Efektywne pozyskiwanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych

Ogólnym celem tej procedury jest powtarzalne uzyskanie wysokiej jakości nabłonka barwnikowego siatkówki lub RPE z komórek macierzystych. Osiąga się to poprzez wyhodowanie najpierw indukowalnych pluripotencjalnych komórek macierzystych do współbiegłości. W drugim kroku pożywka jest zmieniana, aby skierować komórki w losy RPE.

Następnie komórki RPE są izolowane od innych zróżnicowanych komórek w naczyniu, a następnie kultury są rozprężane, aż do uzyskania wystarczającej liczby komórek. Ostatecznie, ciemna pigmentacja i brukowa morfologia kultur mogą być wykorzystane do potwierdzenia, że komórki RPE osiągają końcowe różnicowanie. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak spontaniczne różnicowanie, jest to, że dodanie zdefiniowanych czynników przyspiesza różnicowanie, czas i zwiększa wydajność RPE.

Do tej pory tysiące gryzoni zostało wyleczonych za pomocą komórek RPE, pochodzących z różnych chorób zwyrodnieniowych siatkówki IPSA. Jeśli jednak sprawnie i skutecznie przełożymy to na leczenie ludzi w klinikach z tymi chorobami, absolutnie konieczne jest opracowanie sprawdzonych powtarzalnych protokołów, które zapewnią nam wysoką jakość, wysoką sprzedaż RPE i IPS Wizualna prezentacja tej metody jest niezbędna, ponieważ tylko jedna osoba może pracować w mikroskopie pod maską w danym momencie, co sprawia, że etap izolacji jest trudny do wizualizacji. Mitchell Prince, technik badawczy z mojego laboratorium, będzie teraz demonstrował protokół związany z aspektami procedury hodowli cyfrowej Aby skierować różnicowanie hodowli RPE pochodzącej z komórek macierzystych, interesującej nas linii komórek macierzystych na warstwie embrionalnych komórek żywicielskich myszy dwa razy 10 do sześciu komórek na dołek płytki sześciodołkowej, Pozwól koloniom osiągnąć płynność COF, a następnie przejdź na codzienne karmienie z różnicowaniem.

Podłoże uzupełnione nikotynamidem. Po trzech tygodniach zacznij dodawać do karmienia aktywny w jednym lub IDE jeden, aby zwiększyć różnicowanie RPE. Dwa tygodnie później należy przestawić się z powrotem na pożywkę różnicującą i sam nikotynamid zaprzestając codziennego karmienia.

Gdy wskaźniki pH w pożywce przestaną żółknąć następnego dnia po karmieniu, należy umieścić hodowlę z powrotem w inkubatorze, aż pojawią się oczka pigmentowanych komórek, które są wystarczająco duże, aby można je było przeciąć i usunąć. Aby wyizolować pigmentowane oczka, następnie powłóknij dołki 24-dołkowej płytki z matrycą wolną od kseno, która naśladuje naturalne środowisko komórkowe. Następnie napełnij tyle dołków płytki 24-dołkowej pożywką różnicującą, ile potrzeba.

A w kapturze do hodowli komórkowej użyj lunety preparacyjnej i skalpela, aby posiekać każde pigmentowane oczko na dnie oryginalnej płytki na dwie do sześciu części i chwyć pigmentowane części ostrymi kleszczami, a następnie przenieś jeden do dwóch pigmentowanych kawałków do każdej.24. Dobrze inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy do pięciu dni, aż komórki się przylgną. Następnie zacznij zmieniać media trzy razy w tygodniu.

Rozszerzaj komórki przez trzy do czterech tygodni w pożywce różnicowej. Kontynuując karmienie komórek trzy razy w tygodniu do przejścia. RPE dodaje 200 mikrolitrów wstępnie ciepłego roztworu dysocjacji komórek bez trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby odłączyć komórki.

Po pięciu do ośmiu minutach zatrzymaj reakcję ze świeżymi pożywkami różnicującymi, a następnie ponownie zawieś kultury do zawiesin jednokomórkowych za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów, łącząc kolonie z kilkoma komórkami. Następnie przenieś zdysocjowane kolonie do 15-mililitrowych probówek i odwiruj komórki. Resus zawieszający granulki w trzech mililitrach pożywki różnicującej przenosi kolonie do każdej studzienki zakodowanej matrycowo płytki sześciodołkowej zawierającej trzy dodatkowe mililitry pożywki różnicującej na studzienkę.

Następnie rozprężaj komórki przez jeden do dwóch tygodni, aż komórki zlewają się w około 90% i ponownie odłącz komórki w jednym mililitrze roztworu dysocjacyjnego, jak właśnie pokazano. Tym razem. Używając pipety o pojemności 1000 mikrolitrów do ponownego zawieszenia komórek, przenieś roztwór pojedynczej komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.

A następnie po ponownym odwirowaniu komórek res, zawieś pellet. W 18 mililitrach różnicowania, pożywki ostatecznie ponownie odtwarzają komórki w pojemniku hodowlanym kodowanym matrycą, aby uzyskać maksymalną liczbę pożądanych komórek w minimalnej liczbie przejść do dalszej analizy, pigmentowane kolonie zaczynają pojawiać się po pięciu do siedmiu tygodniach indukowalnej hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych. Kolonie te mogą rosnąć przez tygodnie, ponieważ kultury są utrzymywane.

Gdy osiągną odpowiedni rozmiar, można je ręcznie wyciąć. Staranne wycięcie w celu uniknięcia zanieczyszczenia komórkami innymi niż RPE znacznie ułatwia wytwarzanie wystarczająco czystych kultur RPE. Po opanowaniu, dużą liczbę komórek RPE można uzyskać w ciągu ośmiu do 12 tygodni, jeśli technika jest wykonywana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby uważać, aby nie zanieczyścić kultur podczas wytwarzania pożywki i karmienia komórek. Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu wielu z Was będzie w stanie wyprodukować dużą liczbę wysokiej jakości ogniw RPE firmy IPS. Miejmy nadzieję, że ułatwi to szybszą transmisję z łóżka pacjenta na łóżko pacjenta i zaoferuje terapie komórkowe pacjentom cierpiącym na obecnie nieuleczalne choroby zwyrodnieniowe siatkówki wywołane chorobą neowaskularną.