Przyżyciowe obrazowanie interakcji aksonalnych z mikroglejem i makrofagami w urazie zmiażdżenia kolumny grzbietowej myszy
23 listopada 2014
Dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe może być użyte do zbadania interakcji między różnymi typami komórek w rdzeniu kręgowym w ich naturalnym środowisku tkankowym u chimerycznego zwierzęcia szpiku kostnego z urazowym uszkodzeniem rdzenia kręgowego w kolumnie grzbietowej.
Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja ruchu i interakcji między mikroglejem, monocytami i innymi typami komórek w uszkodzonym rdzeniu kręgowym. Osiąga się to poprzez stworzenie chimerycznych myszy szpiku kostnego, które będą miały rezydentny mikroglej lub makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego znakowane markerem fluorescencyjnym. Drugim krokiem jest spowodowanie zmiażdżenia kręgosłupa w rdzeniu kręgowym.
Następnie zwierzęta są ponownie otwierane, a rdzeń kręgowy jest stabilizowany W przypadku obrazowania wielofotonowego ostatnim krokiem jest wykonanie pojedynczych zdjęć lub filmów poklatkowych w obrębie zmiany. Ostatecznie analiza obrazu pokazuje ruch komórek i interakcję komórkową z otaczającymi substratami. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z tradycyjną techniką, taką jak hodowla komórkowa i utrwalone tkanki, jest to, że komórki można obrazować w ich naturalnym, złożonym środowisku u żywego zwierzęcia.
Do tej operacji użyj chimerycznych lub podwójnie transgenicznych zwierząt. Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby dowiedzieć się, jak oznaczać komórki rezydentne lub pochodzące ze szpiku kostnego po wywołaniu znieczulenia, utrzymuj go za pomocą jednego do 2% fluoru ISO, aby uzyskać częstość oddechów około 60 do 100 oddechów na minutę. Teraz nałóż maści do oczu i potwierdź chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia szczyptą palca u nogi.
Przygotuj się do operacji, najpierw goląc docelowy obszar rdzenia kręgowego, a następnie wycierając skórę do czysta jodem powidonu i 70% peelingami alkoholowymi, udrapuj zwierzę i zrób otwór, aby uzyskać dostęp do miejsca operacji. Następnie rozłóż narzędzia do autoklawu na sterylnej serwacji. Obejmuje to kleszcze numer cztery, które są zamocowane tak, aby znajdowały się w odległości jednego milimetra między zębami i mają ślady w odległości jednego milimetra od końcówek.
Teraz można otworzyć skórę w linii środkowej za pomocą nożyczek do tęczówki, odsłaniając mięśnie. Kontynuuj operację pod mikroskopem preparacyjnym. Wzdłuż linii środkowej przetnij mięśnie pleców w miejscu, w którym przyczepiają się do grzbietowych wyrostków kręgosłupa, w celu odsłonięcia kręgosłupa.
Polega to na przecięciu mięśnia czworobocznego i więzadeł mięśnia najszerszego grzbietu. Następnie usuń mięśnie rotatorów między wyrostkami poprzecznymi a wyrostkiem grzbietowym, aby odsłonić blaszkę określonego kręgu przeznaczonego do usunięcia. Tutaj odsłonięty jest T 10.
Kontynuuj, wkładając końcówki jurora RO w przestrzeń powyżej i poniżej procesu. Następnie lekko unieś, aby upewnić się, że końcówki są bezpiecznie na swoim miejscu i nie są zbyt głębokie. Następnie zamknij ławice RO, aby usunąć blaszkę.
Teraz usuń wszystkie mniejsze części pozostałego kręgu, powiększając w ten sposób otwór. Za pomocą igły o rozmiarze 30 wykonaj dwa otwory w oponie twardej w odległości jednego milimetra od siebie, aby utworzyć punkt dostępu dla stałych kleszczy. Następnie włóż stałe kleszcze pod kątem 90 stopni przez oponę twardą, zachowując ślady na zębach nad oponą twardą.
Teraz ściśnij kleszcze na 10 sekund. Wykonaj dziesięć sekundowych ściśnięć jeszcze dwa razy i usuń kleszcze. Następnie namocz kawałek wchłanialnej żelatyny, sprasowaną gąbkę w soli fizjologicznej i przykryj nią miejsce urazu.
Zamknij mięsień nad gąbką żelatynową za pomocą czterech, syntetycznych szwów biegowych z innego nylonu. Następnie użyj pięciomilimetrowych kliss, aby zabezpieczyć skórę. Zakończ procedurę podskórnym wstrzyknięciem 10 mikrolitrów bupiwakainy w 490 mikrolitrach soli fizjologicznej na jeden miligram na kilogram.
Następnie wstrzyknij pięć mikrolitrów buprenorfiny do mięśnia pośladkowego w ilości 100 mikrogramów na kilogram. Po operacji. Ogrzej zwierzę i monitoruj je, aż odzyska przytomność. Aby ponownie otworzyć zwierzę w celu wykonania obrazowania, należy wprowadzić znieczulenie jak poprzednio, a następnie zdjąć klipsy do ran zgodnie z instrukcjami producenta.
W razie potrzeby nałóż produkt do depilacji na obszar wokół nacięcia. Tym razem zastosuj dodatkowe peelingi z powidonem, jodem i 70% alkoholem. Teraz ponownie otwórz skórę wzdłuż poprzedniego nacięcia.
Usuń pozostałe szwy i w razie potrzeby otwórz mięśnie kleszczami za pomocą nożyczek. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj nożyczek, aby wykonać kieszenie na zaciski rdzenia kręgowego wzdłuż wyrostków poprzecznych na kręgu, jeden poziom powyżej laminektomii i jeden poziom poniżej laminektomii. Włóż zaciski stabilizatora rdzenia kręgowego wokół każdego kręgu i dokręć zaciski.
Wyreguluj zaciski tak, aby rdzeń kręgowy był równoległy do platformy obrazowania, a tkanka była stabilna. Jeśli widoczny jest artefakt oddychania, wyreguluj zaciski, aby zminimalizować ruch. Następnie zakryj zaciski i paraform.
Następnie delikatnie usuń piankę żelową za pomocą kleszczy. Usuń jak najwięcej. Usuń również grubą tkankę bliznowatą nad oponami mózgowymi, które mogą być obecne.
Po usunięciu całej pianki żelowej przykryj rdzeń kręgowy solą fizjologiczną. Jeśli zauważysz krwawienie, użyj gąbki żelatynowej do zatamowania krwawienia. W razie potrzeby zastosuj kauteryzację podczas kauteryzacji.
Uważaj, aby nie dotykać rdzenia kręgowego i utrzymuj go pokrytego solą fizjologiczną i pianką żelową. Teraz stwórz studzienkę, w której znajdzie się płyn immersyjny, uszczelnij skórę i tkanki klejem cyjanoakrylowym. Następnie zbuduj zagłębienie z akrylu dentystycznego między dwoma zaciskami.
Poczekaj, aż studnia się utwardzi. Po utwardzeniu napełnij studzienkę sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Podczas wykonywania tych czynności należy obserwować, czy nie ma krwawienia.
W tym momencie opcjonalnie wstrzyknąć fluorescencyjne naczynia obumierają do żyły ogonowej. Aby uwydatnić naczynia krwionośne podczas obrazowania, użyj fluorescencyjnej nici DExT powyżej 70 kilodaltonowych kropek kwantowych lub fluorescencyjnie znakowanych lektyn. Podczas obrazowania utrzymuj mysz w temperaturze 37 stopni Celsjusza w kontrolowanym środowisku Na scenie mikroskopu Najbardziej krytycznymi krokami do skutecznego przygotowania jest upewnienie się, że rdzeń kręgowy jest czysty, nie krwawi i że nie ma widocznych artefaktów oddychania.
Okresowo podczas obrazowania sprawdzaj poziom znieczulenia, monitorując oddech zwierzęcia, który powinien wynosić od 60 do 100 oddechów na minutę. Popraw znieczulenie, regulując poziomy fluoru ISO. Po wykonaniu badania obrazowego należy zwrócić zwierzę do miejsca operacji, usunąć zaciski rdzeniowe i ściągnąć akryl ze skóry.
Mysz może być następnie zamknięta w celu późniejszego obrazowania pod koniec początkowej operacji lub poddana eutanazji pięć dni po urazie. Miejsca wprowadzenia kleszczy są nadal widoczne, ale zmiana zaczęła się powiększać z powodu wtórnego urazu spowodowanego stanem zapalnym. Aksony na drugim końcu zmiany co-end co-s cofnęły się od początkowego miejsca urazu.
Jednocześnie można zaobserwować duży napływ trzech komórek CX C--dodatnich, mikrogleju lub makrofagów, infiltrujących w i wokół zmiany zmiażdżenia, aby dostrzec zachowanie tych komórek w mikrośrodowisku zmiany, najpierw zastosowano model chimery radiacyjnej. Komórki progenitorowe szpiku kostnego myszy CX z trzema CR z jednym dodatnim GFP zastąpiono niefluorescencyjnymi komórkami dawcy, więc widoczny byłby tylko mikroglej rezydujący w OUN z dodatnim GFP. Po drugie, komórki progenitorowe szpiku kostnego u myszy niefluorescencyjnej zastąpiono komórkami szpiku z myszy CX three CR z jednym dodatnim GFP w celu wyświetlenia komórek pochodzących ze szpiku kostnego.
Przed urazem jedynymi wykrytymi komórkami GFP pochodzącymi ze szpiku kostnego były w dużej mierze komórki przynaczyniowe, które, jak donoszono, były stale zastępowane ze szpiku kostnego po urazie zmiażdżenia. CX: trzy C, jeden dodatni GFP, komórki GFP są zwiększone wzdłuż wnętrza naczyń krwionośnych otaczających zmianę. Dodatkowo centrum zmian zostało wypełnione naciekającymi CX trzema CR jeden dodatni makrofagami GFP.
Korzystając z tej techniki, różne zwierzęta transgeniczne mogą być wykorzystywane do znakowania innych populacji komórek fluorescencyjnych w celu zidentyfikowania ich interakcji zarówno w rdzeniu kręgowym, jak i w innych modelach choroby.
Przegląd
W niniejszym badaniu wykorzystano dwufotonową obrazowanie intravitalne, aby zbadać interakcje między różnymi typami komórek w rdzeniu kręgowym w żywym modelu zwierzęcym. W szczególności skupiono się na dynamice mikrogleju i monocytów w kontekście urazowego uszkodzenia rdzenia kręgowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Obrazowanie in vivo
Wprowadzenie
- Obrazowanie dwufotonowe umożliwia obserwację interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym.
- Chimeryczne myszy z przeszczepem szpiku kostnego są wykorzystywane do rozróżnienia między komórkami rezydentnymi a komórkami pochodzącymi ze szpiku kostnego.
- Urazy rdzenia kręgowego stanowią model do badania odpowiedzi komórkowych w złożonym środowisku.
- Metoda ta oferuje przewagę nad tradycyjnymi technikami dzięki zachowaniu naturalnej architektury tkanki.
Cel badania
- Obserwacja ruchu i interakcji mikrogleju oraz monocytów w uszkodzonym rdzeniu kręgowym.
- Ocena zachowania komórkowego w żywym organizmie po urazie.
- Pogłębienie zrozumienia dynamiki komórkowej w odpowiedziach neurozapalnych.
Zastosowane metody
- Tworzenie myszy chimerycznych szpiku kostnego z komórkami znakowanymi fluorescencyjnie.
- Indukcja urazu zmiażdżeniowego kolumny tylnej rdzenia kręgowego.
- Obrazowanie wielofotonowe w celu uchwycenia interakcji i ruchów komórkowych.
- Monitorowanie i obrazowanie pooperacyjne w kontrolowanych warunkach.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja interakcji mikrogleju i monocytów w czasie rzeczywistym.
- Wykazanie przemieszczania się komórek w obrębie miejsca urazu.
- Wskazanie zalet obrazowania in vivo w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Przedstawienie wglądu w odpowiedzi komórkowe po urazie rdzenia kręgowego.
Wnioski
- Obrazowanie dwufotonowe jest potężnym narzędziem do badania dynamiki komórkowej in vivo.
- Badanie to pogłębia zrozumienie procesów neurozapalnych w urazach rdzenia kręgowego.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu eksploracji interwencji terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta metoda obrazowania intravitalnego umożliwia wizualizację dynamiki komórek odpornościowych w czasie rzeczywistym w przypadku urazowego uszkodzenia rdzenia kręgowego, dostarczając wglądu w mechanizmy procesów neurozapalnych. Dzięki odróżnianiu mikrogleju od makrofagów in vivo, metoda ta wspomaga walidację celów oraz ograniczanie ryzyka strategii immunomodulacyjnych w przedklinicznych modelach chorób OUN. Technika ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkryć poprzez rejestrowanie interakcji komórkowych w fizjologicznie istotnym mikrośrodowisku zmiany chorobowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie wzorców infiltracji i interakcji mikrogleju oraz makrofagów po zmiażdżeniu tylnych sznurów rdzenia kręgowego.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje chimeryczne modele szpiku kostnego do oddzielenia mikrogleju rezydującego w OUN od makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego w celu specyficznego badania wybranych celów.
- Wartość prognostyczna: Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez wizualizację odpowiedzi komórkowych w żywym systemie, co zmniejsza zależność od sztucznych systemów hodowli.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych, rozdzielonych w czasie danych na temat ruchu i interakcji komórkowych w obrębie miejsca uszkodzenia.
- Wartość operacyjna: Ustanawia powtarzalną platformę obrazowania do podłużnego śledzenia dynamiki komórek odpornościowych po urazie.
- Gotowość analizy: Umożliwia standaryzowaną wizualizację populacji komórek CX3CR1-dodatnich jako biomarkera aktywacji zapalnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje progresję wtórnego urazu oraz infiltrację komórek zapalnych istotną dla patologii ludzkiego rdzenia kręgowego.
- Wartość operacyjna: Umożliwia długofalowe sesje obrazowania w celu oceny wpływu terapeutycznego na dynamikę komórkową w okresie od kilku dni do kilku tygodni.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkrywania celów molekularnych z przedkliniczną oceną skuteczności poprzez spójne odczyty fenotypowe.
Integracja potoków i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkrywania procesów neurozapalnych, wspierając wczesną walidację celów terapeutycznych poprzez screening fenotypowy i umożliwiając dalsze badania mechanistyczne w modelach przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących udziału komórek odpornościowych w urazach rdzenia kręgowego poprzez bezpośrednią obserwację zachowania mikrogleju i makrofagów.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowe dane obrazowe, takie jak prędkość komórek, gęstość nacieku i częstotliwość interakcji, do celów przesiewania związków.
- Analityka: Zapewnia zestawy danych czasoprzestrzennych umożliwiające statystyczne porównanie fenotypów komórkowych w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Jest zgodne ze strategiami poszukiwania biomarkerów poprzez śledzenie dynamiki komórek CX3CR1-dodatnich jako korelat odpowiedzi neurozapalnej.
- Zastosowanie w organizacji: Ustanawia możliwość wielokrotnego wykorzystania obrazowania intravitalnego, które można zastosować w wielu modelach chorób OUN poza urazami rdzenia kręgowego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność co do celu poprzez ujawnienie mechanistycznych wglądów w interakcje neuroimmunologiczne in situ.
- Wartość operacyjna: Wspiera powtarzalność dzięki standaryzowanym protokołom przygotowania chirurgicznego, stabilizacji i obrazowania.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań poprzez redukcję niepewności biologicznej w zakresie mechanizmów działania immunomodulatorów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację terapii skierowanych na OUN z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowane zaangażowanie celu w systemach istotnych dla danej choroby.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie chirurgii myszy, mikroskopii dwufotonowej oraz tworzenia chimer szpiku kostnego.
- Zależne od specjalistycznej aparatury, w tym laserów z regulowaną długością fali, stabilizatorów rdzenia kręgowego i stołów obrazujących z kontrolą temperatury.
- Wymaga międzyzespołowej koordynacji pomiędzy zespołami chirurgicznymi, obrazującymi i opiekunami zwierząt w celu zapewnienia spójności w przygotowaniu zmian.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia modyfikacji przy zastosowaniu modelu w innych kontekstach uszkodzeń neuronów lub chorób neurodegeneracyjnych.
- Ograniczone przez okna przeżywalności pooperacyjnej oraz wyzwania techniczne związane z utrzymaniem stabilności rdzenia kręgowego podczas obrazowania podłużnego.
