Przyżyciowe obrazowanie interakcji aksonalnych z mikroglejem i makrofagami w urazie zmiażdżenia kolumny grzbietowej myszy

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja ruchu i interakcji między mikroglejem, monocytami i innymi typami komórek w uszkodzonym rdzeniu kręgowym. Osiąga się to poprzez stworzenie chimerycznych myszy szpiku kostnego, które będą miały rezydentny mikroglej lub makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego znakowane markerem fluorescencyjnym. Drugim krokiem jest spowodowanie zmiażdżenia kręgosłupa w rdzeniu kręgowym.

Następnie zwierzęta są ponownie otwierane, a rdzeń kręgowy jest stabilizowany W przypadku obrazowania wielofotonowego ostatnim krokiem jest wykonanie pojedynczych zdjęć lub filmów poklatkowych w obrębie zmiany. Ostatecznie analiza obrazu pokazuje ruch komórek i interakcję komórkową z otaczającymi substratami. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z tradycyjną techniką, taką jak hodowla komórkowa i utrwalone tkanki, jest to, że komórki można obrazować w ich naturalnym, złożonym środowisku u żywego zwierzęcia.

Do tej operacji użyj chimerycznych lub podwójnie transgenicznych zwierząt. Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby dowiedzieć się, jak oznaczać komórki rezydentne lub pochodzące ze szpiku kostnego po wywołaniu znieczulenia, utrzymuj go za pomocą jednego do 2% fluoru ISO, aby uzyskać częstość oddechów około 60 do 100 oddechów na minutę. Teraz nałóż maści do oczu i potwierdź chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia szczyptą palca u nogi.

Przygotuj się do operacji, najpierw goląc docelowy obszar rdzenia kręgowego, a następnie wycierając skórę do czysta jodem powidonu i 70% peelingami alkoholowymi, udrapuj zwierzę i zrób otwór, aby uzyskać dostęp do miejsca operacji. Następnie rozłóż narzędzia do autoklawu na sterylnej serwacji. Obejmuje to kleszcze numer cztery, które są zamocowane tak, aby znajdowały się w odległości jednego milimetra między zębami i mają ślady w odległości jednego milimetra od końcówek.

Teraz można otworzyć skórę w linii środkowej za pomocą nożyczek do tęczówki, odsłaniając mięśnie. Kontynuuj operację pod mikroskopem preparacyjnym. Wzdłuż linii środkowej przetnij mięśnie pleców w miejscu, w którym przyczepiają się do grzbietowych wyrostków kręgosłupa, w celu odsłonięcia kręgosłupa.

Polega to na przecięciu mięśnia czworobocznego i więzadeł mięśnia najszerszego grzbietu. Następnie usuń mięśnie rotatorów między wyrostkami poprzecznymi a wyrostkiem grzbietowym, aby odsłonić blaszkę określonego kręgu przeznaczonego do usunięcia. Tutaj odsłonięty jest T 10.

Kontynuuj, wkładając końcówki jurora RO w przestrzeń powyżej i poniżej procesu. Następnie lekko unieś, aby upewnić się, że końcówki są bezpiecznie na swoim miejscu i nie są zbyt głębokie. Następnie zamknij ławice RO, aby usunąć blaszkę.

Teraz usuń wszystkie mniejsze części pozostałego kręgu, powiększając w ten sposób otwór. Za pomocą igły o rozmiarze 30 wykonaj dwa otwory w oponie twardej w odległości jednego milimetra od siebie, aby utworzyć punkt dostępu dla stałych kleszczy. Następnie włóż stałe kleszcze pod kątem 90 stopni przez oponę twardą, zachowując ślady na zębach nad oponą twardą.

Teraz ściśnij kleszcze na 10 sekund. Wykonaj dziesięć sekundowych ściśnięć jeszcze dwa razy i usuń kleszcze. Następnie namocz kawałek wchłanialnej żelatyny, sprasowaną gąbkę w soli fizjologicznej i przykryj nią miejsce urazu.

Zamknij mięsień nad gąbką żelatynową za pomocą czterech, syntetycznych szwów biegowych z innego nylonu. Następnie użyj pięciomilimetrowych kliss, aby zabezpieczyć skórę. Zakończ procedurę podskórnym wstrzyknięciem 10 mikrolitrów bupiwakainy w 490 mikrolitrach soli fizjologicznej na jeden miligram na kilogram.

Następnie wstrzyknij pięć mikrolitrów buprenorfiny do mięśnia pośladkowego w ilości 100 mikrogramów na kilogram. Po operacji. Ogrzej zwierzę i monitoruj je, aż odzyska przytomność. Aby ponownie otworzyć zwierzę w celu wykonania obrazowania, należy wprowadzić znieczulenie jak poprzednio, a następnie zdjąć klipsy do ran zgodnie z instrukcjami producenta.

W razie potrzeby nałóż produkt do depilacji na obszar wokół nacięcia. Tym razem zastosuj dodatkowe peelingi z powidonem, jodem i 70% alkoholem. Teraz ponownie otwórz skórę wzdłuż poprzedniego nacięcia.

Usuń pozostałe szwy i w razie potrzeby otwórz mięśnie kleszczami za pomocą nożyczek. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj nożyczek, aby wykonać kieszenie na zaciski rdzenia kręgowego wzdłuż wyrostków poprzecznych na kręgu, jeden poziom powyżej laminektomii i jeden poziom poniżej laminektomii. Włóż zaciski stabilizatora rdzenia kręgowego wokół każdego kręgu i dokręć zaciski.

Wyreguluj zaciski tak, aby rdzeń kręgowy był równoległy do platformy obrazowania, a tkanka była stabilna. Jeśli widoczny jest artefakt oddychania, wyreguluj zaciski, aby zminimalizować ruch. Następnie zakryj zaciski i paraform.

Następnie delikatnie usuń piankę żelową za pomocą kleszczy. Usuń jak najwięcej. Usuń również grubą tkankę bliznowatą nad oponami mózgowymi, które mogą być obecne.

Po usunięciu całej pianki żelowej przykryj rdzeń kręgowy solą fizjologiczną. Jeśli zauważysz krwawienie, użyj gąbki żelatynowej do zatamowania krwawienia. W razie potrzeby zastosuj kauteryzację podczas kauteryzacji.

Uważaj, aby nie dotykać rdzenia kręgowego i utrzymuj go pokrytego solą fizjologiczną i pianką żelową. Teraz stwórz studzienkę, w której znajdzie się płyn immersyjny, uszczelnij skórę i tkanki klejem cyjanoakrylowym. Następnie zbuduj zagłębienie z akrylu dentystycznego między dwoma zaciskami.

Poczekaj, aż studnia się utwardzi. Po utwardzeniu napełnij studzienkę sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Podczas wykonywania tych czynności należy obserwować, czy nie ma krwawienia.

W tym momencie opcjonalnie wstrzyknąć fluorescencyjne naczynia obumierają do żyły ogonowej. Aby uwydatnić naczynia krwionośne podczas obrazowania, użyj fluorescencyjnej nici DExT powyżej 70 kilodaltonowych kropek kwantowych lub fluorescencyjnie znakowanych lektyn. Podczas obrazowania utrzymuj mysz w temperaturze 37 stopni Celsjusza w kontrolowanym środowisku Na scenie mikroskopu Najbardziej krytycznymi krokami do skutecznego przygotowania jest upewnienie się, że rdzeń kręgowy jest czysty, nie krwawi i że nie ma widocznych artefaktów oddychania.

Okresowo podczas obrazowania sprawdzaj poziom znieczulenia, monitorując oddech zwierzęcia, który powinien wynosić od 60 do 100 oddechów na minutę. Popraw znieczulenie, regulując poziomy fluoru ISO. Po wykonaniu badania obrazowego należy zwrócić zwierzę do miejsca operacji, usunąć zaciski rdzeniowe i ściągnąć akryl ze skóry.

Mysz może być następnie zamknięta w celu późniejszego obrazowania pod koniec początkowej operacji lub poddana eutanazji pięć dni po urazie. Miejsca wprowadzenia kleszczy są nadal widoczne, ale zmiana zaczęła się powiększać z powodu wtórnego urazu spowodowanego stanem zapalnym. Aksony na drugim końcu zmiany co-end co-s cofnęły się od początkowego miejsca urazu.

Jednocześnie można zaobserwować duży napływ trzech komórek CX C--dodatnich, mikrogleju lub makrofagów, infiltrujących w i wokół zmiany zmiażdżenia, aby dostrzec zachowanie tych komórek w mikrośrodowisku zmiany, najpierw zastosowano model chimery radiacyjnej. Komórki progenitorowe szpiku kostnego myszy CX z trzema CR z jednym dodatnim GFP zastąpiono niefluorescencyjnymi komórkami dawcy, więc widoczny byłby tylko mikroglej rezydujący w OUN z dodatnim GFP. Po drugie, komórki progenitorowe szpiku kostnego u myszy niefluorescencyjnej zastąpiono komórkami szpiku z myszy CX three CR z jednym dodatnim GFP w celu wyświetlenia komórek pochodzących ze szpiku kostnego.

Przed urazem jedynymi wykrytymi komórkami GFP pochodzącymi ze szpiku kostnego były w dużej mierze komórki przynaczyniowe, które, jak donoszono, były stale zastępowane ze szpiku kostnego po urazie zmiażdżenia. CX: trzy C, jeden dodatni GFP, komórki GFP są zwiększone wzdłuż wnętrza naczyń krwionośnych otaczających zmianę. Dodatkowo centrum zmian zostało wypełnione naciekającymi CX trzema CR jeden dodatni makrofagami GFP.

Korzystając z tej techniki, różne zwierzęta transgeniczne mogą być wykorzystywane do znakowania innych populacji komórek fluorescencyjnych w celu zidentyfikowania ich interakcji zarówno w rdzeniu kręgowym, jak i w innych modelach choroby.