin w czterech stopniach Celsjusza. Potrzebne są tylko dwie godziny, jeśli tkanka jest embrionalna. Jednak po utrwaleniu zastąp roztwór 10% sacharozą, aby chronić tkankę przed kriogeniczną substancją i inkubować ją przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia zmień roztwór na sterylny, przefiltrowany 30% sacharozę i kontynuuj inkubację przez noc lub do momentu, gdy tylne kończyny opadną na dno probówki. Podczas osadzania ważne jest, aby tylne kończyny były całkowicie zanurzone w podłożu do zatapiania. Formy do zatapiania można umieścić bezpośrednio na suchym lodzie lub w izop pentanie na suchym lodzie w celu zamrożenia podłoża.Podczas kriosekcji. Bloki wycinają sekcje transferowe o grubości 10 mikronów lub cieńsze, grubsze odcinki nie zostaną przeniknięte przez odczynniki do etykietowania tunelowego. Zebrać te cienkie skrawki na szkiełka podstawowe pokryte żelatyną lub wiązaniem wektorowym w temperaturze pokojowej.Bardzo szybko przenieś szkiełka do suchego lodu w celu przechowywania. Najpierw rozmrozić szkiełko zamrożonego wycinka tkanki do temperatury pokojowej i pozostawić do wyschnięcia na 16 do 64 godzin. Gdy szkiełko osiągnie temperaturę pokojową, ponownie nawodnij sekcję w słoiku łączącym wypełnionym PBS przez 10 minut.Powtórz ten etap nawadniania raz, a następnie ostrożnie osusz szkiełko chusteczką laboratoryjną, nie naruszając sekcji tkanki, aby przeniknąć do sekcji, umieść szkiełko w komorze wilgotnościowej i odpipetuj 50 mikrolitrów komercyjnych odczynników na bazie saponin proteolitycznych na sekcję. Nie pipetować bezpośrednio na sekcje, ponieważ może to spowodować odłączenie lub uszkodzenie. Następnie umieść mały kawałek folii para, aby rozprowadzić odczynnik.Jeśli utworzą się bąbelki, ponownie nałóż folię para. Po godzinie pozwól szkiełku inkubować przez godzinę. Usuń odczynniki, przeprowadzając dwa pięciominutowe płukania w PBS i ostrożnie wytrzyj je do sucha.Obok oznaczania pęknięć DNA metodą TDT użyj dostępnego na rynku zestawu. Najpierw utwórz jeden bufor XTDT i pipetuj na sekcję. Następnie inkubuj szkiełko przez pięć minut w komorze nawilżania.Po drugie, przygotuj mieszankę do etykietowania TDT zgodnie z instrukcją zestawu lub szkiełkiem kontroli pozytywnej. Dodaj DNA do mieszanki do znakowania TDT. W przypadku szkiełka kontrolnego należy pominąć enzym TDT w mieszance.Teraz za pomocą chusteczki usuń jak najwięcej buforu ze szkiełka i odpipetuj go na mieszance do etykietowania. 50 mikrolitrów powinno wystarczyć. Ponownie rozprowadź roztwór za pomocą paraformu, nie robiąc pęcherzyków.Pozostaw szkiełko do inkubacji w komorze przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po trzecie, utwórz bufor jeden x stop zgodnie z instrukcjami zestawu. Po usunięciu mieszanki do etykietowania za pomocą chusteczki laboratoryjnej dodaj od dwóch do 300 mikrolitrów mieszanki zatrzymującej, aby całkowicie pokryć sekcję.Następnie inkubować szkiełko przez pięć minut w komorze. Na tym etapie nie jest używany żaden film para. Aby usunąć bufor zatrzymujący, użyj dwóch dwuminutowych płukań w PBS.Teraz odpipetuj 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu do znakowania fluoresceiny. Na szkiełko nałóż perfil i inkubuj przez 20 minut w komorze, ale teraz w ciemności. Usuń roztwór do etykietowania podczas jednorazowego dwuminutowego mycia w PBS, podczas mycia rozcieńczyć kilka haczyków.3, 3, 2, 5, 8 do jednego mikrograma na mililitr w PBS. Po umyciu przykryj sekcje jednym do 200 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu haczyków. Następnie inkubuj szkiełko przez pięć minut, osłonięte przed światłem, aby usunąć haczyki do zabarwienia, użyj trzech pięciominutowych płukań w PBS.Następnie ostrożnie osusz szkiełko chusteczką laboratoryjną i nałóż szkiełko nakrywkowe do obrazowania. Zobrazuj sekcję za pomocą filtrów dpi, fitzy i Texas red, aby oddzielić sygnały plam haczykowych, plam tunelowych i autofluorescencji na trzy fałszywe kanały kolorów na jednym obrazie. Ustandaryzuj i utrzymuj te same ustawienia obrazowania między wszystkimi slajdami, aby można je było łatwo porównać.Nie używaj żadnych automatycznych ustawień ekspozycji lub wzmocnienia do odniesienia anatomicznego. Użyj jasnego obrazu w jasnym polu sąsiedniego odcinka kończyny tylnej zabarwionego kolorami h i e w oprogramowaniu do analizy obrazu. Wyłącz kanał tunelu.Następnie ręcznie prześledź kontur obszaru mięśniowego, który ma zostać określony ilościowo, za pomocą innych kanałów. Przekształć obrysowany obszar w maskę. Następnie ponownie włącz kanał tunelowy i dostosuj minimalny próg natężenia, aby wykluczyć sygnał autofluorescencyjny.Zastosuj ten sam limit progowy dla wszystkich odcinków analizowanych w badaniu. Następnie przekształć piksele progowe w maskę. Na każdym obrazie połącz maskę obszaru mięśniowego i maskę tunelu progowego.Tworzy to reprezentację sygnału tunelowego w śledzonym obszarze mięśniowym. Teraz określ ilościowo połączoną maskę, aby określić liczbę obiektów tunelowych dodatnich i całkowitą powierzchnię pikseli sygnału tunelowego w mięśniach. Wartości te służą do analizy statystycznej.Tunelowe obiekty dodatnie, które mają małe powiększenie, mogą wyglądać jak jasne, nieregularne fragmenty w mięśniach szkieletowych. Jednak przy większym powiększeniu należy obserwować niektóre obiekty tunelowo-dodatnie o klasycznej morfologii apoptotycznej, jeśli typ śmierci komórki obejmował tę apoptozę. Kontrola pozytywna z dodanymi DNA D powinna wykazywać obfity tunelowy sygnał dodatni rozmieszczony równomiernie we wszystkich tkankach.W sekcji. Kontrola ujemna bez enzymu TDT powinna mieć tło o niskiej intensywności i wykazywać tylko autofluorescencję. Dzięki opisanemu protokołowi stwierdzono, że komórki kości i śródbłonka krwinek czerwonych przyczyniają się do sygnału autofluorescencyjnego w przygotowanych odcinkach kończyn wysokich.Prawdziwy tunelowy sygnał dodatni był znacznie bardziej intensywny. Można go odizolować od sygnału autofluorescencyjnego za pomocą progu intensywności pikseli. Inną opcją wyizolowania sygnału tunelowego było cyfrowe odjęcie czerwonego kanału autofluorescencji od kanału tunelowego.Za pomocą tej techniki dochodzi do śmierci komórek mięśni szkieletowych. W mysim modelu SMA, który oceniano, znakowanie tunelowe ujawniło więcej komórek apoptotycznych u pięciodniowych myszy SMA niż w kontrolnych. Określając ilościowo barwienie tunelu, wykazano, że obserwacja ta jest statystycznie istotna dla wielu grup mięśni w obrębie kończyny tylnej.Po opanowaniu technikę tunelową można wykonać w ciągu około czterech godzin, aby uzyskać wiarygodne wyniki ilościowe.

detection-analysis-dna-damage-mouse-skeletal-muscle-situ-using-tunel

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano tutaj protokoły służące do wizualizacji dynamicznego procesu naprawy błony komórkowej zapośredniczonej przez MG53 w całych organizmach oraz na poziomie komórkowym. Metody te mogą być stosowane do badania biologii komórkowej uszczelniania błony plazmatycznej oraz w medycynie regeneracyjnej.

Wizualizacja naprawy błony komórkowej pośredniczonej przez MG53 z wykorzystaniem systemów in vivo i in vitro

W tym filmie test TUNEL jest wykonywany w celu wykrycia obecności komórek apoptotycznych w próbce. Badanie polega na użyciu specjalnej polimerazy DNA - końcowej deoksynukleotydylotransferazy - która katalizuje dodawanie znakowanych dUTP do końca 3' fragmentowanego DNA, który można obserwować i identyfikować pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Końcowe znakowanie końca dUTP Nick za pośrednictwem transferazy końcowej — test TUNEL: metoda in situ do wykrywania fragmentacji DNA w komórkach apoptotycznych

Obrazowanie spektroskopowe elektronów może obrazować i odróżniać kwas nukleinowy od białka z rozdzielczością nanometrów. Można go połączyć z systemem miniSOG, który jest w stanie specyficznie znakować znakowane białka w próbkach z transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowanie tych technologii ilustrujemy na przykładzie dwuniciowych ognisk naprawy pęknięć.

Wizualizacja białek naprawczych DNA oznaczonych tagami miniSOG w połączeniu z obrazowaniem spektroskopowym elektronów (ESI)

Kolejne kriosekcje są zbierane, aby umożliwić zastosowania histologiczne i wzbogacenie RNA do pomiarów ekspresji genów przy użyciu sąsiednich regionów z pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy. Wysokiej jakości RNA uzyskuje się z 20 - 30 mg zbiorczych kriosekcji, a pomiary są bezpośrednio porównywane między aplikacjami.

Kriosekcja sąsiadujących ze sobą obszarów pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy w celu ekspresji genów i analiz histologicznych

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wykrywania zarówno starczych, jak i pluripotencjalnych komórek macierzystych w mięśniach szkieletowych po urazie, podczas indukowania przeprogramowania in vivo. Metoda ta jest odpowiednia do oceny roli starzenia się komórek podczas regeneracji i przeprogramowania tkanek in vivo.

Ocena starzenia się wywołanego urazem i przeprogramowania in vivo w mięśniach szkieletowych

Opisany tutaj jest protokół bezpośredniego znakowania immunologicznego martwiczych włókien mięśniowych w kriosekcjach mięśni. Komórki martwicze są przepuszczalne dla białek surowicy, w tym immunoglobuliny G (IgG). Ujawnienie wychwytu IgG przez włókna mięśniowe umożliwia identyfikację i ilościowe określenie włókien mięśniowych, które ulegają martwicy niezależnie od stanu mięśni.

Znakowanie immunologiczne zwyrodnienia włókien mięśniowych w biopsjach mięśni

Tutaj proponujemy metodę efektywnego pozyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych we wczesnych stadiach rozwoju pourodzeniowego z homozygotycznego zmutowanego modelu myszy Lamin Δ8-11, bardzo ciężkiego modelu dystrofii mięśniowej Emery'ego-Dreifussa (EDMD).

Izolacja i hodowla pojedynczych włókien mięśniowych z mysiego modelu dystrofii mięśniowej Embergla-Dreifussa we wczesnym rozwoju poporodowym

Elektroporacja plazmidowego DNA w mięśniach szkieletowych jest realną metodą modulowania ekspresji genów bez naruszania kurczliwości mięśni u myszy.

Elektroporacja plazmidowego DNA do mięśni szkieletowych myszy

Utrzymanie integralności genomu oocytu jest niezbędne do zapewnienia genetycznej wierności powstałego zarodka. W tym miejscu przedstawiamy dokładny protokół wykrywania pęknięć dwuniciowych DNA w żeńskich komórkach rozrodczych ssaków.

Wykrywanie dwuniciowych pęknięć DNA w oocytach myszy

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia identyfikację i wielowymiarową analizę komórek macierzystych i progenitorowych mięśni za pomocą jednokomórkowej cytometrii masowej oraz ich oczyszczanie przez FACS w celu dogłębnych badań ich funkcji. Podejście to można zastosować do badania dynamiki regeneracji w modelach chorobowych i testowania skuteczności interwencji farmakologicznych.

Identyfikacja i analiza progenitorów miogennych in vivo podczas ostrego uszkodzenia mięśni szkieletowych za pomocą wysokowymiarowej cytometrii masowej pojedynczej komórki

Miejscowe wstrzyknięcia barwnika mitochondrialnego oznacza końcowe mitochondria komórek Schwanna in vivo do mikroskopii konfokalnej. Ta metoda wykorzystuje dowód koncepcji wykazany w tkance mięśniowej szkieletowej myszy ze zdrową lub chorą tkanką mięśniową, aby zapewnić wysoką rozdzielczość wizualizacji mitochondriów.

Metody in situ ilościowej oceny morfologii mitochondriów w mięśniach i komórkach Schwanna końcowych myszy

Poznaj metodę TUNEL do wykrywania uszkodzeń DNA i śmierci komórkowej w mięśniach szkieletowych myszy. Technika ta umożliwia szybką, specyficzną analizę z półautomatyczną kwantyfikacją sygnałów fluorescencyjnych.

Wykrywanie i analiza uszkodzeń DNA w mięśniach szkieletowych myszy in situ metodą TUNEL

Przeglądaj więcej filmów