Name: Efektywne pozyskiwanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Poznaj efektywny protokół pozyskiwania komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych. Ta metoda zwiększa wydajność i powtarzalność, wspierając badania nad terapiami zwyrodnienia siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować następującym osobom: Doktorom Timowi Krohne i Eyalowi Baninowi (wraz z dr Mandy Lehmann i Davidem Friedlanderem) za hojną pomoc w opracowaniu protokołów różnicowania. Dr Felicitas Bucher udzieliła pomocy w różnicowaniu komórek RPE użytych w tym badaniu. Dziękujemy również National Eye Institute (granty NEI EY11254 i EY021416), Kalifornijskiemu Instytutowi Medycyny Regeneracyjnej (grant CIRM TR1-01219) oraz Lowy Medical Research Institute (LMRI) za bardzo hojne finansowanie tego projektu.

1. Ukierunkowane różnicowanie RPE pochodzącego z komórek macierzystych
UWAGA: Wszystkie etapy inkubacji przeprowadzane są w temperaturze 37 °C przy 5% CO2
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Utrzymuj linie hES lub hiPS (podawanie codziennie) w pożywkach konserwacyjnych (MM; Tabela 1). Gdy linie osiągną wystarczające standardy kontroli jakości, utrzymuj je na warstwie mysich embrionalnych komórek żywiących (MEF) wysianych w gęstości 250 000 / dołek na płytce sześciodołkowej. Kultury wolne od ksenotypów mogą być również generowane zgodnie z protokołem ustalonym przez Tuckera i wsp.Lokal mieszkalny 40.</li>
	<li>Pozwól koloniom komórek macierzystych osiągnąć zbieg.</li>
	<li>Przełącz się na pożywki różnicujące z nikotynamidem (DM/NIC; Tabela 1); karmić codziennie.</li>
	<li>Po trzech tygodniach w hodowli zmień na pożywki różnicujące z nikotynamidem i Activin-A lub IDE-1 (DM/NIC/AA lub DM/NIC/IDE1; Tabela 1) w celu zwiększenia zróżnicowania RPE.</li>
	<li>Po pięciu tygodniach w hodowli przełącz się z powrotem na DM/NIC. Codzienne karmienie nie jest już konieczne, gdy wskaźniki pH w pożywce przestają żółknąć następnego dnia po karmieniu.</li>
	<li>Poczekaj, aż pojawią się wysepki komórek barwnikowych, które są wystarczająco duże, aby można je było przeciąć i usunąć (patrz rysunki 2D-F i 3A).</li>
</ol>
2. Izolowanie pigmentowanych wysepek
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Pokryj studzienki 24-dołkowej płytki matrycą, która naśladuje naturalne środowisko komórkowe (preferowane jest wolne od kseno). 
	UWAGA: Ostrza rogówki i ostre kleszcze z cienką końcówką są bardzo przydatne do zbierania. Cały arkusz zróżnicowanych komórek może się odczepić podczas pobierania. Unikaj tego, pracując ostrożnie i początkowo zbierając kolonie na środku naczynia.</li>
	<li>Napełnij tyle studzienek płytki 24-dołkowej pożywką różnicującą (DM; Tabela 1) w zależności od potrzeb. Decyzja ta będzie zależeć od liczby zebranych pigmentowanych kolonii.</li>
	<li>W kapturze do hodowli komórkowej z lunetą sekcyjną ręcznie wytnij pigmentowane wysepki. Pokrój każdą wysepkę na dnie oryginalnej płytki za pomocą skalpela na około 2-6 kawałków i chwyć pigmentowane części ostrymi kleszkami.</li>
	<li>Przenieś 1-2 pigmentowane kawałki do każdej 24-dołkowej.</li>
	<li>Nie zmieniaj pożywki przez 3-5 dni, aż komórki się przykleją, a następnie zacznij zmieniać pożywkę trzy razy w tygodniu. (Jeśli nie zastosują się do nich po tym czasie, istnieje duże prawdopodobieństwo, że nigdy tego nie zrobią).</li>
	<li>Rozwijaj komórki przez 3-4 tygodnie w pożywkach różnicujących (DM; Tabela 1) -- Obraz typowej kultury jest pokazany na rysunku 3B. Komórki mogą nadal nie wypełniać całej studni, ale dłuższe czekanie nie wydaje się pomagać. Karm komórki trzy razy w tygodniu.</li>
	<li>Po około 3 tygodniach ręcznie usuń skupiska białych krwinek w grudkach, jeśli to konieczne, za pomocą ostrych kleszczy. Nie wykonuj tego kroku, chyba że jest to konieczne – łatwo o wprowadzenie zanieczyszczeń. Idealnym rozwiązaniem jest próba uzyskania najczystszych populacji RPE z oryginalnych pigmentowanych kolonii w kroku 1.6.</li>
</ol>
3. Passaging Stem Cell RPE
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Odłączyć komórki o stężeniu 200 μl roztworem do dysocjacji komórek (najlepiej nie trypsyny – preferowany jest odczynnik, który można inaktywować przez rozcieńczenie) na 5-8 minut w temperaturze 37 °C i dezaktywować go przez rozcieńczenie s.m. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl zmyć wszystkie komórki i ponownie je zawiesić (jeśli wybrana studzienka zawiera tylko kilka komórek, rozważ połączenie komórek z dwóch 24-dołków).</li>
	<li>Odwirować (800 x g przez 5 min), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 3 ml pożywki DM.</li>
	<li>Ponownie płytkować komórki z jednego (lub dwóch) 24-dołków w jednym 6-dołku pokrytym matrycą w 3 ml DM na dołek (ekspansja 1:5).</li>
	<li>Rozszerzaj się przez 1-2 tygodnie, aż komórki zlewają się w ~90%; obraz w pełni zróżnicowanej czystej kultury pokazano na rysunku 3C.</li>
	<li>Odłączyć komórki z 1 ml roztworu dysocjacyjnego na około 5-8 minut w temperaturze 37 °C, dezaktywować je przez rozcieńczenie DM, użyć pipety 1 000 μl do zmycia wszystkich komórek i ponownie je zawiesić.</li>
	<li>Odwirować (800 x g przez 5 min), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 18 ml pożywki DM.</li>
	<li>Ponownie płytki komórek z jednego 6-dołkowego każdego do sześciu 6-dołkowych pokrytych matrycą w 3 ml s.m. na studzienkę (ekspansja 1:6) lub jednokrotnie powlekanej kolby o długości 75 cm2 (ekspansja 1:7,5).</li>
	<li>W razie potrzeby powtarzaj kroki 3.4–3.8, aż do uzyskania wystarczającej liczby komórek. 
	UWAGA: Staraj się zebrać jak najwięcej kolonii w celu ekspansji, zamiast planować amplifikację kultur poprzez pasażowanie, ponieważ każde przejście wywołuje dedyferencjację RPE.</li>
</ol>

<ol><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Congdon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+prevalence+of+visual+impairment+among+adults+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Causes and prevalence of visual impairment among adults in the United States.</a> Arch Ophthalmol. 122 (4), 477-485 (2004).</li>
<li>Friedman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+age-related+macular+degeneration+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Prevalence of age-related macular degeneration in the United States.</a> Arch Ophthalmol. 122 (4), 564-572 (2004).</li>
<li>Resnikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+data+on+visual+impairment+in+the+year%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Global data on visual impairment in the year.</a> Bull World Health Organ. 82 (11), 844-851 (2002).</li>
<li>Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targets+in+age-related+macular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targets in age-related macular disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3033-3041 (2010).</li>
<li>Jong, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> N Engl J Med. 355 (14), 1474-1485 (2006).</li>
<li>Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+In+Retinal+And+Eye+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+of+the+RPE+in+AMD%22%5BJournal%5D)">Progress In Retinal And Eye Research.</a> Transplantation of the RPE in AMD. 26 (5), 516-554 (2007).</li>
<li>Cruz, L., Chen, F. K., Ahmado, A., Greenwood, J., Coffey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPE+transplantation+and+its+role+in+retinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+In+Retinal+And+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">RPE transplantation and its role in retinal disease.</a> Progress In Retinal And Eye Research. 26 (6), 598-635 (2007).</li>
<li>Carr, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+human+iPS-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+transplantation+in+the+retinal+dystrophic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat.</a> PLoS One. 4 (12), e8152(2009).</li>
<li>Idelson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).</li>
<li>Klimanskaya, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+comparative+assessment+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+embryonic+stem+cells+using+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics.</a> Cloning Stem Cells. 6 (3), 217-245 (2004).</li>
<li>Krohne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+small+molecules+and+OCT4-reprogrammed+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4-reprogrammed human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1 (2), 96-109 (2012).</li>
<li>Lund, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8, 189-199 (2006).</li>
<li>Vugler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+phenomenon+of+HESC-derived+RPE%3A+anatomy+of+cell+genesis%2C+expansion+and+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation.</a> Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).</li>
<li>Algvere, P. V., Berglin, L., Gouras, P., Sheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+fetal+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration+with+subfoveal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of fetal retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration with subfoveal neovascularization.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (12 ), 707-716 (1994).</li>
<li>Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+transplantation+of+autologous+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration%3A+a+prospective+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (11), 4151-4160 (2004).</li>
<li>Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+autologous+retinal+pigment+epithelium+in+eyes+with+foveal+neovascularization+resulting+from+age-related+macular+degeneration%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study.</a> Am J Ophthalmol. 133 (2), 215-225 (2002).</li>
<li>Falkner-Radler, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+retinal+pigment+epithelium+%28RPE%29+transplantation%3A+outcome+after+autologous+RPE-choroid+sheet+and+RPE+cell-suspension+in+a+randomised+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomised clinical study.</a> British Journal of Ophthalmology. 95 (3), 370-375 (2011).</li>
<li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+efficacy+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+%28iPS%29+grafts+in+a+preclinical+model+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+%28Cambridge%2C+Mass%29%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and efficacy of human-induced pluripotent stem cell (iPS) grafts in a preclinical model of retinitis pigmentosa.</a> Molecular Medicine (Cambridge, Mass). 18, 1312-1319 (2012).</li>
<li>Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Safety+and+Function+of+RPE+from+Human+Embryonic+Stem+Cells+in+Preclinical+Models+of+Macular+Degeneration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Long-Term Safety and Function of RPE from Human Embryonic Stem Cells in Preclinical Models of Macular Degeneration).</a> Stem Cells. 27 (9), 2126-2135 (2009).</li>
<li>Peyman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+retinal+pigment+epithelium+transplantation+for+age-related+macular+degeneration+secondary+to+extensive+subfoveal+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Surgery%22%5BJournal%5D)">A technique for retinal pigment epithelium transplantation for age-related macular degeneration secondary to extensive subfoveal scarring.</a> Ophthalmic Surgery. 22 (2), 102-108 (1991).</li>
<li>Schwartz, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> The Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Wang, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89 (8), 911-919 (2010).</li>
<li>Cruz, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+receptor+tyrosine+kinase+gene+Mertk+in+the+retinal+dystrophic+RCS+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutation of the receptor tyrosine kinase gene Mertk in the retinal dystrophic RCS rat.</a> Human Molecular Genetics. 9 (4), 645-651 (2000).</li>
<li>Buchholz, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+functional+retinal+pigmented+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).</li>
<li>Hirami, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+retinal+cells+from+mouse+and+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells.</a> Neurosci Lett. 458 (3), 126-131 (2009).</li>
<li>Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (39), 16698-16703 (2009).</li>
<li>Osakada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+by+small-molecule+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of retinal cells from human pluripotent stem cells by small-molecule induction.</a> J Cell Sci. 122 (17), 3169-3179 (2009).</li>
<li>Carr, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+functional+analysis+of+phagocytosis+by+human+embryonic+stem+cell-derived+RPE+cells+using+a+novel+human+retinal+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay.</a> Mol Vis. 15, 283-295 (2009).</li>
<li>Kokkinaki, M., Sahibzada, N., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Induced+Pluripotent+Stem-Derived+Retinal+Pigment+Epithelium+%28RPE%29+Cells+Exhibit+Ion+Transport%2C+Membrane+Potential%2C+Polarized+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Secretion%2C+and+Gene+Expression+Pattern+Similar+to+Native+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human Induced Pluripotent Stem-Derived Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cells Exhibit Ion Transport, Membrane Potential, Polarized Vascular Endothelial Growth Factor Secretion, and Gene Expression Pattern Similar to Native RPE.</a> Stem Cells. 29 (5), 825-835 (2011).</li>
<li>Westenskow, P., Friedlander, M. Ch. 111. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWestenskow%2C+P+%22The+New+Visual+Neurosciences%22">The New Visual Neurosciences</a>. Werne, J. S., Chalupa, L. M. , The MIT Press. Cambridge, MA. 1611-1626 (2013).</li>
<li>Westenskow, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+flow+cytometry+to+compare+the+dynamics+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+in+iPS-derived+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (10), 6282-6290 (2012).</li>
<li>Algvere, P. V., Gouras, P., Dafgard Kopp,, E, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+outcome+of+RPE+allografts+in+non-immunosuppressed+patients+with+AMD%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Long-term outcome of RPE allografts in non-immunosuppressed patients with AMD.</a> Eur J Ophthalmol. 9 (3), 217-230 (1999).</li>
<li>Zhang, X., Bok, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+and+immune+response+in+the+subretinal+space%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Transplantation of retinal pigment epithelial cells and immune response in the subretinal space.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (6), 1021-1027 (1998).</li>
<li>Gamm, D. M., Phillips, M. J., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+retinal+degenerative+diseases+with+human+iPS-derived+cells%3A+current+status+and+future+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+Of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Modeling retinal degenerative diseases with human iPS-derived cells: current status and future implications.</a> Expert Review Of Ophthalmology. 8, 213-216 (2013).</li>
<li>Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cell+modeling+of+Best+disease%3A+insights+into+the+pathophysiology+of+an+inherited+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">iPS cell modeling of Best disease: insights into the pathophysiology of an inherited macular degeneration.</a> Hum Mol Genet. 22 (3), 593-607 (2013).</li>
<li>Buchholz, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (5), 384-393 (2013).</li>
<li>Fuhrmann, S., Levine, E. M., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraocular+mesenchyme+patterns+the+optic+vesicle+during+early+eye+development+in+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Extraocular mesenchyme patterns the optic vesicle during early eye development in the embryonic chick.</a> Development (Cambridge, England). 127 (21), 4599-4609 (2000).</li>
<li>Borowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+efficiently+direct+endodermal+differentiation+of+mouse+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (4), 348-358 (2009).</li>
<li>Tucker, B. A., Anfinson, K. R., Mullins, R. F., Stone, E. M., Young, M. J. Use of a synthetic xeno-free culture substrate for induced pluripotent stem cell induction and retinal differentiation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTucker%2C+BA+%22Stem+Cells+Transl+Med%22">Stem Cells Transl Med</a>. 2 (1), 16-24 (2013).</li>
<li>Ramsden, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+retinal+regeneration%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Stem cells in retinal regeneration: past, present and future.</a> Development (Cambridge, England). 140 (12), 2576-2585 (2013).</li>
<li>Zhao, T., Zhang, Z. -N., Rong, Z., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 474 (7350), 212-215 (2011).</li>
<li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+into+retinal+pigment+epithelium-like+cells+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Protei.%2C+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts into retinal pigment epithelium-like cells by defined factors.</a> Protei., & Cell. 5 (1), 48-58 (2013).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma żadnych ujawnień komercyjnych do zadeklarowania.

W tym manuskrypcie przedstawiamy kroki, które należy podjąć, aby efektywnie wygenerować dużą liczbę czystych kultur iPS-RPE. Wykazaliśmy wcześniej, używając tego protokołu ukierunkowanego różnicowania z aktywiną A, że możemy generować iPS-RPE, które bardzo przypominają hRPE w oparciu o transkryptomikę, proteomikę, metabolomikę i funkcjonalność, oraz że opóźniają one zwyrodnienie siatkówki po wszczepieniu szczurom RCS12,31,32. Proces generowania iPS-RPE jest czasochłonny, ale nie pracochłonny (rys. 1</s...

Różne typy komórek, które zajmują siatkówkę, są zorganizowane w funkcjonalną architekturę. Fotoreceptory w tylnej części siatkówki są odpowiedzialne za przekształcanie światła w impulsy elektryczne poprzez fototransdukcję. Jednak fototransdukcja nie może zachodzić bez skoordynowanych wysiłków innych sąsiednich typów komórek, w tym komórek glejowych Muellera i komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Monowarstwa komórek RPE oddziela siatkówkę czuciową od naczyniówki włosowatej, głównego źródła krwi dla fotoreceptorów, i jest idealnie usytuowana do kontrolowania wielu funkcji ważnych dla homeostazy fotoreceptorów. W rzeczywistości RPE i fotoreceptory są tak współzależne, że powszechnie uważa się je za jedną jednostkę funkcjonalną. (Przegląd wszystkich różnorodnych funkcji RPE można znaleźć w Strauss, 2005,s. 1.) Śmierć lub dysfunkcja komórek nabłonka barwnikowego siatkówki może wywołać zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), główną przyczynę trwałej utraty wzroku w krajach uprzemysłowionych2-4. 
AMD jest wieloczynnikową chorobą RPE, fotoreceptorów i naczyniówki; czynniki ryzyka są zróżnicowane i obejmują kombinacje wpływów środowiskowych i genetycznych5,6. Metody leczenia AMD są bardzo ograniczone, ale jedną z obiecujących potencjalnych terapii jest wymiana komórek RPE7,8. Chociaż wyniki były mieszane, przeszczepienie komórek RPE u pacjentów z AMD (i u innych pacjentów ze zwyrodnieniem siatkówki), a także w modelach zwyrodnienia siatkówki u gryzoni, może przejściowo zapobiec znacznemu zanikowi fotoreceptorów9-23. (Modelem zwierzęcym powszechnie używanym w tych badaniach są szczury Royal College of Surgeons (RCS), które są nosicielami mutacji w genie MerTK. Ta mutacja sprawia, że komórki RPE nie są zdolne do fagocytozy zewnętrznych segmentów fotoreceptorów i sprzyjają zwyrodnieniu siatkówki24.) Chociaż zgłaszane wskaźniki przeżycia wszczepionego RPE w przestrzeni podsiatkówkowej szczurów i myszy RCS różnią się znacznie, istnieje potencjał, aby przeżyły one kilka miesięcy lub lat9,10,12,20. 
Komórki RPE można uzyskać w wystarczającej liczbie do przeszczepu, pozyskując je z pluripotencjalnych komórek macierzystych9-14,25-28. Kilka niezależnych grup wykazało, że komórki te funkcjonują w podobny sposób jak ich somatyczne odpowiedniki, a długoterminowe badania sugerują, że są one bezpieczne po implantacji w modelach chorób szczurów i myszy9,10,12,14,19,20,25,29-32. Stosowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych zamiast embrionalnych komórek macierzystych może być korzystne, ponieważ można uniknąć problemów etycznych i immunologicznych związanych z allogenicznym RPE33,34. Innym ekscytującym zastosowaniem technologii iPS jest modelowanie chorób35. Możliwość badania dużej liczby komórek RPE pochodzących od pacjentów z chorobami RPE może być nieoceniona dla zrozumienia ich podstaw molekularnych. Tego typu badanie zostało niedawno przeprowadzone z udziałem najlepszego pacjenta z chorobą RPE i może utorować drogę do podobnych badań nad dziedzicznymi makulopatiami36. 
Uzyskanie RPE z komórek macierzystych jest stosunkowo prostym procesem i może być przeprowadzone całkowicie w warunkach wolnych od kseno. Najprostszą strategią jest spontaniczne wyprowadzanie monowarstw komórek RPE, jednak wydajność można znacznie poprawić, stosując techniki ukierunkowanego różnicowania. Techniki te wiążą się jednak z wykorzystaniem egzogennych czynników białkowych, które mogą być kosztowne i często generowane przez bakterie lub inne źródła inne niż ludzkie10,12,37. W naszych badaniach postępowaliśmy zgodnie z ustalonym protokołem10, który wykorzystuje nikotynamid i aktywinę A, czynnik sygnalizacyjny, który, jak wykazano, jest wystarczający dla specyfikacji RPE38. Tutaj pokażemy, że mała cząsteczka IDE-1 może odpowiednio zastąpić aktywinę A, zmniejszając w ten sposób koszty i łagodząc obawy związane ze stosowaniem rekombinowanych białek39. Dodatkowo stosujemy zamiennik surowicy wolnej od ksenotypów i hodujemy różnicujące się komórki RPE na syntetycznym podłożu wolnym od kseno. Wcześniej wykazano, że komórki RPE bardzo skutecznie różnicują się przy użyciu tego podejścia40.
Gdy różnicujemy się jako monowarstwa, wizualizujemy pigmentowane kolonie zawierające komórki RPE już po pięciu tygodniach12. Gdy osiągną odpowiedni rozmiar, można je ręcznie wyciąć i przenieść do innego naczynia w celu rozprężenia. Komórki RPE są znane z dedyferencjacji przy każdym pasażu i należy unikać używania czegokolwiek starszego niż pięć pasaży (stwierdzamy, że wystarczająca liczba komórek do charakterystyki i przeszczepu w modelach zwierzęcych może być łatwo wygenerowana po dwóch lub trzech pasażach). Po pełnym zróżnicowaniu stosujemy wiele technik, aby scharakteryzować komórki anatomicznie i funkcjonalnie, aby zapewnić, że będą one służyć jako odpowiednie zamienniki chorego RPE. Opis tych technik i protokół wszczepiania iPS-RPE w przestrzeń podsiatkówkową gryzoni wykraczają poza zakres tej pracy metodologicznej i zostały wcześniej opublikowane12,32,41. 
Podczas gdy opracowanie standardowych protokołów do skutecznego wyprowadzania iPS-RPE jest wyraźnie ważne dla klinik, jest jeszcze wiele do zrobienia w zakresie badań przedklinicznych na modelach zwierzęcych. Istnieją obawy dotyczące immunogenności komórek pochodzących z iPS i bada się wiele różnych technik implantacji, w tym wszczepianie komórek na sztuczne podłoża42,43. Z tych powodów uważamy, że publikacja ustandaryzowanych protokołów jest korzystna dla ułatwienia zarówno badań klinicznych, jak i przedklinicznych. Zwłaszcza, jeśli zostaną przeprowadzone bezpośrednie porównania komórek iPS-RPE pochodzących z różnych laboratoriów przez różne grupy badawcze.

<table><tbody><tr><td>Nóż do rogówki&nbsp;</td><td>Nóż Surgipro</td><td>SPOI-070</td><td>x 1</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>500 ml x 4&nbsp;</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco, 1X bez Ca lub Mg</td><td>VWR</td><td>45000-434</td><td>500 ml x 6</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu, regularna (inaktywowana termicznie)</td><td>VWR</td><td>45000-736</td><td>500 ml x 1</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 10-155) Rekombinowane technologie życia białek ludzkich</td><td></td><td>PHG0021</td><td>100 i mikro; g x 1</td></tr><tr><td>IDE-1</td><td>Stemgent</td><td>04-0026</td><td>2 mg x 1</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>500 ml x 1</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych 100X&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>100 g x 1</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-148</td><td>20 ml x 1</td></tr><tr><td>Rekombinowana aktywina ludzka/mysia/szczurza A&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>120-14E</td><td>10 &mikro; g x 2</td></tr><tr><td>Synthemax-T Powierzchnia 6-dołkowa Płytki</td><td>Corning</td><td>3877</td><td>Case(12) x 1</td></tr><tr><td>Enzym TrypLE-Express (1X), bez czerwieni fenolowej&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12604-021</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>System filtrów próżniowych/butelek do przechowywania, 0,1 i mikro; m porów, 500ml&nbsp;</td><td>Etui na 431475 Corning</td><td></td><td>(12) x 1&nbsp;</td></tr></tbody></table>

efektywne pozyskiwanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Nie znaleziono lekarstwa na zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), główną przyczynę utraty wzroku u osób powyżej 55 roku życia. AMD jest złożoną, wieloczynnikową chorobą o nieznanej etiologii, chociaż w dużej mierze uważa się, że występuje z powodu śmierci lub dysfunkcji nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), monowarstwy komórek, która leży u podstaw siatkówki i zapewnia krytyczne wsparcie dla fotoreceptorów. Strategie wymiany komórek RPE mogą być bardzo obiecujące, jeśli chodzi o zapewnienie ulgi terapeutycznej dla dużej podgrupy pacjentów z AMD, a komórki RPE, które bardzo przypominają pierwotne komórki ludzkie (hRPE), zostały wygenerowane w wielu niezależnych laboratoriach, w tym w naszym. Ponadto zastosowania iPS-RPE nie ograniczają się do terapii opartych na komórkach, ale są również wykorzystywane do modelowania chorób RPE. Tego typu badania mogą nie tylko wyjaśnić molekularne podstawy chorób, ale także służyć jako nieocenione narzędzia do opracowywania i testowania nowych leków. Przedstawiamy tutaj zoptymalizowany protokół ukierunkowanego różnicowania RPE od komórek macierzystych. Dodanie nikotynamidu i aktywiny A lub IDE-1, małej cząsteczki, która naśladuje jej działanie, w określonych punktach czasowych, znacznie zwiększa wydajność komórek RPE. Korzystając z tej techniki, możemy uzyskać dużą liczbę RPE o niskim pasażu już po trzech miesiącach.

Kroki opisane w niniejszym manuskrypcie, przedstawione na Rysunku 1, mogą zostać wykorzystane do łatwego generowania RPE z komórek macierzystych, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami10,12. Po utrzymywaniu linii iPS przez kilka tygodni, w koloniach zaczynają pojawiać się obszary pigmentowane po 5-7 tygodniach (kultury 7-tygodniowe przedstawiono na Rysunku 2A-C). Kolonie te mogą nadal rosnąć przez wiele tygodni w miarę utrzymywania kultur. Po osiągnięciu odpowiedniej wielkości...

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzące z komórek macierzystych mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, w tym do terapii komórkowych w celu zwyrodnienia siatkówki, modelowania chorób i badań nad lekami. Poniżej przedstawiamy prosty protokół umożliwiający powtarzalne pozyskiwanie RPE z komórek macierzystych.

Efektywne pozyskiwanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Ogólnym celem tej procedury jest powtarzalne uzyskanie wysokiej jakości nabłonka barwnikowego siatkówki lub RPE z komórek macierzystych. Osiąga się to poprzez wyhodowanie najpierw indukowalnych pluripotencjalnych komórek macierzystych do współbiegłości. W drugim kroku pożywka jest zmieniana, aby skierować komórki w losy RPE.Następnie komórki RPE są izolowane od innych zróżnicowanych komórek w naczyniu, a następnie kultury są rozprężane, aż do uzyskania wystarczającej liczby komórek. Ostatecznie, ciemna pigmentacja i brukowa morfologia kultur mogą być wykorzystane do potwierdzenia, że komórki RPE osiągają końcowe różnicowanie. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak spontaniczne różnicowanie, jest to, że dodanie zdefiniowanych czynników przyspiesza różnicowanie, czas i zwiększa wydajność RPE.Do tej pory tysiące gryzoni zostało wyleczonych za pomocą komórek RPE, pochodzących z różnych chorób zwyrodnieniowych siatkówki IPSA. Jeśli jednak sprawnie i skutecznie przełożymy to na leczenie ludzi w klinikach z tymi chorobami, absolutnie konieczne jest opracowanie sprawdzonych powtarzalnych protokołów, które zapewnią nam wysoką jakość, wysoką sprzedaż RPE i IPS Wiz

efficient-derivation-retinal-pigment-epithelium-cells-from-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym filmie zademonstrujemy, jak izolować komórki macierzyste siatkówki z nabłonka rzęskowego oka myszy i hodować je in vitro w celu uzyskania klonalnych sfer siatkówkowych. Izolowane sfery posiadają kluczowe właściwości komórek macierzystych: zdolność do samoodnowy oraz wielopotencjalność.

Izolacja komórek macierzystych siatkówki z oka myszy

Porównano profile mikroRNA (miRNA) ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzącego z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS-RPE) oraz płodowego RPE.

Profile ekspresji mikroRNA ludzkich komórek iPS, nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPS oraz nabłonka barwnikowego siatkówki płodu

Tutaj prezentujemy akceptowany przez społeczność protokół w formacie multimedialnym do podsiatkówkowego wstrzykiwania bolusa komórek RPE szczurom i myszom. Podejście to można wykorzystać do określenia potencjałów ratunkowych, profili bezpieczeństwa i zdolności przeżycia przeszczepionych komórek RPE po implantacji w zwierzęcych modelach zwyrodnienia siatkówki.

Wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u gryzoni w celu dostarczenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w zawiesinie

Celem tego raportu jest opisanie protokołów pozyskiwania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) przy użyciu różnych rozmiarów ciał embrionalnych.

Otrzymywanie nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) za pomocą różnych rozmiarów ciał zarodkowych

Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metoda wykorzystuje kombinację czynników wzrostu i małych cząsteczek do skierowania różnicowania komórek macierzystych w niedojrzałe RPE w ciągu czternastu dni i dojrzałe, funkcjonalne RPE po trzech miesiącach.

Szybkie, ukierunkowane różnicowanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z ludzkich embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół różnicowania komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych posiadających mutacje pochodzące od pacjenta. Zmutowane linie komórkowe mogą być wykorzystywane do analiz funkcjonalnych, w tym immunoblottingu, immunofluorescencji i patch clamp. To podejście typu "choroba w naczyniu" pozwala uniknąć trudności związanych z uzyskaniem natywnych ludzkich komórek RPE.

Różnicowanie, utrzymanie i analiza ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki: model choroby w naczyniu dla mutacji BEST1

Produkcja wyspecjalizowanych komórek siatkówki z pluripotencjalnych komórek macierzystych jest punktem zwrotnym w rozwoju terapii chorób siatkówki opartej na komórkach macierzystych. W niniejszej pracy opisano prostą metodę wydajnego generowania organoidów siatkówki i nabłonka barwnikowego siatkówki do badań podstawowych, translacyjnych i klinicznych.

Zdefiniowano warunki hodowli wolnej od ksenotypów i karmówek w celu wytworzenia modeli ludzkich komórek siatkówki pochodzących z iPSC

Opisujemy metodę inżynierii tkanki siatkówki składającej się z komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych hodowanych na ludzkich błonach owodniowych i jej przygotowania do szczepienia na modelach zwierzęcych.

Inżynieria Odpowiednia do przeszczepu tkanka nabłonka barwnikowego siatkówki pochodząca z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system indukcji organoidów siatkówki, który jest odpowiedni dla różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do generowania tkanek siatkówki o wysokiej powtarzalności i wydajności.

System indukcji organoidów siatkówki do wyprowadzania tkanek siatkówki 3D z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

To badanie dostarcza szczegółowego protokołu do efektywnej kriokonserwacji komórek nabłonkowych barwnika siatkówki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych.

Kriokonserwacja ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z komórek macierzystych w optymalnym stadium

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) działa jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, promując zdrowie i funkcję typów komórek siatkówki, takich jak fotoreceptory. W tym miejscu opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji i hodowli dorosłego mysiego RPE.

Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy

Poznaj efektywny protokół pozyskiwania komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych. Ta metoda zwiększa wydajność i powtarzalność, wspierając badania nad terapiami zwyrodnienia siatkówki.

Efektywne pozyskiwanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów