Name: Przyżyciowe obrazowanie interakcji aksonalnych z mikroglejem i makrofagami w urazie zmiażdżenia kolumny grzbietowej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Poznaj technikę dwufotonowego obrazowania przyżyciowego do badania interakcji mikrogleju i makrofagów w uszkodzonej rdzeniu kręgowym myszy. Ta metoda umożliwia obserwację ruchu komórek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Następujące agencje zapewniły kluczowe wsparcie finansowe dla tego badania: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick's Foundation (A.Y.H.), Alex's Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle's Angel Foundation (A.Y.H.) i Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). Autorzy są wdzięczni za niezastąpioną pomoc Jerry'ego Silvera i Sarah Busch w poznaniu kontuzji zmiażdżenia kolumny grzbietowej (DCC). Autorzy są również wdzięczni Jingquang You, Elisabeth Hare i Hongmei Hu za pomoc techniczną w genotypowaniu oraz Rossowi Andersonowi za montaż jednostki stabilizującej kręgosłup.

UWAGA: Wszystkie zwierzęta powinny być trzymane i wykorzystywane zgodnie z zaleceniami komitetu ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania (IACUC) w instytucji. Wszystkie opisane tutaj procedury są zatwierdzone przez Case Western Reserve University IACUC.
1. Zwierzęta transgeniczne
<ol>
	<li>Użyj dostępnych w handlu fluorescencyjnych myszy reporterowych do znakowania aksonów (Thy-1 YFP H)50 i mikrogleju / monocytów (CX3CR1GFP / GFP 51; patrz lista materiałów). Myszy te powinny być krzyżowane i utrzymywane jako indywidualne kolonie hodowlane zgodnie z instytucjonalną polityką opieki nad zwierzętami.</li>
</ol>
2. Chimery szpiku kostnego
<ol>
	<li>Zidentyfikować zwierzęta, które ukończyły co najmniej 8 tygodni, w celu wykorzystania ich jako biorców.</li>
	<li>Umieść zwierzęta żywicielskie w okrągłej klatce do napromieniania, zaprojektowanej tak, aby utrzymać mysz w pozycji zapewniającej równomierne napromieniowanie całego ciała.</li>
	<li>Ustaw timer na promienniku cezu (Cs-137), aby podać zwierzętom dawkę promieniowania całego ciała 800-1,000 Rads zgodnie z instrukcjami producenta (pokazane tutaj przykłady to 980 Rads).</li>
	<li>Zwierzęta należy umieścić w klatkach, aby odpoczęły przez co najmniej 4 godziny.</li>
	<li>Jako źródło komórek progenitorowych szpiku należy wybrać zwierzęta dawców o odpowiednim genotypie (patrz rysunek 2A). 
	UWAGA: Odpowiednimi dawcami są zwierzęta wykazujące ekspresję różnych reporterów fluorescencyjnych specyficznych dla linii od gospodarza w celu identyfikacji różnych populacji komórek lub jednej o tym samym genotypie co grupa kontrolna.</li>
	<li>Napełnij jedną szalkę Petriego 70% alkoholem, a drugą pożywkę 10 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) i sitkiem o średnicy 40 μm nasączonym w pożywce. Napełnij stożkową probówkę o pojemności 15 ml pożywką RPMI. Trzymaj naczynia i rurkę na lodzie.</li>
	<li>Uśmiercać zwierzęta dawcy przez uduszenie CO2 zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Oczyść skórę i sierść, mocząc całe zwierzę w 70% etanolu, aż całe futro będzie mokre.</li>
	<li>Usuń skórę z dolnej połowy zwierzęcia, przecinając wokół środkowej części i ciągnąc skórę w dół po tylnych nogach, aby całkowicie odsłonić mięśnie nóg.</li>
	<li>Usuń kość piszczelową przez nadmierny przedni wyprost w stawie kolanowym, aby zwichnąć kość, a następnie za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek oderwij i odetnij mięśnie z obu końców kości piszczelowej. Umieścić kość na szalce Petriego z alkoholem na okres do 30 sekund, a następnie przenieść do sitka do komórek wewnątrz szalki Petriego zawierającej podłoże.</li>
	<li>Zwichnij staw biodrowy i oderwij mięśnie przyczepione do kości udowej, umieść kość udową na krótko w alkoholu, a następnie umieść ją w tym samym sitku komórkowym wewnątrz naczynia.</li>
	<li>W kapturze do hodowli tkankowej użyj sterylnych nożyczek, aby odciąć oba końce kości i włóż igłę 21G na strzykawce o pojemności 1 ml w koniec kości. Przepłukać szpik kostny do 15 ml stożka z pożywką. Powtórz procedury dla pozostałych kości.</li>
	<li>Używając tylnej części tłoka ze strzykawki o pojemności 3 ml, zmiażdżyć końce kości w sitku na szalce Petriego, aby usunąć więcej komórek.</li>
	<li>Umieścić filtr na górze stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przenieść pożywkę z zasysanymi komórkami z probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Użyć tylnej części tłoka, aby zmiażdżyć szpik w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej. Przemyć stożkową probówkę o pojemności 15 ml, fragmenty kości i sitko do komórek z 30 ml pożywki do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki przez 5 minut przy 500 x g w celu osadzenia komórek.</li>
	<li>Lizować krwinki czerwone za pomocą 2 ml buforu do lizy chlorku amonu i potasu (ACK) przez 2 minuty. Ugasić bufor do lizy 10 ml pożywki zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej. Wirować przy 500 x g przez 5-10 minut do osadzania.</li>
	<li>Umyj komórki raz w 10 ml pożywki RPMI i dwa razy w soli fizjologicznej, odwirowując przy 500 x g przez 5-10 minut do granulacji przy każdym płukaniu.</li>
	<li>Zawiesić komórki do końcowego stężenia 3 x 106 komórek w 200 μl soli fizjologicznej.</li>
	<li>Przenieś 3 x 106 komórek szpiku przez wstrzyknięcie żyły ogonowej do napromieniowanych myszy biorców.</li>
	<li>Umieść zakwaszoną wodę (pH 3,0) w klatce biorcy i pozwól myszom dojść do siebie. 
	UWAGA: Myszy, które nie przejdą przeszczepu, umrą w ciągu 10-14 dni po zabiegu.</li>
	<li>Po 8 tygodniach sprawdź rekonstytucję szpiku, badając komórki odpornościowe krwi obwodowej za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 2B-C).</li>
</ol>
3. Uraz zmiażdżenia kolumny grzbietowej
UWAGA: Wybierz odpowiednie zwierzęta chimery lub podwójnie transgeniczne zwierzęta do operacji na podstawie pożądanego eksperymentu. Zwierzęta z oznakowanymi komórkami rezydentnymi lub pochodzącymi ze szpiku kostnego zostały stworzone w poprzednich etapach.
<ol>
	<li>Przygotuj i autoklawuj narzędzia chirurgiczne, w tym rongeurs, kleszcze Dumont #4, nożyczki do tęczówki, kleszcze do trzymania tkanek, wkrętaki do igieł i klipsy do ran.</li>
	<li>Przygotuj leki do podania myszom w celu kontroli bólu. Bupernex i Marcaine są powszechnie stosowane w celu kontroli bólu. Stosuj odpowiednie leki zgodnie z wymaganiami i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC).</li>
	<li>Wywołaj znieczulenie 4% izofluranem i utrzymuj 1-2% izofluranu, aby osiągnąć częstość oddechów 60-100 oddechów na minutę. Nałóż smar do oczu zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu i potwierdzić brak reakcji przez uszczypnięcie stopy. Utrzymuj temperaturę za pomocą poduszki grzewczej i monitoruj temperaturę za pomocą sondy doodbytniczej.</li>
	<li>Ogol grzbiet myszy golarką elektryczną na docelowym poziomie rdzenia kręgowego, a następnie trzykrotnie przetrzyj obszar powidonem-jodem, a następnie dwukrotnie 70% alkoholem. Umieść zwierzę na sterylnym serwowaniu i przykryj zwierzę inną sterylną serwetą z otworem wyciętym w odpowiednim miejscu, aby uwidocznić miejsce operacji. Utrzymuj wszystkie narzędzia na sterylnych obłożach przez cały czas trwania zabiegu.</li>
	<li>Przetnij skórę wzdłuż linii środkowej na pożądanym poziomie kręgosłupa nożyczkami do tęczówki, aby odsłonić mięsień na grzbiecie zwierzęcia.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym przetnij mięśnie pleców, w tym mięsień czworoboczny i więzadła najszerszego grzbietu wzdłuż linii środkowej, gdzie przyczepiają się do grzbietowych wyrostków kręgosłupa, i odsłoń kręgosłup.</li>
	<li>Usuń mięśnie rotatorów między wyrostkami grzbietowymi i poprzecznymi kręgu, aby odsłonić blaszkę konkretnego kręgu, który ma zostać usunięty (w tym przypadku T11). Zidentyfikuj T11 poprzez wstawienie ostatniego niepływającego żebra do tego procesu.</li>
	<li>Włóż końcówki rongeurs w przestrzeń powyżej i poniżej procesu, który ma zostać usunięty, i lekko podnieś, aby upewnić się, że są bezpiecznie na miejscu wokół blaszki kręgowej, ale nie za głęboko, aby uszkodzić kręgosłup. Zamknij rongeurs jednym ruchem, aby usunąć blaszkę.</li>
	<li>W razie potrzeby powiększ laminektomię, używając rongeurs do usunięcia małych części pozostałego kręgu.</li>
	<li>Odmierz 1 mm od końcówek kleszczyków #4, przytrzymując je przy linijce i oznaczając trwałym markerem. Odmierz 1 mm odstępu między dwoma zębami, przytrzymując kleszcze przy linijce i ustal maksymalną szerokość końcówek na 1 mm, wsuwając gumowy pierścień kleszczowy na miejsce nad trzonkiem kleszczy.</li>
	<li>Utwórz mały otwór, wprowadzając igłę o rozmiarze 30 przez oponę twardą w dwóch punktach wprowadzania zębów kleszczy, aby uzyskać dostęp do rdzenia kręgowego.</li>
	<li>Włóż zęby kleszczy pod kątem 90° do opony twardej przez otwory na głębokość 1 mm zaznaczone po bokach kleszczy, upewniając się, że znak znajduje się nad oponą twardą. Ściśnij kleszcze i przytrzymaj przez 10 sekund. Zwolnij i powtórz kleszcze, ściśnij jeszcze dwa razy, co daje w sumie trzy chwyty. Usuń kleszcze z rdzenia kręgowego.</li>
	<li>Namocz kawałek wchłanialnej gąbki żelatynowej w soli fizjologicznej i umieść w miejscu urazu.</li>
	<li>Za pomocą ściegu do biegania zszyj mięsień na miejscu nad laminektomią i nasączoną gąbką żelatynową z syntetycznymi, niewchłanialnymi szwami nylonowymi #4.</li>
	<li>Przypnij skórę na miejscu za pomocą klipsów do ran o średnicy 5 mm.</li>
	<li>Wstrzyknąć 10 μl Marcaine (1,0 mg/kg) w 490 μl soli fizjologicznej podskórnie wokół miejsca nacięcia i 5 μl Bupernexu (0,1 mg/kg) domięśniowo do mięśni pośladkowych.</li>
	<li>Pozwól zwierzęciu dojść do siebie na ciepłej podkładce i monitoruj, czy nie ma trudności w poruszaniu się lub oznak paraliżu kończyn tylnych. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki lub w obecności innych zwierząt, dopóki nie dojdzie do całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia. Nie należy używać zwierząt, które wykazują zauważalne deficyty motoryczne. 
	UWAGA: Chociaż ta zmiana zmiażdżenia może być wykonana na dowolnym poziomie wzdłuż rdzenia kręgowego, praktycznie T10-L4 stwarza mniej wyzwań technicznych dla obrazowania w odniesieniu do oddychania i stabilizacji ruchu ciała za pomocą zacisków. Umieszczenie zacisku musi być zmodyfikowane wokół klatki piersiowej, aby obrazować na poziomie klatki piersiowej.</li>
</ol>
4. Obrazowanie przyżyciowe
<ol>
	<li>Przygotuj i autoklawuj narzędzia chirurgiczne, w tym kleszczyki Dumont #4, nożyczki do tęczówki, kleszcze do trzymania tkanek, wkrętaki do igieł i klipsy do ran.</li>
	<li>Znieczulić mysz jak poprzednio izofluranem. Wywołaj znieczulenie na poziomie 4-5% i utrzymuj na poziomie 1-2% w razie potrzeby, aby utrzymać częstość oddechów 60-100 oddechów na minutę i brak reakcji na szczypanie stopy. Utrzymuj mysz w cieple, monitoruj częstość oddechów, gdy nie obrazujesz i stale monitoruj temperaturę zwierzęcia za pomocą sondy doodbytniczej.</li>
	<li>Oczyść skórę wokół klipsów do ran Betadine, a następnie alkoholem i zdejmij klipsy do ran zgodnie z instrukcjami producenta. Po usunięciu klipsów do ran, w razie potrzeby usuń włosy za pomocą Nair i ponownie oczyść miejsce powidonem i 70% alkoholem.</li>
	<li>Ponownie otwórz skórę nożyczkami. Usuń wszelkie pozostałe szwy z mięśni i rozsuń mięśnie kleszczami, w razie potrzeby przecinając nożyczkami.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym utwórz kieszenie na zaciski rdzenia kręgowego, przecinając mięsień nożyczkami po stronie wyrostków poprzecznych na kręgu na jednym poziomie kręgu powyżej i poniżej laminektomii.</li>
	<li>Umieść zaciski wokół każdego z tych kręgów i dokręć. Dostosuj w razie potrzeby, aby umożliwić obiektywowi mikroskopu dotarcie do rdzenia kręgowego. Upewnij się, że rdzeń kręgowy jest równoległy do platformy obrazowania i utrzymuj stabilność tkanek podczas obrazowania. Jeśli widoczny jest artefakt oddychania, odpowiednio wyreguluj zaciski, aby zminimalizować ruch w polu obrazowania.</li>
	<li>Przykryj zaciski parafilmem.</li>
	<li>Usuń wchłanialną żelatynową gąbkę skompresowaną z rdzenia kręgowego za pomocą kleszczy, delikatnie odrywając jak najwięcej kawałków, usuwając również jak najwięcej tkanki bliznowatej znad opon mózgowych. W razie potrzeby przykryj odsłonięty rdzeń kręgowy solą fizjologiczną i nową gąbką. 
	UWAGA: Jeśli wystąpi jakiekolwiek krwawienie z otaczającego mięśnia, zatamuj gąbką lub kauteryzuj w razie potrzeby. Należy jednak uważać, aby nie dotykać rdzenia kręgowego kauteryzacją. Podczas kauteryzacji przykryj rdzeń kręgowy kawałkiem zwilżonej tkanki lub gąbką sprasowaną żelatyną.</li>
	<li>Stwórz studzienkę do przechowywania płynu immersyjnego, najpierw uszczelniając skórę i tkankę za pomocą Vetbond, a następnie używając akrylu dentystycznego, aby zbudować studzienkę między dwoma zaciskami uchwytu rdzenia kręgowego a bokami zwierzęcia. Poczekaj, aż akryl utwardzi się.</li>
	<li>Napełnij studzienkę sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF) i ponownie sprawdź, czy nie ma krwawienia wokół miejsca operacji.</li>
	<li>Opcjonalnie w tym momencie wstrzyknąć dożylnie fluorescencyjne barwniki naczyniowe przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej, aby uwydatnić naczynia krwionośne podczas obrazowania. 
	UWAGA: Często stosuje się dekstran fluorescencyjny o stężeniu powyżej 70 kDa, chociaż kropki kwantowe i znakowane fluorescencyjnie lektyny również służą jako użyteczne barwniki naczyniowe. 50 μl 150 000 WM TRITC-dekstranu jest zwykle wstrzykiwane dożylnie.</li>
	<li>Aby uzyskać fizjologicznie istotną ruchliwość komórek odpornościowych, temperatura myszy musi być utrzymywana na poziomie 37 °C. Przenieś mysz do środowiska o kontrolowanej temperaturze pod mikroskopem w celu obrazowania i monitoruj zwierzę pod kątem prawidłowego poziomu znieczulenia za pomocą częstości oddechów i szczypania stopy. Często monitoruj zwierzę podczas obrazowania, aby określić głębokość znieczulenia, dążąc do osiągnięcia częstości oddechów 60-100 oddechów na minutę.</li>
	<li>Zlokalizuj miejsce obrazowania przez okular mikroskopu.</li>
	<li>Dostosuj 2-fotonowy laserowy mikroskop skaningowy tak, aby wykonywał obraz z-stack co 30-60 sekund, aby uzyskać dynamiczne dane obrazowania.</li>
	<li>Po zakończeniu sesji obrazowania wyjmij zwierzę z podgrzewanego pudełka.</li>
	<li>Poluzuj zaciski kręgosłupa i wyjmij mysz z zacisków. Odciągnij akryl od skóry, jednocześnie usuwając zaciski.</li>
	<li>Jeśli mysz ma zostać ponownie zobrazowana, umieść na rdzeniu kręgowym nasączoną solą fizjologiczną gąbkę sprasowaną żelatyną. Zamknij mięsień i skórę nad miejscem operacji. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki lub w obecności innych zwierząt podczas rekonwalescencji po znieczuleniu. Jeśli zwierzę wykazuje jakiekolwiek oznaki deficytu neurologicznego po wyzdrowieniu, zwierzę powinno zostać poddane eutanazji. W przeciwnym razie należy poddać mysz eutanazji w komorze CO2 przed wyjściem ze znieczulenia zgodnie z zatwierdzonym przez IACUC protokołem eutanazji.</li>
	<li>Analizuj obrazy fluorescencyjne za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obrazowanie interakcji różnych typów komórek w ich natywnych przedziałach tkankowych podczas późniejszej patologii w czasie rzeczywistym wzbudziło duże zainteresowanie. W gęstej sieci OUN kontakt komórka-komórka i sygnalizacja z sąsiednimi komórkami są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania i zrozumienia patologii OUN. W tym miejscu opisaliśmy zastosowanie 2-fotonowej laserowej mikroskopii skaningowej do obserwacji ruchu komórek w obrębie zmiany mechanicznej w rdzeniu kręgowym. Oprócz jakości operacji i przygotowania tkanek, stabilność mechaniczna tkanki ma kluczowe znaczenie dla udanej mikroskopii poklatkowej, a w szczególności izolacji rdzenia kręgowego od artefaktu ruchu oddechowego. Stabilność można ocenić, szukając ruchu rdzenia kręgowego pod mikroskopem preparacyjnym, który odpowiada częstości akcji serca lub oddechowi zwierzęcia. Stabilność należy oceniać zarówno podczas wykonywania zabiegu, jak i bezpośrednio przed rozpoczęciem obrazowania. Jeśli zwierzę nie jest stabilne, należy dostosować rozmieszczenie i szczelność zacisków rdzenia kręgowego. Specyficzne dla typu komórki fluorescencyjne modele myszy reporterowych w połączeniu z metodami chimery szpiku kostnego umożliwiły identyfikację komórek monocytowych w porównaniu z mikroglejem i aksonami. Wcześniejsze badania wykazały, że to monocyty pochodzące z krwi, a nie mikroglej, są odpowiedzialne za wtórne uszkodzenie aksonów po urazie przy użyciu metodologii opisanej tutaj43. Sprzężony z dekstranem barwnik naczyniowy pozwala na identyfikację naczyń zarówno w celu zapewnienia punktów orientacyjnych, jak i identyfikacji naruszeń integralności naczyń. Wybór odpowiedniego fluorescencyjnego modelu myszy reporterowej ma kluczowe znaczenie dla umożliwienia prawidłowej identyfikacji pożądanych typów komórek, które mają zostać zobrazowane.
Opracowanie fluorescencyjnych modeli myszy, które są odpowiednie dla podejmowanych badań, ma również kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentów. Rozróżnienie między dwiema populacjami fagocytarnymi komórek CX3CR1 + / GFP w OUN tradycyjnie było trudne. Jak pokazano tutaj, powszechna technika immunologiczna, chimery napromieniające, może być wykorzystana do odróżnienia odpornego na promieniowanie mikrogleju rezydującego w OUN od makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego. Procedura napromieniania może potencjalnie uszkodzić barierę krew-mózg i zmienić fenotypy komórek, dlatego należy dokładnie rozważyć użycie tego modelu. Zakres tych zmian różni się w zależności od dawki napromieniowania, a także czasu trwania okresu rekonwalescencji, a ich wpływ na różne modele stanu zapalnego nie został w pełni zbadany. Wpływ napromieniania na barierę krew-mózg OUN można zminimalizować poprzez osłonę głowy podczas napromieniania, a wykazano, że zmniejsza to infiltrację komórek do rdzenia kręgowego po napromieniowaniu, nawet jeśli rdzeń kręgowy nie jest bezpośrednioekranowany. Tutaj zaobserwowaliśmy, że liczba komórek naciekających do OUN w stanie stacjonarnym w wyniku generacji chimer jest nieznaczna w porównaniu z liczbą komórek wchodzących do zmiany. Inne alternatywne modele, które należy rozważyć, obejmują chimery indukowane lekami52 lub parabiotyczne modele myszy53.
W tym miejscu przedstawiliśmy specyficzny, prosty i powtarzalny model małego urazu, który powoduje uszkodzenie grzbietowej istoty białej rdzenia kręgowego, które jest łatwe do zobrazowania za pomocą mikroskopii 2-fotonowej. Metoda ta zapewnia również wymierną zmianę do oznaczania stopnia zamierania aksonów w kolumnach grzbietowych, które w literaturze zostały sprzężone z komplementarną analizą tkanek stałych16,18,43,48,54. W tym modelu zwierzęta wykazują jedynie minimalne deficyty i nie wymagają specjalnej opieki po kontuzji. Przyszłe badania wykorzystujące uraz zmiażdżenia kręgosłupa i opisane tutaj techniki obrazowania mogą być potężnymi narzędziami przesiewowymi do oceny skuteczności leczenia urazu rdzenia kręgowego. Leczenie to może obejmować inhibitory małocząsteczkowe, leki, produkty komórkowe, przeszczepy tkanek i terapie skojarzone. Wzajemne oddziaływanie między makrofagami, mikroglejem i neuronami może również odgrywać rolę w innych modelach chorób rdzenia kręgowego, w tym stwardnieniu rozsianym, guzach, zapaleniu opon mózgowych i stwardnieniu zanikowym bocznym, a technika ta może być również przydatna w badaniu tych chorób.

Reakcja zapalna na chorobę lub uraz w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) jest słabo poznana, szczególnie w odniesieniu do interakcji między komórkami odpornościowymi i rezydentnymi w tkance. Badania tych interakcji komórkowych w rdzeniu kręgowym są szczególnie interesujące u żyjących zwierząt. Jedyny łatwo dostępny szlak istoty białej OUN znajduje się w grzbietowych kolumnach rdzenia kręgowego, co czyni go ważnym obszarem, na którym należy skoncentrować wysiłki w celu poprawy wykonalnego podejścia eksperymentalnego. Badania te były ograniczone ze względu na trudności techniczne w dostępie i stabilizacji OUN do obrazowania. Obrazowanie na żywo w rdzeniu kręgowym zostało opisane wcześniej1-13, jednak niewiele badań dotyczyło ruchu komórkowego w urazie rdzenia kręgowego dłużej niż kilka godzin po początkowym urazie. Urazowe uszkodzenie rdzenia kręgowego jest złożonym środowiskiem, w którym znajdują się neurony, astrocyty, fibroblasty, komórki progenitorowe NG2 i komórki odpornościowe, w tym mikroglej, neutrofile, makrofagi, limfocyty T, limfocyty B i komórki dendrytyczne14,15. Makrofagi są podzbiorem komórek odpornościowych odpowiedzialnych za fagocytozę w zmianie, infiltrujących z krążenia. Rola tych komórek fagocytarnych była dyskutowana, a doniesienia wskazują, że komórki te mogą pełnić zarówno szkodliwe, jak i ochronne role w uszkodzonej tkance. Role te wahają się od zwiększenia wtórnego zamierania aksonów po urazie i działania w sposób fagocytarny16-22, do przyjęcia fenotypu gojenia się ran i zmniejszenia deficytów funkcjonalnych u zranionego zwierzęcia21,23,24.
Poprzednio, próby odróżnienia makrofagów od mikrogleju opierały się głównie na morfologii zdrowych tkanek. Jednak aktywowany mikroglej i makrofagi wyrażają wiele tych samych markerów i wykazują nieodróżnialną morfologię po urazie25-29, co utrudnia rozdzielenie różnych aktywności tych komórek na podstawie samych tych czynników30. Komórki te można rozdzielić przez różnicową ekspresję CD45 za pomocą cytometrii przepływowej33,34, chociaż podejście to jest mniej przydatne w rozróżnianiu tych typów komórek in vivo. Zbadano również wykorzystanie zróżnicowanej ekspresji CCR2 i CX3CR1 w mikrogleju i makrofagach, chociaż dynamiczne zmiany w ekspresji tych markerów, gdy monocyty różnicują się w makrofagi, mogą komplikować dokładną analizę35,36. Mikroglej jest rezydującymi komórkami odpornościowymi w OUN i powstaje z komórek progenitorowych woreczka żółtkowego podczas rozwoju płodu, podczas gdy makrofagi pochodzą z komórek progenitorowych szpiku kostnego i dostają się do uszkodzonego OUN po zniewadze31,32. Alternatywnym podejściem do wykorzystania morfologii do rozróżnienia tych dwóch typów komórek jest zastąpienie szpiku kostnego progenitorami od zwierzęcia dawcy wykazującymi ekspresję identyfikowalnego markera w makrofagach pochodzących od przodków dawcy, przy jednoczesnym zachowaniu mikrogleju pochodzącego od biorcy zamieszkującego OUN. Te chimeryczne modele szpiku kostnego są powszechnie wykorzystywane w wielu innych zastosowaniach37-40. Metoda ta ma unikalne zastrzeżenia związane z uszkodzeniem integralności bariery krew-mózg spowodowanym napromienianiem lub lekami cytotoksycznymi stosowanymi w celu wyeliminowania komórek progenitorowych szpiku u gospodarza, ograniczając w ten sposób jej zastosowanie w niektórych zastosowaniach. Ostatnio zaczynają być dostrzegane funkcjonalne różnice między mikroglejem a makrofagami w OUN za pomocą cytometrii przepływowej, analizy macierzy chipów genowych i metod chimeryzmu24,26,41-44, które okażą się bardzo przydatne w przyszłości. Chociaż oddzielenie tych dwóch typów komórek pozostaje trudne, zrozumienie ich unikalnych funkcji jest ważne w prowadzeniu do bardziej ukierunkowanego leczenia zaburzeń, które obejmują zarówno mikroglej, jak i makrofagi w OUN.
Opis interakcji komórkowych w obrębie uszkodzenia rdzenia kręgowego pochodzi głównie z badań z udziałem modeli hodowli komórkowych. Wynika to z wyzwań związanych z obrazowaniem zarówno uszkodzenia rdzenia kręgowego, jak i komórek odpornościowych u żywego zwierzęcia. Obecne modele urazów rdzenia kręgowego u gryzoni o różnym typie i stopniu obejmują modele stłuczenia45,46, urazy ukłucia szpilką2, rany szarpane47 i opisane tutaj urazy zmiażdżenia kręgosłupa16,18,48. Stan zapalny opon mózgowych nasila się wraz z ciężkością urazu i stanowi wyjątkowe wyzwanie dla implantacji okien lub operacji w celu seryjnego obrazowania. Niektóre z tych wyzwań obejmują infiltrację komórek fagocytarnych, a także wytwarzanie tkanki włóknistej w miejscu operacji. Niektóre z tych problemów można przezwyciężyć, tworząc mniejsze zmiany i pokrywając odsłonięty rdzeń kręgowy nieimmunogennym opatrunkiem chirurgicznym między oponą twardą a mięśniami przykolcowymi, aby umożliwić późniejszą operację ponownego otwarcia, tak jak ma to miejsce w przypadku badania uszkodzenia zmiażdżenia kolumny grzbietowej. Możliwość zobrazowania tylko grzbietowej części rdzenia kręgowego również ogranicza wybór urazu, ponieważ modele stłuczenia powodują przede wszystkim uszkodzenie rdzenia centralnego, często oszczędzając najbardziej grzbietową część kolumn grzbietowych, zwłaszcza we wczesnych punktach czasowych po urazie45,49. Dlatego opisujemy prosty model urazu, który daje czystą, powtarzalną zmianę o prostokątnym kształcie, która jest przydatna zarówno do obserwacji ruchu komórek w obrębie zmiany, jak i do łatwego ilościowego określenia pozycji aksonów względem zmiany.

<table><tbody><tr><td>CX3CR1 Myszy GFP</td><td>Laboratoria Jacksona</td><td>5582</td><td></td></tr><tr><td>Myszy Thy-1 YFP H</td><td>Laboratoria Jacksona</td><td>3782</td><td></td></tr><tr><td>Klatka do ciasta dla myszy</td><td>Braintree Scientific</td><td>MPC 2 zestaw</td><td></td></tr><tr><td>60 mm2 szalka Petriego</td><td>Corning</td><td>430166</td><td>Do izolacji szpiku kostnego</td></tr><tr><td>Falcon 40 &mu; m filtr komórkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td>Do izolacji szpiku kostnego</td></tr><tr><td>1 x 15 ml i 1 x 50 ml rurka stożkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Do izolacji szpiku kostnego</td></tr><tr><td>Igła o rozmiarze 21 BD</td><td></td><td>305177</td><td>Do izolacji szpiku kostnego</td></tr><tr><td>1 ml strzykawka</td><td>BD</td><td>309628</td><td>Do izolacji szpiku kostnego</td></tr><tr><td>Bufor do lizy ACK</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>Do kości izolacja szpiku</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-022-CV</td><td>Do izolacji szpiku kostnego</td></tr><tr><td>RPMI media</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>Do izolacji szpiku kostnego</td></tr><tr><td>Przeciwciało F4/80</td><td>Ebioscience</td><td>12-4801 PE</td><td>Do weryfikacji chimer FACS</td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa o rozmiarze 30</td><td>BD</td><td>328280</td><td>Do wstrzykiwania żyły ogonowej</td></tr><tr><td>Zaciski rdzenia kręgowego</td><td>Narshinge</td><td>STS-A</td><td>Do obrazowania</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Dental Proszek akrylowy</td><td>Lang Dental</td><td>REF1320</td><td>Do obrazowania</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Dental Płyn akrylowy</td><td>Lang Dental</td><td>REF1404</td><td>Do obrazowania</td></tr><tr><td>Gąbki żelatynowe żelpiankowe</td><td>Pfizer</td><td>9034201</td><td>Do obrazowania</td></tr><tr><td>4-0 Nici</td><td>Ethilon</td><td>1667G</td><td>Do operacji</td></tr><tr><td>Klipsy refleksyjne, 7 mm</td><td>Kent Scientific</td><td>INS750344</td><td>Do chirurgii. Sterylizuj przed użyciem</td></tr><tr><td>Nożyczki do tęczówki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-09</td><td>Do operacji</td></tr><tr><td>45/5 Kleszcze, Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>Do operacji</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td>Do chirurgii</td></tr><tr><td>Igła o rozmiarze 30</td><td>BD</td><td>305106</td><td>Do wykonywania otworów dostępowych w oponie twardej</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #4 Wskazówki biologiczne</td><td>Dumont</td><td>11242-40</td><td>Do chirurgii</td></tr><tr><td>Sterowniki igieł</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td>Do operacji</td></tr><tr><td>Michel Szczypce do przycinania ran</td><td>Kent Scientific INS700753</td><td></td><td>Do operacji</td></tr><tr><td>Środek do usuwania klipsów do ran</td><td>Fine Science Tools</td><td>12033-00</td><td>Do chirurgii</td></tr><tr><td>O-ringi do kleszczy</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-00</td><td>Do operacji, często wyposażone w kleszcze #4, mogą również należy zamawiać osobno</td></tr><tr><td>Akumulatorowy trymer dla zwierząt</td><td>Wahl</td><td>Series 8900</td><td>do operacji</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>Do operacji</td></tr><tr><td>Roztwór Betadine (10% roztwór miejscowy Providine-Jod)</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>NDC 67618-150-08</td><td>Do zabiegu chirurgicznego</td></tr><tr><td>Nair Balsam do depilacji</td><td>Church & Dwight Co., Inc.</td><td>NRSL-22329-05</td><td>Do zabiegu chirurgicznego</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td>Leki &ndash; do zabiegu chirurgicznego</td></tr><tr><td>Marcaine</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 0409-1587-50</td><td>Leki &ndash; do zabiegu chirurgicznego 1,0 mg/kg podawane podskórnie</td></tr><tr><td>Bupernex</td><td>Henry Schein</td><td>121-7793</td><td>Leki &ndash; do operacji buprenorfina 0,1 mg/kg</td></tr><tr><td>aCSF</td><td>Chemikalia firmy Sigma</td><td>119 mM NaCl 26,2 mM NaHCO3 2,5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1,3 mM MgCl2 10 mM</td><td>glukozy Do zabiegu chirurgicznego Z protokołów Cold Spring Harbor</td></tr><tr><td>TRITC-dekstran 150 000 MW</td><td>Sigma</td><td>T1287</td><td>Do podawania dożylnego w celu oznaczenia naczyń krwionośnych</td></tr></tbody></table>

przyżyciowe obrazowanie interakcji aksonalnych z mikroglejem i makrofagami w urazie zmiażdżenia kolumny grzbietowej myszy

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Urazowe uszkodzenie rdzenia kręgowego powoduje reakcję zapalną z udziałem makrofagów pochodzenia krwionośnego i mikrogleju rezydującego w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Mikroskopia dwufotonowa przyżyciowych umożliwia badanie makrofagów i mikrogleju w uszkodzeniu rdzenia kręgowego u żywego zwierzęcia. Można to wykonać u dorosłych zwierząt z urazowym urazem kolumny grzbietowej. W tym miejscu opisujemy metody odróżniania makrofagów od mikrogleju w OUN za pomocą chimery szpiku kostnego napromieniającej w celu uzyskania zwierząt, u których tylko makrofagi lub mikroglej są znakowane genetycznie kodowanym zielonym białkiem fluorescencyjnym. Opisujemy również model urazu, który miażdży grzbietową kolumnę rdzenia kręgowego, wytwarzając w ten sposób prostą, łatwo dostępną, prostokątną zmianę, którą można łatwo uwidocznić u zwierzęcia za pomocą laminektomii. Ponadto przedstawimy procedury sekwencyjnego obrazowania zwierząt w anatomicznym miejscu urazu w celu zbadania interakcji komórkowych w ciągu pierwszych kilku dni do tygodni po urazie.

Schematycznego rysunku przedstawiającego zmiażdżenie słupów tylnych rdzenia kręgowego pokazano na Ryc. 1A. Po wykonaniu urazu zwierzę jest przygotowywane i stabilizowane do mikroskopii intravitalnej przy użyciu klamer do rdzenia (Ryc. 1B). Obraz wykonany bezpośrednio po zmiażdżeniu słupów tylnych ukazuje wyraźnie widoczną prostokątną zmianę z łatwo identyfikowalnymi punktami wprowadzenia ramion pęsety. Aksony w miejscu urazu są przerwane w obrębie całego słupa tylnego (Ryc. 1C). Integralność naczyń krwionośnych zostaje zachowana, a w badaniu fluorescencyjnym nie stwierdzono wycieku barwnika z naczyń. Aby przeprowadzić seryjne obrazowanie tej samej zmiany w ciągu kilku tygodni, mięśnie i skórę można zaszyć nad miejscem laminektomii w celu późniejszej ponownej ekspozycji. Podobna morfologia zmiany jest widoczna w późniejszych punktach czasowych (Ryc. 1D, E). 5 dni po urazie miejsca wprowadzenia pęsety są nadal widoczne, ale zmiana zaczęła zwiększać swoje rozmiary z powodu urazu wtórnego spowodowanego stanem zapalnym. Aksony na końcu ogonowym zmiany wycofały się z pierwotnego miejsca urazu w procesie zwanym „axonal dieback”. Aksony na końcu głowowym zmiany wykazywały degenerację typu Wallera (Ryc. 1D, E). Między 5. a 22. dniem po urazie rozmiar zmiany ustabilizował się. Jednocześnie w tych punktach czasowych można zaobserwować duży napływ komórek CX3CR1+ infiltrujących zmianę zmiażdżeniową i jej okolice, choć w preparacie przedstawionym na Ryc. 1 nie można rozróżnić tożsamości tych komórek (mikroglej a makrofagi).
Aby odróżnić zachowanie mikrogleju i makrofagów w mikrośrodowisku zmiany po zmiażdżeniu, zastosowano model chimery radiacyjnej (przedstawiony na ryc. 2A). Po pierwsze, komórki progenitorowe szpiku kostnego myszy CX3CR1+/GFP zostają zastąpione niefluorescencyjnymi komórkami dawcy, dzięki czemu w obrazowaniu fluorescencyjnym widoczne są jedynie GFP+ mikroglej rezydentny w OUN. Wydajność rekonstrukcji szpiku można potwierdzić za pomocą cytometrii przepływowej krwi obwodowej 8 tygodni po przeszczepie szpiku (ryc. 2B, C). Na ryc. 2B u myszy chimerycznej CX3CR1+/GFP → C57BL/6 wykryto makrofagi dodatnie pod względem F4/80 i GFP, zaznaczone na niebiesko, w których obecne są również niektóre monocyty GFP-ujemne, ale F4/80-dodatnie. Na ryc. 2C po zastąpieniu szpiku kostnego biorcy CX3CR1+/GFP szpikiem kostnym typu dzikiego nie pozostały żadne komórki podwójnie dodatnie dla F4/80 i GFP. Przed urazem mikroglej jest równomiernie rozłożony w rdzeniu kręgowym, wykazując spoczynkową, rozgałęzioną morfologię (ryc. 2D). 8 dni po urazie w obrębie i wokół zmiany można wykryć tylko kilka komórek mikrogleju. Komórki te wykazują morfologię ameboidalną (ryc. 2E). Po drugie, komórki progenitorowe szpiku kostnego u niefluorescencyjnej myszy zostają zastąpione komórkami szpiku z myszy CX3CR1+/GFP, co czyni monocyty/makrofagi CX3CR1+ pochodzące ze szpiku kostnego widocznymi w fluorescencji GFP (ryc. 2A). Przed urazem jedyne wykryte komórki GFP+ znajdują się głównie w obrębie naczyniowym; zgłoszono, że pochodzą one ze szpiku kostnego i podlegają ciągłej wymianie28 (ryc. 2F). Po urazie zmiażdżeniowym komórki CX3CR1+/GFP są widoczne wzdłuż wewnętrznej ściany naczyń krwionośnych otaczających zmianę (ryc. 2H-J), a centrum zmiany jest wypełnione infiltrującymi makrofagami CX3CR1+/GFP (ryc. 2G).
Obrazowanie time-lapse słupów tylnych można prowadzić do 6 hr. Na Rysunku 3 przedstawiamy niechimeryczną mysz CX3CR1+/GFP bezpośrednio po urazie, w której widać komórki z krążenia przemieszczające się z naczynia krwionośnego w stronę centrum zmiany oraz poruszające się w obrębie miejsca urazu (Rysunek 3A, B; Film uzupełniający 1). Analiza obrazu z wykorzystaniem intensywności fluorescencji do identyfikacji komórek pozwala śledzić trasy przemieszczania się makrofagów (Rysunek 3A, B; Film uzupełniający 1). Statystyki wynikające z analizy obrazowania wykazują, że średnia ruchliwość makrofagów w obrębie zmiany wynosi 3,6 µm/min (Rysunek 3D). Ostatecznie, 22 dni po urazie w obrębie zmiany nadal można wykryć aksony, mikroglej i makrofagi, co dowodzi, że obszar obrazowania jest stabilny w długich okresach czasu (Film uzupełniający 2).
<img alt="Proces zmiażdżenia rdzenia kręgowego, użycie pęsety, schemat osi czasu urazu, badanie odpowiedzi mikrogleju." fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Wywołanie i sekwencyjne obrazowanie urazu zmiażdżeniowego słupów tylnych. (A) Uraz zmiażdżeniowy słupów tylnych jest wykonywany poprzez usunięcie wyrostka kolczystego kręgu na interesującym nas poziomie. Pęsetę wprowadza się do słupów tylnych rdzenia kręgowego w odstępie 1 mm, a następnie zamyka się ją 3 razy, aby wywołać zmianę zaznaczoną kolorem fioletowym. (B) Następnie zwierzę jest unieruchamiane za pomocą klamer do rdzenia kręgowego w celu uzyskania stabilności niezbędnej do obrazowania intravitalnego. (C) Bezpośrednio po urazie można wyraźnie zidentyfikować miejsca wprowadzenia pęsety (czerwona owal) oraz prostokątną objętość urazu zmiażdżeniowego (szare pole). Widoczne są aksony w korzeniach tylnych (białe strzałki), a także uszkodzone końce aksonów po stronie ogonowej zmiany (pełne groty strzałek). (D) 5 dni po urazie wciąż można łatwo zwizualizować miejsca wprowadzenia pęsety (czerwona owal) oraz zasięg zmiany (szare pole). Od momentu początkowego urazu rozmiar zmiany uległ zwiększeniu. Przed zmianą (otwarte groty strzałek) widoczne są aksony ulegające degeneracji typu Wallera, a także aksony w korzeniach tylnych (białe strzałki) i końce uszkodzonych aksonów (białe groty strzałek). (E) 22 dni po urazie miejsce zmiany jest nadal identyfikowalne i ma wymiary zbliżone do tych z 5. dnia po urazie. Zwróć uwagę na dużą liczbę komórek CX3CR1+ w miejscu urazu i wokół niego. Oznaczenia elementów są takie same jak w (D). Wszystkie paski skali = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment na modelu mysim z oznakowaną mikrogleją i makrofagami, schematy uszkodzeń aksonów, mikroskopia." fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Konstrukcja myszy chimerycznych w celu śledzenia mikroglei rezydującej w OUN lub makrofagów pochodzenia szpikowego wykazujących ekspresję CX3CR1+/GFP w miejscu zmiażdżeniowego uszkodzenia słupa tylnego. (A) Schemat generowania myszy chimerycznych z mikrogleją lub makrofagami wykazującymi ekspresję CX3CR1+/GFP. Po pierwsze, myszy Thy-1 YFP H są naświetlane, a szpik kostny jest rekonstruowany komórkami szpiku wyizolowanymi z myszy CX3CR1+/GFP, co daje mysz chimerę, której makrofagi są GFP+. Po drugie, myszy Thy-1 YFP H / CX3CR1+/GFP są naświetlane, a szpik kostny jest rekonstruowany komórkami szpiku wyizolowanymi z myszy niefluorescencyjnej, co daje mysz chimerę, której mikrogleja jest GFP+. (B) Przykład danych z cytometrii przepływowej z komórkami F4/80+ i CX3CR1 GFP+ we krwi zwierzęcia chimerycznego z donorem szpiku CX3CR1+/GFP przeszczepionym do naświetlonego biorcy C57BL/6. Komórki pochodzące od donorów CX3CR1 dodatnich, które są dodatnie zarówno dla GFP, jak i F4/80, są pokazane w obszarze wyróżnionym na niebiesko. (C) Przykład danych z cytometrii przepływowej z komórkami F4/80+ i CX3CR1 GFP+ u zwierzęcia chimerycznego ze szpikiem donora C57BL6 przeszczepionym do naświetlonego biorcy CX3CR1+/GFP. Należy zwrócić uwagę na brak komórek podwójnie dodatnich CX3CR1+/GFP i F4/80 w obszarze wyróżnionym na niebiesko. (D) Intrawitalny obraz z mikroskopii dwufotonowej myszy z pierwszego schematu chimerycznego, pokazujący GFP+ mikrogleję o morfologii rozgałęzionej w obrębie słupa tylnego (grot strzałki). Komórki te są rozmieszczone pomiędzy aksonami (żółty) w korzeniu tylnym i słupie tylnym. Pasek skali = 100 µm. (E) Obrazowanie intrawitalne tej samej myszy co w (B) 8 dni po uszkodzeniu słupa tylnego ujawnia kilka mikroglej CX3CR1+ o dużych, ameboidalnych ciałach komórkowych pozbawionych wypustek (grot strzałki). Pasek skali = 100 µm. (F) Obraz myszy z drugiego schematu chimerycznego z (A), pokazujący nieliczne makrofagi GFP+ w obrębie miąższu OUN. Pasek skali = 100 µm. (G) Obrazowanie intrawitalne tej samej myszy co w (F) 8 dni po uszkodzeniu słupa tylnego ujawnia duży napływ makrofagów do miejsca uszkodzenia i wokół niego. Pasek skali = 100 µm. (H) Zdjęcie przy większym powiększeniu przedstawiające komórki CX3CR1+ pochodzenia krwi w kontakcie z naczyniami u nieuszkodzonego zwierzęcia. Pasek skali = 30 µm. (I) Rekonstrukcja komórek CX3CR1 w kontakcie z naczyniem, widziana z wnętrza naczynia. Pasek skali = 30 µm. (J) Rekonstrukcja komórek CX3CR1 w kontakcie z naczyniem, widziana z zewnątrz naczynia. Pasek skali = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Eksperyment na modelu mysim z oznakowaną mikrogleją i makrofagami, schematy uszkodzenia aksonów, mikroskopia." fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 3:. Reprezentatywne dane z trackingu komórek u niechimerycznej myszy CX3CR1+/GFP bezpośrednio po urazie zmiażdżeniowym kolumny grzbietowej. (A) Migawka z mikrogleją i makrofagami CX3CR1+ wokół uszkodzonych aksonów (żółte) z Supplementary Movie 1 bezpośrednio po urazie zmiażdżeniowym kolumny grzbietowej. (B) Ścieżki (szare) przebyte przez komórki CX3CR1+ z panelu (A) podczas 110-minutowej sesji obrazowania intravitalnego. (C) Reprezentacja ścieżek z panelu (B) zakodowana czasowo. Ścieżki są pokolorowane w zależności od czasu ich wystąpienia w całym 110-minutowym filmie, zgodnie z paskiem czasu. (D) Histogram całkowitej ruchliwości komórek CX3CR1+ . Wszystkie paski skali wynoszą 30 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Film uzupełniający 1: Reprezentatywny film intravitalny bezpośrednio po zmiażdżeniu sznura tylnego u myszy podwójnie heterozygotycznej Thy-1YFP/+ / CX3CR1GFP/+ . Obrazowanie intravitalne rdzenia kręgowego przeprowadzono bezpośrednio po zmiażdżeniu sznura tylnego na poziomie T11. Prawy panel pokazuje ruch mikrogleju i makrofagów CX3CR1+. Ścieżki ruchu komórek przedstawiono jako białe linie na lewym panelu. Miejsce urazu znajduje się w górnym lewym rogu. Widać komórki CX3CR1+ przemieszczające się w stronę miejsca urazu wzdłuż tych ścieżek. Aksony przedstawiono w kolorze żółtym. Pasek skali = 40 µm. Czas całkowity: 110 min. Prędkość odtwarzania: 300x.
Film uzupełniający 2: Reprezentatywne nagranie intravitalne 22 dni po zmiażdżeniu słupów tylnych u myszy podwójnej heterozygoty Thy-1YFP/+ / CX3CR1GFP/+ . Przedstawiono reprezentatywny film zarejestrowany u myszy 22 dni po pierwotnym urazie zmiażdżeniowym słupów tylnych na poziomie T11 rdzenia kręgowego. Miejsce urazu znajduje się w prawym górnym rogu kadru. W prawym dolnym rogu widoczne są aksony (żółte) biegnące w kierunku rostralnym. Żyła grzbietowa oraz naczynia krwionośne zostały oznakowane TRITC-dekstraną (czerwone). Komórki CX3CR1+ w obrębie zmiany przemieszczają się z mniejszą prędkością w porównaniu do komórek bezpośrednio po urazie. Pasek skali = 50 µm. Czas całkowity: 90 min. Prędkość odtwarzania: 600x.

Dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe może być użyte do zbadania interakcji między różnymi typami komórek w rdzeniu kręgowym w ich naturalnym środowisku tkankowym u chimerycznego zwierzęcia szpiku kostnego z urazowym uszkodzeniem rdzenia kręgowego w kolumnie grzbietowej.

Przyżyciowe obrazowanie interakcji aksonalnych z mikroglejem i makrofagami w urazie zmiażdżenia kolumny grzbietowej myszy

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja ruchu i interakcji między mikroglejem, monocytami i innymi typami komórek w uszkodzonym rdzeniu kręgowym. Osiąga się to poprzez stworzenie chimerycznych myszy szpiku kostnego, które będą miały rezydentny mikroglej lub makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego znakowane markerem fluorescencyjnym. Drugim krokiem jest spowodowanie zmiażdżenia kręgosłupa w rdzeniu kręgowym.Następnie zwierzęta są ponownie otwierane, a rdzeń kręgowy jest stabilizowany W przypadku obrazowania wielofotonowego ostatnim krokiem jest wykonanie pojedynczych zdjęć lub filmów poklatkowych w obrębie zmiany. Ostatecznie analiza obrazu pokazuje ruch komórek i interakcję komórkową z otaczającymi substratami. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z tradycyjną techniką, taką jak hodowla komórkowa i utrwalone tkanki, jest to, że komórki można obrazować w ich naturalnym, złożonym środowisku u żywego zwierzęcia.Do tej operacji użyj chimerycznych lub podwójnie transgenicznych zwierząt. Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby dowiedzieć się, jak oznaczać komórki rezydentne lub pochodzące ze szpiku kostnego po wywołaniu znieczulenia, utrzymuj go za pomocą jednego do 2% fluoru ISO, aby uzyskać częstość oddechów około 60 do 100 oddechów na minutę. Teraz nałóż maści do oczu i potwierdź chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia szczyptą palca u nogi.Przygotuj się do operacji, najpierw goląc docelowy obszar rdzenia kręgowego, a następnie wycierając skórę do czysta jodem powidonu i 70% peelingami alkoholowymi, udrapuj zwierzę i zrób otwór, aby uzyskać dostęp do miejsca operacji. Następnie rozłóż narzędzia do autoklawu na sterylnej serwacji. Obejmuje to kleszcze numer cztery, które są zamocowane tak, aby znajdowały się w odległości jednego milimetra między zębami i mają ślady w odległości jednego milimetra od końcówek.Teraz można otworzyć skórę w linii środkowej za pomocą nożyczek do tęczówki, odsłaniając mięśnie. Kontynuuj operację pod mikroskopem preparacyjnym. Wzdłuż linii środkowej przetnij mięśnie pleców w miejscu, w którym przyczepiają się do grzbietowych wyrostków kręgosłupa, w celu odsłonięcia kręgosłupa.Polega to na przecięciu mięśnia czworobocznego i więzadeł mięśnia najszerszego grzbietu. Następnie usuń mięśnie rotatorów między wyrostkami poprzecznymi a wyrostkiem grzbietowym, aby odsłonić blaszkę określonego kręgu przeznaczonego do usunięcia. Tutaj odsłonięty jest T 10.Kontynuuj, wkładając końcówki jurora RO w przestrzeń powyżej i poniżej procesu. Następnie lekko unieś, aby upewnić się, że końcówki są bezpiecznie na swoim miejscu i nie są zbyt głębokie. Następnie zamknij ławice RO, aby usunąć blaszkę.Teraz usuń wszystkie mniejsze części pozostałego kręgu, powiększając w ten sposób otwór. Za pomocą igły o rozmiarze 30 wykonaj dwa otwory w oponie twardej w odległości jednego milimetra od siebie, aby utworzyć punkt dostępu dla stałych kleszczy. Następnie włóż stałe kleszcze pod kątem 90 stopni przez oponę twardą, zachowując ślady na zębach nad oponą twardą.Teraz ściśnij kleszcze na 10 sekund. Wykonaj dziesięć sekundowych ściśnięć jeszcze dwa razy i usuń kleszcze. Następnie namocz kawałek wchłanialnej żelatyny, sprasowaną gąbkę w soli fizjologicznej i przykryj nią miejsce urazu.Zamknij mięsień nad gąbką żelatynową za pomocą czterech, syntetycznych szwów biegowych z innego nylonu. Następnie użyj pięciomilimetrowych kliss, aby zabezpieczyć skórę. Zakończ procedurę podskórnym wstrzyknięciem 10 mikrolitrów bupiwakainy w 490 mikrolitrach soli fizjologicznej na jeden miligram na kilogram.Następnie wstrzyknij pięć mikrolitrów buprenorfiny do mięśnia pośladkowego w ilości 100 mikrogramów na kilogram. Po operacji. Ogrzej zwierzę i monitoruj je, aż odzyska przytomność. Aby ponownie otworzyć zwierzę w celu wykonania obrazowania, należy wprowadzić znieczulenie jak poprzednio, a następnie zdjąć klipsy do ran zgodnie z instrukcjami producenta.W razie potrzeby nałóż produkt do depilacji na obszar wokół nacięcia. Tym razem zastosuj dodatkowe peelingi z powidonem, jodem i 70% alkoholem. Teraz ponownie otwórz skórę wzdłuż poprzedniego nacięcia.Usuń pozostałe szwy i w razie potrzeby otwórz mięśnie kleszczami za pomocą nożyczek. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj nożyczek, aby wykonać kieszenie na zaciski rdzenia kręgowego wzdłuż wyrostków poprzecznych na kręgu, jeden poziom powyżej laminektomii i jeden poziom poniżej laminektomii. Włóż zaciski stabilizatora rdzenia kręgowego wokół każdego kręgu i dokręć zaciski.Wyreguluj zaciski tak, aby rdzeń kręgowy był równoległy do platformy obrazowania, a tkanka była stabilna. Jeśli widoczny jest artefakt oddychania, wyreguluj zaciski, aby zminimalizować ruch. Następnie zakryj zaciski i paraform.Następnie delikatnie usuń piankę żelową za pomocą kleszczy. Usuń jak najwięcej. Usuń również grubą tkankę bliznowatą nad oponami mózgowymi, które mogą być obecne.Po usunięciu całej pianki żelowej przykryj rdzeń kręgowy solą fizjologiczną. Jeśli zauważysz krwawienie, użyj gąbki żelatynowej do zatamowania krwawienia. W razie potrzeby zastosuj kauteryzację podczas kauteryzacji.Uważaj, aby nie dotykać rdzenia kręgowego i utrzymuj go pokrytego solą fizjologiczną i pianką żelową. Teraz stwórz studzienkę, w której znajdzie się płyn immersyjny, uszczelnij skórę i tkanki klejem cyjanoakrylowym. Następnie zbuduj zagłębienie z akrylu dentystycznego między dwoma zaciskami.Poczekaj, aż studnia się utwardzi. Po utwardzeniu napełnij studzienkę sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Podczas wykonywania tych czynności należy obserwować, czy nie ma krwawienia.W tym momencie opcjonalnie wstrzyknąć fluorescencyjne naczynia obumierają do żyły ogonowej. Aby uwydatnić naczynia krwionośne podczas obrazowania, użyj fluorescencyjnej nici DExT powyżej 70 kilodaltonowych kropek kwantowych lub fluorescencyjnie znakowanych lektyn. Podczas obrazowania utrzymuj mysz w temperaturze 37 stopni Celsjusza w kontrolowanym środowisku Na scenie mikroskopu Najbardziej krytycznymi krokami do skutecznego przygotowania jest upewnienie się, że rdzeń kręgowy jest czysty, nie krwawi i że nie ma widocznych artefaktów oddychania.Okresowo podczas obrazowania sprawdzaj poziom znieczulenia, monitorując oddech zwierzęcia, który powinien wynosić od 60 do 100 oddechów na minutę. Popraw znieczulenie, regulując poziomy fluoru ISO. Po wykonaniu badania obrazowego należy zwrócić zwierzę do miejsca operacji, usunąć zaciski rdzeniowe i ściągnąć akryl ze skóry.Mysz może być następnie zamknięta w celu późniejszego obrazowania pod koniec początkowej operacji lub poddana eutanazji pięć dni po urazie. Miejsca wprowadzenia kleszczy są nadal widoczne, ale zmiana zaczęła się powiększać z powodu wtórnego urazu spowodowanego stanem zapalnym. Aksony na drugim końcu zmiany co-end co-s cofnęły się od początkowego miejsca urazu.Jednocześnie można zaobserwować duży napływ trzech komórek CX C--dodatnich, mikrogleju lub makrofagów, infiltrujących w i wokół zmiany zmiażdżenia, aby dostrzec zachowanie tych komórek w mikrośrodowisku zmiany, najpierw zastosowano model chimery radiacyjnej. Komórki progenitorowe szpiku kostnego myszy CX z trzema CR z jednym dodatnim GFP zastąpiono niefluorescencyjnymi komórkami dawcy, więc widoczny byłby tylko mikroglej rezydujący w OUN z dodatnim GFP. Po drugie, komórki progenitorowe szpiku kostnego u myszy niefluorescencyjnej zastąpiono komórkami szpiku z myszy CX three CR z jednym dodatnim GFP w celu wyświetlenia komórek pochodzących ze szpiku kostnego.Przed urazem jedynymi wykrytymi komórkami GFP pochodzącymi ze szpiku kostnego były w dużej mierze komórki przynaczyniowe, które, jak donoszono, były stale zastępowane ze szpiku kostnego po urazie zmiażdżenia. CX: trzy C, jeden dodatni GFP, komórki GFP są zwiększone wzdłuż wnętrza naczyń krwionośnych otaczających zmianę. Dodatkowo centrum zmian zostało wypełnione naciekającymi CX trzema CR jeden dodatni makrofagami GFP.Korzystając z tej techniki, różne zwierzęta transgeniczne mogą być wykorzystywane do znakowania innych populacji komórek fluorescencyjnych w celu zidentyfikowania ich interakcji zarówno w rdzeniu kręgowym, jak i w innych modelach choroby.

intravital-imaging-axonal-interactions-with-microglia-macrophages

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano małoinwazyjny protokół stabilizacji kręgosłupa myszy oraz wykonywania powtarzalnego obrazowania rdzenia kręgowego in vivo z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej. Metoda ta łączy urządzenie do stabilizacji kręgosłupa z reżimem anestezjologicznym w celu zminimalizowania ruchów wywołanych oddychaniem i uzyskania surowych danych obrazowych, które nie wymagają wyrównania ani innego przetwarzania końcowego.

Obrazowanie in vivo rdzenia kręgowego myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Opisano protokół obrazowania in vivo służący do monitorowania pierwotnych aksonów sensorycznych po zmiażdżeniu korzenia grzbietowego. Procedury te wykorzystują fluorescencyjną mikroskopię szerokopolową oraz myszy transgeniczne thy1-YFP i umożliwiają wielokrotne obrazowanie regeneracji aksonów na odcinku 4 cm w obwodowym układzie nerwowym (PNS) oraz oddziaływań aksonów z granicą ośrodkowego układu nerwowego (CNS).

Obrazowanie na żywo aksonów korzeni grzbietowych po ryzotomii

Źródło: Maruoka, H., et. al. Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy. J. Vis. Exp. (2022) Ten film przedstawia procedurę mikroskopii dwufotonowej do obrazowania aktywności neuronalnej i dynamiki mikrogleju u obudzonej myszy podczas stymulacji wzrokowej, podkreślając stany przejściowe wapnia i interakcje komórkowe.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u wybudzonej myszy

Opisujemy metodę wszczepiania i utrzymywania szklanych okien nad odsłoniętymi rdzeniami kręgowymi dorosłych myszy do badania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia. Okna te zapewniają przewlekły dostęp optyczny do rdzenia kręgowego w celu monitorowania dynamiki komórek na poziomie subkomórkowym u żywych zwierząt za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Wszczepianie szklanych okien rdzenia kręgowego dorosłym myszom z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego

Ostra uraz mózgu to poważny uraz, który do tej pory nie doczekał się odpowiedniego leczenia. Mikroskopia wielofotonowa pozwala na badanie podłużne procesu rozwoju ostrego urazu mózgu i sondowanie strategii terapeutycznych u gryzoni. W protokole przedstawiono dwa modele ostrego urazu mózgu badane za pomocą dwufotonowego obrazowania mózgu in vivo.

Ostry uraz mózgu u myszy, po którym następuje podłużne obrazowanie dwufotonowe

Prezentujemy protokół wykorzystujący mikroskopię poklatkową z wzbudzeniem dwufotonowym do jednoczesnej wizualizacji dynamiki uszkodzeń aksonów i mielin w czasie rzeczywistym. Ten proponowany protokół pozwala na badanie zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych czynników, które mogą wpływać na los centralnego mielinizowanego aksonu po urazie i przyczyniać się do trwałej niepełnosprawności klinicznej.

Model uszkodzenia rdzenia kręgowego indukowany laserem ex vivo do oceny mechanizmów zwyrodnienia aksonów w czasie rzeczywistym

W tym filmie opisujemy procedurę wszczepienia przewlekłej komory obrazowania optycznego do grzbietowego rdzenia kręgowego żywej myszy. Komora, zabieg chirurgiczny i przewlekłe obrazowanie są oceniane i demonstrowane.

Procedura wszczepienia komory rdzeniowej do podłużnego obrazowania in vivo rdzenia kręgowego myszy

Wprowadzamy metodę obrazowania in vivo przy użyciu dwóch różnych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamicznych zmian naczyniowych kręgosłupa po kontuzji rdzenia kręgowego u dorosłych szczurów Sprague-Dawley.

Badanie in vivo Dwukolorowa metoda obrazowania dynamiki naczyń krwionośnych po kontuzyjnym urazie rdzenia kręgowego

Ten protokół opisuje technikę przewlekłego wszczepiania okien czaszkowych, która może być używana do podłużnego obrazowania struktur nerwowo-glejowo-naczyniowych, interakcji i funkcji zarówno w zdrowych, jak i chorych warunkach. Służy jako alternatywa uzupełniająca dla metody obrazowania przezczaszkowego, która, choć często preferowana, ma pewne krytyczne ograniczenia.

Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy

To badanie demonstruje dostarczanie powtarzających się urazowych uszkodzeń mózgu myszom i jednoczesne wszczepienie okna czaszkowego do późniejszego przyżyciowego obrazowania EGFP wyrażonego przez neuron za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Przyżyciowe obrazowanie ekspresji białek fluorescencyjnych u myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu i okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopu dwufotonowego

Niniejszy artykuł demonstruje metodę wizualizacji i ilościowej ruchliwości mikrogleju oraz kontaktu z postsynaptycznymi punktami siatkówki za pomocą obracającej się mikroskopii konfokalnej dysku.

Obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy

Poznaj technikę dwufotonowego obrazowania przyżyciowego do badania interakcji mikrogleju i makrofagów w uszkodzonej rdzeniu kręgowym myszy. Ta metoda umożliwia obserwację ruchu komórek w czasie rzeczywistym.

Przyżyciowe obrazowanie interakcji aksonalnych z mikroglejem i makrofagami w urazie zmiażdżenia kolumny grzbietowej myszy

Przeglądaj więcej filmów